技术领域
[0001] 本
发明涉及复合微生物发酵菌提取培养技术领域，具体为一种复合微生物发酵菌的提取培养方法。
背景技术
[0002] 近年来，微生物广泛应用于食品，医药，农业种植、养殖，环保等诸多领域，越来越多的科研工作者也开展
益生菌的研究与应用。在日常生活中，常见的富含益生菌的产品有酸奶，保健品、固体颗粒饮料等，而酸奶主要就是利用固体发酵剂来制作的。家庭式用的发酵剂使用简单，只需将发酵剂加入至一定量的
牛奶中，经过合适的
温度与适当的时间即可制作成活性益生菌酸奶。
[0003] 目前，在农业种植、养殖领域也有微生物发酵剂的出现。但是，现有的符合微生物发酵菌的提取培养方法复杂，活菌数不高，应用受到限制。
[0004] 因此，我们提出一种复合微生物发酵菌的提取培养方法。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种复合微生物发酵菌的提取培养方法，步骤简单合理，操作控制方便，提取培养周期短，成本较低，应用范围广，适用性强，环保无污染，无人为干扰，取材完全来源于自然，从各种地域的果蔬中进行提取，提取培养的复合微生物发酵菌可应用于作为发酵有机
肥料的菌种，
土壤的改良和修复，养殖
水体改良剂，人体使用酵素、
营养品、功能性饮料生产，以解决上述背景技术中提出的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] 一种复合微生物发酵菌的提取培养方法，包括以下步骤：
[0008] S1.原料准备：
[0009] 1)原料选择，选择新鲜、自然成熟、无病虫害、无畸形、非转基因、非反季节的水果和蔬菜作为原料；
[0010] 2)原料处理，将各种果蔬洗净，将带有外皮的果蔬去皮，带有芯核的果蔬去芯核，然后切
块备用；
[0011] 榨汁，对切块后的果蔬进行榨汁，过滤后得到果汁和蔬菜汁；
[0012] S2.密闭沤制：
[0013] 1)将榨取的各种果汁和蔬菜汁混合成均匀的果蔬汁，平均分装在桶中，每桶的分装
质量为80kg；
[0014] 2)向每桶果蔬汁中加入优质糖8-12kg，使优质糖在果蔬汁上层完全
覆盖，形成一个密闭的隔离层；
[0015] 3)除去液面以上桶内壁上的果蔬汁及水分，保持果蔬汁液面平衡稳定，盖上桶盖，保持桶内液面的稳定；
[0016] 4)根据气温的不同将桶静置2-5天，保持内部稳定，并调节PH值为4-4.5，直到桶内的果蔬汁表面发现有气泡，加入耐高糖
酵母菌；
[0017] 5)将桶放置到摇床上进行振荡培养，并调节PH值为3.5-4，直到果蔬汁浆表面有清液出现，且有效活菌数达到6-8×108cfu/ml，形成基本的菌群母体；
[0018] S3.第一阶段扩培：
[0019] 1)将前期密闭沤制完成的果蔬汁用分离机进行渣汁分离，果渣去除，留取清液，再将清液平均分装在桶中，每桶的分装质量为35kg，并调节PH值为3.5-4；
[0020] 2)每桶加入与清液等量的无菌水，充分搅拌完全后，再将桶放置到摇床上，在32-9
36℃下加气振荡培养22-26h，进行低糖扩培训练，直至有效活菌数达到2-4×10cfu/ml，淘汰掉部分不耐低糖菌；
[0021] S4.第二阶段扩培：
[0022] 1)第一阶段扩培完成后，每桶中加入30kg无菌水和50kg糖蜜后，再加无菌水到九分满；
[0023] 2)在32-36℃下通入空气振荡培养36-48h，进行高糖耐糖扩培训练，直至有效活菌数达到5-6×109cfu/ml；
