方法
阅读：905发布：2020-05-11
专利汇可以提供方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了用于增加 烟草 植物 或烟草细胞培养物中的 蔗糖 酯含量的方法，所述方法包括通过抑制二萜合成基因的活性或表达来修饰所述烟草植物或烟草细胞培养物。本发明还提供了二萜合成基因用于增加烟草植物或烟草细胞培养物中的蔗糖酯含量的用途，以及根据本发明可获得的烟草细胞、烟草植物、烟草 植物繁殖 材料 、 收获 的叶、加工的烟草或烟草产品。，下面是方法专利的具体信息内容。
1.增加烟草植物或其部分或烟草细胞培养物中的蔗糖酯含量的方法，所述方法包括通过抑制二萜合成基因的活性或表达来修饰所述烟草植物或烟草细胞培养物。
2.二萜合成基因用于增加烟草植物或其部分或烟草细胞培养物中的蔗糖酯含量的用途。
3.用于生产具有增加的蔗糖酯含量的烟草植物或其部分、烟草植物繁殖材料、烟叶、切割收获的烟叶、加工的烟叶或切割并加工的烟叶或烟草细胞培养物的方法，所述方法包括修饰所述烟草以抑制二萜合成基因的活性或表达。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中与未经修饰以抑制二萜合成基因的活性或表达的烟草植物或烟草细胞培养物相比，蔗糖酯含量增加。
5.烟草植物或其部分或烟草细胞培养物，与未修饰的植物或未修饰的烟草细胞培养物相比，其经修饰以实现蔗糖酯含量的增加，其中所述修饰是二萜合成基因的活性或表达的抑制。
6.可从根据权利要求5所述的烟草植物或烟草细胞培养物获得的烟草植物繁殖材料(例如，植物种子)。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法或用途、根据权利要求5所述的烟草植物或烟草细胞培养物或根据权利要求6所述的烟草植物繁殖材料，其中所述二萜合成基因是环化酶2基因(CYC2)、CBTol环化酶或萜烯合酶3-8。
8.根据权利要求1-4或7中任一项所述的方法或用途、根据权利要求5或7所述的烟草植物或其部分或烟草细胞培养物或根据权利要求6或7所述的烟草植物繁殖材料，其中使用RNA干扰(RNAi)抑制二萜合成基因的表达。
9.根据权利要求8所述的方法、用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用包含环化酶2基因(CYC2)的外显子1的至少部分、外显子2的至少部分和外显子
3的至少部分的ddRNAi DNA构建体抑制环化酶2基因(CYC2)表达。
10.根据权利要求8所述的方法、用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用包含CBTol环化酶基因的外显子4的至少部分、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6、内含子6和外显子7的至少部分的ddRNAi DNA构建体抑制CBTol环化酶基因表达。
11.根据权利要求8所述的方法、用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用包含萜烯合酶3-8基因的至少核苷酸1497至1517的ddRNAi DNA构建体抑制萜烯合酶3-8基因表达，其中编号通过与SEQ ID No.3比对来确定。
12.根据权利要求8所述的方法、用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用包含萜烯合酶3-8基因的至少核苷酸884至904的ddRNAi DNA构建体抑制萜烯合酶3-8基因表达，其中编号通过与SEQ ID No.3比对来确定。
13.根据权利要求1-4或7-12中任一项所述的方法或用途或根据权利要求5或7-12中任一项所述的烟草植物或其部分或烟草细胞培养物，其中与未经修饰以抑制二萜合成基因的活性或表达的烟草植物或烟草细胞培养物相比，在修饰的烟草植物或烟草细胞培养物中的烟草植物的蔗糖酯含量为至少2倍。
14.根据权利要求5或7-13中任一项所述的烟草植物或其部分用于培育烟草植物的用途。
15.根据权利要求5或7-13中任一项所述的烟草植物或其部分或烟草细胞培养物用于生产烟草工业产品的用途。
16.根据权利要求5或7-13中任一项所述的烟草植物或其部分用于生长作物的用途。
17.根据权利要求5或7-13中任一项所述的烟草植物或其部分用于生产烟叶(例如，加工的(优选调制的)烟叶)的用途。
18.根据权利要求5或7-13中任一项所述的烟草植物的收获的叶，或可从根据权利要求
6-13中任一项所述的繁殖材料繁殖的烟草植物获得或可从通过根据权利要求14-17中任一项所述的用途获得的烟草植物获得的烟草植物的收获的叶。
19.根据权利要求18所述的烟草植物的收获的叶，其中烟草植物的收获的叶是切割收获的叶。
20.加工的烟叶(优选无活力的加工的烟叶)，其：
i) 可获得自可从根据权利要求14-17中任一项所述的用途获得的烟草植物；
ii) 可通过加工根据权利要求5或7-13中任一项所述的烟草植物获得；
iii) 可获得自从根据权利要求6-13中任一项所述的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物；或
iv) 可通过加工根据权利要求18或19所述的烟草植物的收获的叶获得。
21.根据权利要求20所述的加工的烟叶，其中所述烟草通过调制、发酵、巴氏杀菌或其组合加工。
22.根据权利要求20或21所述的加工的烟叶，其中所述加工的烟叶是切割加工的烟叶。
23.调制的烟草材料，其由根据权利要求5或7-13中任一项所述的植物或其部分或其提取物或根据权利要求5或7-13中任一项所述的烟草细胞培养物制成。
24.烟草共混物，其包含权利要求23所述的调制的烟草材料。
25.烟草工业产品，其由以下制备：
i) 根据权利要求5或7-13中任一项所述的烟草植物或其部分或根据权利要求5或7-13中任一项所述的烟草细胞培养物；
ii) 从根据权利要求6-13中任一项所述的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；
iii) 根据权利要求18或19所述的烟草植物的收获的叶；
iv) 根据权利要求19-22中任一项所述的加工的烟叶；
v) 根据权利要求23所述的调制的烟草材料；或
vi) 根据权利要求24所述的烟草共混物。
26.根据权利要求25所述的烟草工业产品，其中所述烟草产品是可燃吸烟制品。
27.根据权利要求25所述的烟草工业产品，其中所述烟草产品是无烟烟草产品。
28.根据权利要求25所述的烟草工业产品，其中所述烟草产品是不可燃气雾剂供应系统，诸如烟草加热装置或气雾剂产生装置。
29.可燃吸烟制品、不可燃气雾剂供应系统、无烟烟草产品或烟草加热装置，其包含根据权利要求5或7-13中任一项所述的植物或其部分或其提取物(例如烟草提取物)或根据权利要求5或7-13中任一项所述的烟草细胞培养物；或根据权利要求23所述的调制的烟草材料；或根据权利要求24所述的烟草共混物。
30.基本上如本文中参考说明书和附图所述的方法、烟叶、烟草植物、烟草植物繁殖材料、收获的叶、加工的烟草、烟草产品、用途或其组合。
方法
发明领域
[0001] 本发明涉及改善烟草的风味，且具体地涉及烟草植物中的蔗糖酯含量。具体而言，本发明涉及增加烟草植物中的蔗糖酯含量。更具体地，本发明涉及抑制二萜合成基因的活性或表达的方法和用途以及烟草植物及其下游产物(例如繁殖材料、收获的叶、加工的烟草、烟草产品)。
[0002] 背景植物毛状体是包含表皮突起的特化结构，其可以在许多植物的气生(ariel)表面上发
现。它们的形态在物种间且甚至在物种内是可变的，包括它们在植物器官上的位置、它们的大小和密度。它们被认为提供针对昆虫、病原微生物和食草动物的第一道防线，并提供针对环境诸如霜冻和多风条件的保护。毛状体可以是腺状的，并且分泌产物，其主要功能可以是产生在植物表面储存或挥发的害虫或传粉者相互作用的化学物质。此类植物的毛状体可以充当用于产生具有经济和商业重要性的天然产物的工厂。有利地，分泌的化合物仅在毛状体腺体中产生并且在周围的角质层下的腺体细胞外积聚。因此，通过将植物浸没在非侵入性溶剂中可以简单且干净地回收渗出物，因为渗出物材料基本上积聚在植物外部。植物毛状体次级渗出物组合物的操作已被用于增强昆虫抗性(Wang等人 Nature Biotechnology
19, 371–374 (2001)，其通过引用并入本文)，并且腺状毛状体的代谢工程改造已被用于增强精油的质量(Mahmoud和Croteau Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 17;98(15):
8915-20. Epub 2001 Jun 26，其通过引用并入本文)。
现。它们的形态在物种间且甚至在物种内是可变的，包括它们在植物器官上的位置、它们的大小和密度。它们被认为提供针对昆虫、病原微生物和食草动物的第一道防线，并提供针对环境诸如霜冻和多风条件的保护。毛状体可以是腺状的，并且分泌产物，其主要功能可以是产生在植物表面储存或挥发的害虫或传粉者相互作用的化学物质。此类植物的毛状体可以充当用于产生具有经济和商业重要性的天然产物的工厂。有利地，分泌的化合物仅在毛状体腺体中产生并且在周围的角质层下的腺体细胞外积聚。因此，通过将植物浸没在非侵入性溶剂中可以简单且干净地回收渗出物，因为渗出物材料基本上积聚在植物外部。植物毛状体次级渗出物组合物的操作已被用于增强昆虫抗性(Wang等人 Nature Biotechnology
19, 371–374 (2001)，其通过引用并入本文)，并且腺状毛状体的代谢工程改造已被用于增强精油的质量(Mahmoud和Croteau Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 17;98(15):
8915-20. Epub 2001 Jun 26，其通过引用并入本文)。
[0003] 许多烟草品种具有高生物质和高渗出物积累潜能。例如，实验烟草株系T.I. 1068可以产生最高达17%的叶干重作为腺状毛状体渗出物(Wagner, G.J 1991 Plant Physiology 96, 675–679，其通过引用并入本文)。近似72%的毛状体腺渗出物是二萜类，并且近似24%是蔗糖酯。
[0004] 蔗糖酯的最丰富的天然来源似乎是烟草植物。糖酯是化合物的复杂混合物，因为许多可能的酰基和酰基的组合可以被酯化成糖(蔗糖或葡萄糖)。这些化合物主要负责产生它们的烟叶的粘性质地(Kandra, L.和G.J. Wagner, Archives Biochem. Biophys. 265 (1988) 425–432，其通过引用并入本文)。蔗糖酯是3-甲基戊酸和3-甲基丁酸(其为土耳其烟草烟雾的重要香味组分)的前体(Kandra, L., 等人 Eur. J. Biochem. 188 (1990) 385–391，其通过引用并入本文)，此外，据说3-甲基戊酸为烟草提供“土耳其印象(Turkish note)”。
[0005] T.I. 1068毛状体渗出物主要含有西松烷二萜(cembrenoid)和labdanoid二萜类。CBT二醇(α和β位置异构体)、顺式-冷杉醇和labdenediol分别占渗出物重量的约60%、10%和
0.6%。用于合成T.I. 1068毛状体渗出物二萜类和CBT-二醇的主要二萜组分的一般途径显示于图2中。叶绿体的甲基-赤藓糖醇-磷酸酯(MEP)途径提供香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)用于二萜合成。
0.6%。用于合成T.I. 1068毛状体渗出物二萜类和CBT-二醇的主要二萜组分的一般途径显示于图2中。叶绿体的甲基-赤藓糖醇-磷酸酯(MEP)途径提供香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)用于二萜合成。
[0006] 不同烟草类型的感官或感觉特性差别很大，并受包括遗传差异的因素的复杂性的影响。烟草的抗真菌和感官特性被认为与蔗糖酯含量有关。烟草的独特香气和风味概况是芳香化合物或这些化合物的前体的独特风味的结果，所述芳香化合物或这些化合物的前体在调制叶中以特定水平存在并可以包括蔗糖酯含量。
[0007] 土耳其烟草(有时称为东方烟草)具有期望的感官特性；它是烟草的一种高度芳香、小叶品种，其味道温和，并且比其他烟草品种含有更少的尼古丁。已经确定，可测量的量的蔗糖酯在烟草调制/陈化过程后保留，并且因此作为商业土耳其(或东方)烟草的整体成分出现(M. Ashraf-Khorassani, 等人 Contributions to Tobacco Research Vol 21: 7;October 2005，其通过引用并入本文)。此外，蔗糖酯是土耳其烟草烟雾中芳香族羧酸的前体，并且因此是土耳其烟草的重要风味组分(Arrendale, R.F., 等人, J. Agric. Food Chem. 38 (1990) 75–85，其通过引用并入本文)。
[0008] 由于酯化程度和分子内酯官能团的分布，天然存在的蔗糖酯呈现挑战性的分析问题。在蔗糖分子中，葡萄糖(GLU)环上存在四个潜在酰基的位点(例如一个伯位点、三个仲位点)；并且在果糖(FRU)环上可以发现另外四个位点(例如两个伯位点，两个仲位点)。迄今为止，已经由蔗糖甲基/丁基酯或蔗糖三甲基甲硅烷基(TMS)衍生物的GC-MS(气相色谱-质谱)和LC-MS(液相色谱-质谱)鉴定酯酸部分(参见Slocombe等人Plant Physiol.148, 1830-1846，其通过引用并入本文)。为了尝试涵盖更高分子量的碳水化合物衍生物，已经研究高温GC(气相色谱法)但成功渺茫(Karrer, R., 等人, J. High Resolu. Chromatogr. 15 (1992) 585–589，其通过引用并入本文)。已经报道来自通过酯的酸水解和释放的羧酸的再衍生化获得的数据的关于蔗糖酯上的酰基取代模式的推论，但该方法可以进行不同的解释。
[0009] 发明概述已令人惊讶地发现，通过抑制本文所教导的二萜合成基因的活性或表达，可以通过修
饰烟草以产生具有增加的蔗糖酯含量的烟草而由具有商业期望的性状的烟草植物产生独特的风味(和/或香气和/或味道)特征，诸如在土耳其烟草中发现的那些。因此，可以生产具有烟草产品的消费者追求的优异风味(和/或香气和/或味道)特征的烟草产品。
饰烟草以产生具有增加的蔗糖酯含量的烟草而由具有商业期望的性状的烟草植物产生独特的风味(和/或香气和/或味道)特征，诸如在土耳其烟草中发现的那些。因此，可以生产具有烟草产品的消费者追求的优异风味(和/或香气和/或味道)特征的烟草产品。
[0010] 本发明人研究了产生特定二级化合物的特化毛状体腺细胞中的碳流的调节和途径。本发明人的一个目的是优化毛状体腺二萜代谢以修饰毛状体渗出物化学物质以提供惊人的二萜含量。产生植物株系细胞系，与在相同条件下生长的其野生型植物对应物相比，其出乎意料地表现出渗出物中的蔗糖酯含量增加。植物株系靶向催化CBTol(合酶)和萜烯合酶3-8的形成的酶。在一些实施方案中，萜烯合酶3-8可被称为顺式-冷杉醇合酶。
[0011] 本发明人已令人惊讶地确定通过抑制二萜合成基因的活性或表达来增加烟草植物的蔗糖酯含量的方法。在本发明之前，尚不知道二萜合成基因的活性或表达的抑制可用于增加蔗糖酯含量，特别是同时改善产量和其他商业上期望的性状。
[0012] 根据一个方面，本发明提供了增加烟草植物或其部分或烟草细胞培养物中的蔗糖酯含量的方法，所述方法包括通过抑制二萜合成基因的活性或表达来修饰所述烟草植物或烟草细胞培养物。
[0013] 在另一个方面，提供了二萜合成基因用于增加烟草植物或其部分或烟草细胞培养物中的蔗糖酯含量的用途。
[0014] 在另一个方面，本发明提供了用于生产具有增加的蔗糖酯含量的烟草植物或其部分、烟草植物繁殖材料、烟叶、切割收获的烟叶、加工的烟叶或切割并加工的烟叶或烟草细胞培养物的方法，所述方法包括修饰所述烟草以抑制二萜合成基因的活性或表达。
[0015] 在另一个方面，提供了根据本发明的方法或用途，其中与未经修饰以抑制二萜合成基因的活性或表达的烟草植物或烟草细胞培养物相比，蔗糖酯含量增加。
[0016] 在另一个方面，提供了烟草植物或其部分或烟草细胞培养物，与未修饰的植物或未修饰的烟草细胞培养物相比，其经修饰以实现蔗糖酯含量的增加，其中所述修饰是二萜合成基因的活性或表达的抑制。
[0018] 在另一个方面，本发明提供了方法或用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中所述二萜合成基因是环化酶2基因(CYC2)、CBTol环化酶或萜烯合酶3-8。
[0019] 在一个方面，本发明提供了方法或用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料，其中所述二萜合成基因是环化酶2基因(CYC2)。
[0020] 在一个方面，本发明提供了方法或用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料，其中所述二萜合成基因是CBTol环化酶。
[0021] 在一个方面，本发明提供了方法或用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料，其中所述二萜合成基因是萜烯合酶3-8。
[0022] 在另一个方面，本发明提供了根据本发明的方法或用途、烟草植物或其部分或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用RNA干扰(RNAi)抑制二萜合成基因的表达。
[0023] 在一个方面，提供了方法、用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用包含环化酶2基因(CYC2)基因的外显子1的至少部分、外显子2的至少部分和外显子3的至少部分的ddRNAi DNA构建体抑制环化酶2基因(CYC2)表达。
[0024] 在一个方面，提供了方法、用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用dsRNA抑制环化酶2基因(CYC2)表达，所述dsRNA由细胞中的内源途径加工成单链短干扰RNA(siRNA)，其指导RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合对应于环化酶2基因(CYC2)的外显子1的至少部分、外显子2的至少部分和外显子3的至少部分的mRNA。在一个方面，所述单链siRNA产生反义(或引导)链，其具有与对应于环化酶2基因(CYC2)的外显子1的至少部分、外显子2的至少部分和外显子3的至少部分的mRNA的互补序列。
[0025] 在一个方面，提供了根据本发明的方法、用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用包含CBTol环化酶基因的外显子4的至少部分、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6、内含子6和外显子7的至少部分的ddRNAi DNA构建体抑制CBTol环化酶基因表达。
[0026] 在另一个方面，提供了根据本发明的方法、用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用dsRNA抑制CBTol环化酶基因表达，所述dsRNA由细胞中的内源途径加工成单链siRNA，其指导RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合对应于CBTol环化酶的外显子4的至少部分、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6、内含子6和外显子7的至少部分的mRNA。在一个方面，所述单链siRNA产生反义(或引导)链，其具有与对应于CBTol环化酶基因的外显子4的至少部分、外显子5、外显子6和外显子7的至少部分的mRNA的互补序列。
[0027] 在一个方面，提供了根据本发明的方法、用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用包含对应于SEQ ID No.3的至少核苷酸1497至1517的序列的ddRNAi DNA构建体抑制萜烯合酶3-8基因表达。
[0028] 在另一个方面，提供了根据本发明的方法、用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用包含对应于SEQ ID No.3的至少核苷酸1497至1517的序列的人工微小RNAi (amiRNAi)抑制萜烯合酶3-8基因表达。
[0029] 在一个方面，提供了根据本发明的方法、用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用包含对应于SEQ ID No.3的至少核苷酸884至904的序列的ddRNAi DNA构建体抑制萜烯合酶3-8基因表达。
[0030] 在另一个方面，提供了根据本发明的方法、用途、烟草植物或烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中使用包含对应于SEQ ID No.3的至少核苷酸884至904的序列的人工微小RNAi (amiRNAi)抑制萜烯合酶3-8基因表达。
[0031] 在一个方面，提供了本发明的方法或用途、本发明的烟草植物或其部分或本发明的烟草植物繁殖材料或烟草细胞培养物，其中与未经修饰以抑制二萜合成基因的活性或表达的烟草植物或烟草细胞培养物相比，在修饰的烟草植物或烟草细胞培养物中的烟草植物的蔗糖酯含量为至少2倍(合适地至少3倍)。
[0032] 在一个方面，提供了本发明的烟草植物或其部分用于培育烟草植物的用途。
[0033] 在另一个方面，本发明提供了本发明的烟草植物或其部分或烟草细胞培养物用于生产烟草工业产品的用途。
[0034] 在另一个方面，提供了本发明的烟草植物或其部分用于生长作物的用途。
[0035] 在一个方面，本发明提供了由根据本发明的植物或其部分或其提取物或根据本发明的烟草细胞培养物制成的调制的烟草材料。
[0036] 在另一个方面，提供了烟草共混物，其包含根据本发明的所述调制的烟草材料。
[0037] 在一个方面，提供了本发明的烟草植物或其部分用于生产烟叶(例如加工的(优选调制的)烟叶)的用途。
[0038] 在另一个方面，提供了本发明的烟草植物的收获的叶或可从本发明的繁殖材料繁殖的烟草植物获得或可从通过使用本发明获得的烟草植物获得的烟草植物的收获的叶。
[0039] 在一个方面，提供了本发明的烟草植物的收获的叶，其中烟草植物的收获的叶是切割收获的叶。
[0040] 在另一个方面，本发明提供了加工的烟叶(优选无活力的加工的烟叶)，其：i) 可获得自可从使用本发明获得的烟草植物；
ii) 可通过加工本发明的烟草植物获得；
iii) 可获得自从本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物；或
iv) 可通过加工本发明的烟草植物的收获的叶获得。
ii) 可通过加工本发明的烟草植物获得；
iii) 可获得自从本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物；或
iv) 可通过加工本发明的烟草植物的收获的叶获得。
[0042] 在一个方面，提供了本发明的加工的烟叶，其中所述加工的烟叶是切割加工的烟叶。
[0043] 在另一个方面，本发明提供了烟草工业产品，其由以下制备：i) 本发明的烟草植物或其部分或本发明的烟草细胞培养物；
ii) 从本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；
iii) 本发明的烟草植物的收获的叶；
iv) 本发明的加工的烟叶。
ii) 从本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分；
iii) 本发明的烟草植物的收获的叶；
iv) 本发明的加工的烟叶。
[0044] 在一个方面，提供了本发明的烟草工业产品，其中烟草产品是吸烟制品。
[0045] 在另一个方面，提供了本发明的烟草工业产品，其中烟草产品是无烟烟草产品。
[0046] 在一个方面，提供了本发明的烟草工业产品，其中烟草产品是烟草加热装置，诸如气雾剂产生装置。
[0047] 在一个方面，提供了吸烟制品、无烟烟草产品或烟草加热装置，其包含根据本发明的植物或其部分或其提取物(例如烟草提取物)或根据本发明的烟草细胞培养物；或根据本发明的调制的烟草材料；或根据本发明的烟草共混物。
[0049] 附图简述本发明的实施方案现将仅借助于实例并参考附图进行描述，在所述附图中：
图1显示蔗糖酯的一般结构。
图1显示蔗糖酯的一般结构。
[0050] 图2显示质体中的二萜合成途径的示意图。
