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一种特殊膳食蛋白质的生产方法与应用

阅读：753发布：2020-05-14

专利汇可以提供一种特殊膳食蛋白质的生产方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种特殊膳食蛋白质的生产方法与应用。以芽孢杆菌来源的蛋白酶蛋白序列作为模板，进行苯丙氨酸的敲除替换，并进行部分氨基酸的重排，从而保证无苯丙氨酸蛋白在发酵过程中具有蛋白酶特异性活力，降解掉其他杂蛋白或者抑制其他杂蛋白的生长；采用补料发酵工艺延长菌种对数生长期时间，提高蛋白表达量，同时对后处理工艺进行优化，得到的蛋白粉纯度高，口感佳。获得的重组无苯丙氨酸蛋白中LNAA与Phe的比值超过100倍，可有效降低血液中的苯丙氨酸进入大脑。按照本专利方法生产无/低苯丙氨酸的蛋白粉的生产成本可降低至普通蛋白制品的价格，有巨大的实际应用价值和广阔的市场前景。，下面是一种特殊膳食蛋白质的生产方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种表达重组无苯丙氨酸蛋白PKU2的地衣芽孢杆菌重组工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)表达菌种中原始基因的敲除
(1)敲除质粒的构建；
以地衣芽孢杆菌CICC10266的基因组DNA为模板，用表1中的引物apr-up-F/apr-up-R，apr-down-F/apr-down-R，PCR扩增上游同源臂apr-up和下游同源臂apr-down，然后以apr-up-F/apr-down-R为引物，通过重叠PCR扩增apr-up+down，并用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR片段；以pEBKan194-GFP质粒为模板，用表1中的引物pEBKan194-F/pEBKan194-R，PCR扩增约5300bp的载体骨架片段，并用DpnI内切酶消化后DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体骨架片段，将载体骨架与up+down重叠片段进行组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选到的阳性菌株进行DNA测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用；该质粒命名为pEBKan194-GFP-apr-up+down；
表1. pEBKan194-GFP-apr-up+down载体构建引物
引物名称引物序列(5’-3’)
apr-up-F GACTCTAGAGGATCCctacaccctttcattgacagaatc
apr-up-R CGTTTCTTTGCcgcttgatgaaatcagctcatgtgaaag
apr-down-F cacatgagctgatttcatcaagcgGCAAAGAAACGATC
apr-down-R GAGCTCGGTACCCGGaaagcggtatgctctatggac
pEBKan194-F CCGGGTACCGAGCTCGAGGC
pEBKan194-R GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGC
PEBKan194-F(ce) GTTTATGCATCCCTTAACCG
PEBKan194-R(ce) TTTACCAGACAACCATTACCT
apr-F双 ctccatcaatgacaatgataatcattatc
apr-R双 gtacgccgttttaggagctc
(2)电击转化宿主菌：
I.制备地衣芽孢杆菌感受态细胞；
II.电击转化：将质粒pEBKan194-GFP-apr-up+down电击转化到地衣芽孢杆菌感受态细胞中，倒置于37℃培养箱过夜培养至长出单菌落；
(3)基因敲除菌株的筛选：
I.转化子鉴定：
在紫外灯下观察步骤(2)平板上长出的转化子，挑取有绿色荧光的菌落过夜培养，过夜培养的菌液，提取质粒，进行酶切分析，阳性菌株加入终浓度为20％的甘油冻存在-80℃冰箱；
II.单交换传代与筛选：
将过夜培养的阳性菌液，传代，从划线平板上挑取单菌落到含有卡那霉素的LB培养基中，振荡培养至菌液浑浊，菌液PCR筛选阳性菌株，用表1中的pEBKan194-F(ce)/apr-R双或apr-F双/pEBKan194-R(ce)引物对，对单菌落进行PCR验证并DNA测序确认；
III.双交换传代与筛选：
将单交换筛选为阳性的菌株，按0.2％的比例接种至LB培养基，每12h转接一次，如此转接2-3次，筛选抗性缺失株，用表1中的apr-F双/apr-R双为引物对，对单菌落进行PCR验证，敲除正确的菌株命名为CICC10266-1；
2)在原始基因敲除位点整合无苯丙氨酸蛋白基因
(1)编码无苯丙氨酸蛋白PKU2基因的合成
以芽孢杆菌来源的蛋白酶蛋白序列(Genebank：MK085119.1)作为模板，进行苯丙氨酸的敲除替换，并进行部分氨基酸的重排，获得无苯丙氨酸目的蛋白PKU2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，根据蛋白PKU2的序列和表达系统密码子偏好，设计并全基因合成表达基因(完整表达框)；
(2)无苯丙氨酸蛋白PKU2基因的敲入
以pEBKan194-GFP-apr-up+down质粒为模板，用表2中的引物P-LC-F/P-ydeD-R，PCR扩增约6800bp的载体骨架，用DpnI内切酶消化后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，用表2中的引物PKU2-F/PKU 2-R，PCR扩增PKU2完整表达框约1800bp，将消化回收的载体骨架与PKU2完整表达框按照无缝克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选到的阳性菌株经DNA测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用；
表2. pEBKan194-GFP-apr-up+PKU2+down载体构建相关引物
(3)、(4)的筛选步骤同步骤1)表达菌种中原始基因的敲除中的(2)、(3)；
将整合了目的基因PKU2的重组菌株进行验证和保种，命名为重组地衣芽孢杆菌BL01；
3)在单拷贝整合菌株的基础上，可用相同方法在基因组其他位点整合目的基因，构建双拷贝菌株BL02和三拷贝重组菌株BL03或更高拷贝数的表达菌种，进一步提高目的蛋白的表达量。
2.根据权利要求1所述的一种表达重组无苯丙氨酸蛋白PKU2的地衣芽孢杆菌重组工程菌的构建方法获得的重组地衣芽孢杆菌BL01、BL02或BL03。
3.一种苯丙酮尿症患者适用的无/低苯丙氨酸含量的蛋白粉的生产方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)菌种活化：将权利要求2所述的重组地衣芽孢杆菌接种于LB平板培养基，于37℃培养
12～15h，制备活化后的单菌落菌种；
2)种子液制备：挑取步骤1)中的单菌落接种到LB培养基中，摇床培养，摇床条件设定：
37℃，180～220rpm培养10～15h，得到一级种子液；按3～5％的接种量转接LB培养基扩大培养，得到上罐种子液；
3)发酵罐培养：按照体积比3％～5％的接种量将种子液接种发酵罐，发酵条件为：37℃，罐压0.03～0.05MPa，通风量0.6～1.2vvm，初始pH为7.0～7.5，培养46～68h；在发酵12～15h开始补料，补加碳源速率控制在1.8～3.2g/L/h，补加氮源速率控制在0.6～1.2g/L/h，控制pH6.70～7.00；
其中，发酵基础培养基各组分用量为：碳源2％～5％、氮源2％～5％、K2HPO40.3％～
0.6％、NaH2PO4 0.6％～1.2％、CaCl2 0.02％～0.06％、MgSO4·7H2O 0.06％～0.10％、MnSO4 0.01％～0.03％和消泡剂0.1～0.3％；补料培养基的碳源为葡萄糖；氮源为大豆水解蛋白、大豆蛋白胨或酵母粉任意一种；
4)提取纯化及喷雾：采用离心、板框或陶瓷膜进行固液分离，滤液采用陶瓷膜或正压过滤方式除菌，调节滤液pH使目标蛋白沉淀，对得到的目标蛋白沉淀进行清洗浓缩，然后对蛋白进行灭菌、喷雾干燥，最终得到无/低苯丙氨酸含量的蛋白粉。
4.根据权利要求3所述的苯丙酮尿症患者适用的无/低苯丙氨酸含量的蛋白粉的生产方法，其特征在于，所述步骤3)中的发酵基础培养基中的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉的任意一种或一种以上的组合；氮源包括但不限于大豆蛋白胨、大豆分离蛋白、大豆蛋白粉、大豆水解蛋白、硫酸铵的任意一种或一种以上的组合。
5.根据权利要求3所述的苯丙酮尿症患者适用的无/低苯丙氨酸含量的蛋白粉的生产方法，其特征在于，所述步骤4)中经固液分离后的滤液调节pH至1.5～3.5进行蛋白的沉淀，pH调节剂优选盐酸及盐酸缓冲液，磷酸及磷酸缓冲液；酸沉蛋白加入3倍体积纯化水稀释经陶瓷膜或蝶式离心清洗，重复清洗3～4次，得到蛋白清洗浓液。
6.根据权利要求3所述的苯丙酮尿症患者适用的无/低苯丙氨酸含量的蛋白粉的生产方法，其特征在于，所述步骤4)中蛋白清洗浓液经巴氏消毒后，喷雾进行干燥，进风温度为
160～200℃，出风温度为70～90℃，得到无/低苯丙氨酸含量的蛋白粉。
7.权利要求3-6任一项所述的苯丙酮尿症患者适用的无/低苯丙氨酸含量的蛋白粉的生产方法在制备治疗苯丙酮尿症和/或高苯丙氨酸血症的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的产品为药物、食品、保健品或医学用配方食品。