[0024] S5.第三阶段扩培：
[0025] 1)准备多个一吨桶，清洗干净，加入无菌水250kg和糖蜜150kg，充分搅拌均匀；
[0026] 2)将第二阶段扩培完成后的料液抽进一吨桶里，每两桶的料液抽进一个一吨桶里，然后再加无菌水补充到八分满的
位置，在35-38℃下加气发酵48-60h；
[0027] 3)补水到满，搅拌均匀后，在32-34℃下继续加气发酵48-60h；
[0028] 4)直至有效活菌数达到7-9×109cfu/ml，停止加
氧气发酵，把一吨桶桶口擦拭干净，密封起来备用，即制得复合微生物发酵菌；
[0029] S6.复活发酵菌：
[0030] 密封桶置放时间较久后，要用时，加入10-20kg糖蜜，充分搅拌完全后，加氧气通气几天，直至有效活菌数达到7-9×109cfu/ml，便可使复合微生物发酵菌复活。
[0031] 优选的，所述步骤S2全程需要15-20天，所述步骤S3全程需要5-6天，所述步骤S4全程需要5-6天，所述步骤S5全程需要20-23天；所述复合微生物发酵菌的提取培养周期为45-55天。
[0032] 优选的，所述步骤S1操作1)中作为原料的水果和蔬菜的选择条件为广泛选择跨各地域温带的果蔬和各种各样色彩的果蔬，且酸性强的果蔬含量占比不少于70％，以保证一定的初始酸度，例如初始PH值在5.5-6.5之间。
[0033] 优选的，所述步骤S1操作2)中榨汁时将较硬的果蔬与较软的果蔬、含汁较少的果蔬与含汁较多的果蔬搭配榨汁。
[0034] 优选的，所述步骤S2操作2)中的优质糖包括优质红糖和优质白糖，所述优质红糖和优质白糖的重量比为1:1。
[0035] 优选的，所述步骤S2操作4)中当平均气温高于15℃时静置2-3天，当平均气温低于15℃时静置4-5天。
[0036] 优选的，所述步骤S2操作4)中耐高糖酵母菌的加入量为80-120g/桶。
[0037] 优选的，所述步骤S3操作2)及步骤S5操作2)和操作3)中加气所通入的气体中的氧气体积含量为14-20％。
[0038] 优选的，所述步骤S4操作1)中在加入糖蜜时同时加入无菌水，避免糖浓度过高而导致渗透压过高。
[0039] 优选的，所述步骤S4操作2)中在通入空气时盖上桶盖，保持进气管不要下垂，防止不通气时桶内液体倒流。
[0040] 本发明提供的一种复合微生物发酵菌的提取培养方法，以酸度强的新鲜水果和蔬菜为原料，保证混合蔬果汁具有一定的初始酸度例如初始PH值在5.5-6.5之间；然后在密闭沤制阶段形成糖覆盖隔离层，静置并调节PH值为4-4.5，直到桶内液面出现气泡，加入耐高糖酵母菌，振荡培养并调节PH值为3.5-4，直到果蔬汁表面有清液出现，且有效活菌数达到6-8×108cfu/ml，形成基本的菌群母体；然后依次通过低糖扩培训练和高糖耐糖扩培训练这两个阶段的扩培，在较短的时间(10-12天)内使有效活菌数达到5-6×109cfu/ml；最后进行第三阶段扩培，获得稳定的有效活菌数7-9×109cfu/ml，停止加气发酵，将桶口密封备用，即制得复合微生物发酵菌。
[0041] 本发明的复合微生物发酵菌的提取培养方法，取材完全来源于自然果蔬，步骤简单合理，操作控制方便，制得的复合微生物发酵菌可反复多次使用，成本低；生产工序简单，通过低糖扩培训练和高糖耐糖扩培训练这两个阶段的扩培后，可在较短的时间(10-12天)9
内使有效活菌数达到5-6×10cfu/ml；复合微生物发酵菌的提取培养周期短，约45-55天，且有效活菌含量高，有效活菌数达到7-9×109cfu/ml；制得的复合微生物发酵菌的保藏周期长，可常温密闭