[0051] 图3显示展现田间生长的对照相比于转基因株系的绿叶分析的图。个别植物化学物质以量的升序排列。
[0052] 图4显示展现对照相比于转基因株系中总蔗糖酯含量的图。
[0053] 图5显示表明在GW-3株系相比于对照中的蔗糖酯富集的图。蔗糖酯含量表示为总主要渗出物化合物的百分比。
[0054] 图6显示表明在GW-3株系相比于对照中的顺式-冷杉醇富集的图。顺式-冷杉醇含量表示为总主要渗出物化合物的百分比。
[0055] 图7显示如下所述的SEQ ID No.1。
[0056] 图8显示如下所述的SEQ ID No.2。
[0057] 图9显示如下所述的SEQ ID No.3。
[0058] 图10显示如下所述的SEQ ID No.4。
[0059] 图11显示如下所述的SEQ ID No.5。
[0060] 图12显示如下所述的SEQ ID No.6。
[0061] 图13显示如下所述的SEQ ID No.7。
[0062] 图14显示如下所述的SEQ ID No.8。
[0063] 图15显示如下所述的SEQ ID No.9。
[0064] 图16显示如下所述的SEQ ID No.10。
[0065] 图17显示如下所述的SEQ ID No.11。
[0066] 序列表提供了在整个本说明书和相应的序列表中使用的序列标识符的概述，其中：
SEQ ID No.1对应于编码CBTol环化酶基因的核苷酸序列。该核苷酸序列在Genbank:
AY049090中注释。
SEQ ID No.1对应于编码CBTol环化酶基因的核苷酸序列。该核苷酸序列在Genbank:
AY049090中注释。
[0067] SEQ ID No.2对应于多肽CBTol环化酶的氨基酸序列。
[0068] SEQ ID No.3对应于cDNA基因序列，即来自普通烟草(Nicotiana tabacum)的萜烯合酶3-8基因的编码序列。全长cDNA基因序列在Genbank:AY528645中注释。
[0069] SEQ ID No.4对应于来自普通烟草的多肽萜烯合酶3-8的氨基酸序列。
[0070] SEQ ID No.5依次包含来自序列AF401234的第54至第716核苷酸的5`-有义片段(其为CYC2 mRNA的完整编码序列，并且对应于SEQ ID No.9中的核苷酸编号)；部分GUS A片段作为发夹环(从第787至第1812核苷酸)；和有义片段-3`的反向互补物。在该图中，下划线序列对应于第787至第1812核苷酸的GUS A片段(AF502128)。以有义方向来自CYC2 mRNA(AF401234对应于SEQ ID No.9)的54至716核苷酸序列对应于来自AY495694的以下基因组序列(AY495694是CYC2基因的基因组序列并且对应于SEQ ID No.8)： 核苷酸1至25，第1外显子(核苷酸26至271)，第2外显子(核苷酸1253至1529)和第3外显子的前115个核苷酸(核苷酸2366至2480)，其中核苷酸编号对应于SEQ ID No. 8中的编号。SEQ ID No.5编码dsRNA并用于ddRNAi DNA构建体(本文有时称为GW1)中以产生dsRNA。
[0071] SEQ ID No.6包含来自CBTol环化酶基因普通烟草的序列，其包含外显子4的部分序列、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6、内含子6和部分外显子7有义和反义方向，其由GUS间隔区分开。部分基因的元件在图中以下列顺序显示：普通烟草环化酶基因(AY049090)，部分外显子4 - 从核苷酸2854至核苷酸4175，正向方向，部分外显子4，内含子
4(粗体)，外显子5，内含子5(粗体)，外显子6，内含子6(粗体)，部分外显子7(对应于SEQ ID No.1的核苷酸2854至4175)；随后为GUS环-部分GUS A基因(Genbank登录号AF502128)-从
786至1816(下划线)；随后为普通烟草环化酶基因的相同序列(AY049090)，但在反向互补物中(反向互补物在阴影中显示)。该序列编码dsRNA并用于ddRNAi DNA构建体(本文有时称为GW3)中以产生dsRNA。
4(粗体)，外显子5，内含子5(粗体)，外显子6，内含子6(粗体)，部分外显子7(对应于SEQ ID No.1的核苷酸2854至4175)；随后为GUS环-部分GUS A基因(Genbank登录号AF502128)-从
786至1816(下划线)；随后为普通烟草环化酶基因的相同序列(AY049090)，但在反向互补物中(反向互补物在阴影中显示)。该序列编码dsRNA并用于ddRNAi DNA构建体(本文有时称为GW3)中以产生dsRNA。
[0072] SEQ ID No.7包含来自普通烟草的萜烯合酶3-8基因的21个核苷酸序列和与拟南芥miRNA168序列匹配的序列。该序列与拟南芥miRNA168a对应，第一和第二斜体序列对应于来自萜烯合酶3-8基因AY528645的21个核苷酸序列(1497至1517nt)。第一斜体序列(突出)呈反向互补方向。第二斜体序列(下划线)呈正向方向，并且具有三个修饰(粗体)。该序列编码amiRNAi并用于ddRNAi DNA构建体(本文有时称为GW2)中以产生amiRNAi。
[0073] SEQ ID No.8对应于环化酶2基因(CYC2)的基因组序列。该核苷酸序列在Genbank:AY495694中注释。
[0074] SEQ ID No.9对应于Genbank:(AF401234)中注释的环化酶2基因(CYC2)的mRNA的完整编码序列。
[0075] SEQ ID No.10对应于由环化酶2基因(CYC2) SEQ ID No.9编码的多肽的氨基酸序列。
[0076] SEQ ID No.11包含来自普通烟草的萜烯合酶3-8基因的21个核苷酸序列和与拟南芥miRNA168a序列匹配的序列。该序列与拟南芥miRNA168a序列对应，第一和第二斜体序列对应于来自萜合成酶3-8基因AY528645的反向互补的21个核苷酸序列(884至904 nt)。第一斜体序列(突出)呈反向互补方向。第二斜体序列(下划线)呈正向方向，并且具有修饰(粗体)。该序列编码amiRNAi并用于ddRNAi DNA构建体(本文有时称为GW5)中以产生amiRNAi。
[0077] 详述本发明人已首次显示，通过抑制烟草中二萜合成基因的活性或表达，可以增加烟草植
物的蔗糖酯含量。不希望受理论束缚，据信二萜合成基因的抑制导致降低碳利用以制备二萜类并且因此增强蔗糖酯产生。
物的蔗糖酯含量。不希望受理论束缚，据信二萜合成基因的抑制导致降低碳利用以制备二萜类并且因此增强蔗糖酯产生。
[0078] 在一个实施方案中，本发明提供了增加烟草植物的蔗糖酯含量的方法，所述方法包括通过抑制二萜合成基因的活性或表达来修饰所述烟草植物。
[0079] 合适地，用于本发明中的二萜合成基因可以是环化酶2基因(CYC2)。合适地，用于本发明中的二萜合成基因可以是CBTol环化酶基因。合适地，用于本发明中的二萜合成基因可以是萜烯合酶3-8基因。
[0080] 术语“增加”在本文中用于意味着本发明的产品(例如植物，其部分(例如叶)，加工叶或烟草产品)中蔗糖酯的浓度和/或总含量与未根据本发明修饰的可比较的产品相比更高。
[0081] 如本文所定义的“可比较的产品”将是从未根据本发明修饰的、但其中所有其他相关特征相同的烟草植物(例如，植物物种、生长条件、加工烟草的方法等)衍生的产品。根据本发明的可比较的产品可以意指可获自或获得自未修饰以抑制二萜合成基因的活性或表达的烟草植物的烟草植物或其部分，诸如烟叶，收获的叶，切割收获的叶，加工的烟叶或烟草植物繁殖材料，或烟草产品或其组合。可比较的产品也可称为对照。在一个实施方案中，可比较的产品是不包含其活性或表达已被抑制的二萜合成基因的产品。
[0082] 如本文所定义的术语“未修饰的植物”将是这样的烟草植物，其未根据本发明修饰以抑制二萜合成基因的活性或表达，并且其中所有其他相关特征是相同的(例如植物物种、生长条件、加工烟草的方法等)。在一个实施方案中，未修饰的植物是不包含其活性或表达已被抑制的二萜合成基因的植物。
[0083] 在一个进一步方面，从绿叶测量蔗糖酯含量。在一个进一步方面，从调制的叶，例如晾制的、烟道烤制的、明火烤制的或晒制的叶，测量蔗糖酯含量。在一个进一步方面，从烟道烤制的叶测量蔗糖酯含量。在一个进一步方面，从晾制的叶测量蔗糖酯含量。
[0084] 术语“蔗糖酯含量”在本文中用于意指归类为蔗糖酯的整组化合物的浓度和/或总含量。通常存在于烟草中的蔗糖酯可以由图1中所示的式代表。
[0085] 可以使用本领域中已知的用于测定蔗糖酯的浓度和/或总含量的任何方法。用于分析蔗糖酯(SE)的一种优选方法涉及通过皂化分析从蔗糖释放的酰基，随后通过GC-MS分析它们的丁酯。通过该方法的分析提供了蔗糖酯量的强定量。一种替代方法涉及通过测量每µg/cm2叶表面的蔗糖来分析蔗糖酯。可以在烟叶中评价蔗糖酯含量的测定。用于分析蔗糖酯含量的合适方法可以包括皂化、例如将胶样品在22℃下置于80%甲醇中过夜以皂化的步骤。然后可以将样品分配于己烷和水之间。为了分配样品，样品可以首先干燥，例如在N2下干燥，然后可以添加n-BuOH和H2SO4。在脉冲涡旋之前，可以将样品加热至110°，持续1小时。可以进行提取，并将干燥的样品溶解于CHCl3中以转移至另一个管中并在N2下干燥。可以将样品溶解于二甲基甲酰胺(DMF)和双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺中。样品可以衍生化，例如在70°下衍生化，然后冷却至室温。然后可以通过GC-MS分析衍生化的样品。可以通过保留时间和MS概况与标准品的比较来鉴定洗脱的化合物。
[0086] 在一个实施方案中，提供了用于生产通过具有增加的蔗糖酯含量的本发明的烟草植物可获得或获得的烟草植物，烟草植物繁殖材料，烟叶，收获的叶，切割收获的叶，加工的烟叶，切割并加工的烟叶，烟草产品或其组合的方法，所述方法包括修饰所述烟草以抑制二萜合成基因的活性或表达。增加的蔗糖酯含量可以通过比较烟草植物、烟草植物繁殖材料、烟叶、收获的叶、切割收获的叶、加工的烟叶、切割并加工的烟叶、烟草产品或其组合中的蔗糖酯含量与可比较的产品来测定。
[0087] 合适地，蔗糖酯含量可以在烟草植物、例如修饰的烟草植物中增加。合适地，蔗糖酯含量可以在烟叶(例如来自修饰的烟草植物的烟叶)中增加。合适地，蔗糖酯含量可以在收获的叶(例如来自修饰的烟草植物的收获的烟叶)中增加。合适地，蔗糖酯含量可以在切割收获的叶(例如来自修饰的烟草植物的切割收获的烟叶)中增加。合适地，蔗糖酯含量可以在加工的烟叶(例如来自修饰的烟草植物的加工的烟叶)中增加。合适地，蔗糖酯含量可以在切割并加工的烟叶(例如来自修饰的烟草植物的切割并加工的烟叶)中增加。合适地，蔗糖酯含量可以在调制的烟叶(例如来自修饰的烟草植物的烟叶)的毛状体渗出物中增加。合适地，蔗糖酯含量可以在绿色烟叶(例如来自修饰的烟草植物的烟叶)的提取物中增加。
合适地，蔗糖酯含量可以在烟草产品(例如由修饰的烟草植物或其部分产生的烟草产品)中增加。合适地，蔗糖酯含量可以在上述产品的任一种或其组合中增加。
合适地，蔗糖酯含量可以在烟草产品(例如由修饰的烟草植物或其部分产生的烟草产品)中增加。合适地，蔗糖酯含量可以在上述产品的任一种或其组合中增加。
[0088] 在一个实施方案中，蔗糖酯含量在调制的烟叶(例如来自修饰的烟草植物的烟叶)的毛状体渗出物中增加。
[0089] 在一个实施方案中，蔗糖酯含量在绿色烟叶(例如来自修饰的烟草植物的烟叶)的提取物中增加。
[0090] 在一个实施方案中，当与在相似生长条件下生长的未被修饰以抑制二萜合成基因的活性或表达的烟草植物或其部分的蔗糖酯含量相比时，烟草植物或其部分的蔗糖酯含量可以分别增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍。合适地，蔗糖酯含量可以增加约2倍至约10倍，优选约3倍至约10倍，合适地约3倍至约5倍。
[0091] 在一个实施方案中，与未修饰以抑制二萜合成基因的活性或表达的烟草植物或其部分相比，且更具体地与没有引入抑制的烟草植物的表达相比或相对于没有引入抑制的烟草植物的表达，所述方法或用途导致蔗糖酯含量增加。
[0092] 在一个实施方案中，与未被修饰以抑制二萜合成基因的活性或表达的分别烟草植物或其部分相比，烟草植物或其部分已被修饰以实现蔗糖酯含量的增加。
[0093] 如本文所用的术语“修饰”或“修饰的”意指已经改变或变化的烟草植物。本发明包括使用用于遗传修饰植物或非遗传修饰植物的技术修饰植物。此类方法是本领域中众所周知的，并且遗传修饰技术的实例包括转化、转基因、顺式基因(cisgenics)和基因编辑方法。非遗传修饰技术的实例包括快中子诱变、化学诱变和现代群体分析方法。在一个实施方案中，术语“修饰”是指选择具有抑制的二萜合成基因的天然变体，和将该性状或基因育种至具有商业上期望性状的第二植物中。
[0094] 如本文所用的术语“抑制”(例如抑制二萜合成基因的活性或表达)意味着与可比较的产品中的基因活性或基因表达相比，二萜合成基因的活性或表达降低或减少，或由二萜合成基因产生的蛋白的量或活性降低。
[0095] 在一个实施方案中，如本文所用的术语“抑制”(例如抑制二萜合成基因的活性或表达)意味着与可比较的产品中的基因活性或基因表达相比，二萜合成基因的活性或表达降低。
[0096] 二萜合成基因的“活性”或“功能”涉及其在二萜类的生物合成中发挥功能的能力。二萜合成基因的活性或功能可以通过测量二萜合成的直接产物，即通过测量二萜的水平来测定。可以通过用乙腈洗涤叶子或叶盘来测量渗出物组分。经由转子蒸发浓缩洗涤液，以得到油状残余物。然后可以将残余物衍生化以形成三甲基甲硅烷基(TMS)酯(如Severson等人
1985. J. Agric. Food Chem. 33, 870-875(其通过引用并入本文)所述)。然后可以通过与质谱联用的气相色谱(GC-MS)分离和分析TMS衍生物。可以通过保留时间和MS概况与标准品的比较来鉴定洗脱的化合物，如Wang等人 2001 (同上，其通过引用并入本文)中所述。在一个实施方案中，二萜合成基因的直接产物可以是顺式-冷杉醇、α-CBT-ol、β-CBT-ol、α-CBT-二醇、β-CBT-二醇或Labdenediol。
1985. J. Agric. Food Chem. 33, 870-875(其通过引用并入本文)所述)。然后可以通过与质谱联用的气相色谱(GC-MS)分离和分析TMS衍生物。可以通过保留时间和MS概况与标准品的比较来鉴定洗脱的化合物，如Wang等人 2001 (同上，其通过引用并入本文)中所述。在一个实施方案中，二萜合成基因的直接产物可以是顺式-冷杉醇、α-CBT-ol、β-CBT-ol、α-CBT-二醇、β-CBT-二醇或Labdenediol。
[0097] 特定二萜合成基因的活性可以通过测量基因的转录来测量。用于测量转录的方法是本领域中众所周知的，并且尤其包括northern印迹、RNA-Seq、原位杂交、DNA微阵列和RT-PCR。或者，可以通过测量基因产物(例如由所述基因编码的蛋白)的水平间接测量基因的活性。
[0098] 基因的活性或表达可以是指转录、翻译(即蛋白表达)或由二萜合成基因编码的蛋白的活性的水平。根据本发明的一个方面，可以通过抑制转录和/或翻译来抑制基因表达。在一个实施方案中，基因的活性或表达可以是指转录水平(即产生的mRNA的量)或翻译水平(即产生的蛋白的水平或量)。
[0099] 抑制、减少或阻止表达和/或功能本领域中已知用于抑制或减少或阻止二萜合成基因的表达或功能的任何方法可用于
本方法中。
本方法中。
[0100] 借助于实例，本方法可以包括：• 提供了编码包含如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11所示氨基酸序列或与其具有至少70%序列同一性的氨基酸序列的蛋白的核酸序列中的突变；
• 提供了有助于控制包含如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11所示氨基酸序列或与其具有至少70%序列同一性的氨基酸序列的蛋白的表达的调节区(例如启动子和增强子)中的突变；
• 提供了减少编码包含如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11所示氨基酸序列或与其具有至少70%序列同一性的氨基酸序列的蛋白的核酸序列的水平的反义RNA、siRNA或miRNA。
• 提供了有助于控制包含如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11所示氨基酸序列或与其具有至少70%序列同一性的氨基酸序列的蛋白的表达的调节区(例如启动子和增强子)中的突变；
• 提供了减少编码包含如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11所示氨基酸序列或与其具有至少70%序列同一性的氨基酸序列的蛋白的核酸序列的水平的反义RNA、siRNA或miRNA。
[0101] 以上方法的每一种导致减少或阻止包含如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11所示氨基酸序列或与其具有至少70%序列同一性的氨基酸序列的蛋白的表达或功能。
[0102] 如本文所用，术语“突变”包括天然遗传变体和工程化的变体。具体而言，术语“突变”是指与SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11所示的序列或与其具有至少70%序列同一性的氨基酸序列相比编码氨基酸序列的核苷酸序列或氨基酸序列中的变化，其减少了蛋白的表达或功能。
[0103] 在一个优选的实施方案中，存在于植物中的编码包含如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11所示的序列或与其具有至少70%序列同一性的序列的蛋白的核酸序列的每一拷贝如本文限定被突变(例如，植物中编码所述蛋白的基因的每个基因组拷贝被突变)。例如，普通烟草(N. tabacum)异源四倍体基因组中的基因的每个拷贝都可以被突变。
[0104] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的植物或植物细胞对于所述突变是纯合的。
[0105] 在一个实施方案中，优选地，根据本发明的植物或植物细胞只表达突变的核酸。换言之，在一些实施方案中，根据本发明的植物中不存在内源(或内源和功能性)蛋白。换言之，如果存在任何内源蛋白，则其优选处于无活性和/或截短形式。
[0106] 在一个实施方案中，本方法可以包括提供如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.8所示的序列或与其具有至少70%同一性的核酸序列中的突变。
[0107] 突变可以改变植物基因组，从而使得编码包含如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列或与其具有至少70%序列同一性的氨基酸序列的蛋白的核酸序列被完全或部分地缺失或者以其他方式变得无功能。
[0108] 突变可以中断编码包含如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列或与其具有至少70%序列同一性的氨基酸序列的蛋白的核酸序列。
[0109] 中断可能导致核酸序列不被转录和/或翻译。例如，可以通过缺失或另外修饰核酸序列的ATG起始密码子来中断核酸序列，从而减少或阻止蛋白的翻译。
[0110] 核酸序列可包含一个或多个减少或阻止蛋白表达或影响蛋白运输的核苷酸改变。例如，可通过在可读框中引入一个或多个提前终止密码子、移码、剪接突变体或非可接受的氨基酸取代来减少或阻止蛋白的表达。提前终止密码子是指将终止密码子引入可读框并且阻止整个氨基酸序列翻译的突变。提前终止密码子可以是TAG(“琥珀”)、TAA(“赭石”)或TGA(“蛋白石”或“棕土”)密码子。
[0111] 移码突变(也称为框架错误或阅读框移位)是由核酸序列中不能被3整除的多个核苷酸的插入缺失(插入或缺失)引起的突变。由于通过密码子的基因表达的三联体性质，插入或缺失可以改变阅读框，从而导致与原始翻译完全不同的翻译。移码突变通常会导致阅读突变后的密码子以编码不同的氨基酸。移码突变通常会导致引入提前的终止密码子。
[0112] 剪接突变体在将前体信使RNA加工成成熟信使RNA期间在剪接发生的特定位点中插入、缺失或改变多个核苷酸。剪接位点的缺失导致一个或多个内含子保留在成熟mRNA中并可能导致产生异常蛋白。
[0113] 非可接受的氨基酸取代是指导致蛋白中非同义氨基酸取代的突变，其导致蛋白功能减少或消除。本领域中已知的用于在核酸序列中提供突变的任何方法可用于本方法中。例如，可以使用同源重组，其中产生其中相关核酸序列被突变并用于转化植物或植物细胞的载体。然后可以选择表达突变序列的重组植物或植物细胞。
[0114] 在一个实施方案中，突变在包含如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.11所示的氨基酸序列或与其具有至少70%序列同一性的序列的蛋白中引入非可接受的氨基酸取代。
[0115] 在一个实施方案中，突变相对于如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11或与其具有至少70%序列同一性的序列所示的蛋白减少蛋白的活性。
[0116] 在一个实施方案中，突变相对于如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.11或与其具有至少70%序列同一性的序列所示的蛋白不改变蛋白的水平或表达但减少所述蛋白的活性。
[0117] 核酸序列可以全部或部分缺失。缺失可以是连续的，或者可以包括多个序列部分。缺失优选去除足够量的核苷酸序列，使得核酸序列不再编码功能性蛋白。例如，缺失可以去除核酸序列编码部分的至少50%、60%、70%、80%或90%。
[0118] 所述缺失可以去除二萜合成基因的一个或多个结构域。与可比较的未修饰植物的相应基因组相比时，缺失可能是全部的，在这种情况下，100%的核酸序列的编码部分不存在。
[0119] 在植物中缺失核酸序列的方法是本领域中已知的。例如，可以使用同源重组，其中产生其中相关核酸序列缺失并用于转化植物或植物细胞的载体。然后可以选择表达序列的新的部分的重组植物或植物细胞。
[0120] 在一些实施方案中，当与未根据本发明修饰的烟草植物中的二萜合成基因的活性或表达相比时，二萜合成基因的活性或表达可被抑制或降低至少约10%、20%、30%或40%，合适地至少约50%、60%、70%，更合适地至少约80%、90%、95%或100%。
[0121] 在一个优选实施方案中，所述二萜合成基因可以实质上没有活性或表达，这意味着植物可以包含小于约1%(合适地小于约0.1%)的活性或表达，优选地当与未经修饰以抑制二萜合成基因的活性或表达的植物相比时。
[0122] 如本文所用的二萜合成基因是指参与二萜的产生的任何基因。合适地，所述二萜合成基因是植物二萜合成基因。此类基因可以直接是产生双萜的生物合成途径的一部分，或者可以例如通过提供代谢前体间接地供入生物合成途径。二萜合成基因可参与专门(次级)代谢或一般(初级)代谢。在一个实施方案中，如本文所用的二萜合成基因是指参与专门(次级)代谢的基因。合适地，如本发明中所用的二萜合成基因可以选自由环化酶2基因(CYC2)、CBTol环化酶和萜烯合酶3-8组成的二萜合成基因的组，或与环化酶2基因(CYC2)、CBTol环化酶或萜烯合酶3-8中的任一种同源。合适地，如本发明中所用的二萜合成基因可以选自由环化酶2基因(CYC2)、CBTol环化酶和萜烯合酶3-8组成的二萜合成基因的组。
[0123] 合适地，如本发明中所用的二萜合成基因是环化酶2基因(CYC2)。合适地，如本发明中所用的二萜合成基因是CBTol环化酶。合适地，如本发明中所用的二萜合成基因是萜烯合酶3-8。
[0124] 在一个实施方案中，本文提及的二萜合成基因是环化酶2基因(CYC2)，并且可以由包含以下的多核苷酸序列编码：i) 本文中显示为SEQ ID No.8或SEQ ID No.9的多核苷酸序列，或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码二萜合成基因，或
iii) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含本文中显示为SEQ ID No.10的氨基酸序列，或
iv) 可以在高度严格条件下与上述i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸
序列，或
v) 与上述i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少70%(优选85%，更优选90%)同一性的多核苷酸序列，或