说明书全文

一种特殊膳食蛋白质的生产方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地涉及在地衣芽孢杆菌中的表达及生产苯丙酮尿症患者适用的重组蛋白质的方法，其中包括在设计重组蛋白时，以芽孢杆菌来源的蛋白酶蛋白序列作为模板，进行苯丙氨酸的敲除替换，并进行部分氨基酸的重排，从而保证新设计的无苯丙氨酸蛋白在发酵过程中是有蛋白酶活力的，在发酵后处理过程中，可经过简单处理使其蛋白酶活力永久性丧失，从而保证膳食蛋白的安全性。

背景技术

[0002] 苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)是一种罕见的氨基酸代谢遗传病，在中国新生儿中的发病率约为1:11800，全国PKU患者总人数在12万人左右。PKU为常染色体隐性遗传，是由于苯丙氨酸代谢途径中的关键酶(PAH)或辅因子(BH4)缺失，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸在脑和血浆中蓄积，也称高苯丙氨酸血症(HPA)，体内的苯丙氨酸主要从尿中排出。在患者出生3-4个月时就开始表现出来典型症状，一岁时症状明显。PKU的主要表现形式为各种毒性物质在大脑中累积，引起中枢神经系统的损害，影响人们思考、感受和行为方式，其主要表现为生长及智力发育迟缓、抽搐、反射亢进、湿疹和鼠气味等，如不及时治疗，可造成智力低下

[0003] 大多数国家通常会对出生后的新生儿进行筛查。如果在生命早期未被发现和未及时治疗，PKU会导致婴儿神经系统不可逆转的损害、严重的智力迟钝和大脑发育不良。据报道，如果不及时治疗，婴儿在出生后的第一年就会损失智商。根据治疗开始时的年龄，不同年龄期间的血液Phe水平和膳食治疗PKU的依从性不可避免地会伴随着至少一些智商的丧失。一旦检测到，可通过向婴儿和之后的儿童提供Phe限制膳食来治疗该病症。

[0004] 苯丙酮尿症根据血液中苯丙氨酸的含量分为以下几个类型：当未经治疗时，血浆Phe浓度大于1200μmol/L的，称为经典型PKU(最严重的PKU)；未经治疗，血浆Phe浓度在600-1200μmol/L中间的，称为轻度型PKU；未经治疗，血浆Phe浓度在180-600μmol/L中间的，称为良性PKU(或非PKU-HPA)。具有经典型(或严重)PKU的个体必须采用基于极低Phe膳食的严格膳食方案进行治疗，以将其Phe浓度降低至安全范围。这种中等程度形式的PKU通过使用适度的膳食限制来管理，例如：相对低蛋白质的膳食，不需要补充无Phe的氨基酸配方。患有非PKU-HPA的个体通常不被治疗，因为他们被认为具有在“安全”范围内的血浆Phe水平。在膳食PKU治疗中，目标范围是<360μmol/L，高达600μmol/L的范围也被认为是可接受的。

[0005] 苯丙酮尿症(PKU)的目前的主要治疗途径有以下几种：

[0006] 1)饮食疗法

[0007] 通过控制摄入苯丙氨酸含量的膳食疗法来治疗苯丙酮尿症的历史最为悠久。早在20世纪50年代就开始了苯丙氨酸限制膳食治疗PKU，通过蛋白质水解的方式，然后通过肽的过滤步骤去除尽可能多的Phe后，向患者提供必需氨基酸(Phe除外)。基本要求为在保证人体正常生长发育所需的苯丙氨酸摄入量的基础上限制苯丙氨酸的摄入。为避免血液中苯丙氨酸浓度增高所致的脑神经不可逆损伤，PKU患者自新生儿期起就开始控制饮食，坚持终身治疗。传统的苯丙氨酸限制饮食疗法存在诸多的缺点：(1)由于大多数食物的蛋白质中都含有苯丙氨酸，所以能选择的食物非常受限，只能选择不含蛋白质或者含蛋白质很低的食物，导致病人的氮代谢紊乱，引发并发症，(2)以氨基酸复配粉作为饮食蛋白质的替代物，由于多种氨基酸均有很强的苦涩味以及特殊不愉快气味，导致氨基酸复配粉的口感差，患者治疗依从性较差；另外，由于口服大量游离氨基酸，导致肠道的渗透压紊乱，引发肠道不适以及肠道代谢紊乱；再次之，氨基酸粉能做成的食物形式非常有限，长期服用导致患者的生活质量下降。(3)由于生活质量差导致神经和心理问题不断；(4)饮食的长期受限制或选择单一导致营养缺乏；(5)特殊食品和营养素的花费较大，家庭负担较重。