封存数十天，例如10-90天，且发酵菌的复活操作简单，复活效率和质量有保证，通氧气后可在1-7天内迅速恢复至有效活菌数达到7-9×109cfu/ml。本发明的复合微生物发酵菌的提取培养方法，应用范围广，适用性强，环保无污染，无人为干扰，且提取培养的复合微生物发酵菌可应用于作为发酵
有机肥料的菌种，土壤的改良和修复，养殖水体改良剂，人体使用酵素、营养品、功能性饮料生产。
具体实施方式
[0042] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体
实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0043] 实施例1
[0044] 一种复合微生物发酵菌的提取培养方法，包括以下步骤：
[0045] S1.原料准备：
[0046] 1)原料选择，选择新鲜、自然成熟、无病虫害、无畸形、非转基因、非反季节的水果和蔬菜作为原料，作为原料的水果和蔬菜的选择条件为广泛选择跨各地域温带的果蔬和各种各样色彩的果蔬，其中以酸性强的果蔬适量多选择为佳，例如酸性强的果蔬占比为70％；
[0047] 2)原料处理，将各种果蔬洗净，将带有外皮的果蔬去皮，带有芯核的果蔬去芯核，然后切块备用；
[0048] 榨汁，将较硬的果蔬与较软的果蔬、含汁较少的果蔬与含汁较多的果蔬搭配进行榨汁，过滤后得到果蔬汁；
[0049] S2.密闭沤制：
[0050] 1)将榨取的各种果蔬汁合并混合均匀后平均分装在桶中，每桶的分装质量为80kg；
[0051] 2)向每桶果蔬汁中加入优质糖8kg，优质糖包括优质红糖和优质白糖，所述优质红糖和优质白糖的重量比为1:1，使优质糖在果蔬汁上层完全覆盖，形成一个密闭的隔离层；
[0052] 3)除去液面以上桶内壁上的果蔬汁及水分，保持果蔬汁液面平衡稳定，盖上桶盖，保持桶内液面的稳定；
[0053] 4)当平均气温高于15℃时静置2天，当平均气温低于15℃时静置4天，保持内部稳定，并调节PH值为4，直到桶内的果蔬汁表面发现有气泡，加入耐高糖酵母菌，加入量为80g/桶；
[0054] 5)将桶放置到摇床上进行振荡培养，并调节PH值为3.5，直到果蔬汁浆表面有清液出现，有效活菌数达到6×108cfu/ml，形成基本的菌群母体；
[0055] S3.第一阶段扩培：
[0056] 1)将前期密闭沤制完成的果蔬汁用分离机进行渣汁分离，果渣去除，留取清液，再将清液平均分装在桶中，每桶的分装质量为35kg，并调节PH值为3.5；
[0057] 2)每桶加入与清液等量的无菌水，充分搅拌完全后，再将桶放置到摇床上，在32℃下加入氧气体积含量为14％的气体振荡培养22h，进行低糖扩培训练，直至有效活菌数达到9
2×10cfu/ml，淘汰掉部分不耐低糖菌；
[0058] S4.第二阶段扩培：
[0059] 1)第一阶段扩培完成后，每桶中加入30kg无菌水和50kg糖蜜后，加入糖蜜时同时加入无菌水，避免糖浓度过高而导致渗透压过高，再加无菌水到九分满；
[0060] 2)在32℃下通入空气振荡培养36h，通入空气时盖上桶盖，保持进气管不要下垂，防止不通气时桶内液体倒流，进行高糖耐糖扩培训练，直至有效活菌数达到5×109cfu/ml；
[0061] S5.第三阶段扩培：
[0062] 1)准备多个一吨桶，清洗干净，加入无菌水250kg和糖蜜150kg，充分搅拌均匀；
