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一种控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法

阅读：1028发布：2020-07-10

专利汇可以提供一种控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法。本发明控制方法包括：S1、外植体选择及预处理：选择太白贝母新鲜鳞茎，在洗衣粉溶液中浸泡，擦拭，冲洗，滤纸吸干，备用；S2、外植体消毒处理：预处理后的外植体浸没在氯化汞溶液中，搅拌，于超净工作台，漂洗，干燥，备用；S3、小鳞茎诱导分化：将S2处理获得的外植体鳞片掰开，纵向切成2～4mm宽小块，接种于添加了青霉素和多菌灵的培养基上培养；S4、继代培养：每20天继代培养一次；S5小鳞茎增殖培养：将S4得到的健康小鳞茎，转移至不添加任何灭菌剂的培养基上培养。本发明控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，内生菌污染控制率可达到96.5%。，下面是一种控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、外植体选择及预处理：以3～4月挖取的太白贝母新鲜鳞茎为外植体，去掉外层腐烂、褐化的鳞片，切除根系；洗净鳞茎表面，洗衣粉溶液中浸泡4～6min，擦拭鳞茎表面，流水冲洗0.8～1.2h，再用去离子水冲洗4～6次，滤纸吸干，备用；
S2、外植体消毒处理：将S1处理后的外植体，浸没在浓度为0.08～0.12%的氯化汞溶液中，搅拌，于超净工作台中，漂洗，干燥，备用；
S3、小鳞茎诱导分化：将S2得到的无菌外植体，用灭过菌的镊子将其鳞片掰开，再用无菌刀片纵切鳞片得2～4mm宽的条状小块，将小块接种于培养基上培养；
S4、继代培养：将S3步骤的培养的小鳞茎在相同培养基上，每20天继代培养一次，共继代培养3次；
S5、小鳞茎增殖培养：将S4得到的生长旺盛的健康小鳞茎，转移至不添加任何灭菌剂的培养基上增殖培养85～95d；
所述S3步骤中培养温度为18～22℃，相对湿度为75～85%，光照强度为1000～1500Lx，光照时间为11～13h；
S3、S4步骤中所述培养基的pH值为5.6～5.8；是由MS基本培养基+3.0～5.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.8～1.2mg/L的α-萘乙酸+4.0～6.0mg/L的青霉素+0.8～1.2g/L的多菌灵+3%蔗糖+9g/L琼脂组成。
2.根据权利要求1所述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，S1步骤中所述洗衣粉溶液是由洗衣粉与水按照重量体积比0.8～1.2g:1000mL配置而成。
3.根据权利要求2所述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，S1步骤中所述洗衣粉溶液是由洗衣粉与水按照重量体积比1.0g:1000mL配置而成。
4.根据权利要求1所述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，所述S2步骤中搅拌采用磁力搅拌器搅拌，搅拌时间为6～8min，搅拌速度为150～200r/min。
5.根据权利要求1所述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，所述S2步骤中漂洗为用无菌水漂洗3～5次，每次漂洗时间为3～5min；干燥为用无菌滤纸吸干。
6.根据权利要求1所述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，所述S3步骤中培养温度为20℃，相对湿度为80%，光照强度为1000～1500Lx，光照时间为12h。
7.根据权利要求1所述的控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，所述诱导培养基是由MS基本培养基+4.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+1.0mg/L的α-萘乙酸+5.0mg/L的青霉素+1.0g/L的多菌灵+3%蔗糖+9g/L琼脂组成。
8.根据权利要求1所述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，S5步骤中所述培养基是由MS基本培养基+3.0～5.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.8～1.2mg/L的α-萘乙酸+3%蔗糖+9g/L琼脂组成。

说明书全文

一种控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种控制太白贝母组织培养过程中内生菌污染的方法。

背景技术

[0002] 《中华人民共和国药典》收载的川贝母为百合科植物川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母Fritillaria przewalskii Maxim.梭砂贝母Fritillaria delavayi Franch.太白贝母Fritillaria taipaiensis P.Y.Li或瓦布贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var wabuensis(Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.C.Chen的干燥鳞茎。是名贵川产道地大宗药材之一，主要用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咯痰带血等病症，临床需求量巨大。

[0003] 太白贝母作为新增来源列入2010版《中国药典》，具有野生资源少、适应性强、低海拔也能正常生长发育等特性，是川贝母中适宜家种栽培的最佳品种。太白贝母种植业迎来了新的发展机遇。