[0008] 糖巨肽(Glycomacropeptide，GMP)是制作奶酪期间从乳清中提取的天然低苯丙氨酸蛋白质，也是目前苯丙酮尿症患者适用的唯一低苯丙氨酸的膳食蛋白质。纯GMP缺乏芳香族氨基酸苯丙氨酸(Phe；F)，但同时也缺乏酪氨酸(Tyr；Y)和色氨酸(Trp；W)以及精氨酸(Arg；R)、组氨酸(His；H)和半胱氨酸(Cys；C)等必需氨基酸和重要氨基酸。糖巨肽在乳汁中的含量较低，约占乳清蛋白的15-20％，除糖巨肽外，其他蛋白都是含有苯丙氨酸的，因此需要经过多步精细纯化才能得到较纯的糖巨肽，市场上销售的糖巨肽产品的苯丙氨酸含量约4mg/g[Kyungwha Lim,Molecular Genetics and Metabolism,(2007)]。然而，由于糖巨肽缺乏多种必需氨基酸，不能作为膳食蛋白质的唯一来源，因此需要复配其他必需氨基酸组合作为低苯丙氨酸饮食，由于其并不是完全无苯丙氨酸蛋白粉，因此其可以作为一种辅助疗法替代部分氨基酸饮食。另外，由于生产纯化工艺十分复杂，一般乳品厂无法大批量生产出合格的低苯丙氨酸的糖巨肽，所以市场售价昂贵，且市场占有率也很低。根据《中国居民膳食营养素参考摄入量(2013版)》的规定，苯丙酮尿症患者对膳食蛋白质的需求量为0.8-
1.2g/kg·d，也就是每天需求总量15-75g，普通患者经济上很难支撑长期服用如此大量的糖巨肽蛋白产品。目前绝大多数的苯丙氨酸限制饮食的产品均为复配氨基酸粉。

[0009] 2)药物治疗

[0010] 沙丙蝶呤是BH4的药物形式，FDA于2007年12月26日批准BioMarin Pharmaceutical研发生产的Kuvan上市，其主要针对的是四氢生物蝶呤(BH4)缺乏症所致的高苯丙氨酸血症(HPA)。BH4为孤儿药，价格偏高，在国内供应渠道较少。注射用PEG修饰的苯丙氨酸解氨酶(商品名：Palynziq)，FDA于2018年批准Bio Marin制药公司用于成人治疗苯丙酮尿症。适用于那些使用已有治疗药物无法控制病情(血液苯丙氨酸浓度失控)的成年PKU患者。治疗苯丙酮尿症的药物为孤儿新药，价格昂贵，且并非对所有苯丙酮尿症患者有效，且长期使用，产生免疫原性导致效果逐渐变差。

[0011] 3)大分子中性氨基酸(LNAA)

[0012] 由于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸及一些支链氨基酸等大的中性氨基酸(Large neutral amino acids)是通过共同的转运载体L-type amino acid transporter(LAT1,SLC7A5)通过血脑屏障进入大脑的，因此，血液中苯丙氨酸过高会和其他的LNAA竞争转运载体，研究证实补充LNAA可以降低大脑中苯丙氨酸浓度，从而缓解高浓度苯丙氨酸对大脑神经的毒害和引起的智力障碍。LNAA的补充剂，同样面临着口服氨基酸的缺点，如苦涩味重，口感差，引起肠道不适以及肠道功能紊乱等。

[0013] 常见的优质食物蛋白质，如乳清蛋白，卵蛋白，大豆蛋白等，其苯丙氨酸含量均比较高(约3.1-5.35％)[Christopher J.Rasmussen,Nutritional Supplements in Sports and Exercise，(2008)；Maria Minnaar，USDA，(1994)]，不适合苯丙酮尿症患者食用。另外这些蛋白质的LNAA与苯丙氨酸的比值较低(约5.89-11.06)，无法起到有效抑制苯丙氨酸进入大脑的作用。目前作为苯丙酮尿症患者唯一适用的天然的苯丙氨酸食物蛋白---酪蛋白糖巨肽，虽然苯丙氨酸含量较低，但是其缺少了多种必需氨基酸，需要复配氨基酸粉组合才能使用，影响口感体验。

[0014] 目前尚没有一种蛋白质可满足苯丙酮尿症患者的所有氨基酸需求，可作为苯丙酮尿症患者的唯一蛋白质食物来源。也没有一种蛋白质满足低苯丙氨酸含量，同时含有较高比例的LNAA氨基酸。因此，开发一种苯丙酮尿症患者适用的低苯丙氨酸含量，且含有较高LNAA的蛋白质，可显著提升苯丙酮尿症患者的生存质量，具有巨大的社会意义和商业价值。

[0015] 满足苯丙酮尿症患者长期食用的膳食蛋白必须满足两个条件，一个是苯丙氨酸含量必须非常低，氨基酸种类齐全且安全性好；还有一个是生产成本必须便宜。因为苯丙酮尿症患者需要长期使用且每天摄入的蛋白都至少在15-75g以上，如果表达效率低或生产纯化工艺复杂，则会导致产量受限以及售价昂贵，普通苯丙酮尿症患者经济上无法承受，那这样的产品是无法适应市场需求的。

发明内容

[0016] 为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种在地衣芽孢杆菌中表达及生产苯丙酮尿症患者适用的重组蛋白质的方法。地衣芽孢杆菌表达生产的重组无苯丙氨酸蛋白中LNAA与Phe的质量比值超过100倍，可有效降低血液中的苯丙氨酸进入大脑，从而保护患者的智力。本发明采用基因工程手段改造地衣芽孢杆菌，将无苯丙氨酸的目的蛋白基因整合到宿主的基因组中，使其高效且持续的表达无/低苯丙氨酸的蛋白，采用补料发酵工艺延长菌种对数生长期时间，从而延长蛋白表达时间，提高蛋白表达量，收集发酵液并通过固液分离除去菌体、调节pH沉淀蛋白及浓缩清洗、喷雾干燥得到无/低苯丙氨酸的蛋白粉，且由于本发明以芽孢杆菌来源的蛋白酶蛋白序列作为模板，进行苯丙氨酸的敲除替换，并进行部分氨基酸的重排，从而保证新设计的无苯丙氨酸蛋白在发酵过程中具有蛋白酶特异性活力，降解掉发酵液中的杂蛋白，提高发酵产物中的目的蛋白的纯度，因此经本发明技术发酵表达得到的目的蛋白纯度较高。

[0017] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0018] 第一方面，本发明提供一种表达重组无苯丙氨酸蛋白PKU2的地衣芽孢杆菌重组工程菌的构建方法，包括以下步骤：

[0019] 1)表达菌种中原始基因的敲除

[0020] (1)敲除质粒的构建；

[0021] 以地衣芽孢杆菌CICC10266的基因组DNA为模板，用表1中的引物apr-up-F/apr-up-R，apr-down-F/apr-down-R，PCR扩增上游同源臂apr-up和下游同源臂apr-down，然后以apr-up-F/apr-down-R为引物，通过重叠PCR扩增apr-up+down，并用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR片段；以pEBKan194-GFP质粒为模板，用表1中的引物pEBKan194-F/pEBKan194-R，PCR扩增约5300bp的载体骨架片段，并用DpnI内切酶消化后DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体骨架片段，将载体骨架与up+down重叠片段进行组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选到的阳性菌株进行DNA测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用；该质粒命名为pEBKan194-GFP-apr-up+down；

[0022] 表1.pEBKan194-GFP-apr-up+down载体构建引物

[0023]引物名称引物序列(5’-3’)
apr-up-F GACTCTAGAGGATCCctacaccctttcattgacagaatc
apr-up-R CGTTTCTTTGCcgcttgatgaaatcagctcatgtgaaag
apr-down-F cacatgagctgatttcatcaagcgGCAAAGAAACGATC
apr-down-R GAGCTCGGTACCCGGaaagcggtatgctctatggac
pEBKan194-F CCGGGTACCGAGCTCGAGGC
pEBKan194-R GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGC
PEBKan194-F(ce) GTTTATGCATCCCTTAACCG
PEBKan194-R(ce) TTTACCAGACAACCATTACCT
apr-F双 ctccatcaatgacaatgataatcattatc
apr-R双 gtacgccgttttaggagctc