vi) 由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序
列。
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码二萜合成基因，或
iii) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含本文中显示为SEQ ID No.10的氨基酸序列，或
iv) 可以在高度严格条件下与上述i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸
序列，或
v) 与上述i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少70%(优选85%，更优选90%)同一性的多核苷酸序列，或
vi) 由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序
列。
[0125] 在一个实施方案中，本文提及的二萜合成基因是CBTol环化酶，并且可以由包含以下的多核苷酸序列编码：i) 本文中显示为SEQ ID No.1的多核苷酸序列，或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码二萜合成基因，或
iii) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含本文中显示为SEQ ID No.2的氨基酸序列，
或
iv) 可以在高度严格条件下与上述i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸
序列，或
v) 与上述i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少70%(优选85%，更优选90%)同一性的多核苷酸序列，或
vi) 由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序
列。
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码二萜合成基因，或
iii) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含本文中显示为SEQ ID No.2的氨基酸序列，
或
iv) 可以在高度严格条件下与上述i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸
序列，或
v) 与上述i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少70%(优选85%，更优选90%)同一性的多核苷酸序列，或
vi) 由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序
列。
[0126] 在一个实施方案中，本文提及的二萜合成基因是萜烯合酶3-8，并且可以由包含以下的多核苷酸序列编码：i) 本文中显示为SEQ ID No.3的多核苷酸序列，或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码二萜合成基因，或
iii) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含本文中显示为SEQ ID No.4的氨基酸序列，
或
iv) 可以在高度严格条件下与上述i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸
序列，或
v) 与上述i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少70%(优选85%，更优选90%)同一性的多核苷酸序列，或
vi) 由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序
列。
ii) i)中所示的多核苷酸序列的功能片段，所述功能片段编码二萜合成基因，或
iii) 编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含本文中显示为SEQ ID No.4的氨基酸序列，
或
iv) 可以在高度严格条件下与上述i)、ii)或iii)中教导的多核苷酸杂交的多核苷酸
序列，或
v) 与上述i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸具有至少70%(优选85%，更优选90%)同一性的多核苷酸序列，或
vi) 由于遗传密码的简并性而不同于i)、ii)或iii)中所示的多核苷酸的多核苷酸序
列。
[0127] 在一个实施方案中，根据本发明使用的二萜合成基因对烟草植物可以是内源的。
[0128] 本文提及“内源的”基因不仅指所讨论的基因在植物中以其天然形式发现(即不存在任何人为干预)，也指该相同基因(或基本上同源的核酸/基因)随后以分离的形式被(重新)引入植物中(转基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可能遇到转基因表达的实质性减少和/或内源基因的表达的实质性减少。分离的基因可以分离自生物体或可以是人工制备的，例如，通过化学合成。
[0129] 在另一个实施方案中，根据本发明使用的二萜合成基因对烟草植物可以是外源的。
[0130] 为了确定基因是否是根据本发明使用的二萜合成基因，技术人员可以确定该基因是否能够产生二萜。可以如上文所述测量二萜的含量。简言之，测量二萜含量的方法可涉及通过用乙腈洗涤叶子或叶盘来收集一片或多片叶子的渗出物。然后可以将来自洗涤物的残余物衍生化以形成三甲基甲硅烷基(TMS)酯(如Severson等人，1985同上(其通过引用并入本文)所述)。然后可以通过与质谱联用的气相色谱(GC-MS)分离和分析TMS衍生物。可以通过其保留时间和MS概况与标准品的比较来鉴定洗脱的化合物。
[0131] 本发明还提供了二萜合成基因用于增加植物的蔗糖酯含量的用途。
[0132] 用于降低基因或基因产物的表达的方法是本领域中充分记载的。
[0133] 在一个实施方案中，可以通过本领域中已知的任何方法抑制二萜合成基因的活性或表达。合适地，可以通过本领域中已知的任何方法抑制选自由环化酶2基因(CYC2)、CBTol环化酶和萜烯合酶3-8组成的二萜合成基因的组的二萜合成基因的活性或表达。合适地，可以通过本领域中已知的任何方法抑制环化酶2基因(CYC2)的活性或表达。合适地，可以通过本领域中已知的任何方法抑制CBTol环化酶的活性或表达。合适地，可以通过本领域中已知的任何方法抑制萜烯合酶3-8的活性或表达。
[0134] 用于抑制二萜合成基因的活性或表达的方法可以包括RNA干扰、反义或有义共抑制(参见Wang和Wagner 2003, Planta Volume 216, Issue 4, pp 686–691，其通过引用并入本文)、基因编辑或定向诱变。在一个实施方案中，可以通过使用基因编辑来实现二萜合成基因的活性或表达的抑制。可以使用本领域中已知的任何方法实施基因编辑。本文呈现了几个非限制性实例。
[0135] 在一个实施方案中，可以使用包括CRISPR(包括使用CRISPR-Cas9系统)的基因编辑方法实现二萜合成基因的活性或表达的抑制。CRISPR/Cas9基因组编辑工具是商业可得的，诸如来自Clontech (Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye, France)的“Guide-it”。
[0136] 另一种基因编辑方法包括使用试剂盒商业可得(例如来自Addgene, 1Kendall Sq. Ste. B7102, Cambridge, MA 02139, USA)的TALEN(转录激活因子样效应因子核酸酶)技术。在一个实施方案中，可以使用TALEN来实现二萜合成基因的活性或表达的抑制。
[0137] 在另一个实施方案中，该方法可包括使用锌指核酸酶，诸如可得自Sigma-Aldrich的CompoZr®锌指核酸酶技术。另一个实施方案可包括使用Silva等人 Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1):11–27(其教导通过引用并入本文)中描述的大范围核酸酶(或另外的方法)。
[0138] 在一个实施方案中，用于抑制二萜合成基因的活性或表达的方法可以是定向诱变。可以使用任何靶向诱变的方法。在一个实施方案中，所述方法可以是寡核苷酸定向诱变(ODM)，诸如可得自Keygene (Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen, The Netherlands)的KeyBase®。在另一个实施方案中，可以通过使用构建体或载体(例如质粒)来实现二萜合成基因的活性或表达的抑制。
[0139] 本发明的遗传构建体可以呈表达盒的形式，其可以适合于抑制宿主细胞中的二萜合成基因的活性或表达。可以将遗传构建体引入宿主细胞中，而不将其引入载体中。例如，可以是核酸分子的遗传构建体可以并入脂质体或病毒颗粒内。或者，可以通过合适的方式(例如，直接内吞摄取)将纯化的核酸分子(例如无组蛋白DNA或裸DNA)直接插入宿主细胞中。可以通过转染、感染、显微注射、细胞融合、原生质体融合或弹道轰击将遗传构建体直接引入宿主主体(例如植物)的细胞中。或者，可以使用粒子枪将本发明的遗传构建体直接引入宿主细胞中。
[0140] 或者，所述遗传构建体可包含重组载体或携带于重组载体内，用于在合适的宿主细胞中表达。重组载体可以是质粒、粘粒或噬菌体。此类重组载体非常可用于用本发明的遗传构建体转化宿主细胞，以及用于复制其中的表达盒。技术人员将理解，本发明的遗传构建体可以与许多类型的骨架载体组合用于表达目的。骨架载体可以是双元载体，例如可以在大肠杆菌和根癌土壤杆菌两者中复制的载体。例如，合适的载体可以是pBIN质粒，诸如pBIN19 (Bevan M., 1984, Nucleic Acids Research 12:8711-21)。
[0141] 除了抑制二萜合成基因的活性或表达的序列以外，重组载体可以包括多种其他功能元件。例如，载体可以包含启动子。另外，可以设计重组载体，使得其在宿主细胞的胞质溶胶中自主复制。在该情况下，重组载体中可能需要诱导或调节DNA复制的元件。或者，可以设计重组载体，使得其整合至宿主细胞的基因组中。在该情况下，设想有利于靶向整合(例如通过同源重组)的DNA序列。
[0142] 重组载体还可以包含编码基因的DNA，所述基因可以在克隆过程中用作选择标记，即使得能够选择已经转染或转化的细胞，并且使得能够选择携带并入异源DNA的载体的细胞。载体还可以包含参与调节编码序列的表达或用于将表达的多肽靶向至宿主细胞的特定部分(例如，至毛状体或腺状毛状体)的DNA。因此，载体可以包含至少一种选自以下的额外元件： 选择标记基因(例如抗生素抗性基因)；多肽终止信号；和蛋白靶向序列(例如转运肽)。
[0143] 在一个实施方案中，所述方法或用途可以包括使用RNAi抑制二萜合成基因的活性或表达。在一个实施方案中，RNAi方法使用miRNA，例如，人工微小-RNA(amiRNA)。在一个实施方案中，RNAi方法使用siRNA。在一个实施方案中，RNAi方法使用dsRNA。
[0144] 在一个实施方案中，所述方法或用途可以包括使用干扰寡核苷酸抑制二萜合成基因的活性或表达。在一个实施方案中，寡核苷酸是基于RNA的。在一个实施方案中，寡核苷酸是RNA干扰(RNAi)，例如dsRNAi。在一个实施方案中，所述方法可以包括用抑制二萜合成基因的活性或表达的RNAi分子(例如dsRNAi)转化烟草植物的细胞。
[0145] 在一个实施方案中，提供了烟草植物和烟草植物繁殖材料，其中使用RNAi(例如dsRNAi)抑制二萜合成基因的表达。所述方法可包括从转化细胞再生烟草植物。
[0146] RNAi(例如dsRNAi)分子能够在转化的植物中使二萜合成基因的活性或表达与未用RNAi转化的野生型植物中多肽的浓度相比降低至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多或100%。在一个实施方案中，RNAi分子能够在转化的植物中使二萜合成基因的活性或表达降低30%至100%，优选40%至100%，更优选90%至100%。
[0147] 可以通过本领域中已知的任何方法抑制二萜合成基因的活性或表达。合适地，可以通过本领域中已知的任何方法抑制选自由环化酶2基因(CYC2)、CBTol环化酶和萜烯合酶3-8组成的二萜合成基因的组的二萜合成基因的活性或表达。
[0148] 合适地，所述方法可以包括用ddRNAi DNA构建体转化烟草植物的细胞，所述ddRNAi DNA构建体编码形成发夹结构的RNA，其通过细胞中的内源途径加工成小的或短的干扰RNA(siRNA)。
[0149] 合适地，可以通过本领域中已知的任何方法抑制环化酶2基因(CYC2)的活性或表达。在一个实施方案中，环化酶2基因(CYC2)的序列如SEQ ID No.8中所示。在一个实施方案中，环化酶2基因(CYC2)的氨基酸序列如SEQ ID No.10中所示。环化酶2基因(CYC2)的表达可以通过任何方法抑制，所述方法包括包括CRISPR的基因编辑方法，包括使用CRISPR-Cas9系统，RNA干扰(RNAi)，反义或有义共抑制，基因编辑或定向诱变。在一个实施方案中，可以通过RNAi抑制环化酶2基因(CYC2)的活性或表达。可以通过RNAi使用miRNA、siRNA、dsRNA或shRNA抑制环化酶2基因(CYC2)的活性或表达。
[0150] 在一个实施方案中，抑制环化酶2基因(CYC2)的活性或表达的方法靶向环化酶2基因(CYC2)的外显子1的至少部分、外显子2的至少部分和外显子3的至少部分。在一个优选实施方案中，所述方法靶向环化酶2基因(CYC2)的外显子1的至少部分、外显子2的至少部分和外显子3的至少部分。在一个实施方案中，所述方法靶向环化酶2基因(CYC2)的外显子1的至少部分、外显子2的至少部分和第三外显子的前115个核苷酸。在一个实施方案中，所述方法靶向环化酶2基因(CYC2)的核苷酸1-25、核苷酸26-271(外显子1)、核苷酸1253-1529(外显子2)和第3外显子的前115个核苷酸(核苷酸2366-2480)，其中编号通过与SEQ ID No.8比对来确定。
[0151] 在任何前述实施方案中，可以使用包括CRISPR(包括使用CRISPR-Cas9系统)的基因编辑方法抑制环化酶2基因(CYC2)的活性或表达。在任何前述实施方案中，可以使用RNAi方法抑制环化酶2基因(CYC2)的活性或表达。
[0152] 合适地，可以通过本领域中已知的任何方法抑制CBTol环化酶基因的活性或表达。在一个实施方案中，CBTol环化酶基因的序列如SEQ ID No.1中所示。在一个实施方案中，CBTol环化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2中所示。CBTol环化酶基因的表达可以通过任何方法抑制，所述方法包括包括CRISPR的基因编辑方法，包括使用CRISPR-Cas9系统，RNA干扰(RNAi)，反义或有义共抑制，基因编辑或定向诱变。在一个实施方案中，可以通过RNAi抑制CBTol环化酶基因的活性或表达。可以通过RNAi使用miRNA、siRNA、dsRNA或shRNA抑制CBTol环化酶基因的活性或表达。
[0153] 在另一个实施方案中，抑制CBTol环化酶基因的活性或表达的方法靶向CBTol环化酶的外显子4的至少部分、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6、内含子6和外显子7的至少部分。在一个优选实施方案中，所述方法靶向CBTol环化酶基因的外显子4的至少部分、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6、内含子6和外显子7的至少部分。在一个实施方案中，所述方法靶向CBTol环化酶基因的核苷酸5’-2854-4175-3’，其中编号通过与SEQ ID No.1比对来确定。
[0154] 在任何前述实施方案中，可以使用包括CRISPR(包括使用CRISPR-Cas9系统)的基因编辑方法抑制CBTol环化酶基因的活性或表达。在任何前述实施方案中，可以通过使用RNAi方法抑制CBTol环化酶基因的活性或表达。
[0155] 合适地，可以通过本领域中已知的任何方法抑制萜烯合酶3-8基因的活性或表达。在一个实施方案中，萜烯合酶3-8基因的序列如SEQ ID No.3中所示。在一个实施方案中，萜烯合酶3-8的氨基酸序列如SEQ ID No.4中所示。萜烯合酶3-8基因的表达可以通过任何方法抑制，所述方法包括包括CRISPR的基因编辑方法，包括使用CRISPR-Cas9系统，RNA干扰(RNAi)，反义或有义共抑制，基因编辑或定向诱变。在一个实施方案中，可以通过RNAi抑制萜烯合酶3-8基因的活性或表达。可以通过RNAi使用miRNA、siRNA、dsRNA或shRNA抑制萜烯合酶3-8基因的活性或表达。在一个实施方案中，抑制萜烯合酶3-8基因的活性或表达的方法至少靶向萜烯合酶3-8基因的核苷酸1497至1517，其中编号通过与SEQ ID No.3比对来确定。在一个实施方案中，抑制萜烯合酶3-8基因的活性或表达的方法至少靶向萜烯合酶3-8基因的核苷酸884至904，其中编号通过与SEQ ID No.3比对来确定。在一个优选实施方案中，RNAi方法靶向萜烯合酶3-8基因的核苷酸884至904，其中编号通过与SEQ ID No.3比对来确定。
[0156] 在任何前述实施方案中，可以使用包括CRISPR(包括使用CRISPR-Cas9系统)的基因编辑方法抑制萜烯合酶3-8基因的活性或表达。在任何前述实施方案中，可以使用RNAi方法抑制萜烯合酶3-8基因的活性或表达。
[0157] 在一个实施方案中，所述方法可以包括用包装在递送载体中的DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)构建体转化烟草植物的细胞，所述构建体包含编码dsRNA的核苷酸序列或编码amiRNA的核苷酸序列。
[0158] 在一个实施方案中，所述RNAi分子是由ddRNAi DNA构建体编码的dsRNA。
[0159] 在一个实施方案中，所述RNAi分子是由ddRNAi DNA构建体编码的amiRNA。在一个实施方案中，本发明提供了包含ddRNAi DNA序列的构建体，所述ddRNAi DNA序列被设计为编码抑制二萜合成基因的表达的dsRNA。
[0160] 在另一个实施方案中，本发明提供了包含ddRNAi DNA序列的构建体，所述ddRNAi DNA序列被设计为编码抑制二萜合成基因的表达的amiRNA。
[0161] 所述构建体可以包含在载体中。合适地，所述载体可以是质粒。
[0162] 在一个实施方案中，用于本发明中的载体是基于土壤杆菌的质粒pKYLX71:35S2。该质粒基于An等人 (An, G.等人 1985 EMBO J. 4, 277-284，其通过引用并入本文)描述的pGA471质粒。在另一个实施方案中，用于本发明中的载体是pCAMBIA2300。pCAMBIA载体骨架衍生自pPZP载体。
[0163] 如本文所用的术语“DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)”意指用于活化细胞的内源RNA干扰(RNAi)途径的DNA构建体。合适地，这些构建体被设计为表达自身互补的RNA，例如，双链RNA (dsRNA)或单链RNA (ssRNA)或短发夹RNA (shRNA)或微小RNA(例如人工微小RNA-amiRNA)，其一旦加工就导致一种或多种靶基因的沉默。有利地，ddRNAi的使用意味着连续产生表达的RNA(例如dsRNA或amiRNA)，且由此能够提供靶向基因的长期沉默。相反，直接施用于细胞的小干扰RNA(siRNA)(例如，不从根据本发明的ddRNAi DNA构建体连续表达)在细胞内转化并且仅瞬时沉默基因。
[0164] 在一个实施方案中，所述方法或用途可以包括使用从ddRNAi DNA构建体表达的dsRNA抑制二萜合成基因的活性或表达。
[0165] 在另一个实施方案中，所述方法或用途可以包括使用从ddRNAi DNA构建体表达的amiRNA抑制二萜合成基因的活性或表达。
[0166] 因此，在一个实施方案中，提供了烟草植物和烟草植物繁殖材料、烟叶、切割收获的叶、加工的烟叶或切割并加工的烟叶，其中使用ddRNAi DNA构建体抑制二萜合成基因的表达。合适地，ddRNAi DNA构建体可以并入植物的基因组DNA中。烟草植物、烟草植物繁殖材料、烟叶、切割收获的叶、加工的烟叶或切割并加工的烟叶可以包含ddRNAi DNA构建体，其表达抑制二萜合成基因的活性或表达的dsRNA或amiRNA。与不包含ddRNAi DNA构建体的烟草植物、烟草植物繁殖材料、烟叶、切割收获的叶、加工的烟叶或切割并加工的烟叶相比，包含表达抑制二萜合成基因的活性或表达的dsRNA或amiRNA的ddRNAi DNA构建体的烟草植物、烟草植物繁殖材料、烟叶、切割收获的叶、加工的烟叶或切割并加工的烟叶可以具有增加的蔗糖酯含量。
[0167] ddRNAi DNA构建体可以包含二萜合成基因的全部或部分。所述构建体可以包含二萜合成基因的外显子和/或内含子。所述ddRNAi DNA构建体可以包含部分基因序列，其在转录时产生发夹RNA结构。由ddRNAi DNA构建体编码的RNA可以具有内含子-发夹或GUS-发夹结构，或者可以是单一全长RNA。如本文所述，本发明人已证明抑制二萜合成基因的活性或表达的RNAi分子用于增加烟草植物中的蔗糖酯含量的令人惊讶的效力。
[0168] 如本文所用的术语“外显子”意指在通过RNA剪接除去内含子之后编码由基因产生的最终成熟RNA的基因的一部分。
[0169] 如本文所用的术语“内含子”意指基因内的核苷酸序列，其在最终RNA产物的成熟期间通过RNA剪接除去。
[0170] 如本文所用的术语“…的至少部分”或“部分序列”意指包含至少5、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、400或至少
500个连续核苷酸的序列。例如，ddRNAi DNA构建体可以包含外显子的至少部分，其中构建体包含来自所述外显子的100个连续核苷酸。
500个连续核苷酸的序列。例如，ddRNAi DNA构建体可以包含外显子的至少部分，其中构建体包含来自所述外显子的100个连续核苷酸。
[0171] 如本文所用的术语“对应于…的mRNA”意味着RNA具有与DNA相同的序列，即mRNA和DNA序列中的核苷酸序列是相同的，除了在RNA中，胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U)替换，并且脱氧核糖被核糖替换。
[0172] ddRNAi DNA构建体可用于抑制环化酶2基因(CYC2)的表达。在一个实施方案中，环化酶2基因(CYC2)的序列如SEQ ID No.8中所示。在一个实施方案中，由环化酶2基因(CYC2)编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.10中所示。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含环化酶2基因(CYC2)的全部或部分。
[0173] 在一个实施方案中，所述ddRNAi DNA构建体可以包含环化酶2基因(CYC2)的外显子1的至少部分、外显子2的至少部分和外显子3的至少部分。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含环化酶2基因(CYC2)的外显子1的至少部分、外显子2的至少部分和第3外显子的前115个核苷酸。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含环化酶2基因(CYC2)的核苷酸1-25、核苷酸26-271(外显子1)、核苷酸1253-1529(外显子2)和第3外显子的前115个核苷酸(核苷酸
2366-2480)，其中编号通过与SEQ ID No.8比对来确定。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含SEQ ID No.5中所示的序列。
2366-2480)，其中编号通过与SEQ ID No.8比对来确定。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含SEQ ID No.5中所示的序列。
[0174] ddRNAi DNA构建体可用于抑制CBTol环化酶基因的表达。在一个实施方案中，CBTol环化酶基因的序列如SEQ ID No.1中所示。在一个实施方案中，CBTol环化酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2中所示。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含CBTol环化酶基因的全部或部分。