[0063] 2)将第二阶段扩培完成后的料液抽进一吨桶里，每两桶的料液抽进一个一吨桶里，然后再加无菌水补充到八分满的位置，在35℃下加入氧气体积含量为14％的气体发酵48h；
[0064] 3)补水到满，搅拌均匀后，在32℃下继续加入氧气体积含量为14％的气体发酵48h；
[0065] 4)直至有效活菌数达到7×109cfu/ml，停止加氧气发酵，把一吨桶桶口擦拭干净，密封起来备用，即制得复合微生物发酵菌；
[0066] S6.复活发酵菌：
[0067] 密封桶置放时间较久后，要用时，加入10kg糖蜜，充分搅拌完全后，加氧气通气1-79
天，直至有效活菌数达到7×10cfu/ml，便可使复合微生物发酵菌复活。
[0068] 优选的，所述步骤S2全程需要15-20天，所述步骤S3全程需要5-6天，所述步骤S4全程需要5-6天，所述步骤S5全程需要20-23天；所述复合微生物发酵菌的提取培养周期为45-55天。
[0069] 实施例2
[0070] 一种复合微生物发酵菌的提取培养方法，包括以下步骤：
[0071] S1.原料准备：
[0072] 1)原料选择，选择新鲜、自然成熟、无病虫害、无畸形、非转基因、非反季节的水果和蔬菜作为原料，作为原料的水果和蔬菜的选择条件为广泛选择跨各地域温带的果蔬和各种各样色彩的果蔬，其中以酸性强的果蔬适量多选择为佳，例如酸性强的果蔬占比为80％；
[0073] 2)原料处理，将各种果蔬洗净，将带有外皮的果蔬去皮，带有芯核的果蔬去芯核，然后切块备用；
[0074] 榨汁，将较硬的果蔬与较软的果蔬、含汁较少的果蔬与含汁较多的果蔬搭配进行榨汁，过滤后得到果蔬汁；
[0075] S2.密闭沤制：
[0076] 1)将榨取的各种果蔬汁合并混合均匀后平均分装在桶中，每桶的分装质量为80kg；
[0077] 2)向每桶果蔬汁中加入优质糖10kg，优质糖包括优质红糖和优质白糖，所述优质红糖和优质白糖的重量比为1:1，使优质糖在果蔬汁上层完全覆盖，形成一个密闭的隔离层；
[0078] 3)除去液面以上桶内壁上的果蔬汁及水分，保持果蔬汁液面平衡稳定，盖上桶盖，保持桶内液面的稳定；
[0079] 4)当平均气温高于15℃时静置2.5天，当平均气温低于15℃时静置4.5天，保持内部稳定，并调节PH值为4.2，直到桶内的果蔬汁表面发现有气泡，加入耐高糖酵母菌，加入量为100g/桶；
[0080] 5)将桶放置到摇床上进行振荡培养，并调节PH值为3.8，直到果蔬汁浆表面有清液出现，有效活菌数达到7×108cfu/ml，形成基本的菌群母体；
[0081] S3.第一阶段扩培：
[0082] 1)将前期密闭沤制完成的果蔬汁用分离机进行渣汁分离，果渣去除，留取清液，再将清液平均分装在桶中，每桶的分装质量为35kg，并调节PH值为3.8；
[0083] 2)每桶加入与清液等量的无菌水，充分搅拌完全后，再将桶放置到摇床上，在34℃下加入氧气体积含量为17％的气体振荡培养24h，进行低糖扩培训练，直至有效活菌数达到3×109cfu/ml，淘汰掉部分不耐低糖菌；
[0084] S4.第二阶段扩培：
[0085] 1)第一阶段扩培完成后，每桶中加入30kg无菌水和50kg糖蜜后，加入糖蜜时同时加入无菌水，避免糖浓度过高而导致渗透压过高，再加无菌水到九分满；
[0086] 2)在34℃下通入空气振荡培养42h，通入空气时盖上桶盖，保持进气管不要下垂，防止不通气时桶内液体倒流，进行高糖耐糖扩培训练，直至有效活菌数达到5.5×109cfu/ml；