[0004] 而现有川贝母产量严重不足，需求量却逐年增加，存在严重的供求矛盾。其药材来源中有4种已列入国家三级保护植物名录且栽种困难。在其生长期内生物量积累缓慢、植株死亡率高，从而导致经济效益低下，农民种植积极性不高，这一直是制约川贝种植发展的瓶颈。

[0005] 在《中国中药杂志》1996年01期中收载了《太白贝母的快速繁殖试验》，文中报道了太白贝母组织培养快速繁殖试验。研究表明：采用MS+NAA1.0mg/L+6～BA3.0mg/L培养基，诱导愈伤组织和再生鳞茎的频率为93％；愈伤组织和再生鳞茎中含有15种人体必需的常量和微量元素，其中大多数元素的含量均明显超过栽培鳞茎。但在现有技术中通过此方法培育得到的鳞茎在培育过程中感染内生菌的几率非常大，能顺利进行转代继续培养的比例低。因此，对控制太白贝母组培内生菌的污染非常关键。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种控制太白贝母组织培养内生菌的污染率高的控制方法。

[0007] 本发明太白贝母组织培养过程中内生菌的控制方法，包括如下步骤：

[0008] S1、外植体选择及预处理：以3～4月挖取的太白贝母新鲜鳞茎为外植体，去掉外层腐烂、褐化的鳞片，切除根系；洗净鳞茎表面，洗衣粉溶液中浸泡4～6min，擦拭鳞茎表面，流水冲洗0.8～1.2h，再用去离子水冲洗4～6次，滤纸吸干，备用；

[0009] S2、外植体消毒处理：将S1处理后的外植体，浸没在浓度为0.08～0.12％的氯化汞溶液中，搅拌，于超净工作台中，漂洗，干燥，备用；

[0010] S3、小鳞茎诱导分化：将S2得到的无菌外植体，用灭过菌的镊子将其鳞片掰开，再用无菌刀片纵切鳞片得2～4mm宽的条状小块，将小块接种于添加了青霉素和多菌灵的培养基上进行培养；

[0011] S4、小鳞茎继代培养：将S3步骤的诱导分化培养的小鳞茎在相同培养基上，每20天继代培养一次，共继代培养3次；

[0012] S5、小鳞茎增殖培养：将S4得到的生长旺盛的健康小鳞茎，转移至不添加任何灭菌剂的培养基上增殖培养85～95d。

[0013] 上述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其中S1步骤中所述洗衣粉溶液是由洗衣粉与水按照重量体积比0.8～1.2g:1000mL配置而成。

[0014] 进一步的，上述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其中S1步骤中所述洗衣粉溶液是由洗衣粉与水按照重量体积比1.0g:1000mL配置而成。

[0015] 上述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其中所述S2步骤中搅拌采用磁力搅拌器搅拌，搅拌时间为6～8min，搅拌速度为150～200r/min。

[0016] 上述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其中所述S2步骤中漂洗为用无菌水漂洗3～5次，每次漂洗时间为3～5min；干燥为用无菌滤纸吸干。

[0017] 上述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其中所述S3步骤中培养温度为18～22℃，相对湿度为75～85％，光照强度为1000～1500Lx，光照时间为11～13h。

[0018] 进一步的，上述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其中所述S3步骤中培养温度为20℃，相对湿度为80％，光照强度为1000～1500Lx，光照时间为12h。

[0019] 上述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其中所述培养基的pH值为5.6～5.8；是由MS培养基+3.0～5.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.8～1.2mg/L的α-萘乙酸+4.0～
6.0mg/L的青霉素+0.8～1.2g/L的多菌灵+3％蔗糖+9g/L琼脂组成。

[0020] 进一步的，上述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其中所述诱导培养基是由MS培养基+4.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+1.0mg/L的萘乙酸+5.0mg/L的青霉素+1.0g/L的多菌灵+3％蔗糖+9g/L琼脂组成。

[0021] 上述控制太白贝母组织培养内生菌污染的方法，其中S5步骤中所述培养基是由MS基本培养基+3.0～5.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.8～1.2mg/L的萘乙酸+3％蔗糖+9g/L琼脂组成。

[0022] 本发明的有益效果是：

[0023] 1、控制太白贝母组织培养内生菌污染，污染控制率达到96.5％，外植体使用量减少，降低生产成本；

[0024] 2、控制太白贝母组织培养内生菌污染，直接诱导形成小鳞茎多，对农户、企业生产种植种源紧缺有重大意义；

[0025] 3、污染率得到控制，鳞茎繁殖生长快，为市场提供大量鳞茎药材，缓解供需矛盾。

具体实施方式

[0026] 下面结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

[0027] 实施例1

[0028] 1、外植体选择及预处理：

[0029] 采挖3～4月的太白贝母新鲜鳞茎作外植体，去掉外层腐烂、褐化的鳞片，切除根系；洗净鳞茎表面泥土，在浓度为1g/L的洗衣粉溶液中浸泡5min，用刷子轻轻刷洗表面后流水冲洗1h，再用无菌去离子水冲洗5次,滤纸吸干，备用；