[0175] 在另一个实施方案中，ddRNAi DNA构建体可以包含CBTol环化酶基因的外显子4的至少部分、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6、内含子6和外显子7的至少部分。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含CBTol环化酶基因的核苷酸5’-2854-4175-3’，其中编号通过与SEQ ID No.1比对来确定。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含SEQ ID No.6中所示的序列。
[0176] ddRNAi DNA构建体可用于抑制萜烯合酶3-8基因的表达。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含萜烯合酶3-8基因全部或部分。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含萜烯合酶3-8基因的至少核苷酸1497至1517，其中编号通过与SEQ ID No.3比对来确定。在一个实施方案中，萜烯合酶3-8基因的序列如SEQ ID No.3中所示。在一个实施方案中，萜烯合酶3-8的氨基酸序列如SEQ ID No.4中所示。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含SEQ ID No.7中所示的序列。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含萜烯合酶3-8基因的至少核苷酸884至904，其中编号通过与SEQ ID No.3比对来确定。合适地，ddRNAi DNA构建体可以包含SEQ ID No.11中所示的序列。
[0177] 在一个实施方案中，编码dsRNA的ddRNAi DNA构建体的序列可以包含SEQ ID No.7中所示的序列。从包含SEQ ID No.7的ddRNAi DNA构建体表达的dsRNA可用于抑制二萜合成基因的活性或表达或下调二萜合成基因，其中所述二萜合成基因是环化酶2基因(CYC2)。
[0178] 在另一个实施方案中，编码dsRNA的ddRNAi DNA构建体的序列可以包含如SEQ ID No.8中所示的序列。从包含SEQ ID No.8的ddRNAi DNA构建体表达的dsRNA可用于抑制二萜合成基因的活性或表达或下调二萜合成基因，其中所述二萜合成基因是CBTol环化酶基因。
[0179] 在一个实施方案中，编码amiRNA的ddRNAi DNA构建体的序列可以包含如SEQ ID No.9中所示的序列。从包含SEQ ID No.9的ddRNAi DNA构建体表达的amiRNA可用于抑制二萜合成基因的活性或表达或下调二萜合成基因，其中所述二萜合成基因是萜烯合酶3-8基因。
[0180] 如此处所用的术语“GW1”或“GW-1”可以意指包含环化酶2基因(CYC2)的外显子1的至少部分、外显子2的至少部分和第3外显子的前115个核苷酸的ddRNAi DNA构建体。
[0181] 如此处所用的术语“GW2”或“GW-2”可以意指包含萜烯合酶3-8基因的至少核苷酸1497至1517的ddRNAi DNA构建体，其中编号通过与SEQ ID No.3比对来确定。
[0182] 如此处所用的术语“GW3”或“GW-3”可以意指包含CBTol环化酶基因的外显子4的至少部分、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6、内含子6和外显子7的至少部分的ddRNAi DNA构建体。
[0183] 如此处所用的术语“GW5”或“GW-5”可以意指包含萜烯合酶3-8基因的至少核苷酸884至904的ddRNAi DNA构建体，其中编号通过与SEQ ID No.3比对来确定。
[0184] 因此，本发明的ddRNAi DNA构建体可以包含编码dsRNA的核苷酸序列，其中所述dsRNA编码序列是基本上如SEQ ID No.5或8中所示的核苷酸序列或其功能变体或片段。
[0185] 合适地，本发明的ddRNAi DNA构建体可以包含编码dsRNA的核苷酸序列，其中所述dsRNA编码序列是基本上如SEQ ID No.5中所示的核苷酸序列或其功能变体或片段。
[0186] 合适地，本发明的ddRNAi DNA构建体可以包含编码dsRNA的核苷酸序列，其中dsRNA编码序列是基本上如SEQ ID No.6中所示的核苷酸序列或其功能变体或片段。
[0187] 在另一个实施方案中，本发明的ddRNAi DNA构建体可以包含编码amiRNA的核苷酸序列，其中amiRNA编码序列是基本上如SEQ ID No.9中所示的核苷酸序列。
[0188] 应理解，对于技术人员相对简单的是，修饰编码dsRNA(例如SEQ ID No.7)或amiRNA(例如SEQ ID No.9)的序列以产生ddRNAi DNA构建体的变体或片段，其仍将发挥功能以抑制或下调二萜合成基因的表达，由此增加烟草植物的蔗糖含量。通过使用标准实验室技术来确定由萜烯合成基因编码的mRNA的水平是否已经降低至低于在相同条件下生长的相应野生型植物细胞中的相同二萜合成基因mRNA的水平，可以容易地鉴定ddRNAi DNA构建体的功能变体和片段。这种技术的一个实例是聚合酶链式反应(PCR)。熟练技术人员将理解，通过使用标准技术，诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光激活细胞分选、Western印迹或染色质免疫沉淀(ChIP)，可以在野生型和转基因植物中直接测量由二萜合成基因编码的多肽的浓度。
[0189] 在另一个实施方案中，烟草细胞、烟草植物或其部分和/或植物繁殖材料可以包含抑制二萜合成基因的活性或表达的构建体。在一个优选实施方案中，所述构建体是ddRNAi DNA构建体，更优选地，所述ddRNAi DNA构建体包含抑制环化酶2基因(CYC2)、CBTol环化酶基因或萜烯合酶3-8基因的活性或表达的RNAi模块。
[0190] 在一个进一步实施方案中，所述烟草细胞、烟草植物或其部分和/或植物繁殖材料可以包含：i) 本文中显示为SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7、SEQ ID No.11的多核苷
酸序列，或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的片段，该功能片段抑制二萜合成基因的活性或表达，
或
iii) 与上述i)或ii)中所示的多核苷酸具有至少70%(优选85%，更优选90%)同一性的
多核苷酸序列。
酸序列，或
ii) i)中所示的多核苷酸序列的片段，该功能片段抑制二萜合成基因的活性或表达，
或
iii) 与上述i)或ii)中所示的多核苷酸具有至少70%(优选85%，更优选90%)同一性的
多核苷酸序列。
[0191] 在一个实施方案中，所述多核苷酸序列可以与SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.11具有至少80%同一性。合适地，所述多核苷酸序列可以与SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.11具有至少90%同一性。合适地，所述多核苷酸序列可以与SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或SEQ ID No.11具有至少95%同一性(更合适地至少99%同一性)。
[0192] 在一个有利的实施方案中，二萜合成基因的活性或表达的抑制可以导致烟草植物的蔗糖酯含量增加，且同时导致烟草植物的一种或多种其他风味组分的改变。二萜合成基因的活性或表达的抑制可以导致蔗糖酯含量的增加和二萜含量的改变。蔗糖酯含量的增加可以伴随一种或多种选自以下的风味化合物含量的增加： 顺式-冷杉醇、labdenediol和CBT-ol。
[0193] 蔗糖酯含量的增加可以伴随顺式-冷杉醇含量的增加和labdenediol含量的增加。在另一个实施方案中，蔗糖酯含量的增加可以伴随labdenediol含量的增加。蔗糖酯含量的增加可以伴随CBT-ol和高顺式-冷杉醇含量的增加。
[0194] 在一个实施方案中，本发明的方法产生白肋或烟道烤制的叶，其具有土耳其样渗出物化学物质。优选地，与不具有抑制的二萜合成基因的活性或表达的可比较的白肋或烟道烤制的植物相比，所述白肋或烟道烤制的叶具有与土耳其样烟草更类似的化学物质。
[0195] 在一个实施方案中，根据本发明的烟草植物或其部分是根据本发明修饰的白肋或烟道烤制的植物。在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明修饰以具有土耳其样渗出物化学物质的白肋或烟道烤制的植物。在一个实施方案中，根据本发明的烟草植物(例如修饰的烟草植物)不是东方或土耳其烟草植物。
[0196] 在一个实施方案中，所述烟草植物或其部分是调制的。在一个实施方案中，所述烟草植物或其部分是调制的，例如晾制的、烟道烤制的、明火烤制的或晒制的。在一个进一步方面，所述烟草植物或其部分是烟道烤制的。在一个进一步方面，所述烟草植物或其部分是晾制的。
[0197] 烟道烤制是本领域中众所周知的，并且是指用烟道烤制烟草的方法，所述烟道由火箱或燃气系统供给。该过程热烤制烟草而不使其暴露于烟雾中，在烤制过程中缓慢升高温度。该方法产生的烟草糖含量高且具有中等至高水平的尼古丁。史密斯烟草谷仓是传统的烟道烤制的烟草谷仓的一个实例。
[0198] 晾制的烟草包括白肋、马里兰和深色烟草。常见的因素是调制主要在没有人为的热量和湿度下进行。白肋烟草的颜色为浅棕色至深棕色，油含量高，且糖含量低。白肋烟草在谷仓中晾制。主要的白肋烟生长国家是阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美国。白肋烟草植物包括，例如，Clay 402、Clay 403、Clay 502、Ky 14、Ky 907、Ky 910、Ky 8959、NC 2、NC 3、NC 4、NC 5、NC 2000、TN 86、TN 90、TN 97、R 610、R 630、R711、R 712、NCBH 129、Bu 21xKy 10、HB04P、Ky 14xL 8、Kt 200、Newton 98、Pedigo 561、Pf561和Va 509。
[0199] 马里兰烟草极端蓬松，具有良好的燃烧特性、低尼古丁和中性香气。主要马里兰烟生长国家包括美国和意大利。深色晾制的烟草与其他类型的主要区别在于其发酵过程，其给予深色晾制的烟草中等棕色至深棕色和独特的香气。它们的叶子具有低糖量，但具有高尼古丁含量。深色晾制的烟草主要用于生产嚼用烟草和鼻烟。深色明火烤制的烟草的主要生长区域是美国田纳西州、肯塔基州和弗吉尼亚州。
[0200] 在一个优选实施方案中，本发明的烟草含有至少与土耳其样烟草一样多的3-甲基戊酸乙酰化蔗糖酯。
[0201] “土耳其样渗出物化学物质”意味着由本发明的植物产生的渗出物具有与土耳其烟草中观察到的类似的渗出物化学物质。土耳其(或东方)烟草、例如普通烟草Samsun亚种的化学物质已经由R. Severson等人1985(同上，其通过引用并入本文)表征。已知土耳其烟草含有低水平的CBT-二醇、高水平的CBT的氧化产物和高水平的含有3-甲基戊酸的蔗糖酯。因此，本发明有利地提供了具有土耳其烟草样毛状体渗出物的更高生物质烟草植物。
[0202] 在一个实施方案中，提供了烟草植物，其包含增加的3-甲基戊酸蔗糖酯。与未根据本发明修饰的烟草植物(即，其中未引入二萜合成基因的抑制的植物)相比，所述烟草植物可以包含增加的3-甲基戊酸蔗糖酯。优选地，与未经修饰以抑制二萜合成基因的活性或表达的对照烟草植物相比，本发明的烟草株系含有至少两倍的3-甲基戊酸蔗糖酯。在一个进一步方面，本发明的烟草植物含有至少与土耳其型烟草一样多的3-甲基戊酸酯。
[0203] 有利地，本发明的烟草植物在田间具有正常生长。在一个实施方案中，CBTol合成酶敲低植物像土耳其烟草一样有利地具有低CBT二醇、高顺式-冷杉醇、高含3-甲基戊酸的蔗糖酯，但与土耳其类型不同，本发明的CBTol合酶敲低植物可以产生比土耳其烟草植物更高的生物质。对于土耳其烟草类型，产量通常在600至1100 磅/英亩的范围内。
[0204] 如本文所用的术语“功能片段”是指能够以与多核苷酸相同的方式发挥功能的多核苷酸的一部分。例如，如果多核苷酸是二萜合成基因，则功能片段必须能够作为二萜合成基因发挥功能，例如所述功能片段保留二萜合成基因的活性。所述功能片段可以具有等于或大于全长多核苷酸的活性水平的活性水平。如果多核苷酸编码dsRNA或amiRNA，则功能片段必须能够抑制二萜合成基因的活性或表达。
[0205] 在一个实施方案中，功能片段可以是如本文所讨论的二萜合成基因的一部分，其包含至少50、75、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个连续核苷酸。在一些实施方案中，所述功能片段可以包含本文所讨论的二萜合成基因的至少150个核苷酸。在其中所述功能片段是ddRNAi DNA构建体的功能片段的一个实施方案中，所述功能片段可以是如本文所讨论的RNAi的一部分，其包含至少50、75、100、150、200或250个连续核苷酸。
[0206] 如本文所用的术语“遗传密码的简并性”是指编码多肽序列的密码子的冗余，其表现为指定氨基酸的三密码子组合的多样性。例如，在编码具有异亮氨酸氨基酸的多肽的mRNA分子中，异亮氨酸可以由AUU、AUC或AUA编码。这意味着编码RNA的DNA分子可以具有多种序列，但所得多肽将具有相同的序列。换言之，多态的核苷酸序列可以编码相同的多肽产物。这意味着一个核酸序列可以包含与第二个序列具有非常低序列同一性的序列、但编码相同的多肽序列。
[0207] 本发明的方法和用途包括抑制至少一种二萜合成基因。可以通过本领域技术人员已知的任何方式实现抑制。
[0208] 在本发明的一些实施方案中，可以提供启动子。用于本发明中的启动子可以选自以下中的一种或多种：组成型启动子、衰老特异性启动子、组织特异性启动子、发育调节型启动子和诱导型启动子。在一个实施方案中，启动子可以是组成型启动子。
[0209] 组成型启动子在植物发育过程中持续地在整个植物的各个部分中指导基因的表达，尽管所述基因在所有细胞类型中可能不以相同水平表达。已知的组成型启动子的实例包括与以下相关的那些：花椰菜花叶病毒35S转录物(Odell JT, Nagy F, Chua NH.(1985).Identification of DNA sequences required for activity of the
cauliflower mosaic virus 35S promoter.Nature.313 810-2)和稻肌动蛋白1基因
(Zhang W, McElroy D, Wu R. (1991)，其通过引用并入本文。Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. (Plant Cell 3 1155-65，其通过引用并入本文)和玉米泛素1基因(Cornejo MJ, Luth D, Blankenship KM, Anderson OD,
Blechl AE.(1993).Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic
rice.Plant Molec.Biol.23 567-81(其通过引用并入本文))。组成型启动子诸如香石竹蚀环病毒(CERV)启动子(Hull R, Sadler J, LongstaffM (1986，其通过引用并入本文) The sequence of carnation etched ring virus DNA: comparison with cauliflower
mosaic virus and retroviruses.EMBO Journal, 5(2):3083-3090，其通过引用并入本文)。
cauliflower mosaic virus 35S promoter.Nature.313 810-2)和稻肌动蛋白1基因
(Zhang W, McElroy D, Wu R. (1991)，其通过引用并入本文。Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. (Plant Cell 3 1155-65，其通过引用并入本文)和玉米泛素1基因(Cornejo MJ, Luth D, Blankenship KM, Anderson OD,
Blechl AE.(1993).Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic
rice.Plant Molec.Biol.23 567-81(其通过引用并入本文))。组成型启动子诸如香石竹蚀环病毒(CERV)启动子(Hull R, Sadler J, LongstaffM (1986，其通过引用并入本文) The sequence of carnation etched ring virus DNA: comparison with cauliflower
mosaic virus and retroviruses.EMBO Journal, 5(2):3083-3090，其通过引用并入本文)。
[0210] 组成型启动子可以选自：香石竹蚀环病毒(CERV)启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV 35S启动子)、来自稻肌动蛋白1基因或玉米泛素1基因的启动子。合适地，启动子是CERV启动子。
[0211] 或者，在一个实施方案中，启动子可以不是花椰菜花叶病毒(CaMV 35S启动子)。在一个实施方案中，启动子可以是衰老特异性启动子。“衰老特异性启动子”(SAG)可以是与控制衰老相关基因的表达相关的启动子。因此，启动子可以将与其可操作连接的编码序列(即基因)的表达基本上排他地限制于正衰老的组织中。因此，衰老特异性启动子可以是能够以发育调节方式在植物组织中偏好地促进基因表达、使得3’蛋白编码区域的表达基本上仅在植物组织经受衰老时发生的启动子。应理解，衰老倾向于发生在植物的较老部分，诸如较老的叶子，而不是在植物的较年轻部分，诸如种子。
[0212] 已知表达许多衰老相关基因的植物的一个实例是拟南芥。因此，可以从拟南芥的衰老相关基因分离启动子。通过引用并入本文的Gepstein等人(The Plant Journal, 2003, 36, 629-642)使用拟南芥作为模型进行SAG和其启动子的详细研究。遗传构建体可以包含来自该文献中公开的任何SAG的启动子。例如，合适的启动子可以选自SAG12、SAG13、SAG101、SAG21和SAG18或其功能变体或功能片段。
[0213] 在一个实施方案中，启动子可以是SAG12或SAG13启动子。在一个实施方案中，启动子可以是熟练技术人员已知的SAG12启动子，或其功能变体或功能片段(Gan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113: 313-319，其通过引用并入本文)。合适的启动子和其序列可见于WO2010/097623(其通过引用并入本文)。
[0214] 在另一个实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子。组织特异性启动子是指导基因在植物的一个(或几个)部分、通常在这些植物部分的整个寿命期间表达的启动子。组织特异性启动子的种类通常还包括其特异性不是绝对的启动子，即它们也可以在优选组织以外的组织中指导较低水平的表达。许多组织特异性启动子是本领域中已知的并且包括与在马铃薯块茎中表达的马铃薯糖蛋白基因和在小麦、大麦或玉米胚乳中表达的高分子量麦谷蛋白基因相关的那些。这些启动子的任一种可用于本发明中。
[0215] 合适地，组织特异性启动子可以是叶特异性启动子。合适地，叶特异性启动子可以包括ASYMMETRIC LEAVES 1 (AS1)。在一个特别优选的实施方案中，所述组织特异性启动子不是根特异性启动子。
[0216] 在另一个实施方案中，启动子可以是发育调节型启动子。发育调节型启动子在植物发育期间的特定时间指导植物的一个或多个部分中基因表达的改变。基因可以在其他时候以不同的(通常较低的)水平在该植物部分中表达，并且也可以在其他植物部分中表达。
[0217] 在一个实施方案中，启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子能够响应诱导物而指导基因的表达。在没有诱导物的情况下，基因不会被表达。诱导物可以直接作用于启动子序列，或者可以通过抵消阻抑蛋白分子的作用而起作用。诱导物可以是化学试剂例如代谢物、蛋白、生长调节剂或有毒元素，生理应激例如热、创伤或渗透压，或者病原体或害虫的作用的间接结果。发育调节型启动子可以被描述为对由植物产生的内源诱导物或植物生命周期中特定时间点的环境刺激物起反应的特定类型的诱导型启动子。已知的诱导型启动子的实例包括与以下相关的那些：创伤反应，诸如由Warner SA, Scott R, Draper J. (1993) (Isolation of an asparagus intracellular PR gene (AoPR1) wound-
responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and its
characterization in transgenic tobacco. Plant J. 3 191-201.)(其通过引用并入本文)所述，如由Benfey & Chua (1989) (Benfey, P.N.,和Chua, N-H. (1989) Regulated genes in transgenic plants. Science 244 174-181)(其通过引用并入本文)所公开的温度响应以及化学诱导，如由Gatz (1995) (Gatz, C. (1995) Novel inducible/
repressible gene expression systems. Methods in Cell Biol. 50 411-424)(其通过引用并入本文)所述。
responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and its
characterization in transgenic tobacco. Plant J. 3 191-201.)(其通过引用并入本文)所述，如由Benfey & Chua (1989) (Benfey, P.N.,和Chua, N-H. (1989) Regulated genes in transgenic plants. Science 244 174-181)(其通过引用并入本文)所公开的温度响应以及化学诱导，如由Gatz (1995) (Gatz, C. (1995) Novel inducible/
repressible gene expression systems. Methods in Cell Biol. 50 411-424)(其通过引用并入本文)所述。
[0218] 因此，在一个实施方案中，启动子可以选自：CERV启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子(完全或截短的)、rubisco启动子、豌豆质体蓝素启动子、胭脂碱合酶启动子、叶绿素r/b结合启动子、高分子量麦谷蛋白启动子、α、β-麦醇溶蛋白启动子、大麦醇溶蛋白启动子和马铃薯糖蛋白启动子。
[0219] 在一个实施方案中，所述启动子可以是CaMV 35S启动子或具有重复增强子区或双重增强子区的修饰的35S启动子(R. Kay等人 Science. 1987 Jun 5;236(4806):1299-302，其通过引用并入本文)。
[0220] 重组载体还可以包含编码基因的DNA，所述基因可以在克隆过程中用作选择标记，即使得能够选择已经转染或转化的细胞，并且使得能够选择携带并入异源DNA的载体的细胞。载体还可以包含参与调节编码序列的表达或用于将表达的多肽靶向至宿主细胞的特定部分(例如，至叶绿体)的DNA。因此，载体可以包含至少一种选自以下的额外元件： 选择标记基因(例如抗生素抗性基因)；多肽终止信号；和蛋白靶向序列(例如叶绿体转运肽)。