[0024] (2)电击转化宿主菌：

[0025] I.制备地衣芽孢杆菌感受态细胞；

[0026] II.电击转化：将质粒pEBKan194-GFP-apr-up+down电击转化到地衣芽孢杆菌感受态细胞中，倒置于37℃培养箱过夜培养至长出单菌落；

[0027] (3)基因敲除菌株的筛选：

[0028] I.转化子鉴定：

[0029] 在紫外灯下观察步骤(2)平板上长出的转化子，挑取有绿色荧光的菌落(因质粒上有GFP基因)过夜培养，过夜培养的菌液，提取质粒，进行酶切分析，阳性菌株加入终浓度为20％的甘油冻存在-80℃冰箱；

[0030] II.单交换传代与筛选：

[0031] 将过夜培养的阳性菌液，传代，从划线平板上挑取单菌落到含有卡那霉素的LB培养基中，振荡培养至菌液浑浊，菌液PCR筛选阳性菌株，用表1中的pEBKan194-F(ce)/apr-R双或apr-F双/pEBKan194-R(ce)引物对，对单菌落进行PCR验证并DNA测序确认；

[0032] III.双交换传代与筛选：

[0033] 将单交换筛选为阳性的菌株，按0.2％的比例接种至LB培养基，每12h转接一次，如此转接2-3次，筛选抗性缺失株，用表1中的apr-F双/apr-R双为引物对，对单菌落进行PCR验证，敲除正确的菌株命名为CICC10266-1；

[0034] 2)在原始基因敲除位点整合无苯丙氨酸蛋白基因

[0035] (1)编码无苯丙氨酸蛋白PKU2基因的合成

[0036] 本发明以芽孢杆菌来源的蛋白酶蛋白序列(Genebank：MK085119.1)作为模板，进行苯丙氨酸的敲除替换，并进行部分氨基酸的重排，获得无苯丙氨酸目的蛋白PKU2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，根据蛋白PKU2的序列和表达系统密码子偏好，设计并全基因合成表达基因(完整表达框)；

[0037] (2)无苯丙氨酸蛋白PKU2基因的敲入

[0038] 以pEBKan194-GFP-apr-up+down质粒为模板，用表2中的引物P-LC-F/P-ydeD-R，PCR扩增约6800bp的载体骨架，用DpnI内切酶消化后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，用表2中的引物PKU2-F/PKU2-R，PCR扩增PKU2完整表达框约1800bp，将消化回收的载体骨架与PKU2完整表达框按照无缝克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选到的阳性菌株经DNA测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用；

[0039] 表2.pEBKan194-GFP-apr-up+PKU2+down载体构建相关引物

[0040]

[0041]

[0042] (3)、(4)的筛选步骤同步骤1)表达菌种中原始基因的敲除中的(2)、(3)；

[0043] 将整合了目的基因PKU2的重组菌株进行验证和保种，命名为重组地衣芽孢杆菌BL01。

[0044] 3)在单拷贝整合菌株的基础上，可用相同方法在基因组其他位点整合目的基因，构建双拷贝菌株BL02和三拷贝重组菌株BL03或更高拷贝数的表达菌种，进一步提高目的蛋白的表达量。

[0045] 第二方面，提供根据第一方面提供的一种表达重组无苯丙氨酸蛋白PKU2的地衣芽孢杆菌重组工程菌的构建方法获得的重组地衣芽孢杆菌BL01，BL02，BL03。

[0046] 第三方面，提供一种苯丙酮尿症患者适用的无/低苯丙氨酸含量的蛋白粉的生产方法，具体步骤如下：

[0047] 1)菌种活化：将上述获得的重组地衣芽孢杆菌接种于LB平板培养基，于37℃培养12～15h，制备活化后的单菌落菌种；

[0048] 2)种子液制备：挑取将步骤1)中的单菌落接种到LB培养基中，摇床培养，摇床条件设定：37℃，180～220rpm培养10～15h，得到一级种子液；按3～5％的接种量转接LB培养基扩大培养，得到上罐种子液；

[0049] 3)发酵罐培养：按照体积比3％～5％的接种量将种子液接种发酵罐，发酵条件为：37℃，罐压0.03～0.05MPa，通风量0.6～1.2vvm，初始pH为7.0～7.5，培养46～68h；在发酵
12～15h开始补料，补加碳源速率控制在1.8～3.2g/L/h，补加氮源速率控制在0.6～1.2g/L/h，控制pH6.70～7.00；

[0050] 其中，发酵基础培养基各组分用量为：碳源2％～5％、氮源2％～5％、K2HPO4 0.3％～0.6％、NaH2PO4 0.6％～1.2％、CaCl2 0.02％～0.06％、MgSO4·7H2O 0.06％～0.10％、MnSO4 0.01％～0.03％和消泡剂0.1～0.3％；补料培养基的碳源为葡萄糖；氮源为大豆水解蛋白、大豆蛋白胨或酵母粉任意一种；

[0051] 4)提取纯化及喷雾：采用离心、板框或陶瓷膜进行固液分离，滤液采用陶瓷膜或正压过滤方式除菌，调节滤液pH使目标蛋白沉淀，对得到目标蛋白沉淀进行清洗浓缩，然后对蛋白进行灭菌、喷雾干燥，最终得到无/低苯丙氨酸含量的蛋白粉。

[0052] 优选地，上述步骤3)中的发酵基础培养基中的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、可溶性淀粉的任意一种或一种以上的组合；氮源包括但不限于大豆蛋白胨、大豆分离蛋白、大豆蛋白粉、大豆水解蛋白、硫酸铵的任意一种或一种以上的组合。

[0053] 优选地，上述步骤4)中经固液分离后的滤液调节pH至1.3～3.5进行蛋白的沉淀，pH调节剂优选盐酸及盐酸缓冲液，磷酸及磷酸缓冲液；酸沉蛋白加入3倍体积的纯化水稀释经陶瓷膜或蝶式离心清洗，重复清洗3～4次，得到蛋白清洗浓液。

[0054] 优选地，上述步骤4)中蛋白清洗浓液经巴氏消毒后，喷雾进行干燥，进风温度为160～200℃，出风温度为70～90℃，得到无/低苯丙氨酸含量的蛋白粉。

[0055] 第四方面，提供上述方法在制备治疗苯丙酮尿症和/或高苯丙氨酸血症的产品中的应用。

[0056] 优选地，所述的产品为药物、食品、保健品或医学用配方食品。

[0057] 本发明的有益效果在于：

[0058] 1、地衣芽孢杆菌表达生产的重组无苯丙氨酸蛋白中LNAA总量与Phe的比值超过100倍，可有效降低血液中的苯丙氨酸进入大脑，从而保护患者的智力。

[0059] 2、本发明以芽孢杆菌来源的高表达的蛋白酶蛋白序列作为模板，进行苯丙氨酸的敲除替换，并进行部分氨基酸的重排，从而保证新设计的无苯丙氨酸蛋白在发酵过程中具有蛋白酶特异性活力，降解掉其他杂蛋白或者抑制其他杂蛋白的生长，因此可以使发酵出来的蛋白质比较纯，后续纯化的难度下降，在发酵后处理过程中，可经过简单处理使其蛋白酶活力永久性丧失，从而保证膳食蛋白的安全性。因此，本发明可通过简便工艺就可以达到很高的纯度，避免使用复杂的后处理纯化设备而增加生产成本，经发酵表达得到的蛋白纯度较高。