[0087] S5.第三阶段扩培：
[0088] 1)准备多个一吨桶，清洗干净，加入无菌水250kg和糖蜜150kg，充分搅拌均匀；
[0089] 2)将第二阶段扩培完成后的料液抽进一吨桶里，每两桶的料液抽进一个一吨桶里，然后再加无菌水补充到八分满的位置，在37℃下加入氧气体积含量为17％的气体发酵54h；
[0090] 3)补水到满，搅拌均匀后，在33℃下继续加入氧气体积含量为17％的气体发酵54h；
[0091] 4)直至有效活菌数达到8×109cfu/ml，停止加氧气发酵，把一吨桶桶口擦拭干净，密封起来备用，即制得复合微生物发酵菌；
[0092] S6.复活发酵菌：
[0093] 密封桶置放时间较久后，要用时，加入15kg糖蜜，充分搅拌完全后，加氧气通气1-7天，直至有效活菌数达到8×109cfu/ml，便可使复合微生物发酵菌复活。
[0094] 优选的，所述步骤S2全程需要15-20天，所述步骤S3全程需要5-6天，所述步骤S4全程需要5-6天，所述步骤S5全程需要20-23天；所述复合微生物发酵菌的提取培养周期为45-55天。
[0095] 实施例3
[0096] 一种复合微生物发酵菌的提取培养方法，包括以下步骤：
[0097] S1.原料准备：
[0098] 1)原料选择，选择新鲜、自然成熟、无病虫害、无畸形、非转基因、非反季节的水果和蔬菜作为原料，作为原料的水果和蔬菜的选择条件为广泛选择跨各地域温带的果蔬和各种各样色彩的果蔬，其中以酸性强的果蔬适量多选择为佳，例如酸性强的果蔬占比为90％；
[0099] 2)原料处理，将各种果蔬洗净，将带有外皮的果蔬去皮，带有芯核的果蔬去芯核，然后切块备用；
[0100] 榨汁，将较硬的果蔬与较软的果蔬、含汁较少的果蔬与含汁较多的果蔬搭配进行榨汁，过滤后得到果蔬汁；
[0101] S2.密闭沤制：
[0102] 1)将榨取的各种果蔬汁合并混合均匀后平均分装在桶中，每桶的分装质量为80kg；
[0103] 2)向每桶果蔬汁中加入优质糖12kg，优质糖包括优质红糖和优质白糖，所述优质红糖和优质白糖的重量比为1:1，使优质糖在果蔬汁上层完全覆盖，形成一个密闭的隔离层；
[0104] 3)除去液面以上桶内壁上的果蔬汁及水分，保持果蔬汁液面平衡稳定，盖上桶盖，保持桶内液面的稳定；
[0105] 4)当平均气温高于15℃时静置3天，当平均气温低于15℃时静置5天，保持内部稳定，并调节PH值为4.5，直到桶内的果蔬汁表面发现有气泡，加入耐高糖酵母菌，加入量为120g/桶；
[0106] 5)将桶放置到摇床上进行振荡培养，并调节PH值为4，直到果蔬汁浆表面有清液出现，有效活菌数达到8×108cfu/ml，形成基本的菌群母体；
[0107] S3.第一阶段扩培：
[0108] 1)将前期密闭沤制完成的果蔬汁用分离机进行渣汁分离，果渣去除，留取清液，再将清液平均分装在桶中，每桶的分装质量为35kg，并调节PH值为4；
[0109] 2)每桶加入与清液等量的无菌水，充分搅拌完全后，再将桶放置到摇床上，在36℃下加入氧气体积含量为20％的气体振荡培养26h，进行低糖扩培训练，直至有效活菌数达到9
2-4×10cfu/ml，淘汰掉部分不耐低糖菌；
[0110] S4.第二阶段扩培：
[0111] 1)第一阶段扩培完成后，每桶中加入30kg无菌水和50kg糖蜜后，加入糖蜜时同时加入无菌水，避免糖浓度过高而导致渗透压过高，再加无菌水到九分满；