[0221] 合适的标记基因的实例包括抗生素抗性基因，诸如赋予对卡那霉素、遗传霉素(G418)和潮霉素(npt-II，hyg-B)的抗性的那些；除草剂抗性基因，诸如赋予对基于草丁膦和磺酰胺的除草剂的抗性的那些(分别为bar和suI； EP-A-242246，EP-A-0249637)；和可筛选的标记，诸如β-葡糖醛酸酶(GB2197653)、荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。标记基因可以由第二启动子控制，所述第二启动子允许在细胞中表达，其可以在种子中或可以不在种子中，由此允许在植物发育的任何阶段选择含有所述标记的细胞或组织。合适的第二启动子是土壤杆菌的胭脂碱合酶基因的启动子和衍生自编码35S花椰菜花叶病毒(CaMV)转录物的基因的启动子。然而，可以使用任何其他合适的第二启动子。
[0222] 商业上期望的性状术语“商业上期望的性状”将包括性状诸如产量、成熟植株高度、可收获叶数、平均节长、切叶长度、切叶宽度、品质、非生物(例如干旱)胁迫耐受性、除草剂耐受性和/或生物(例如昆虫、细菌或真菌)胁迫耐受性。
[0223] 如本文所教导的术语“商业上期望的性状”意指选自抗旱性、抗害虫性、成熟植株高度、可收获叶数、平均节长、切叶长度、切叶宽度和产量的一种或多种性状，其与当在相似的田间条件下生长时在可比较的植物的烟道烤制的亲本中的那些所述性状相当。
[0224] 除非另有说明，否则本文使用的烟草产量是指调制叶产量，其基于遵循标准农业和调制实践在标准田间条件下每英亩的调制烟叶的重量计算。
[0225] 在一个方面，本发明的烟草植物具有当在类似的田间条件下生长时可比较植物的产量的50%至150%、55%至145%、60%至140%、65%至135%、70%至130%、75%至125%、80%至120%、85%至115%、90%至110%、95%至105%, 50%至100%、55%至100%、60%至100%、65%至100%、70%至
100%、75%至100%、80%至100%、85%至100%、90%至100%、95%至100%、100%至150%、105%至150%、
110%至150%、115%至150%、120%至150%、125%至150%、130%至150%、135%至150%、140%至150%或145%至150%的产量。
100%、75%至100%、80%至100%、85%至100%、90%至100%、95%至100%、100%至150%、105%至150%、
110%至150%、115%至150%、120%至150%、125%至150%、130%至150%、135%至150%、140%至150%或145%至150%的产量。
[0226] 在另一个方面，本发明的烟草植物产量为当在类似的田间条件下生长时可比较植物的产量的近似1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0倍。
[0227] 在另一个方面，本发明的烟草植物的产量与当在类似的田间条件下生长时烟道烤制的可比较植物的产量相当。
[0228] 在一个方面，本发明的烟草植物提供选自以下的产量：约1200至3500、1300至3400、1400至3300、1500至3200、1600至3100、1700至3000、1800至2900、1900至2800、2000至
2700、2100至2600、2200至2500和2300至2400磅/英亩。
2700、2100至2600、2200至2500和2300至2400磅/英亩。
[0229] 在另一个方面，本发明的烟草植物提供选自以下的产量：约1200至3500、1300至3500、1400至3500、1500至3500、1600至3500、1700至3500、1800至3500、1900至3500、2000至
3500、2100至3500、2200至3500、2300至3500、2400至3500、2500至3500、2600至3500、2700至
3500、2800至3500、2900至3500、3000至3500和3100至3500磅/英亩。
3500、2100至3500、2200至3500、2300至3500、2400至3500、2500至3500、2600至3500、2700至
3500、2800至3500、2900至3500、3000至3500和3100至3500磅/英亩。
[0230] 在一个进一步方面，本发明的烟草植物提供选自以下的产量：约1200至3500、1200至3400、1200至3300、1200至3200、1200至3100、1200至3000、1200至2900、1200至2800、1200至2700、1200至2600、1200至2500、1200至2400、1200至2300、1200至2200、1200至2100、1200至2000、1200至1900、1200至1800、1200至1700、1200至1600、1200至1500和1200至1400磅/英亩。
[0231] 烟草植物本发明提供了针对烟草植物的方法、用途以及烟草细胞、烟草植物和植物繁殖材料。
[0232] 如本文所用的术语“烟草”是指用于生产烟草产品的烟草属(Nicotiana)的植物。合适的“烟草”植物的非限制性实例包括普通烟草(N. tabacum)和黄花烟草(N. rustica)(例如普通烟草L.、LA B21、LN KY171、Tl 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico)。
[0233] 在一个实施方案中，合适的烟草植物可以是任何普通烟草物种。
[0234] 在另一个实施方案中，合适的烟草植物可以是非烟草物种。
[0235] 烟草材料可以来源于或获得自普通烟草物种的多种品种，通常称为白肋烟(Burley)品种、烟道或浅色(flue or bright)品种和深色(dark)品种。在一些实施方案中，烟草材料来源于白肋烟、弗吉尼亚或深色烟草植物。烟草植物可选自白肋烟草、稀有烟草、特种烟草、膨胀烟草等。
[0236] 本文也考虑烟草栽培种和优质烟草栽培种的使用。用于本文的烟草植物因此可以是烟草品种或优质烟草栽培种。特别有用的普通烟草品种包括白肋烟型、深色型和烟道烤制型烟草。
[0237] 在一些实施方案中，烟草植物可以例如选自以下品种中的一种或多种：普通烟草L.栽培种T.I. 1068、普通烟草AA 37-1、普通烟草B 13P、普通烟草Xanthi (Mitchell-Mor)、普通烟草KT D#3 Hybrid 107、普通烟草Bel-W3、普通烟草79-615、普通烟草Samsun Holmes NN, 来自普通烟草BU21 x 普通烟草Hoja Parado杂交的F4, 株系97、普通烟草KTRDC#2 Hybrid 49、普通烟草KTRDC#4 Hybrid 1 10、普通烟草Burley 21、普通烟草PM016、普通烟草KTRDC#5 KY 160 SI、普通烟草KTRDC#7 FCA、普通烟草KTRDC#6 TN 86 SI、普通烟草PM021、普通烟草K 149、普通烟草K 326、普通烟草K 346、普通烟草K 358、普通烟草K 394、普通烟草K 399、普通烟草K 730、普通烟草KY 10、普通烟草KY 14、普通烟草KY 160、普通烟草KY 17、普通烟草KY 8959、普通烟草KY 9、普通烟草KY 907、普通烟草MD 609、普通烟草McNair 373、普通烟草NC 2000、普通烟草PG 01、普通烟草PG 04、普通烟草P01、普通烟草P02、普通烟草P03、普通烟草RG 1 1、普通烟草RG 17、普通烟草RG 8、普通烟草Speight G-28、普通烟草TN 86、普通烟草TN 90、普通烟草VA 509、普通烟草AS44、普通烟草Banket A1、普通烟草Basma Drama B84/31、普通烟草Basma I Zichna ZP4/B、普通烟草Basma Xanthi BX 2A、普通烟草Batek、普通烟草Besuki Jember、普通烟草C104、普通烟草Coker 319、普通烟草Coker 347、普通烟草Criollo Misionero、普通烟草PM092、普通烟草Delcrest、普通烟草Djebel 81、普通烟草DVH 405、普通烟草Galpao Comum、普通烟草HB04P、普通烟草Hicks Broadleaf、普通烟草Kabakulak Elassona、普通烟草PM102、普通烟草Kutsage E1、普通烟草KY 14xL8、普通烟草KY 171、普通烟草LA BU 21、普通烟草McNair
944、普通烟草NC 2326、普通烟草NC 71、普通烟草NC 297、普通烟草NC 3、普通烟草PVH 03、普通烟草PVH 09、普通烟草PVH 19、普通烟草PVH 21 10、普通烟草Red Russian、普通烟草Samsun、普通烟草Saplak、普通烟草Simmaba、普通烟草Talgar 28、普通烟草PM132、普通烟草Wislica、普通烟草Yayaldag、普通烟草NC 4、普通烟草TR Madole、普通烟草Prilep HC-
72、普通烟草Prilep P23、普通烟草Prilep PB 156/1、普通烟草Prilep P12-2/1、普通烟草Yaka JK-48、普通烟草Yaka JB 125/3、普通烟草ΤΊ-1068、普通烟草KDH-960、普通烟草TI-
1070、普通烟草TW136、普通烟草PM204、普通烟草PM205、普通烟草Basma、普通烟草TKF
4028、普通烟草L8、普通烟草TKF 2002、普通烟草TN90、普通烟草GR141、普通烟草Basma xanthi、普通烟草GR149、普通烟草GR153和普通烟草Petit Havana。
944、普通烟草NC 2326、普通烟草NC 71、普通烟草NC 297、普通烟草NC 3、普通烟草PVH 03、普通烟草PVH 09、普通烟草PVH 19、普通烟草PVH 21 10、普通烟草Red Russian、普通烟草Samsun、普通烟草Saplak、普通烟草Simmaba、普通烟草Talgar 28、普通烟草PM132、普通烟草Wislica、普通烟草Yayaldag、普通烟草NC 4、普通烟草TR Madole、普通烟草Prilep HC-
72、普通烟草Prilep P23、普通烟草Prilep PB 156/1、普通烟草Prilep P12-2/1、普通烟草Yaka JK-48、普通烟草Yaka JB 125/3、普通烟草ΤΊ-1068、普通烟草KDH-960、普通烟草TI-
1070、普通烟草TW136、普通烟草PM204、普通烟草PM205、普通烟草Basma、普通烟草TKF
4028、普通烟草L8、普通烟草TKF 2002、普通烟草TN90、普通烟草GR141、普通烟草Basma xanthi、普通烟草GR149、普通烟草GR153和普通烟草Petit Havana。
[0238] 品种或栽培种的非限制性实例是：BD 64、CC 101 、CC 200、CC 27、CC 301 、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371 Gold、Coker 48、CD 263、DF91 1 、DT 538 LC Galpao烟草、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL
939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、Hybrid 403LC、Hybrid 404LC、Hybrid 501 LC、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171 、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、窄叶Madole、窄叶Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371 LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291 、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC
606、NC 71 、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD
7302 LC、PD 7309 LC、PD 7312 LC 'Periq'e'烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51 、R
610、R 630、R 7-1 1 、R 7-12、RG 17、RG 81 、RG H51 、RGH 4、RGH 51 、RS 1410、Speight
168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、Tl
1406、Tl 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR (Tom Rosson) Madole、VA 309、VA359、AA 37-1 、B 13P、Xanthi (Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC第2 杂交种 49、Burley 21 、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01 、PG 04、P01 、P02、P03、RG 1 1 、RG 8、VA 509、AS44、Banket A1 、Basma Drama B84/31 、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81 、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、Kutsage E1 、LA BU 21 、NC 2326、NC 297、PVH 21 10、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1 、Prilep P12-2/1 、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-
960、Tl-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141 、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havana。即使本文没有具体指出，也可以考虑上述的低转化子亚变种(Low
converter subvarieties)。
939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、Hybrid 403LC、Hybrid 404LC、Hybrid 501 LC、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171 、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、窄叶Madole、窄叶Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371 LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291 、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC
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960、Tl-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141 、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havana。即使本文没有具体指出，也可以考虑上述的低转化子亚变种(Low
converter subvarieties)。
[0239] 所述烟草植物可以是白肋烟。
[0240] 在一个实施方案中，所述烟草植物是普通烟草L。在最优选实施方案中，所述烟草植物是普通烟草L栽培种T.I. 1068。
[0241] 在一个实施方案中，植物繁殖材料可以可获自本发明的烟草植物。如本文所用的“植物繁殖材料”是指由其可以产生进一步的植物的从植物获取的任何植物物质。合适地，植物繁殖材料可以是种子。
[0242] 在一个实施方案中，本发明的烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可以包含抑制或下调的二萜合成基因。在另一个实施方案中，烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可以包含根据本发明的构建体或载体。在另一个实施方案中，烟草细胞、烟草植物和/或植物繁殖材料可以通过根据本发明的方法可获得(例如获得)。
[0243] 合适地，当与未经修饰以抑制二萜合成基因的表达的烟草植物或其部分相比时，根据本发明的烟草植物或其部分可以包含至少一种二萜合成基因的降低表达。
[0244] 在一个实施方案中，根据本发明的烟草植物或其部分包含本发明的烟草细胞。在另一个实施方案中，植物繁殖材料可以可获自(例如获得自)本发明的烟草植物。
[0245] 在一个实施方案中，提供了如前述实施方案中提供的烟草细胞用于生产烟草产品的用途。此外，提供了如本文所述的烟草植物用于培育烟草植物的用途。
[0246] 在另一个实施方案中，本发明还提供了前述实施方案的烟草植物用于生产烟草产品的用途。在另一个实施方案中，提供了本发明的烟草植物用于生长作物的用途。在一个实施方案中，根据本发明的二萜合成基因的使用可以导致烟草植物的渗出物化学物质的改变。
[0247] 在一个实施方案中，根据本发明的二萜合成基因的使用可以导致烟草植物的蔗糖酯含量的增加。在另一个实施方案中，二萜合成基因的使用(例如其抑制)可以导致蔗糖酯的毛状体渗出物浓度的增加和CBT-ol、顺式-冷杉醇和labdenediol中的一种或多种的含量的增加。合适地，当植物与野生型植物相比表现出降低的二萜合成基因表达时，可以观察到这种情况。
[0248] 在一个实施方案中，本发明提供了烟草细胞培养物(例如在体外培养中)。所述烟草细胞培养物可以是烟草细胞悬浮培养物。体外培养的这些烟草细胞可以并入烟草产品中，例如作为常规烟草颗粒、碎片、细切或长切烟草薄片的替代品，作为添加剂成分或作为替代品和添加剂两者。
[0249] 在一个实施方案中，提供了根据本发明的烟草细胞培养物、例如收获和/或加工的烟草细胞培养物或其提取物用于生产烟草产品的用途。
[0250] 从体外培养物收获的烟草细胞可以干燥，例如，冷冻干燥，例如以生产粉末。
[0251] 技术人员将了解用于建立烟草细胞的体外培养物的已知方法。通过实例的方式，可以仅使用以下方法： 从目标烟草植物收集种子并对其外部进行灭菌以消除不需要的生物，将所述种子种植以使目标烟草植物生长，从烟草植物移取组织(例如，来自烟草茎)用作外植体，从烟草外植体建立愈伤组织培养物，从愈伤组织培养物建立细胞悬浮培养物，和收获培养物材料(例如包括烟草细胞)以产生烟草细胞培养物。
[0253] 收获的烟草细胞培养物可以进一步加工，例如，干燥，诸如晾干和/或冷冻干燥。收获的烟草细胞培养物或干燥的收获的烟草细胞培养物或其提取物可以掺入根据本发明的烟草产品中。
[0254] 产品本发明还提供了可获自或获得自根据本发明的烟草的产品。提供了可获自或获得自烟
草植物的产品，在所述烟草植物中，二萜合成基因活性或表达已被抑制并且其包含增加的蔗糖酯含量。
草植物的产品，在所述烟草植物中，二萜合成基因活性或表达已被抑制并且其包含增加的蔗糖酯含量。
[0255] 如本文所用，术语“烟草工业产品”旨在包括可燃吸烟制品，诸如香烟、小雪茄、雪茄、用于烟管或用于手工卷制的香烟的烟草(无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造烟草、烟草替代品或其他可吸烟材料)，不可燃气雾剂供应系统，诸如从基质材料释放化合物而不燃烧的加热产品，诸如电子烟，烟草加热产品和从基质材料的组合产生气雾剂的混合系统，例如含有液体或凝胶或固体基质的混合系统，以及在这些气雾剂供应系统内使用的可气雾化的基质材料；和无气雾剂的递送制品，诸如锭剂，口香糖，贴剂，包含适合吸入的粉末的制品和无烟烟草产品，诸如鼻烟(snus)和鼻烟(snuff)，所述无气雾剂递送制品可以递送尼古丁或可以不递送尼古丁。
[0256] 合适地，所述烟草工业产品可以由根据本发明的烟草植物或其部分制备(例如可以包含根据本发明的烟草植物或其部分)。
[0257] 合适地，所述烟草工业产品可以由根据本发明的烟草细胞培养物制备。
[0258] 合适地，所述烟草工业产品可以由从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分制备(例如可以包含从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物或其部分)。
[0259] 合适地，所述烟草工业产品可以由根据本发明的烟草植物的收获的叶制备(例如可以包含根据本发明的烟草植物的收获的叶)。
[0260] 合适地，所述烟草工业产品可以由根据本发明的加工的烟叶制备(例如可以包含根据本发明的加工的烟叶)。
[0261] 合适地，所述烟草工业产品可以由根据本发明的调制烟草材料制备(例如可以包含根据本发明的调制烟草材料)。
[0262] 合适地，所述烟草工业产品可以由根据本发明的烟草共混物制备(例如可以包含根据本发明的烟草共混物)。
[0263] 在一个实施方案中，所述烟草工业产品是可燃吸烟制品，其选自香烟、小雪茄和雪茄。
[0264] 在一个实施方案中，所述烟草工业产品包含可燃吸烟制品的一种或多种组分，诸如过滤器，滤棒，滤棒段，烟草，烟草棒，烟草棒段，溢出物，添加剂释放组分诸如胶囊，线，珠粒，纸诸如成型纸、接装纸或卷烟纸。
[0265] 在一个实施方案中，所述烟草工业产品是不可燃气雾剂供应系统。
[0266] 在一个实施方案中，所述烟草工业产品包含不可燃气雾剂供应系统的一种或多种组件，诸如加热器和可气雾化的基质。
[0268] 在一个实施方案中，所述电子烟包含加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化的基质诸如液体或凝胶、壳体和任选吹嘴。
[0269] 在一个实施方案中，可气雾化的基质包含在基质容器中。在一个实施方案中，所述基质容器与加热器组合或包含加热器。
[0270] 在一个实施方案中，所述烟草工业产品是加热产品，其通过加热、但不燃烧基质材料来释放一种或多种化合物。基质材料是可气雾化的材料，其可以是例如烟草或其他非烟草产品，其可以含有或不含有尼古丁。在一个实施方案中，所述加热产品是烟草加热产品。
[0271] 在一个实施方案中，所述加热产品是电子装置。
[0272] 在一个实施方案中，所述烟草加热产品包含加热器、能够向加热器供电的电源、可气雾化的基质、诸如固体或凝胶材料。
[0273] 在一个实施方案中，所述加热产品是非电子制品。
[0275] 在一个实施方案中，所述加热产品还包含能够过滤通过加热可气雾化基质产生的气雾剂的过滤器。
[0277] 在一个实施方案中，所述烟草工业产品是通过加热、但不燃烧基质材料的组合来产生气雾剂的混合系统。基质材料可以包含例如固体、液体或凝胶，其可以含有或可以不含尼古丁。在一个实施方案中，混合系统包含液体或凝胶基质和固体基质。固体基质可以是例如烟草或其他非烟草产品，其可以含有或不含有尼古丁。在一个实施方案中，混合系统包含液体或凝胶基质和烟草。
[0278] 在另一个实施方案中，所述产物可以包含本发明的ddRNAi DNA构建体，其抑制二萜合成基因活性或表达并增加蔗糖酯含量。
[0279] 在一个实施方案中，提供了本发明的烟草植物用于生产烟叶的用途。合适地，烟叶可以经受下游应用诸如加工。因此，在一个实施方案中，前述实施方案的使用可以提供加工的烟叶。合适地，烟叶可以经受调制、发酵、巴氏灭菌或其组合。
[0280] 在另一个实施方案中，烟叶可以被切割。在一些实施方案中，烟叶可以在经受调制、发酵、巴氏灭菌或其组合之前或之后被切割。
[0281] 在一个实施方案中，本发明提供了本发明的烟草植物的收获的叶。在一个实施方案中，收获的叶可以获自烟草植物，所述烟草植物具有抑制的二萜合成基因活性或表达和增加的蔗糖酯含量。在进一步的实施方案中，收获的叶可以可获自(例如获得自)从本发明的繁殖材料繁殖的烟草植物。在另一个实施方案中，提供了可获自本发明的方法或用途的收获的叶。合适地，收获的叶可以是切割收获的叶。在一些实施方案中，收获的叶可以包含活烟草细胞。在一些实施方案中，收获的叶不包含活烟草细胞。在其他实施方案中，收获的叶可以进行进一步加工。