[0060] 3、本发明采用基因工程手段改造地衣芽孢杆菌，将无苯丙氨酸的目的蛋白基因整合到宿主的基因组中，使其高效且持续的表达无/低苯丙氨酸的蛋白，采用补料发酵工艺延长菌种对数生长期时间，从而延长蛋白表达时间，提高蛋白表达量，发酵结束后，发酵液中的蛋白浓度至少为5g/L

[0061] 4、本发明同时对调节pH沉淀蛋白，浓缩及清洗等后处理工艺进行优化，得到的蛋白粉纯度高，口感佳，且可与大多数的配料兼容，制作成为形式多样，体验丰富的各种产品。

[0062] 按照本专利方法生产无/低苯丙氨酸的蛋白粉的生产成本可降低至普通蛋白制品的价格，有巨大的实际应用价值和广阔的市场前景。附图说明

[0063] 图1为喷干粉的蛋白纯度的SDS-PAGE图；

[0064] M：蛋白分子量marker；1：实施例2制备的蛋白粉；2：实施例3制备的蛋白粉；3：实施例4制备的蛋白粉；4：实施例5制备的蛋白粉；5：实施例6制备的蛋白粉；

[0065] 图2为实施例2制备的无/低苯丙氨酸蛋白粉的体外模拟消化图；

[0066] 1：无苯丙氨酸蛋白粉；2：蛋白分子量marker；3：无苯丙氨酸蛋白粉人工胃液消化1min；4：无苯丙氨酸蛋白粉人工胃液消化5min；5：无苯丙氨酸蛋白粉人工胃液消化10min；
6：无苯丙氨酸蛋白粉人工胃液消化20min；7：无苯丙氨酸蛋白粉人工胃液消化30min；8：人工胃液；9：无苯丙氨酸蛋白粉；10：无苯丙氨酸蛋白粉人工肠液消化1min；11：无苯丙氨酸蛋白粉人工肠液消化5min；12：无苯丙氨酸蛋白粉人工肠液消化10min；13：无苯丙氨酸蛋白粉人工肠液消化20min；14：无苯丙氨酸蛋白粉人工肠液消化30min；15：人工肠液；

具体实施方式

[0067] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

[0068] 实施例1：表达无/低苯丙氨酸含量蛋白质的地衣芽孢杆菌菌种的构建[0069] 实施例中采用的地衣芽孢杆菌菌种(B.licheniformis CICC 10266)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

[0070] 实施例中采用的pEBKan194-GFP质粒为申请人的另外1件专利申请(申请号：201610410811.8)中的pKGFP194ts，其构建信息参见该申请的说明书实施例1。

[0071] 试验用试剂除特别注明外，均为市售科研试剂或耗材，各种试剂及培养基的成分和配制方法可参考常规实验手册中的操作。

[0072] 一、无苯丙氨酸蛋白表达菌种BL01的构建

[0073] 1.表达菌种中原始基因的敲除

[0074] (1)敲除质粒的构建；

[0075] 以地衣芽孢杆菌CICC10266的基因组DNA为模板，用表1中的引物apr-up-F/apr-up-R，apr-down-F/apr-down-R，PCR扩增上游同源臂apr-up和下游同源臂apr-down，然后以apr-up-F/apr-down-R为引物，通过重叠PCR扩增apr-up+down，并用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR片段；以pEBKan194-GFP质粒为模板，用表1中的引物pEBKan194-F/pEBKan194-R，PCR扩增约5300bp的载体骨架片段，用DpnI内切酶消化2h后用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段；将消化回收的载体骨架与up+down重叠片段按照无缝克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit，南京诺唯赞生物科技)的方法进行组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB平板(加入终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液PCR筛选，筛选到的阳性菌株进行DNA测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用。

[0076] 表1.pEBKan194-GFP-apr-up+down载体构建引物

[0077] 引物名称引物序列(5’-3’)apr-up-F GACTCTAGAGGATCCctacaccctttcattgacagaatc
apr-up-R CGTTTCTTTGCcgcttgatgaaatcagctcatgtgaaag
apr-down-F cacatgagctgatttcatcaagcgGCAAAGAAACGATC
apr-down-R GAGCTCGGTACCCGGaaagcggtatgctctatggac
pEBKan194-F CCGGGTACCGAGCTCGAGGC
pEBKan194-R GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGC
pEBKan194-F(ce) GTTTATGCATCCCTTAACCG
pEBKan194-R(ce) TTTACCAGACAACCATTACCT
apr-F双 ctccatcaatgacaatgataatcattatc
apr-R双 gtacgccgttttaggagctc

[0078] (2)电击转化宿主菌；

[0079] I.地衣芽孢杆菌感受态细胞的制备：

[0080] 将冻存地衣芽孢杆菌菌种在LB平板上划线，置于37℃培养箱过夜培养。从新鲜平板上挑取单菌落接种于5ml LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养。吸取过夜培养的菌液转接至GM培养基，控制好接种量，使接种完后的OD600在0.19-0.2之间。37℃，200rpm培养至OD600＝1.0(大约需要3-4小时)左右。取全部菌液转移至50ml无菌离心管，冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。用40ml在4℃预冷的电转缓冲液(ETM)洗涤菌体，
5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此重复漂洗3次。将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl，冻存于-80℃冰箱。

[0081] II.电击转化：

[0082] 取一管冻存的60μl感受态细胞，插入冰上，微微解冻时加入5-10μl目的重组质粒，轻弹管底混匀，冰浴孵育5min，转移至预冷的电转杯(1mm)中，电击一次。电转仪参数设置：2.10kV，电击1次(持续时间4.5ms-5.0ms之间)。电击完毕立即加入1ml复苏培养基RM，30℃，
200rpm复苏培养3h后，涂布LB平板(含终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落。

[0083] (3)基因敲除菌株的筛选。

[0084] I.转化子鉴定：

[0085] 在紫外灯下观察步骤(2)平板上长出的转化子，挑取有绿色荧光的菌落(因质粒上有GFP基因)，接种至LB培养基(加入终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，30℃，200rpm过夜培养。过夜培养的菌液，提取质粒，进行酶切分析，阳性菌株加入终浓度为20％的甘油冻存在-80℃冰箱。

[0086] II.单交换传代与筛选：

[0087] 将过夜培养的阳性菌液，按0.2％的比例接种至LB培养基(加入终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，42℃，200rpm振荡培养，每8-12h转接一次，如此转接3-5次。传代培养的菌液在LB琼脂平板上(加入相应的抗生素)划线，倒置于37℃培养箱过夜培养。从划线平板上挑取单菌落至200uL LB培养基(加入终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，37℃，200rpm振荡培养至菌液浑浊，菌液PCR筛选阳性菌株，用表1中的pEBKan194-F(ce)/apr-R双或apr-F双/pEBKan194-R(ce)引物对，对单菌落进行PCR验证并DNA测序确认。