[0030] 2、外植体消毒处理：将处理后的外植体置入广口瓶中，常温下，倒入浓度0.1％的氯化汞溶液至淹没外植体。用磁力搅拌器低速搅拌外植体6～8min，75％酒精擦拭广口瓶表面后放入超净工作台中，无菌条件下，用无菌水漂洗鳞茎3～5次，每次3～5min，最后用灭菌滤纸吸干，备用；

[0031] 3、小鳞茎的诱导分化：无菌条件下，用镊子将太白贝母鳞片掰开，用无菌刀片将肉质鳞片纵向切成约3mm宽的小块，接种于小鳞茎诱导培养基上，该培养基为：MS基本培养基+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)4.0mg/L+NAA(α-萘乙酸)1.0mg/L+青霉素5.0mg/L+多菌灵1.0g/L+蔗糖3％+9g/L琼脂1.0％，pH为5.6～5.8。接种后，置于温度20℃，相对湿度80％，光照12h，强度为1000～1500Lx条件下进行培养；

[0032] 4、继代培养：在相同培养基上，对诱导分化后的小鳞茎进行每20天继代培养一次，共继代培养3次；

[0033] 5、小鳞茎增殖培养：将老化的和生长不良的鳞茎去掉，选择生长旺盛的健康的小鳞茎,切下，去掉基部残留物，转移到培养基MS+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)4.0mg/L+NAA(α-萘乙酸)1.0mg/L+蔗糖3％+9g/L琼脂1.0％，pH为5.6～5.8进行继代增殖培养，培养90d后统计小鳞茎成活率。

[0034] 为了减少太白贝母鳞茎组培过程中内生菌污染，提高鳞茎的增殖率和成活率。试验设计在培养基MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L中添加多菌灵和青霉素两种灭菌剂，对其内生菌污染进行控制。浓度见表1。二因素完全随机，各处理见表2。

[0035] 以培养基：MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 1.0mg/L为对照。无菌条件下，用无菌刀片将肉质鳞片纵向切成约3mm宽的小块，接种于各处理培养基中，5重复/处理，5瓶/重复，3块鳞茎/瓶。其他条件一致。7d内如有污染鳞片直接去除，不统计。7d后，每天监测内生菌污染情况，如污染，即时转移未污染的鳞片，污染鳞片继续观察。并观察记录小鳞茎诱导分化情况。60d统计内生菌污染率。

[0036] 表1 试验因素和浓度

[0037]

[0038] 表2 控制太白贝母鳞茎组培过程中内生菌生长的各处理培养基

[0039]处理培养基
1 MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L+青霉素5.0mg/L+多菌灵0.5g/L
2 MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L+青霉素5.0mg/L+多菌灵1.0g/L
3 MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L+青霉素5.0mg/L+多菌灵1.5g/L
4 MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L+青霉素10.0mg/L+多菌灵0.5g/L
5 MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L+青霉素10.0mg/L+多菌灵1.0g/L
6 MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L+青霉素10.0mg/L+多菌灵1.5g/L
7 MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L+青霉素20.0mg/L+多菌灵0.5g/L
8 MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L+青霉素20.0mg/L+多菌灵1.0g/L
9 MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L+青霉素20.0mg/L+多菌灵1.5g/L
CK MS+6-BA4.0mg/L+NAA1.0mg/L

[0040] 表3 太白贝母鳞茎组培内生菌污染调查表

[0041]

[0042]

[0043] 注：

[0044]

[0045] 结果：

[0046] 1、没添加青霉素和多菌灵的培养基(CK)，内生菌污染严重，污染率达72.3％；

[0047] 2、青霉素和多菌灵浓度过低(处理1)，污染率较高(23.2％)，分化形成小鳞茎，后期生长较好；

[0048] 3、随青霉素和多菌灵浓度增高，内生菌污染降低，但鳞片不分化没有诱导出小鳞茎。

[0049] 综合比较，处理2青霉素和多菌灵浓度配比最合适，污染率低(2.5％)，鳞片分化形成的小鳞茎多，且生长旺盛。与对照相比，内生菌污染控制率达到96.5％。

[0050] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

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