[0282] 可以通过同时切割茎秆和收获所有叶来收获一些烟草植物(例如与白肋烟草一样)。其他烟草植物(例如烟道烤制的烟草)可以在诸如灌注的过程中分阶段收获，其中当其成熟时从茎秆移除个别叶。
[0283] 还提供了加工的烟叶。加工的烟叶可以可获自本发明的烟草植物。合适地，加工的烟叶可以可获自根据本发明的任何方法和/或用途获得的烟草植物。在一个实施方案中，加工的烟叶可获自烟草植物，所述烟草植物，优选地当与对照叶相比，即与来自未根据本发明修饰的烟草植物的叶相比时，具有抑制的二萜合成基因活性或表达和增加的蔗糖酯含量。加工的烟叶可以包括二萜合成基因活性或表达的降低和蔗糖酯含量增加。
[0284] 在另一个实施方案中，加工的烟叶可以可获自从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖的烟草植物。本发明的加工的烟叶通过加工本发明的收获的叶而可获得。
[0285] 如本文所使用的术语“加工的烟叶”是指已经历了本领域中烟草经受的一个或多个加工步骤的烟叶。“加工的烟叶”不包含或实质上不包含活细胞。
[0286] 术语“活细胞”是指能够生长和/或具有代谢活性的细胞。因此，如果一个细胞被认为不是活的，也称为“无活力的”，那么细胞不会显示活细胞的特征。
[0287] 术语“实质上无活细胞”是指小于约5%的全部细胞是活的。优选地，小于约3%、更优选小于约1%、甚至更优选小于约0.1%的全部细胞是活的。
[0288] 在一个实施方案中，加工的烟叶可以通过以下一种或多种来加工：调制、发酵和/或巴氏灭菌。合适地，加工的烟叶可以通过调制来加工。烟叶可以通过本领域中已知的任何方法来调制。在一个实施方案中，烟叶可以通过选自以下的调制方法中的一种或多种来调制：晾制、明火烤制、烟道烤制和晒制。合适地，烟叶可以是晾制的。合适地，烟叶可以是烟道烤制的。
[0289] 在一个实施方案中，与未根据本发明修饰的可比较的产品(例如加工的叶)相比，根据本发明的加工的叶包含增加的蔗糖酯含量。
[0290] 在一个方面，与未根据本发明修饰的可比较的产品(例如晾制的叶)相比，根据本发明的晾制的叶包含增加的蔗糖酯含量。
[0291] 合适地，蔗糖酯含量可以在茎秆切割的晾制的植物的下部1/3叶中测量。合适地，蔗糖酯含量可以在茎秆切割的晾制的植物的中部1/3叶中测量。合适地，蔗糖酯含量可以在茎秆切割的晾制的植物的上部1/3叶中测量。
[0292] 如本文所用的“下部叶”是指植物的下部三分之一的叶(例如最接近植物基部的叶)，如本文所用的“上部叶”是指植物的上部三分之一的叶(例如最远离植物基部的叶)。如本文所用的“中部叶”是指植物在下部和上部位置之间的中央三分之一(例如，在下部叶和上部叶之间半途的叶。
[0293] 合适地，与未根据本发明修饰的可比较的产品(例如茎秆切割的晾制的植物的叶子的下部1/3)相比，根据本发明的茎秆切割的晾制的植物的叶子的下部1/3可以包括增加的蔗糖酯含量。合适地，与未根据本发明修饰的可比较的产品(例如茎秆切割的晾制的植物的叶子的中部1/3)相比，根据本发明的茎秆切割的晾制的植物的叶子的中部1/3可以包括增加的蔗糖酯含量。合适地，与未根据本发明修饰的可比较的产品(例如茎秆切割的晾制的植物的叶子的上部1/3)相比，根据本发明的茎秆切割的晾制的植物的叶子的上部1/3可以包括增加的蔗糖酯含量。
[0294] 在一个方面，与未根据本发明修饰的可比较的产品(例如烟道烤制的叶)相比，根据本发明的烟道烤制的叶包含增加的蔗糖酯含量。
[0295] 合适地，蔗糖酯含量可以在烟道烤制的植物的第一引发物中测量。合适地，蔗糖酯含量可以在烟道烤制的植物的第二(或者可替代地中间)引发物中测量。合适地，蔗糖酯含量可以在烟道烤制的植物的第三(或者可替代地最后)引发物中测量。
[0296] 如本文所用，“引发物(priming)”是指从烟草植物移取叶子。这可以是指移取烟道烤制的植物的成熟或熟的叶子。
[0297] 如本文所用的“第一引发物”是指首先从烟草植物收获的叶子(例如来自烟草植物的最低部分的叶子)。如本文所用的“第二引发物(或中间引发物)”是指在初始引发后从烟草植物收获的叶子(例如来自烟草植物的中间部分的叶子)。如本文所用的“第三(或最终)引发物”是指最后从烟草植物收获的叶子(例如来自烟草植物的顶部部分的叶子)。
[0298] 合适地，与未根据本发明修饰的可比较的产品(例如烟道烤制的植物的叶子的第一引发物)相比，根据本发明的烟道烤制的植物的叶子的第一引发物可以包括增加的蔗糖酯含量。合适地，与未根据本发明修饰的可比较的产品(例如烟道烤制的植物的叶子的第二(或中间)引发物)相比，根据本发明的烟道烤制的植物的叶子的第二(或中间)引发物可以包括增加的蔗糖酯含量。合适地，与未根据本发明修饰的可比较的产品(例如烟道烤制的植物的叶子的第三(或最终)引发物)相比，根据本发明的烟道烤制的植物的叶子的第三(或最终)引发物可以包括增加的蔗糖酯含量。
[0299] 通常，晾制通过将烟叶悬挂在充分通风的仓房中并允许干燥来实现。这通常在四到八周的时间内进行。晾制特别适合于白肋烟。
[0300] 合适地，烟叶可以明火烤制。明火烤制通常通过以下来实现，将烟叶悬挂在大型仓房中，其中取决于工艺和烟草，以持续或间歇性低闷烧(low smoulder)保持硬木火焰，且通常需要三天至十周。
[0301] 在另一个实施方案中，烟叶可以烟道烤制。烟道烤制可以包括将烟叶串到烟草梗上并将它们从烤架(tier-poles)上悬挂在烤房中。仓房通常具有一个从外部供料的火箱进入的烟道。通常，这产生已经被热烤而不暴露于烟的烟草。通常，温度会在调制过程中缓慢升高，且整个过程大约需要1周。
[0302] 合适地，烟叶可以被晒制。这种方法通常涉及将未覆盖的烟草暴露在太阳下。
[0303] 合适地，加工的烟叶可以通过发酵来加工。可以以本领域中已知的任何方式进行发酵。通常，在发酵过程中，将烟叶堆积成覆盖在例如麻袋内的烤烟垛(堆)以保留水分。叶内剩余水分与烟草重量的组合产生使烟草成熟的自然热量。每天监测堆中心的温度。在一些方法中，每周将整个堆打开。然后移动叶以摇动和润湿，并将堆翻转，使得内部叶到外面且底部叶放置于堆的顶部。这确保了整个堆的均匀发酵。叶上的额外水分加上叶本身的实际翻转产生热量，释放烟草的天然氨并减少尼古丁，同时也加深了颜色并改善了烟草的香气。通常，发酵过程持续长达6个月，这取决于烟草的品种、叶上的秆位置、叶的厚度和预期用途。
[0304] 合适地，加工的烟叶可以通过巴氏灭菌来加工。当烟叶将用于制造无烟烟草产品(最优选鼻烟)时，可以特别优选巴氏灭菌。烟叶巴氏灭菌可以通过本领域中已知的任何方法进行。例如，巴氏灭菌可以如以下中详述进行：J Foulds, L Ramstrom, M Burke, K Fagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public health in Sweden. Tobacco Control (2003) 12:349–359，其教导通过引用并入本文。
[0305] 在鼻烟生产期间，通常通过其中用蒸汽对烟草热处理24-36小时(达到大约100℃的温度)的过程来进行巴氏灭菌。这产生几乎无菌的产品，并且不希望受到理论的束缚，这样的后果之一被认为是限制进一步的TSNA形成。
[0306] 在一个实施方案中，巴氏灭菌可以是蒸汽巴氏灭菌。
[0307] 在一些实施方案中，加工的烟叶可以被切割。加工的烟叶可以在加工之前或之后被切割。合适地，加工的烟叶可以在加工后被切割。
[0308] 在一些实施方案中，烟草植物、烟草植物的收获的叶和/或加工的烟叶可用于提取尼古丁。尼古丁的提取可以使用本领域中已知的任何方法来实现。例如，从烟草中提取尼古丁的方法教导于US 2,162,738，其通过引用并入本文。
[0309] 在一个方面，本发明提供了由根据本发明的烟草植物或其部分或由根据本发明的烟草细胞培养物制成的调制的烟草材料。
[0310] 在另一个方面，本发明提供了烟草共混物，其包含由根据本发明的烟草植物或其部分或由根据本发明的烟草细胞培养物制成的烟草材料。在一个方面，本发明提供了烟草共混物，其包含根据本发明的调制的烟草材料。
[0311] 合适地，根据本发明的烟草共混物可以包含近似10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的来自根据本发明的烟草植物或其部分或来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似10%的来自根据本发明的烟草植物或其部分或来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似20%的来自根据本发明的烟草植物或其部分或来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似30%的来自根据本发明的烟草植物或其部分或来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似40%的来自根据本发明的烟草植物或其部分或来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似50%的来自根据本发明的烟草植物或其部分或来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似60%的来自根据本发明的烟草植物或其部分或来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似70%的来自根据本发明的烟草植物或其部分或来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似80%的来自根据本发明的烟草植物或其部分或来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。合适地，所述烟草共混物可以包含近似90%的来自根据本发明的烟草植物或其部分或来自根据本发明的烟草细胞培养物的烟草。
[0312] 在一个方面，本发明的烟草共混物产品包含至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%干重的从根据本发明的烟草植物或其部分或根据本发明的烟草细胞培养物调制的烟草。
[0313] 合适地，调制的烟草材料可以是晾制的。合适地，调制的烟草材料可以是烟道烤制的。合适地，调制的烟草材料可以是晒制的。
[0314] 根据本发明的烟草产品或吸烟制品可以包含根据本发明的烟草材料(例如，调制的烟草材料)。
[0315] 在另一个方面，本发明提供了烟草产品。根据本发明的烟草产品可以是共混的烟草产品。在一个实施方案中，烟草产品可以从本发明的烟草植物或其部分制备。在一个实施方案中，所述烟草产品可以从具有抑制的二萜合成基因活性或表达和增加的蔗糖酯含量的烟草植物制备。所述烟草产品可以包括二萜合成基因活性或表达的降低和蔗糖酯含量增加。合适地，烟草植物或其部分可以从根据本发明的烟草植物繁殖材料繁殖。
[0316] 如本文在烟草植物上下文中使用的术语“其部分”是指烟草植物的部分。优选地，“其部分”是烟草植物的叶。
[0317] 在另一个实施方案中，烟草产品可以从本发明的收获的叶制备。在进一步的实施方案中，烟草产品可以从本发明的加工的烟叶制备。合适地，烟草产品可以从通过以下中一种或多种加工的烟叶制备：调制、发酵和/或巴氏灭菌。合适地，烟草产品可以包含切丝烟叶，任选地，其根据前述实施方案加工。
[0318] 在一个实施方案中，烟草产品可以是吸烟制品。如本文所用，术语“吸烟制品”可包括可点燃抽吸产品，例如卷烟、香烟、雪茄和小雪茄，无论是基于烟草、烟草衍生物、膨胀烟草、再造烟草或烟草替代品。
[0319] 在另一个实施方案中，烟草产品可以是无烟烟草产品。如本文所用的术语“无烟烟草产品”是指不旨在被点燃抽吸和/或经受燃烧的烟草产品。在一个实施方案中，无烟烟草产品可以包括鼻烟(snus)、鼻烟(snuff)、嚼用烟草等。
[0320] 在进一步的实施方案中，烟草产品可以是烟草加热装置或混合装置或电子烟等。通常，在加热装置或混合装置中，通过将热量从热源传递到物理上分离的气雾剂形成基质或材料(其可位于热源内部、周围或下游)而产生气雾剂。在吸烟过程中，挥发性化合物通过来自热源的热传递而从气雾剂形成基质释放并且夹带在通过吸烟制品吸入的空气中。当释放的化合物冷却时，它们冷凝形成被使用者吸入的气雾剂。
[0321] 用于消耗或吸烟烟草加热装置的气雾剂产生物品和装置在本领域中是已知的。它们可以包括例如电加热的气雾剂产生装置，其中通过将热量从气雾剂产生装置的一个或多个电加热元件传递到烟草加热装置的气雾剂形成基质而产生气雾剂。合适地，烟草加热装置可以是气雾剂产生装置。
[0322] 优选地，烟草加热装置可以是加热但不燃烧装置(heat-not-burn device)。加热但不燃烧装置在本领域中是已知的，并且通过加热而不是燃烧烟草来释放化合物。合适的加热但不燃烧装置的实例可以是WO2013/034459或GB2515502中教导的装置，所述公开通过引用并入本文。
[0323] 在一个实施方案中，烟草加热装置的气雾剂形成基质可以是根据本发明的烟草产品。
[0324] 在一个实施方案中，烟草加热装置可以是混合装置。
[0325] 多核苷酸/多肽/构建体在本发明的某些实施方案中，在启动子的指导下抑制二萜合成基因的活性或表达的构
建体可以转化至植物细胞中。在本发明的某些实施方案中，在启动子的指导下表达dsRNA或amiRNA以抑制二萜合成基因的活性或表达的ddRNAi DNA构建体可以转化至植物细胞中。
建体可以转化至植物细胞中。在本发明的某些实施方案中，在启动子的指导下表达dsRNA或amiRNA以抑制二萜合成基因的活性或表达的ddRNAi DNA构建体可以转化至植物细胞中。
[0326] 可以通过合适的载体例如植物转化载体的方式将构建体引入根据本发明的植物中。植物转化载体可以包含表达盒，所述表达盒在转录方向上5'-3'包含：启动子序列，靶向二萜合成基因、优选靶向环化酶2基因(CYC2)、CBTol环化酶或萜烯合酶3-8(任选地包括内含子)的ddRNAi DNA构建体序列，和任选地3'非翻译终止子序列，所述终止子序列包括用于RNA聚合酶的终止信号和用于聚腺苷酸化酶的聚腺苷酸化信号。启动子序列可以以一个或多个拷贝存在，并且这样的拷贝可以是相同的或如上所述的启动子序列的变体。终止子序列可以从植物、细菌或病毒基因获得。例如，合适的终止子序列是豌豆rbcS E9终止子序列、来源于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合酶基因的nos终止子序列和来自花椰菜花叶病毒的35S终止子序列。本领域技术人员将容易地意识到其他合适的终止子序列。
[0327] 本发明的构建体还可以包含提高启动子强度的基因表达增强机制。这种增强子元件的一个实例是来源于豌豆质体蓝素基因启动子的一部分的增强子元件，并且其是国际专利申请号WO 97/20056(其通过引用并入本文)的主题。例如，合适的增强子元件可以是来源于根癌土壤杆菌的胭脂碱合酶基因的nos增强子元件和来自花椰菜花叶病毒的35S增强子元件。
[0328] 这些调节区可以与启动子DNA序列来源于相同的基因，或者可以来源于不同的基因，所述基因来自普通烟草(Nicotiana tabacum)或其他生物体，例如来源于茄科(Solanaceae)的植物，或来自亚香树亚科(Cestroideae)。所有调节区都应该能够在待转化组织的细胞中起作用。
[0329] 启动子DNA序列可以与本发明中使用的目的基因(例如启动子将要指导的基因，例如编码本发明的失调的硝酸还原酶的基因)编码序列来源于相同的基因，或者可以来源于不同的基因，所述基因来自普通烟草(Nicotiana tabacum)或其他生物体，例如来源于茄科(Solanaceae)的植物，或来自亚香树亚科(Cestroideae)。
[0330] 可以将表达盒整合到基础植物转化载体中，例如pBIN 19 Plus、pBI 101、pKYLX71:35S2、pCAMBIA2300或本领域中已知的其他合适的植物转化载体。除表达盒之外，植物转化载体将含有如转化过程所需的这样的序列。这些序列可包括土壤杆菌vir基因、一个或多个T-DNA边界序列、以及可选择标记物或鉴定转基因植物细胞的其他手段。
[0331] 术语“植物转化载体”是指能够体内或体外表达的构建体。优选地，表达载体被整合到生物的基因组中。术语“整合的”优选涵盖稳定整合入基因组。
[0332] 用于转化植物的技术在本领域中是众所周知的，并且包括例如土壤杆菌介导的转化。遗传修饰植物的构建的基本原则是在植物基因组中插入遗传信息，从而获得插入的遗传物质的稳定维持。在Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)和Christon (AgroFood-Industry Hi-Tech March/April1994 17-27)(其通过引用并入本文)的文章中可以找到关于一般技术的综述。
[0333] 通常，在土壤杆菌介导的转化中，通过将土壤杆菌与来自目标植物的外植体共培养，将携带目的外源DNA的双元载体(即ddRNAi DNA构建体)从合适的土壤杆菌菌株转移至目标植物中。然后在选择培养基上再生转化的植物组织，所述选择培养基包含可选择标记物和植物生长激素。可选择的方法是花浸法(Clough & Bent, 1998 Plant J. 1998 Dec;16(6):735-43，其通过引用并入本文)，其中使完整植物的花芽与含有嵌合基因的土壤杆菌菌株的悬浮液接触，并且在种子形成后，使转化的个体萌发并在选择性培养基上通过生长鉴定。通过土壤杆菌直接感染植物组织是简单的技术，其已被广泛采用并且其描述于
Butcher D. N. 等人, (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, 编辑:D. S. Ingrams和J.P. Helgeson, 203-208，其通过引用并入本文。
Butcher D. N. 等人, (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, 编辑:D. S. Ingrams和J.P. Helgeson, 203-208，其通过引用并入本文。
[0334] 其他合适的转化方法包括使用聚乙二醇或电穿孔技术、粒子轰击、微量注射以及例如使用碳化硅纤维将基因直接转移到原生质体中。使用弹道转化(ballistic transformation)包括碳化硅晶须技术转化植物教导于Frame B R, Drayton P R,
Bagnaall S V, Lewnau C J, Bullock W P, Wilson H M, Dunwell J M, Thompson J A & Wang K (1994)，其通过引用并入本文。通过碳化硅晶须介导的转化产生可育的转基因玉米植物教导于The Plant Journal 6:941-948，其通过引用并入本文)并且病毒转化技术教导于例如Meyer P, Heidmmm I & Niedenhof I (1992)。木薯花叶病毒作为植物的载体系统的用途教导于Gene 110:213-217，其通过引用并入本文。关于植物转化的其他教导可见于EP-A-0449375，其通过引用并入本文。
Bagnaall S V, Lewnau C J, Bullock W P, Wilson H M, Dunwell J M, Thompson J A & Wang K (1994)，其通过引用并入本文。通过碳化硅晶须介导的转化产生可育的转基因玉米植物教导于The Plant Journal 6:941-948，其通过引用并入本文)并且病毒转化技术教导于例如Meyer P, Heidmmm I & Niedenhof I (1992)。木薯花叶病毒作为植物的载体系统的用途教导于Gene 110:213-217，其通过引用并入本文。关于植物转化的其他教导可见于EP-A-0449375，其通过引用并入本文。
[0335] 在进一步的方面，本发明涉及载体系统，其携带ddRNAi DNA构建体并将其引入生物如植物的基因组中。载体系统可以包含一种载体，但它也可以包含两种载体。在两种载体的情况下，载体系统通常被称为双元载体系统。双元载体系统更详细地描述于Gynheung Anetal, (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19，其通过引用并入本文。
[0336] 用于转化植物细胞的一种广泛使用的系统使用来自根癌土壤杆菌的Ti质粒或来自发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒Anetal., (1986), Plant Physiol.81, 301-305和Butcher D. N. 等人, (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, 编辑:D. S. Ingrams和J.P. Helgeson, 203-208，其通过引用并入本文。在植物中根据本发明的期望的外源基因的每种引入方法之后，进一步的DNA序列的存在和/或插入可能是必需的。T-DNA用于转化植物细胞的用途已经被深入研究，并描述于EP-A-120516；Hoekema, 于:The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B., Amsterdam, 1985, 第V章；Fraley,等人, Crit.Rev. Plant Sci., 4:1-46；和Anetal., EMBO J (1985) 4:277-284，其通过引用并入本文。
[0337] 用表达抑制二萜合成基因的活性或表达的dsRNA或amiRNA的ddRNAi DNA构建体转化的植物细胞可以根据众所周知的组织培养方法生长并维持，例如通过在提供有必需生长因子如氨基酸、植物激素、维生素等的合适培养基中培养细胞。
[0338] 与本发明相关的术语“转基因植物”包括包含根据本发明的ddRNAi DNA构建体的任何植物。因此，转基因植物是已用根据本发明的ddRNAi DNA构建体转化的植物。优选地，根据本发明，所述转基因植物表现出抑制的二萜合成基因活性或表达以及增加的蔗糖酯含量。术语“转基因植物”不涵盖当天然核苷酸编码序列在其天然启动子（所述启动子也在其天然环境中）的控制下时的在其天然环境中的所述天然核苷酸编码序列。
[0339] 在一个方面，根据本发明的ddRNAi DNA构建体、植物转化载体或植物细胞呈分离的形式。术语“分离的”意味着序列至少基本上不含至少一种其他组分，所述序列在自然界中与该组分天然地相关并且如在自然界中发现的那样。
[0340] 在一个方面，根据本发明的ddRNAi DNA构建体、植物转化载体或植物细胞呈纯化的形式。术语“纯化的”意指呈相对纯的状态，例如，至少约90%纯、或至少约95%纯或至少约98%纯。
[0341] 如本文所用的术语“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(诸如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成或重组来源的，并且可以是双链的或单链的，无论代表有义链或反义链。
[0342] 与本发明相关的术语“核苷酸序列”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选其意指DNA，更优选编码本发明的cDNA序列。
[0343] 在一个优选实施方案中，核苷酸序列，当涉及本发明本身的范围并由本发明本身的范围涵盖时，即二萜合成基因，当在其自然环境中时和当与其自然相关的序列(也在其自然环境中)相关时，包括天然核苷酸序列。为了易于参考，我们应当将这种优选的实施方案称为“天然核酸序列”。在这方面，术语“天然核苷酸序列”意指在其天然环境中并且当与整个启动子(其是该序列天然相关的)可操作连接时的整个核苷酸序列，所述启动子也在其天然环境中。
[0344] 通常，本发明的范围覆盖的RNAi分子使用重组DNA技术(例如，重组DNA)制备。然而，在本发明的一个替代实施方案中，核苷酸序列可以使用领域中众所周知的化学方法整体或部分合成(参见 Caruthers MH等人, (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等人, (1980) Nuc Acids ResSymp Ser 225-232，其通过引用并入本文)。
[0345] 编码具有特定特性的蛋白作为如本文所定义的二萜合成基因或适用于修饰的蛋白的核苷酸序列可以从产生所述蛋白的任何细胞或生物体鉴定和/或分离和/或纯化。本领域内众所周知多种用于鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列的方法。通过实例的方式，一旦已鉴定和/或分离和/或纯化合适的序列，就可以使用PCR扩增技术来制备更多序列。