[0088] III.双交换传代与筛选：

[0089] 将单交换筛选为阳性的菌株，按0.2％的比例接种至LB培养基，42℃，200rpm振荡培养，每12h转接一次，如此转接2-3次。传代培养的菌液，用无菌水稀释106倍，取100uL涂布LB琼脂平板，倒置于37℃培养箱过夜培养。从平板上挑取单菌落分别点至LB(加入相应抗生素)和LB无抗平板，一一对应，倒置于37℃培养箱过夜培养。观察两种平板上菌落生长状况，挑取在抗性平板上未生长而在无抗平板上生长良好的菌落至200uL LB培养基，37℃，200rpm振荡培养至菌液浑浊，菌液PCR筛选阳性菌株，用表1中的apr-F双/apr-R双为引物对，对菌落进行PCR验证，敲除正确的菌株命名为CICC10266-1。

[0090] 2.在原始基因敲除位点整合无苯丙氨酸蛋白基因

[0091] (1)无苯丙氨酸蛋白PKU2基因的敲入

[0092] 根据无苯丙氨酸目的蛋白序列(PKU2，蛋白序列见SEQ ID NO:1)和表达系统密码子偏好，设计并全基因合成表达基因。以pEBKan194-GFP-apr-up+down质粒为模板，用表2中的引物P-LC-F/P-ydeD-R，PCR扩增约6800bp的载体骨架，用DpnI内切酶消化2h后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，用表2中的引物PKU2-F/PKU2-R，PCR扩增PKU2完整表达框约1800bp，将消化回收的载体骨架与PKU2完整表达框按照无缝克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB平板(含终浓度为20μg/ml的卡那霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液PCR筛选，筛选到的阳性菌株经DNA测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用。

[0093] 表2.pEBKan194-GFP-apr-up+PKU2+down载体构建相关引物

[0094]

[0095]

[0096] (2)重组质粒转化apr基因敲除菌株

[0097] 制备地衣芽孢杆菌10266-1感受态细胞，将重组质粒pEBKan194-GFP-apr-up+PKU2+down，电击转化进10266-1。具体操作方法同1中的(2)。

[0098] (3)重组菌株的筛选

[0099] 筛选方法同1中的(3)。

[0100] 将整合了目的基因PKU2的重组菌株进行验证和保种，命名为重组地衣芽孢杆菌BL01。

[0101] 二、无苯丙氨酸蛋白表达菌种BL02的构建

[0102] 1、lytD位点敲入载体的构建

[0103] 以地衣芽孢杆菌CICC10266的基因组DNA为模板，用表3中的引物lytD-up-F/lytD-up-R，PKU2-F2/PKU2-R2，lytD-down-F/lytD-down-R，PCR扩增上游同源臂lytD-up、PKU2和下游同源臂lytD-down，然后以lytD-up-F/lytD-down-R为引物，通过三片段重叠PCR扩增lytD-up+PKU2+down，并用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR片段；以pEBKan194-GFP质粒为模板，用表1中的引物pEBKan194-F/pEBKan194-R，PCR扩增约5300bp的载体骨架片段，用DpnI内切酶消化2h后用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段；将消化回收的载体骨架与up+PKU2+down重叠片段按照无缝克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit，南京诺唯赞生物科技)的方法进行组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB平板(加入终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液PCR筛选，筛选到的阳性菌株进行DNA测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用。

[0104] 表3.pEBKan194-GFP-lytD-up+PKU2+down载体构建相关引物

[0105]

[0106]

[0107] 2、重组质粒转化单拷贝重组菌株菌株

[0108] 制备地衣芽孢杆菌BL01感受态细胞，将重组质粒pEBKan194-GFP-lytD-up+PKU2+down电击转化进BL01，具体操作方法同1中的(2)。

[0109] 3、重组菌株的筛选

[0110] 筛选方法同“一、无苯丙氨酸蛋白表达菌种BL01的构建”中的1步骤(3)。

[0111] 将整合了双拷贝目的基因PKU2的重组菌株进行验证和保种，命名为重组地衣芽孢杆菌BL02。

[0112] 三、无苯丙氨酸蛋白表达菌种BL03的构建

[0113] 1、yqiI位点敲入载体的构建

[0114] 以地衣芽孢杆菌CICC10266的基因组DNA为模板，用表4中的引物yqiI-up-F/yqiI-up-R，PKU2-F3/PKU2-R3，yqiI-down-F/yqiI-down-R，PCR扩增上游同源臂yqiI-up、PKU2和下游同源臂yqiI-down，然后以yqiI-up-F/yqiI-down-R为引物，通过三片段重叠PCR扩增yqiI-up+PKU2+down，并用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR片段；以pEBKan194-GFP质粒为模板，用表1中的引物pEBKan194-F/pEBKan194-R，PCR扩增约5300bp的载体骨架片段，用DpnI内切酶消化2h后用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段；将消化回收的载体骨架与up+PKU2+down重叠片段按照无缝克隆试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit，南京诺唯赞生物科技)的方法进行组装，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB平板(加入终浓度为20ug/ml的卡那霉素)，倒置于30℃培养箱过夜培养至长出单菌落，挑取若干个单菌落进行菌液PCR筛选，筛选到的阳性菌株进行DNA测序确认，测序正确的阳性菌株用质粒提取试剂盒抽提质粒备用。

[0115] 表4.pEBKan194-GFP-yqiI-up+PKU2+down载体构建相关引物

[0116] 引物名称引物序列(5’-3’)yqiI-up-F GACTCTAGAGGATCCACGCGGATGGCTTCTAACAATTCGG
yqiI-up-R TACAGAAACGGGTGAAAGATCCGTCTTCCCGGAAAGCGGC
PKU2-F3 CGCTTTCCGGGAAGACGGATCTTTCACCCGTTTCTGTATG
PKU2-R3 ACAGCGTCAGCAATCGCGGGCATCAGGAAAAAGCTGCTGAC
yqiI-down-F AGCAGCTTTTTCCTGATGCCCGCGATTGCTGACGCTGTCG
yqiI-down-R GAGCTCGGTACCCGGCTTGGATTCAGTCTGTGGCATAAC
yqiI-F双 GGATCATATAAAGCGAAAGCCG
yqiI-R双 CTATTCCCGCAGCAATCAGC

[0117] 2、重组质粒转化双拷贝重组菌株菌株

[0118] 制备地衣芽孢杆菌BL02感受态细胞，将重组质粒pEBKan194-GFP-yqiI-up+PKU2+down电击转化进BL02，具体操作方法同1中的(2)。

[0119] 3、重组菌株的筛选

[0120] 筛选方法同“一、无苯丙氨酸蛋白表达菌种BL01的构建”中的1步骤(3)。

[0121] 将整合了三拷贝目的基因PKU2的重组菌株进行验证和保种，命名为重组地衣芽孢杆菌BL03。

[0122] 实施例2：无/低苯丙氨酸重组蛋白粉的发酵生产与纯化制备

[0123] 本实施例提供了一种无/低苯丙氨酸重组蛋白粉的生产方法，具体步骤如下：

[0124] 1)以实施例1构建的重组地衣芽孢杆菌BL01为出发菌种，采用5L发酵罐进行连续补料工艺发酵，发酵基础培养基为：玉米淀粉3％、大豆分离蛋白2％、酵母浸粉0.5％、K2HPO4 0.45％、NaH2PO4 0.7％、CaCl2 0.04％、MgSO4·7H2O 0.08％、MnSO4 0.02％、消泡剂0.1％、α-高温淀粉酶0.01％、调节pH至7.5，基础装液量为50％，120℃高温灭菌20min；补料培养基为：葡萄糖、大豆水解蛋白10％、酵母粉10％，120℃高温灭菌。发酵接种量5％，培养条件：37℃，通气量0.6～1.2vvm，通过调节转数和通气量使DO控制40％以上；发酵12h开始补料，补料速率为：葡萄糖1.8～2.8g/L/h，大豆水解蛋白+酵母粉0.7～0.9g/L/h，控制pH6.70～
6.80，发酵64h结束，蛋白浓度为5.0g/L。发酵液留样检测蛋白酶活力。