[0112] 2)在36℃下通入空气振荡培养48h，通入空气时盖上桶盖，保持进气管不要下垂，防止不通气时桶内液体倒流，进行高糖耐糖扩培训练，直至有效活菌数达到6×109cfu/ml；
[0113] S5.第三阶段扩培：
[0114] 1)准备多个一吨桶，清洗干净，加入无菌水250kg和糖蜜150kg，充分搅拌均匀；
[0115] 2)将第二阶段扩培完成后的料液抽进一吨桶里，每两桶的料液抽进一个一吨桶里，然后再加无菌水补充到八分满的位置，在38℃下加入氧气体积含量为20％的气体发酵60h；
[0116] 3)补水到满，搅拌均匀后，在34℃下继续加入氧气体积含量为20％的气体发酵60h；
[0117] 4)直至有效活菌数达到9×109cfu/ml，停止加氧气发酵，把一吨桶桶口擦拭干净，密封起来备用，即制得复合微生物发酵菌；
[0118] S6.复活发酵菌：
[0119] 置放时间较久后，要用时，加入20kg糖蜜，充分搅拌完全后，加氧气通气1-7天，直至有效活菌数达到9×109cfu/ml，便可使复合微生物发酵菌复活。
[0120] 优选的，所述步骤S2全程需要15-20天，所述步骤S3全程需要5-6天，所述步骤S4全程需要5-6天，所述步骤S5全程需要20-23天；所述复合微生物发酵菌的提取培养周期为45-55天。
[0121] 本发明提供的一种复合微生物发酵菌的提取培养方法，其实施例中各阶段的有效活菌数的数据，如下表：
[0122]实施例 实施例1 实施例2 实施例3
基本的菌群母体的有效活菌数(cfu/ml) 6×108 7×108 8×108
第一阶段扩培的有效活菌数(cfu/ml) 2×109 3×109 4×109
第二阶段扩培的有效活菌数(cfu/ml) 5×109 5.5×109 6×109
第三阶段扩培的有效活菌数(cfu/ml) 7×109 8×109 9×109
制得的复合微生物发酵菌的有效活菌数(cfu/ml) 7×109 8×109 9×109
复活后复合微生物发酵菌的有效活菌数(cfu/ml) 7×109 8×109 9×109
[0123] 本发明提供的一种复合微生物发酵菌的提取培养方法，以酸度强的新鲜水果和蔬菜为原料，保证混合蔬果汁具有一定的初始酸度例如初始PH值在5.5-6.5之间；然后在密闭沤制阶段形成糖覆盖隔离层，静置并调节PH值为4-4.5，直到桶内液面出现气泡，加入耐高糖酵母菌，振荡培养并调节PH值为3.5-4，直到果蔬汁表面有清液出现，且有效活菌数达到6-8×108cfu/ml，形成基本的菌群母体；然后依次通过低糖扩培训练和高糖耐糖扩培训练这两个阶段的扩培，在较短的时间(10-12天)内使有效活菌数达到5-6×109cfu/ml；最后进
9
行第三阶段扩培，获得稳定的有效活菌数7-9×10cfu/ml，停止加气发酵，将桶口密封备用，即制得复合微生物发酵菌。上述步骤简单合理，操作控制方便，提取培养周期短，所述复合微生物发酵菌的提取培养周期为45-55天，成本较低，活菌数高，有效活菌数达到7-9×
109cfu/ml，应用范围广，适用性强，环保无污染，无人为干扰，取材完全来源于自然，从各种地域的果蔬中进行提取，提取培养的复合微生物发酵菌可应用于作为发酵有机肥料的菌种，土壤的改良和修复，养殖水体改良剂，人体使用酵素、营养品、功能性饮料生产。
[0124] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉
本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