[0346] 通过进一步实例的方式，可以使用来自产生酶的生物体的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果酶的氨基酸序列是已知的，则可以合成标记的寡核苷酸探针并用于从制备自生物体的基因组文库鉴定编码酶的克隆。或者，含有与另一种已知的酶基因同源的序列的标记的寡核苷酸探针可以被用于鉴定编码酶的克隆。在后一种情况下，使用较低严格性的杂交和洗涤条件。
[0347] 在一个又进一步替代方案中，编码酶的核苷酸序列可以通过建立的标准方法合成制备，所述方法例如由Beucage S.L. 等人, (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869(其通过引用并入本文)描述的亚磷酰胺方法(phosphoroamidite method)或由
Matthes 等人, (1984) EMBO J. 3, p 801-805(其通过引用并入本文)描述的方法。在亚磷酰胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成仪中合成，将其纯化、退火、连接和克隆于适当的载体中。
Matthes 等人, (1984) EMBO J. 3, p 801-805(其通过引用并入本文)描述的方法。在亚磷酰胺方法中，合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成仪中合成，将其纯化、退火、连接和克隆于适当的载体中。
[0348] 如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。
[0349] 本发明还覆盖使用与本文定义的具有特定特性的多肽的氨基酸序列或任何核苷酸序列(即编码这种多肽的二萜合成基因)具有一定程度的序列同一性或序列同源性的序列(以下简称“同源序列”)。在此，术语“同源物”意指与对象氨基酸序列和对象核苷酸序列具有某一同源性的实体。在此，术语“同源性”可以等同于“同一性”。
[0350] 同源氨基酸序列和/或核苷酸序列和/或片段应当提供和/或编码保留二萜合成基因的功能活性和/或增强二萜合成基因的活性的多肽。通常，同源序列将包含与例如主题氨基酸序列相同的活性位点等，或者将编码相同的活性位点。尽管同源性也可以在相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)方面来考虑，但在本发明的上下文中，优选根据序列同一性表示同源性。
[0351] 在一个实施方案中，同源序列被包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，与主题序列相比，其有一个或几个添加、缺失和/或取代。
[0352] 同源性或同一性比较可以通过目视进行，或者更通常地借助于容易获得的序列比较程序进行。这些可商购的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的%同源性。可以在连续序列上计算%同源性或%同一性，即将一个序列与另一序列对齐，并且一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的相应氨基酸直接比较，一次一个残基。这被称为“未加空位的(ungapped)”比对。通常，这种未加空位比对仅在相对少数量的残基上进行。
[0353] 尽管这是非常简单且一致的方法，但它没有考虑到，例如，在其他方面相同的一对序列中，一个插入或缺失会导致随后的氨基酸残基无法对齐，从而可能导致在进行全局比对时%同源性大大降低。因此，设计大多数序列比较方法以产生最佳比对，其考虑到可能的插入和缺失，而不会过度地惩罚总体同源性评分。这是通过在序列比对中插入“空位”以尽量将局部同源性最大化来实现的。
[0354] 然而，这些更为复杂的方法对比对中出现的每个空位分配“空位罚分”，以便对于相同数量的相同氨基酸，具有尽可能少的空位的序列比对 - 反映两个比较的序列之间的更高关联性 - 将获得比具有很多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs)”，其使空位存在承担相对高的成本并且使空位中每个后续残基承担较小罚分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然会产生空位更少的优化的比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用这些软件进行序列比较时，优选使用默认值。
[0355] 因此，考虑到空位罚分，最大%同源性的计算首先需要产生最佳比对。实施此类比对的合适的计算机程序是Vector NTI (Invitrogen Corp.)。可以进行序列比较的软件的实例包括但不限于例如BLAST程序包(参见 Ausubel 等人 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 第四版 - 第18章)、BLAST 2 (参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)、FASTA (Altschul 等人 1990 J. Mol.Biol.403-410)和AlignX。至少BLAST、BLAST 2和FASTA可用于线下和线上检索(参见Ausubel 等人 1999, 第7-58至7-60页)。
[0356] 尽管最终的%同源性可以按照同一性来测量，但比对过程本身通常不是基于全或无的对比较。相反，通常使用缩放的相似性得分矩阵，其基于化学相似性或进化距离将得分分配给每个成对比较。常用的这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵 - BLAST程序套件的默认矩阵。Vector NTI程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(如果提供)(更多详细信息参见用户手册)。对于某些应用，优选使用Vector NTI软件包的默认值。
[0357] 或者，可以基于与CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244)类似的算法，使用Vector NTI (Invitrogen Corp.)中的多比对特征来计算百分比同源性。
[0358] 一旦软件已产生最佳比对，就可以计算%同源性，优选%序列同一性。该软件通常将其作为序列比较的一部分来完成并生成数值结果。
[0359] 如果在确定序列同一性时使用空位罚分，则优选以下参数用于成对比对：对于BLAST
空位开放 0
空位延伸 0
对于CLUSTAL DNA 蛋白
字符大小 2 1 K三连(K triple)
空位罚分 15 10
空位延伸 6.66 0.1
空位开放 0
空位延伸 0
对于CLUSTAL DNA 蛋白
字符大小 2 1 K三连(K triple)
空位罚分 15 10
空位延伸 6.66 0.1
[0360] 在一个实施方案中，可以用如上所限定的空位罚分和空位延伸来使用CLUSTAL。在一些实施方案中，用于BLAST或CLUSTAL比对的空位罚分可以不同于以上详述的那些。技术人员将会理解，用于执行BLAST和CLUSTAL比对的标准参数可以定期改变，并且将能够基于当时针对BLAST或CLUSTAL比对算法详述的标准参数来选择适当的参数。
[0361] 合适地，关于核苷酸序列的同一性程度在至少20个连续核苷酸上，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在至少50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续的核苷酸上，优选在至少100个连续的核苷酸上测定；其中所述核苷酸序列编码ddRNAi DNA构建体。关于核苷酸序列的同一性程度在至少10个连续核苷酸上，优选20个连续核苷酸上，优选在至少30个连续核苷酸上，优选在至少40个连续核苷酸上，优选在至少50个连续核苷酸上，优选在至少60个连续的核苷酸上，优选在至少100个连续的核苷酸上测定。
[0362] 合适地，可以在整个序列上测定关于核苷酸序列的同一性程度。
[0363] 序列还可以具有产生沉默改变并导致功能等同物质的氨基酸残基的缺失、插入或取代。只要物质的二级结合活性得到保留，就可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性来进行有意的氨基酸取代。例如，带负电荷氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且有具有相似亲水性值的不带电荷极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
[0364] 例如根据下表可以进行保守取代。第二列中同一区块中和优选第三列中同一行中的氨基酸可以彼此取代：。
[0365] 本发明还包括可能以即同类(like-for-like)取代(诸如碱性取代碱性、酸性取代酸性、极性取代极性等)发生的同源取代(取代和替换两者在本文用于表示现有氨基酸残基与可选残基的交换)。非同源取代也可以发生，即从一类残基到另一类残基，或可替代地涉及包括非天然氨基酸例如鸟氨酸(以下称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(以下称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(以下称为O)、吡啶丙氨酸、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
[0366] 替换还可以通过非天然氨基酸进行，包括：α*和α双取代的* 氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化物衍生物诸如三氟酪氨酸*、对-Cl-苯丙氨酸*、对-Br-苯丙氨酸*、对-I-苯丙氨酸*、L-烯丙基甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸#、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜#*、L-正亮氨酸*、L-戊氨酸*、对硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟基脯氨酸#、L-硫代脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物诸如4-甲基-Phe*、五甲基-Phe*、L-Phe(4-氨基)＃、L-Tyr(甲基)*、L-Phe(4-异丙基)*、L-Tic(1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸#和L-Phe (4-苄基)*。符号*已用于上述讨论(涉及同源或非同源取代)的目的，以表明衍生物的疏水性质，而＃已被用于指示衍生物的亲水性质，＃*表示两亲性特征。
[0367] 变体氨基酸序列可以包括除了氨基酸间隔子例如甘氨酸或β-丙氨酸残基之外，可以插入序列的任何两个氨基酸残基之间的合适的间隔基团，包括烷基例如甲基、乙基或丙基基团。变化的其他形式涉及存在以类肽形式的一个或多个氨基酸残基，其将被本领域技术人员完全理解。为避免疑问，使用“类肽形式”来指变体氨基酸残基，其中α-碳取代基位于残基的氮原子上而不是α-碳上。制备类肽形式的肽的方法是本领域中已知的，例如Simon RJ 等人, PNAS (1992) 89(20), 9367-9371和Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995) 13(4), 132-134。
[0368] 用于本发明中的核苷酸序列可以包括在其中的合成或修饰的核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是领域中已知的。这些包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯骨架和/或在分子的3’末端或5’末端添加吖啶或聚赖氨酸链。对于本发明的目的，应理解的是，可以通过本领域中可用的任何方法修饰本文描述的核苷酸序列。可以实施此类修饰以增强本发明的核苷酸序列的体内活性和寿命。
[0369] 本发明还包括与本发明的核酸序列互补的序列、或能够与本发明的序列或与其互补的序列杂交的序列。本文所用术语“杂交”应包括“经其核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”以及如聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。
[0370] 本发明还涉及可与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括本文呈现的那些序列的互补序列)。优选地，杂交在严格条件下(例如50℃和0.2xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl、0.015 M 柠檬酸三钠 pH 7.0})测定。更优选地，杂交在高严格条件下(例如65℃和0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl、0.015 M 柠檬酸三钠 pH 7.0})测定。
[0371] 在一个方面，用于本发明中的序列是合成序列-即通过体外化学或酶促合成制备的序列。其包括但不限于用针对宿主生物体的最佳密码子使用制成的序列。
[0372] 术语“表达载体”意指能够体内或体外表达的构建体。在一个实施方案中，本发明的载体表达dsRNA。在一个实施方案中，本发明的载体表达amiRNA。优选地，表达载体被并入合适宿主生物体的基因组中。术语“并入”优选地涵盖稳定并入基因组中。
[0373] 本发明的核苷酸序列可以存在于载体中，其中核苷酸序列可操作连接至能够提供由合适宿主生物体表达核苷酸序列的调节序列。用于本发明中的ddRNAi DNA构建体可以转化至本文描述的合适宿主细胞中以提供本发明的多肽的表达。载体的选择例如质粒、粘粒或噬菌体载体经常取决于待引入载体的宿主细胞。载体可以体外使用，例如，用于产生RNA或用于转染、转化、转导或感染宿主细胞。
[0374] 因此，在一个进一步实施方案中，本发明提供了通过将本发明的核苷酸序列引入可复制载体中、将载体引入相容的宿主细胞中以及使宿主细胞在引起载体复制的条件下生长来制备本发明的核苷酸序列的方法。所述载体可以进一步包含使得载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的核苷酸序列。此类序列的实例是质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的复制起点。
[0375] 在一些应用中，用于本发明中的核苷酸序列可操作连接至能够提供核苷酸序列的表达(诸如通过选择的宿主细胞)的调节序列。通过实例的方式，本发明涵盖包含可操作连接至这种调节序列的本发明的核苷酸序列的载体，即，所述载体为表达载体。
[0376] 术语“可操作连接”是指这样的并置(juxtaposition)，其中所述的组分处于允许它们以其预期的方式发挥功能的关系中。“可操作连接”至编码序列的调节序列以这样的方式连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
[0377] 术语“调节序列”包括启动子和增强子以及其他表达调节信号。术语“启动子”以本领域的通常意义使用，例如，RNA聚合酶结合位点。编码dsRNA或amiRNA的ddRNAi DNA构建体内的核苷酸序列可以与至少一个启动子可操作连接。
[0378] 术语“构建体”-其与术语诸如“盒”或“载体”同义-包括用于根据本发明使用的核苷酸序列，其直接或间接附接至启动子。
[0379] 间接附接的实例是在本发明的启动子和核苷酸序列中间提供合适的间隔基诸如内含子序列，诸如Sh1-内含子或ADH内含子。与本发明相关的术语“融合”也是如此，其包括直接或间接附接。在一些情况下，所述术语不涵盖通常与野生型基因启动子相关的编码蛋白的核苷酸序列的天然组合(并且当它们均在其自然环境中时)。ddRNAi DNA构建体甚至可以含有或表达允许选择基因构建体的标志物。
[0380] 可以在Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225)和Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)(其通过引用并入本文)的文献中找到用于转化植物的一般技术的综述。关于植物转化的进一步教导可见于EP-A-0449375(其通过引用并入本文)中。
[0381] 除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton, 等人, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)和Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)为技术人员提供了本公开中所用的众多术语的一般字典。
[0382] 本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料可以用于本公开的实施方案的实践或测试中。数值范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则分别地，任何核酸序列均以5'至3'的方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基到羧基方向从左到右书写。
[0383] 本文提供的标题不是对本公开的各个方面或实施方案的限制，其可作为整体参考说明书而具有。因此，下文直接定义的术语通过参考说明书整体更全面地定义。
[0384] 氨基酸在本文中使用氨基酸的名称、三字母缩写或单字母缩写来提及。如本文所用，术语“蛋白”包括蛋白、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。
[0385] 术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码如按照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, JCBN)所定义。还应理解的是，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一种核苷酸序列编码。
[0386] 术语的其他定义可以在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施例之前，应理解的是，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应理解本文所用的术语学仅用于描述具体实施方案的目的，并不旨在是限制性的，这是由于本公开的范围仅由所附的权利要求书来限定。
[0387] 在提供数值范围的情况下，应该理解的是，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限和下限之间的每个介于中间的值至下限单位的十分之一也被具体公开。在规定范围内的任何规定值或介于中间的值与该规定范围内的任何其他规定值或介于中间的值之间的每个较小范围包含在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或从该范围排除，并且其中在较小范围内包括任一限值、不包括限值或包括两个限值的每一范围也包括在本公开中，服从于规定范围中任何具体排除的限值。在规定范围包括一个或两个限值的情况下，排除这些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
[0388] 必须注意如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/种(a、an)”和“所述/该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“酶”或“硝酸还原酶”包括多种本领域技术人员已知的此类候选试剂及其等同物等等。
[0389] 提供本文讨论的出版物仅用于其在本申请的申请日之前的公开内容。本文中任何内容都不应被解释为承认此类出版物构成了本文所附权利要求书的现有技术。
[0390] 优点有利地，二萜合成基因的活性或表达的抑制增加烟草植物的蔗糖酯含量。不希望受理
论束缚，据信减少制备二萜的碳利用导致蔗糖酯产量增强。有利地，本发明的方法允许生产具有优选的“土耳其样”化学物质的烟草植物，其为高生物质植物。有利地，本发明提供了可用于热不燃烧产品的理想的一种或多种烟雾化学物质。现在将参考以下附图和实施例仅以实例的方式描述本发明。
实施例
论束缚，据信减少制备二萜的碳利用导致蔗糖酯产量增强。有利地，本发明的方法允许生产具有优选的“土耳其样”化学物质的烟草植物，其为高生物质植物。有利地，本发明提供了可用于热不燃烧产品的理想的一种或多种烟雾化学物质。现在将参考以下附图和实施例仅以实例的方式描述本发明。
实施例
[0391] 实施例1 转基因构建体GW1、GW2、GW3、GW5的制备发明人试图解析植物毛状体次级代谢并使用转录后基因沉默策略(PTGS)评价毛状体
表达的基因对蔗糖酯含量的影响。使用RNAi评价环化酶2基因(CYC2)、CBTol环化酶和萜烯合酶3-8的功能。用于构建体制备和植物再生的方法在Wang和Wagner 2003(同上，其通过引用并入本文)连同常规分子克隆技术(Sambrook等人，1989 Molecular cloning:a
laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)中详细给出。
表达的基因对蔗糖酯含量的影响。使用RNAi评价环化酶2基因(CYC2)、CBTol环化酶和萜烯合酶3-8的功能。用于构建体制备和植物再生的方法在Wang和Wagner 2003(同上，其通过引用并入本文)连同常规分子克隆技术(Sambrook等人，1989 Molecular cloning:a
laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)中详细给出。
[0392] 转基因构建体GW1 - 抑制环化酶2基因(CYC2)的表达该ddRNAi DNA构建体基于环化酶2基因(CYC2)设计。CYC2的mRNA的完整编码序列注释
为AF401234。基因组序列注释为AY495694。用于产生GW1植物的构建体由以下组成： 来自序列AF401234的第54至第716核苷酸的5`-有义片段；作为发夹环的部分GUS A片段(从第787至第1812核苷酸)，GUS A注释是AF502128；和CYC2有义片段-3`的反向互补物。所述构建体包含有义方向的来自CYC2 mRNA(AF401234)的核苷酸54至716。该序列对应于来自基因组序列(AY495694)的核苷酸位置：核苷酸1至25，核苷酸26至271(外显子1)，核苷酸1253至1529(外显子2)和第3外显子的前115个核苷酸(核苷酸2366至2480)。质粒pKYLX71-35S2是用于基因构建体的双元载体(Wang等人，2001，同上，其通过引入并入本文)。GW1构建体插入物的序列在SEQ ID No.5中列出。
为AF401234。基因组序列注释为AY495694。用于产生GW1植物的构建体由以下组成： 来自序列AF401234的第54至第716核苷酸的5`-有义片段；作为发夹环的部分GUS A片段(从第787至第1812核苷酸)，GUS A注释是AF502128；和CYC2有义片段-3`的反向互补物。所述构建体包含有义方向的来自CYC2 mRNA(AF401234)的核苷酸54至716。该序列对应于来自基因组序列(AY495694)的核苷酸位置：核苷酸1至25，核苷酸26至271(外显子1)，核苷酸1253至1529(外显子2)和第3外显子的前115个核苷酸(核苷酸2366至2480)。质粒pKYLX71-35S2是用于基因构建体的双元载体(Wang等人，2001，同上，其通过引入并入本文)。GW1构建体插入物的序列在SEQ ID No.5中列出。
[0393] 转基因构建体GW2 - 抑制萜烯合酶3-8基因的表达该ddRNAi DNA构建体基于miRNA168初级转录物(EU549055.1; GI:171195398)(从5`
127-至535-3`)设计，其中196-216被与原始序列(Genbank：AY528645，对应于如SEQ ID NO.3中所示的核苷酸位置)反向互补的核苷酸1497起的21个核苷酸取代，并且核苷酸279-