[0125] 2)将发酵液通过200nm陶瓷膜进行固液分离，得到发酵滤液，使用HCl调节pH至1.3～2.0，静置沉淀蛋白15～18h，将上清去除后，收集蛋白沉淀浓液，使用陶瓷膜进行清洗54倍体积后，收集浓液。取样经120℃烘干至恒重，测得固形物含量为1.3％。

[0126] 3)喷雾干燥过程：将上步骤得到的固形物含量为1.3％的蛋白液，于60℃保温20min进行巴氏杀菌，采用离心式喷雾干燥机喷雾，雾化盘转速24000～40000r/min，进风温度为160℃、出风温度为75℃条件下喷雾干燥制粉。经测定，喷干粉水份含量为4.56％。

[0127] 实施例3：无/低苯丙氨酸重组蛋白粉的生产

[0128] 本实施例提供了一种无/低苯丙氨酸重组蛋白粉的生产方法，具体步骤如下：

[0129] 1)以实施例1构建的重组地衣芽孢杆菌BL02为出发菌种，采用30L发酵罐进行连续补料工艺发酵，基础发酵培养基为：葡萄糖4％、大豆蛋白粉3％、K2HPO4 0.4％、NaH2PO4 0.8％、CaCl2 0.03％、MgSO4·7H2O 0.06％、MnSO4 0.03％、消泡剂0.2％，调节pH至7.5，基础装液量为40％，120℃高温灭菌20min；补料培养基为：葡萄糖40％、大豆水解蛋白15％+酵母粉5％，两者分别120℃高温灭菌。发酵接种量3％，培养条件：37℃，通气量0.6～1.2vvm，通过调节转数和通气量使DO控制50％以上；发酵15h开始补料，补料速率为：葡萄糖2.0～
3.0g/L/h，大豆水解蛋白+酵母粉0.75～0.95g/L/h，控制pH6.80～6.90，发酵46h结束，蛋白浓度为10.2g/L。发酵液留样检测蛋白酶活力。

[0130] 2)将发酵液通过蝶式离心机离心进行固液分离，得到的离心清液通过200nm陶瓷膜处理后，得到滤液，使用HCl调节pH至1.8～2.5，静置沉淀蛋白15～18h，将上清去除后，收集蛋白沉淀浓液，使用陶瓷膜进行清洗，处理64倍体积后，收集浓液。经测定，固形物含量为2.56％。

[0131] 3)喷雾干燥过程：将上步骤得到的固形物含量为2.56％的蛋白液，于60℃保温，采用离心式喷雾干燥机喷雾，雾化盘转速20000～30000r/min，进风温度为175℃、出风温度为80℃条件下喷雾干燥制粉。经测定，喷干粉的含水量为4.1％。

[0132] 实施例4：无/低苯丙氨酸重组蛋白粉的生产

[0133] 本实施例提供了一种无/低苯丙氨酸重组蛋白粉的生产方法，具体步骤如下：

[0134] 1)以实施例1构建的重组地衣芽孢杆菌菌种BL03为出发菌种，采用500L发酵罐进行连续补料工艺发酵，基础发酵培养基为：可溶性淀粉5％、大豆水解蛋白2％、(NH4)2SO4 1％、K2HPO4 0.6％、NaH2PO4 1.2％、CaCl2 0.02％、MgSO4·7H2O 0.06％、MnSO4 0.01％、消泡剂0.3％，调节pH至7.2，基础装液量为40％，120℃高温灭菌20min；补料培养基为：葡萄糖
40％、大豆蛋白胨18％+酵母粉2％，分开高温灭菌。发酵接种量3％，培养条件：37℃，通气量
0.6～1.2vvm，通过调节转数和通气量使DO控制30％以上；发酵12h开始补料，补料速率为：
葡萄糖2.2～3.2g/L/h，大豆水解蛋白+酵母粉0.75～0.95g/L/h，控制pH6.85～6.95，发酵
68h结束，蛋白浓度为14.3g/L。发酵液留样检测蛋白酶活力。

[0135] 2)将发酵液通过板框过滤进行固液分离，得到发酵清液通过陶瓷膜处理后，得到滤液，通过正压过滤除菌后，使用H3PO4调节pH至2.3～3.0，静置沉淀蛋白15～18h，将上清去除后，收集蛋白沉淀浓液，使用陶瓷膜进行清洗16倍体积后，再次用蝶式离心清洗处理16倍体积后，收集浓液。经测定，固形物含量为3.5％。

[0136] 3)喷雾干燥过程：将上步骤得到的固形物含量为3.5％的蛋白液，于60℃进行巴氏杀菌，采用离心式喷雾干燥机喷雾，雾化盘转速18000～25000r/min，进风温度为200℃、出风温度为85℃条件下喷雾干燥制粉。经测定，喷干粉的含水量为3.2％。

[0137] 实施例5：无/低苯丙氨酸重组蛋白粉的生产

[0138] 本实施例提供了一种无/低苯丙氨酸重组蛋白粉的生产方法，具体步骤如下：

[0139] 1)以实施例1构建的重组地衣芽孢杆菌BL02为出发菌种，采用10000L发酵罐进行连续补料工艺发酵，基础发酵培养基为：蔗糖2％、大豆蛋白胨4％、酵母浸粉0.2％、K2HPO4 0.5％、NaH2PO4 1.0％、CaCl2 0.06％、MgSO4·7H2O 0.10％、MnSO4 0.02％、消泡剂0.2％，调节pH至7.0，基础装液量为40％，120℃高温灭菌20min；补料培养基为：葡萄糖40％、大豆水解蛋白20％，补料培养基的碳源与氮源分别120℃高温灭菌20min。发酵接种量4％，培养条件：37℃，通气量0.6～1.2vvm，通过调节转数和通气量使DO控制30％以上；发酵12h开始补料，补料速率为：葡萄糖2.2～3.2g/L/h，大豆水解蛋白0.75～0.95g/L/h，控制pH6.9～7.0，发酵64h结束，蛋白浓度为12.7g/L。发酵液留样检测蛋白酶活力。

[0140] 2)将发酵液通过板框过滤进行固液分离，得到板框过滤清液通过200nm陶瓷膜处理后，得到滤液，通过正压过滤除菌后，使用H3PO4调节pH至2.8～3.3，静置沉淀蛋白15～18h，将上清去除后，收集蛋白沉淀浓液，使用陶瓷膜进行清洗处理27倍体积后，收集浓缩液。取样经120℃烘干至恒重，测定固形物含量为5.2％。

[0141] 3)喷雾干燥过程：将上步骤得到的固形物含量为5.2％的蛋白液，于65℃进行巴氏杀菌，采用离心式喷雾干燥机喷雾，雾化盘转速15000～20000r/min，进风温度为200℃、出风温度为85℃条件下喷雾干燥制粉。经测定，喷干粉含水量为3.2％。