299被正向方向上来自原始链的21个核苷酸取代，但其中当使用区域1497-1517时，3个碱基被修饰。将侧接5`-HindIII和3`-EcoRI限制性位点延伸的模块插入2X35S启动子和35S终止子之间。将含有2X35S prom- miRNAi 3-8和35S终止子的延伸模块引入双元载体
pCAMBIA2300的多克隆位点(MCS)中。将重组载体(KmR)插入根癌土壤杆菌GV3101(RifR，GmR)中。在三重抗生素(Km、Rif、Gen)上选择菌落。通过质粒PCR证实土壤杆菌转化。GW2构建体插入物的序列在SEQ ID No.7中列出。
127-至535-3`)设计，其中196-216被与原始序列(Genbank：AY528645，对应于如SEQ ID NO.3中所示的核苷酸位置)反向互补的核苷酸1497起的21个核苷酸取代，并且核苷酸279-
299被正向方向上来自原始链的21个核苷酸取代，但其中当使用区域1497-1517时，3个碱基被修饰。将侧接5`-HindIII和3`-EcoRI限制性位点延伸的模块插入2X35S启动子和35S终止子之间。将含有2X35S prom- miRNAi 3-8和35S终止子的延伸模块引入双元载体
pCAMBIA2300的多克隆位点(MCS)中。将重组载体(KmR)插入根癌土壤杆菌GV3101(RifR，GmR)中。在三重抗生素(Km、Rif、Gen)上选择菌落。通过质粒PCR证实土壤杆菌转化。GW2构建体插入物的序列在SEQ ID No.7中列出。
[0394] 转基因构建体GW3 - 抑制CBTol环化酶基因的表达该ddRNAi DNA构建体基于普通烟草环化酶基因(AY049090)设计。该双链RNAi模块以下
列方式组装： -来自普通烟草环化酶基因(AY049090)的部分序列，在正向和反向方向，SEQ ID No.1的5` 2854至4175- 3`，由以下组成：部分外显子4、完整内含子4、外显子5、内含子
5、外显子6、内含子6和部分外显子7。正向和反向段之间的间隔区是部分GUS A基因，来自5`- 786-1816-3`。质粒pCAMBIA2300是用于该基因构建体的双元载体。GW3构建体插入物的序列在SEQ ID No.6中列出。
列方式组装： -来自普通烟草环化酶基因(AY049090)的部分序列，在正向和反向方向，SEQ ID No.1的5` 2854至4175- 3`，由以下组成：部分外显子4、完整内含子4、外显子5、内含子
5、外显子6、内含子6和部分外显子7。正向和反向段之间的间隔区是部分GUS A基因，来自5`- 786-1816-3`。质粒pCAMBIA2300是用于该基因构建体的双元载体。GW3构建体插入物的序列在SEQ ID No.6中列出。
[0395] 转基因构建体GW5 - 抑制萜烯合酶3-8基因的表达该ddRNAi DNA构建体基于miRNA168初级转录物(EU549055.1; GI:171195398)(从5`
127-至535-3`)设计，其中196-216被与原始序列(Genbank：AY528645，对应于如SEQ ID NO.3中所示的核苷酸位置)反向互补的核苷酸884起的21个核苷酸取代，并且核苷酸279-
299被正向方向上来自原始链的21个核苷酸取代，但其中当使用区域884-904时，有义链的4个碱基被修饰。将侧接5`-HindIII和3`-EcoRI限制性位点延伸的模块插入2X35S启动子和
35S终止子之间。将含有2X35S prom- miRNAi 3-8和35S终止子的延伸模块引入双元载体pCAMBIA2300的多克隆位点(MCS)中。将重组载体(KmR)插入根癌土壤杆菌GV3101(RifR，GmR)中。在三重抗生素(Km、Rif、Gen)上选择菌落。通过质粒PCR证实土壤杆菌转化。GW5构建体插入物的序列在SEQ ID No.11中列出。
127-至535-3`)设计，其中196-216被与原始序列(Genbank：AY528645，对应于如SEQ ID NO.3中所示的核苷酸位置)反向互补的核苷酸884起的21个核苷酸取代，并且核苷酸279-
299被正向方向上来自原始链的21个核苷酸取代，但其中当使用区域884-904时，有义链的4个碱基被修饰。将侧接5`-HindIII和3`-EcoRI限制性位点延伸的模块插入2X35S启动子和
35S终止子之间。将含有2X35S prom- miRNAi 3-8和35S终止子的延伸模块引入双元载体pCAMBIA2300的多克隆位点(MCS)中。将重组载体(KmR)插入根癌土壤杆菌GV3101(RifR，GmR)中。在三重抗生素(Km、Rif、Gen)上选择菌落。通过质粒PCR证实土壤杆菌转化。GW5构建体插入物的序列在SEQ ID No.11中列出。
[0396] 实施例2 T.I. 1068的土壤杆菌转化和再生普通烟草T.I. 1068种子获得自KTRDC种子保藏中心，并用70% EtOH表面灭菌1分钟，然后用5% (v/v) Chlorox表面灭菌，且然后用无菌水洗涤三次。使植物在PLANTCON®容器(MP Biomedicals, LLC)中体外生长，并用作外植体的储备物用于转化。通过土壤杆菌介导的转化将所有构建体引入烟草栽培种T.I. 1068中，并通过PCR证实转基因的存在。根癌土壤杆菌转化基本上如Horsch等人在Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtz D, Rogers SG, Fraley RT (1985) Science 227:1229–1231(其通过引用并入本文并作了一些修改)中所述进行。使土壤杆菌在含有50 mg/l Km、50 mg/l Rif和35 mg/l Gm的LB培养基上生长过夜 (GW1, GW2,)。对于GW3，Km被Hyg (55 mg/l)替换。
[0397] 将从无菌生长的植物(45天龄)切下的叶片(1 cm2)在黑暗中用细菌(1x108 cfu/ml)接种，持续2天，然后印干并转移至补充有Gamborg B-5维生素(Sigma-Aldrich Co. LTD, Irvine, UK)、3%蔗糖、1 mg/l BAP和0.05 mg/l NAA且补充有200 mg/l Km (或者，对于GW3，55 mg/l Hyg)和400 mg/l头孢噻肟的MS培养基中。约一个月之后，在该片边缘形成小的小植株，并且在同一培养基上一次传代之后，将小植株转移至同一培养基中，但除去激素，并且抗生素减少一半。将生根的植物转移至生长室中的施肥的Pro-Mix (Premier Horticulture Inc., Canada)。经由GC-MS分析个别转化体，并将具有期望变化的那些自我接种用于进一步分析T1代。
[0398] 实施例3 田间生长的对照相比于转基因株系的绿叶分析用于田间测试和田间测试设计的株系的准备
将来自从T3或T2植株的自花授粉产生的株系GW1和GW2的种子表面灭菌，并在补充有
Gamborg B-5维生素(Sigma-Aldrich Co. LTD, Irvine, UK)、3%蔗糖和Km (200 mg/l)的MS培养基上体外发芽。将GW3种子表面灭菌并在含有Hyg (55 mg/l)的培养基上发芽。一个月之后，将小植株转移至温室中的浮盘(施肥的Pro-Mix (Premier Horticulture Inc., Canada)并使其生长7-8周，然后移植至田间。使用标准的田间实践并且必要时使用灌溉。在近似4个半月之后完成烟道烤制和晾制(对于白肋烟)的收获和收集。烟道烤制包括： 48小时着色，85至100℉，94% RH；24小时萎蔫，100℉至120℉，至54% RH；30小时叶干燥，120℉至
135℉，40% RH；40小时茎干燥，135至168℉，至22% RH。
将来自从T3或T2植株的自花授粉产生的株系GW1和GW2的种子表面灭菌，并在补充有
Gamborg B-5维生素(Sigma-Aldrich Co. LTD, Irvine, UK)、3%蔗糖和Km (200 mg/l)的MS培养基上体外发芽。将GW3种子表面灭菌并在含有Hyg (55 mg/l)的培养基上发芽。一个月之后，将小植株转移至温室中的浮盘(施肥的Pro-Mix (Premier Horticulture Inc., Canada)并使其生长7-8周，然后移植至田间。使用标准的田间实践并且必要时使用灌溉。在近似4个半月之后完成烟道烤制和晾制(对于白肋烟)的收获和收集。烟道烤制包括： 48小时着色，85至100℉，94% RH；24小时萎蔫，100℉至120℉，至54% RH；30小时叶干燥，120℉至
135℉，40% RH；40小时茎干燥，135至168℉，至22% RH。
[0399] 通过GC-MS测量作为TMS衍生物的渗出物组分对于绿叶测量，从每个植株的中间叶片的叶片中间切下两个叶盘(2 cm直径)。将该盘
用乙腈(5 ml)洗涤30秒。经由真空转子蒸发浓缩洗涤液，以得到油状残余物。将残余物衍生化以形成三甲基甲硅烷基(TMS)酯，如Severson等人，1985(同上，其通过引用并入本文)所述，如下： 将乙腈洗涤液蒸发至干，溶解于1 ml CHCl3中，转移至1.5 ml GC小瓶中，并在N2气流下在40℃下干燥。将衍生化的样品溶解于1 ml二甲基甲酰胺(DMF)中，并将50μl BSTFA[双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺]和24μg作为内标松柏烯的松柏烯添加至每个小瓶中。将样品在70℃下衍生化45分钟，冷却至室温并分析。
用乙腈(5 ml)洗涤30秒。经由真空转子蒸发浓缩洗涤液，以得到油状残余物。将残余物衍生化以形成三甲基甲硅烷基(TMS)酯，如Severson等人，1985(同上，其通过引用并入本文)所述，如下： 将乙腈洗涤液蒸发至干，溶解于1 ml CHCl3中，转移至1.5 ml GC小瓶中，并在N2气流下在40℃下干燥。将衍生化的样品溶解于1 ml二甲基甲酰胺(DMF)中，并将50μl BSTFA[双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺]和24μg作为内标松柏烯的松柏烯添加至每个小瓶中。将样品在70℃下衍生化45分钟，冷却至室温并分析。
[0400] 使用30.0 m Agilent毛细管柱19091J-413(其具有0.25 μm膜厚和0.25 mm直径)，通过GC-MS(配备有HP5973 MS和自动采样器注入器的HP6890 GC)分离和分析TMS衍生物。氦气是载气，其中恒定流量为1.8 ml/min，且注入温度为250℃。用于运行TMS酯衍生物的烘箱程序如下：初始温度180℃，持续2.0分钟；速率每分钟8℃，直至280℃，保持9.5分钟。总运行时间为24.0分钟。通过其保留时间和MS概况与标准品的比较来鉴定洗脱的化合物。二萜类如下洗脱： 顺式-冷杉醇至βCBT-二醇，6至8分钟；二萜氧化产物，8至13.5分钟；蔗糖酯，17至22.5分钟。对于烟道烤制和晾制组织的组分测量，从干燥组织切下典型叶片6.14 x 6.14 cm的块(等效于12个绿色组织叶盘)并用乙腈洗涤。每个株系制备10至16个重复样品，并使用用于绿叶分析(叶打孔)的相同叶作为晾制和烟道烤制的对照。作为TMS衍生物的用于化学分析的样品的制备如上所述，并且蔗糖酯的酰基的样品的制备如下所述。
[0401] 记录所有化合物和内标的积分峰面积，并计算每一者的相对量作为总量的%。将蔗糖酯类型的许多峰组合以得到概要峰面积(summary peak area)。
[0402] 对照相比于转基因株系的每个植株的叶子的平均数、每个植株的叶子的绿色重量和每个植株的总渗出物重量呈现于下表1中。数据是在打顶(topping)后19天每个株系的3个植株的平均值。(打顶是指除去烟草花)构建体GW2和GW5 (T0)以及它们的T1和T2代的GC-MS结果是相同的；两者均表现出非常
高的labdenediol和低CBT-二醇和顺式-冷杉醇。为了避免冗余，仅使用构建体GW2实施田间工作。
高的labdenediol和低CBT-二醇和顺式-冷杉醇。为了避免冗余，仅使用构建体GW2实施田间工作。
[0403] 表1.。
[0404] 表1显示每个植株的叶子的平均数、每个植株的叶子的绿色重量在测试的转基因株系之间是相似的并且与对照植物相似。
[0405] 田间生长的对照相比于转基因株系的绿叶分析绿叶渗出物化学物质分析在刚刚打顶后实施，并且显示，对于每个株系，田间的渗出物化学物质与温室中的植物中观察到的相似，并且对于对照和田间的每个株系，化学物质的植物间变异性为约25-30%(参见图3)。图表上的每个点代表来自一个植株的数据。图3中呈现的数据显示：
● 株系GW1和GW3富含顺式-冷杉醇
● 株系GW2富含labdene-diol。
● 株系GW1和GW3富含顺式-冷杉醇
● 株系GW2富含labdene-diol。
[0406] 蔗糖酯酰基组成的测量使用的方法从Severson等人1985(同上，其通过引用并入本文)修改。向30 ml Corex玻璃管中的5至10 mg树胶样品中添加0.5 ml 80% MeOH中的 KOH (1M)，并在22℃下静置过夜以皂化。然后将样品在N2下干燥，随后添加1 ml n-BuOH和3滴浓H2SO4。然后将样品在110℃下加热1小时，其后使用脉冲涡旋混合器(10个脉冲，每个1.5秒)将组分分配于己烷和水(各
1.5 ml)之间。进行六至七次提取(直到水相对于石蕊试纸呈中性)。水相含有K2SO4、H2SO4和糖，且己烷相含有酰基的丁酯。将己烷转移至1.5 ml GC小瓶中，并使用相同的柱且关于TMS通过GC-MS分析。氦气是载气，其中恒定流量为1.8 ml/min，且注入温度为250℃。用于运行丁酯衍生物的烘箱程序如下： 初始温度90℃，持续3.0分钟；速率每分钟3℃，直至160℃，保持2分钟，速率每分钟15℃，至250℃，保持5分钟。总运行时间为39.33分钟。
1.5 ml)之间。进行六至七次提取(直到水相对于石蕊试纸呈中性)。水相含有K2SO4、H2SO4和糖，且己烷相含有酰基的丁酯。将己烷转移至1.5 ml GC小瓶中，并使用相同的柱且关于TMS通过GC-MS分析。氦气是载气，其中恒定流量为1.8 ml/min，且注入温度为250℃。用于运行丁酯衍生物的烘箱程序如下： 初始温度90℃，持续3.0分钟；速率每分钟3℃，直至160℃，保持2分钟，速率每分钟15℃，至250℃，保持5分钟。总运行时间为39.33分钟。
[0407] 图4中的数据清楚地显示，当与对照相比时，株系GW1和GW3(其包含高顺式-冷杉醇)也表现出增强的蔗糖酯产量。图表上的每个点代表来自一个植株的数据。酰基组成未改变，因此这些株系类似于土耳其或东方烟草，因为存在高水平的顺式-冷杉醇和高3-甲基戊酸前体，但有利地，它们由相对高生物质植物产生。
[0408] 图4显示：● 在高顺式-冷杉醇株系(GW1和GW3)中，与对照相比，蔗糖酯大大富集。
● 在GW2株系(高labdenediol)中，蔗糖酯也升高。
● 在GW2株系(高labdenediol)中，蔗糖酯也升高。
[0409] 实施例4 绿色 vs 烟道烤制的田间烟草和绿色 vs 晾制的烟草中的渗出物组分使RNAi株系在田间生长，T2或T3，性状稳定。在近似4个半月之后完成烟道烤制和晾制(对于白肋烟)的收获和收集。烟道烤制包括： 48小时着色，85至100℉，94% RH；24小时萎蔫，100℉至120℉，至54% RH；30小时叶干燥，120℉至135℉，40% RH；40小时茎干燥，135至168℉，至22% RH，如实施例3中所述。
[0410] 使用针对图3和4产生的相同TMS色谱图，基于表面积重新计算渗出物组分，在表2和3中表示为µg/cm2 (绿色vs 烟道和绿色vs 晾制)。计算基于与已知量的内标松柏烯的比较，假设所有化合物的峰响应是相同的。表2中显示的化合物量呈现对照的20个绿色植株、和株系GW1-3的34至36个绿色植株和10至14个调制植株的平均值，±它们各自的标准偏差。
[0411] 表2. 绿色 vs 烟道烤制2014年田间烟草中的渗出物组分* 来自2叶盘提取物的顺式-冷杉醇的丰度很低。数字由总绿叶提取物的%计算。** 来
自2叶盘-绿色的a-和b-CBT-二醇的丰度低。此处，数字由总绿叶提取物的%计算。
自2叶盘-绿色的a-和b-CBT-二醇的丰度低。此处，数字由总绿叶提取物的%计算。
[0412] 表2中呈现的数据显示，烟道烤制不会增加对照植物的蔗糖酯渗出物组分，但其确实增加包含构建体GW1、GW2或GW3的转基因植物的蔗糖酯含量。烟道烤制还增加包含构建体GW1、GW2或GW3的转基因植物的LD含量。烟道烤制增加所有烟草的顺式-冷杉醇含量。
[0413] 数据显示，与绿色烟草相比，烟道烤制增加GW2转基因植物的渗出物组分的α-CBT-二醇含量。对照植物的α-CBT-二醇含量也通过烟道烤制而增加，但程度较小。数据还显示，与绿色烟草相比，烟道烤制增加GW2转基因植物的渗出物组分的β-CBT-二醇含量。对照植物的β-CBT-二醇含量不受烟道烤制的影响。
[0414] 转基因株系中的氧化产物增加。
[0415] 表3(下文)中显示的化合物量呈现对照的20个绿色植株、和株系GW1-3的34至36个绿色植株和8至16个烤制植株的平均值，±它们各自的标准偏差。
[0416] 下表3中呈现的数据显示，晾制不会增加对照植物的蔗糖酯渗出物组分，但其确实略微增加包含构建体GW1、GW2或GW3的转基因植物的蔗糖酯含量。蔗糖酯含量在晾制的转基因株系中是稳定的。数据还显示，与绿色烟草相比，烟道烤制增加GW2转基因植物的渗出物组分的α-CBT-二醇含量(其为转基因物中的次要组分)。对照植物的α-CBT-二醇含量不受烟道烤制的影响。
[0417] 数据显示，与绿色烟草相比，晾制增加GW2转基因植物的渗出物组分的β-CBT-二醇含量。对照植物的β-CBT-二醇含量也通过烟道烤制而增加，但程度较小。晾制还增加包含构建体GW1、GW2或GW3的转基因植物的LD含量。晾制增加对照和包含GW1或GW3的烟草的顺式-冷杉醇含量。
[0418] 转基因株系中的氧化产物增加。
[0419] 表3. 绿色 vs 晾制2014年田间烟草中的渗出物组分* 来自2叶盘提取物的顺式-冷杉醇的丰度很低。数字由总绿叶提取物的%计算。** 来
自2叶盘-绿色的a-和b-CBT-二醇的丰度低。数字由总绿叶提取物的%计算。
自2叶盘-绿色的a-和b-CBT-二醇的丰度低。数字由总绿叶提取物的%计算。
[0420] 实施例5 蔗糖酯的二萜类组成和酰基组成的分析如实施例3中所述测量二萜类组成和蔗糖酯酰基组成。本发明人比较了转基因株系与
对照T.I. 1068和与晒制的土耳其型商业烟草中的二萜类和蔗糖酯组合物。晒制的商业烟草作为压制叶送至本发明人。对于转基因烟草株系呈现的数据呈现10至14个植株的平均值，而T.I. 1068对照呈现超过16个植株的平均值。
对照T.I. 1068和与晒制的土耳其型商业烟草中的二萜类和蔗糖酯组合物。晒制的商业烟草作为压制叶送至本发明人。对于转基因烟草株系呈现的数据呈现10至14个植株的平均值，而T.I. 1068对照呈现超过16个植株的平均值。
[0421] 分析以下商业土耳其型用于比较：A = 东方型，供应商：Socotab EOOD，作物2013
B= 土耳其-Samsun 作物 2013，级别SMAL
C= 土耳其-IXMIR，作物2013，级别YZAL
参见表4 二萜类含量的渗出物组成分析。
B= 土耳其-Samsun 作物 2013，级别SMAL
C= 土耳其-IXMIR，作物2013，级别YZAL
参见表4 二萜类含量的渗出物组成分析。
[0422] 表4(下文)中的数据显示，与测试的对照和/或土耳其植物相比，烟道烤制的转基因株系GW1、GW2和GW3具有更高的蔗糖酯含量。
[0423] 参见表5 蔗糖酯酰基组合物的渗出物组成分析。
[0424] 对于转基因烟草株系呈现的数据呈现4至8个植株的平均值，而T.I. 1068对照呈现超过10个植株的平均值。表5(下文)中的数据显示，转基因烟草株系GW1、GW2和GW3的蔗糖酯酰基组成类似于土耳其型烟草组合物，即富含3-Me戊酸酰基。
[0425] 实施例6 GW3表面化学物质分析实施绿色田间、晾制的和烟道烤制的样品的分析。在可能的情况下，当采取叶打孔以获得绿色田间数据时，所有都通过在田间对叶子进行标记和编号来对来自同一叶子的样品进行。在晾制或烟道烤制之后，对相同编号的叶子进行采样，使得可以直接比较绿色/晾制和绿色/烟道烤制。下表显示绿色相比于烟道烤制样品和绿色相比于晾制样品的结果。将数据标准化为微克/cm2叶。
[0426] 表6. 绿色田间、晾制和烟道烤制的样品的GW3表面化学物质分析
[0427] 绿色或烟道烤制或晾制之后的括号中的数字表示分析多少独立样品并用于推导平均值。例如，对于对照，绿色(20)意指20个独立样品。这些的平均值用下面的标准偏差显示，例如，对于对照绿色(2)，6.695 ± 3.834。
[0428] 绿色至烟道烤制的数据用于以下株系：对照和GW3-高顺式-冷杉醇。该数据显示顺式-冷杉醇从绿色至烟道烤制大大降低，并且对于GW3-高顺式-冷杉醇株系，在最右手栏中，这种顺式可能已经降解为某些“氧化产物”。该数据还显示，在GW3中，labdenediol从绿色至2
烟道烤制增加。变化是成比例的，例如当顺式从绿色至烟道烤制下降(µg/cm )时，
labdenediol成比例上升。注意，对于GW3，从绿色至烟道烤制，氧化栏值也显著增加。此外，CBT二醇从绿色至烟道烤制没有大大变化，并且蔗糖酯量在对照中从绿色至烟道烤制没有大大改变；而在GW3株系中显著增加(+4.7)。分开的分析(未显示)表明，如对稳定的蔗糖酯所预期，酰基组成从绿色至烟道烤制没有定性变化。从绿色至晾制的数据显示，从绿色至晾制的变化比对于从绿色至烟道烤制观察到的变化更小。仅氧化的看起来显著增加，可能是由于顺式-冷杉醇降解。
烟道烤制增加。变化是成比例的，例如当顺式从绿色至烟道烤制下降(µg/cm )时，
labdenediol成比例上升。注意，对于GW3，从绿色至烟道烤制，氧化栏值也显著增加。此外，CBT二醇从绿色至烟道烤制没有大大变化，并且蔗糖酯量在对照中从绿色至烟道烤制没有大大改变；而在GW3株系中显著增加(+4.7)。分开的分析(未显示)表明，如对稳定的蔗糖酯所预期，酰基组成从绿色至烟道烤制没有定性变化。从绿色至晾制的数据显示，从绿色至晾制的变化比对于从绿色至烟道烤制观察到的变化更小。仅氧化的看起来显著增加，可能是由于顺式-冷杉醇降解。
[0429] 图5表明，与对照相比，蔗糖酯含量在转基因株系GW-3中富集。蔗糖酯含量表示为总主要渗出物化合物的百分比。图6表明，与对照相比，顺式-冷杉醇在转基因株系GW-3中富集。顺式-冷杉醇含量表示为总主要渗出物化合物的百分比。
[0430] 实施例7 烟道烤制和晾制的2016田间烟草的渗出物组分使RNAi株系在田间生长，T2或T3，性状稳定，并收获。在2016年，收获烟道烤制的植物作为3种引发物。在2016年试验中，将晾制的植物进行茎秆切割，晾制，分成1/3下部叶片、1/3中部叶片和1/3上部叶片，然后进行分析。这是为了模拟用于商业生产的一般方法。
[0431] 表7. 烟道烤制的2016年田间烟草中的渗出物组分a) 在2016年，与2014年不同，对于烟道烤制的，取3种引发物并分别进行分析。
b) 每种引发物的每个值是3次重复的平均值。每次重复是20个植株的平均值。
c) 在2016年，与2014年不同，未监测田间植物的绿色组织。
b) 每种引发物的每个值是3次重复的平均值。每次重复是20个植株的平均值。
c) 在2016年，与2014年不同，未监测田间植物的绿色组织。
[0432] 结论表7中的数据显示，在2016年烟道烤制的田间烟草中，与对照相比，GW1-3株系中富含蔗糖酯。
[0433] 表8. 晾制的2016年田间烟草中的渗出物组分a) 在2016年，与2014年不同，将茎秆切割的晾制的植物的上部1/3、中部1/3和下部1/3叶片合并，并分别进行分析。
b) 每个水平的每个值是来自20个独立植株的20片叶子的平均值。
c) 在2016年，与2014年不同，未监测田间植物的绿色组织。
b) 每个水平的每个值是来自20个独立植株的20片叶子的平均值。
c) 在2016年，与2014年不同，未监测田间植物的绿色组织。
[0434] 结论表8中的数据显示，在2016年晾制的田间烟草中，与对照相比，GW1-3株系中富含蔗糖
酯。
酯。
[0435] 以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。本发明所述的方法和系统的各种改变和变化对于本领域技术人员是显而易见的，且不会背离本发明的范围和精神。尽管本发明已经关于具体优选的实施方案进行了描述，但应理解要求保护的本发明不应过度地限于此类具体的实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域中的技术人员显而易见的用于进行本发明的所述方式的各种改变均旨在以下权利要求书的范围之内。
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