[0142] 实施例6：无/低苯丙氨酸重组蛋白粉的生产

[0143] 本实施例提供了一种无/低苯丙氨酸重组蛋白粉的生产方法，具体步骤如下：

[0144] 1)以实施例1构建的重组地衣芽孢杆菌BL03为出发菌种，采用50000L发酵罐连续补料工艺发酵，基础发酵培养基为：玉米淀粉4％、大豆分离蛋白3％、K2HPO4 0.5％、NaH2PO4 1.0％、CaCl2 0.05％、MgSO4·7H2O 0.10％、MnSO4 0.02％、消泡剂0.2％、α-高温淀粉酶
0.015％，调节pH至7.5；补料培养基为：葡萄糖40％、大豆水解蛋白5％+酵母粉15％，分别进行配制并120℃高温灭菌。发酵接种量5％，培养条件：37℃，通气量0.6～1.2vvm，通过调节转数和通气量使DO控制40％以上；发酵12h开始补料，补料速率为：葡萄糖2.0～3.0g/L/h，大豆水解蛋白+酵母粉0.75～0.95g/L/h，控制pH6.80～6.90，发酵63h结束，蛋白浓度为
17.2g/L。发酵液留样检测蛋白酶活力。

[0145] 2)将发酵液通过陶瓷膜进行固液分离，得到发酵滤液，通过0.22um的正压过滤除菌后，使用HCl调节pH至1.5～2.0，静置沉淀蛋白15～18h，将上清去除后，收集蛋白沉淀浓液，使用陶瓷膜进行清洗27倍体积后，再次用蝶式离心清洗处理16倍体积后，收集浓液。经测定，固形物含量为4.56％。

[0146] 3)喷雾干燥过程：将上步骤得到的固形物含量为2.56％的蛋白液，于70℃保温进行巴氏杀菌，采用离心式喷雾干燥机喷雾，雾化盘转速11000～15000r/min，进风温度为180℃、出风温度为80℃条件下喷雾干燥制粉。经测定，喷干粉含水量为3.1％。

[0147] 实施例7：无/低苯丙氨酸蛋白粉的质量分析

[0148] 本实施例以实施例2-6中生产得到的蛋白粉为例，阐述对无苯丙氨酸蛋白粉的质量进行分析。

[0149] (1)氨基酸分析：

[0150] 采用GB/T5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》中描述的方法对实施例2-6中生产得到的无/低苯丙氨酸蛋白质粉的氨基酸进行检测分析，不同实施例制备的蛋白粉的氨基酸分布如表5所示：

[0151] 表5.无/低苯丙氨酸蛋白粉的氨基酸分析

[0152]

[0153] (2)蛋白含量测定：

[0154] 采用GB 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定》中描述的凯氏定氮法(I方法)对实施例2-6中得到的无/低苯丙氨酸蛋白质粉的蛋白含量进行检测分析，蛋白含量检测结果如表6所示：

[0155] 表6.无/低苯丙氨酸蛋白粉的蛋白含量测定

[0156] 蛋白含量(％)
实施例2蛋白粉样品 92.6
实施例3蛋白粉样品 83.3
实施例4蛋白粉样品 80.0
实施例5蛋白粉样品 88.6
实施例6蛋白粉样品 96.1

[0157] (3)蛋白纯度分析(SDS-PAGE胶)

[0158] 采用《中国药典2015版》第三部0541电泳法(第五法)描述的方法，对实施例2-6生产得到的无/低苯丙氨酸蛋白质粉进行的电泳分析，并对SDS-PAGE图进行灰度扫描分析，判定目的蛋白的纯度。蛋白粉的SDS-PAGE胶图如图1所示，灰度扫描分析结果显示，目的蛋白的纯度为81％-92％。

[0159] (4)发酵液与喷干粉的蛋白酶活性检测

[0160] 将实施例2-6中发酵留样的发酵液和各自喷雾干燥制备的蛋白粉，按照GB/T23527-2009附录B福林法测定碱性蛋白酶活力的方法描述测定发酵液和喷干粉的活力，结果如表7。

[0161] 表7.发酵液和喷干粉的蛋白酶活力

[0162]

[0163] 结果显示，无苯丙氨酸蛋白在表达过程中具有蛋白酶活力，可以降解其他的杂蛋白，经过酸沉淀的后处理操作后，蛋白酶活力完全丧失。

[0164] (5)胃肠消化酶的消化模拟

[0165] 采用电泳法确定该发明专利得到的无/低苯丙氨酸蛋白粉在人工肠液和人工胃液中的消化特性。称取实施例2制备的蛋白粉0.1g，加纯水4.0ml混匀溶解。取0.1ml溶解蛋白溶液与0.9ml人工胃液混匀，另取0.1ml蛋白溶液与0.9ml人工肠液混匀，置于金属浴(37℃，800rmp)上进行消化反应，分别在0，5，10，20，30min时取100uL反应溶液，立即加入氢氧化钠溶液(胃液消化样品)或盐酸溶液(肠液消化样品)终止消化反应。直接取上述样品各30uL，以及未消化的蛋白粉溶液，胃消化液和肠消化液为对照样，加入SDS-PAGE上样缓冲液10uL，进行SDS-PAGE电泳分析结果如图2所示。试验结果表明，无/低苯丙氨酸的蛋白粉在人工胃液、人工胃液中非常容易被消化，5min左右基本消化完毕。该结果也显示本发明的无苯丙氨酸的蛋白粉是具有良好的易消化特性的。

[0166] (6)重金属/微生物测定数据

[0167] 采用蛋白粉质量标准参照的相应的国标方法，对实施例4中生产得到的无/低苯丙氨酸蛋白粉中的重金属污染物进行分析，结果如表8所示。

[0168] 表8.无/低苯丙氨酸蛋白粉的重金属含量与微生物限度分析

[0169]

[0170]

[0171] 结果显示，制备的蛋白粉符合食品蛋白粉中重金属和微生物的要求。

[0172] 实施例8：降低血液苯丙氨酸效果试验

[0173] 苯丙酮尿症模型鼠(Pahenu2)购自美国Jackson Laboratory公司，共8只，雄雌各半，体重100-120g，喂食特制低苯丙氨酸饲料(Teklad Research公司提供)3天后，尾静脉采血，检测血液中苯丙氨酸含量。随机分为两组(每组4只，雌雄各半)，分别喂食只含牛乳清蛋白的定制鼠粮和只含本发明实施例3中制备的无/低苯丙氨酸蛋白的鼠粮，持续7天，并与第7天尾静脉采血，检测血清中的苯丙氨酸含量，.

[0174] 表9.无/低苯丙氨酸蛋白粉干预对大鼠血液苯丙氨酸浓度的影响

[0175]

[0176] 结果(表9)显示，本发明技术生产的无/低苯丙氨酸含量的蛋白粉，与常规膳食蛋白(乳清蛋白)相比，可有效的控制苯丙酮尿症模型鼠的血液中的苯丙氨酸含量，防治苯丙酮尿症或高苯丙氨酸血症。在试验过程中，所有测试鼠生长状态良好，且主动摄取含本专利蛋白粉的鼠粮，说明本专利蛋白粉的安全性比较好，且感官依从度与乳清蛋白无明显差异。

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