本发明涉及人胶质细胞衍生的神经营养因子(human glial cell line-derived neurotrophic factor，简称GDNF)及其衍生物，以及基因重组 技术生产该因子的方法。

本发明还涉及药物组合物，其中包括有效量的GDNF基因产物，该 产物可用于治疗各种神经性疾病和错乱。

随着分子生物学的发展，利用DNA重组技术，可以构建表达蛋白 质的一系列载体，从而使生物学家能够装配DNA序列以制得生产有用 蛋白质的杂合分子。可利用各种反应，如用限制性酶切割，然后用连 接酶连接如此得到的片段、组装化学合成的寡核苷酸，以及本领域内 各实验室自己设计其他方法学(Maniatis，T.et al. Moleoular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1989).

为了得到高水平的表达，被装配的DNA元件必须存在某些必要的 信息。例如，复制原点、抗生素选择标志、表达启动子、有用基因的 转录激活因子以及本领域内专业人员已知的其他特性等。这些元件适 当地结合即可产生一个质粒，如果有用基因被自然地插入到相关的转 录和转译调节序列上，所得到的质粒便被称为表达质粒。该表达质粒 或载体即可在宿主细胞内表达蛋白质，这样的宿主细胞可以是真核或 原核生物来源的。经纯化后便可得到所需的蛋白质。

自然地控制许多基因如生长因子表达的元件(启动子)在其表达中 并不是强有力的，而只有在合适的天然条件(常常是未知的)下才能被 活化。为此目的，可使用有已知活性的启动子如乳头多瘤空泡病毒系 列的病毒，或其他已知的启动基因序列。因此用于高水平表达的元件 是各种来源(真核生物、细菌、病毒等)的DNA结合形式的杂合体，其 中的末端部分可由不同基因部分相结合而成。

一种基因的转录活性取决于调节和编码序列之间的距离。

根据这些事实，使调节序列适当地工作的最好办法之一是将被引 入的基因置于与天然基因相同的位置上。与所引入的基因结合后产生 一种继后被切除的融合蛋白，以获得位于调节列最邻近位点的基因所 使用的常规技术将取决于允许其克隆之适当限制性位点的存在。如果 在邻近区域没有相匹配的位点，而只有其他位点，则可以通过合成含 所需的限制性位点的寡核苷酸或接头来得到这些片段的结合体。

如果在邻近区域没有合适的限制性位点而不能使用接头，则可以 利用Bal I31和SI缺失DNA的方法。但这样并不能得到精确的缺失， 因此必须在各个时间对不同克隆进行序列分析，以检查哪一个是最适 用的。

虽然用于分离具有新的生物学活性之蛋白质的方法通常包括从生 物体液中纯化而分离蛋白质本身，但所获得的蛋白质总是不充足而不 能用于继后对其结构、功能，特别是应用的研究。可利用DNA重组技 术得到大量的蛋白质。

GDNF是目前正在研究的许多生长因子之一，它是一种以二硫键 形式聚合的糖蛋白二聚体。体外实验表明：GDNF可以维持中脑多巴胺 能神经元的存活，且具有较强的专一性(Lin-F，et al.，Science 260(5111)：1130-1132；1993)，对运动神经元也有较强的保护作用 (Henderson-CE，et al.，Science 267(5199)：777；1995)，有可能成为帕金 森病和侧索硬化症的治疗药物。这些包括GDNF在治疗上可用于维持 神经功能，并可用于防止和恢复在急、慢性病理状态下，包括影响周围、 中枢和植物神经系统神经退化或免疫神经退化性质的各种病理状态下 所造成的神经功能丧失和错乱。

编码GDNF的DNA序列如下：

【(ATG)m      GA TTATCCTGAT CAGTTCGATG ATGTCATGCC AGAGGATTAT CCTGATCAGT TCGATGATGT CATGGATTTT ATTCAAGCCA CCATTAAAAG ACTGAAAAGG】n TCACCAGATA AACAAATGGC AGTGCTTCCT AGAAGAGAGC GGAAICGGCA  GGCIGCAGCI  GCCAACCCAG  AGAATTCCAG AGGAAAATGT  CGGAGAGGCC  AGAGGGGCAA  AAACCGGGGT TGTGTCTTAA  CTGCAATACA  TTTAAATGTC  ACTGACTTGG GTCTGGGCTA  TGAAACCAAG  GAGGAACTGA  TTTTTAGGTA CTGCAGCGGC  TCTTGCGATG  CAGCTGAGAC  AACGTACGAC AAAATATTGA  AAAACCTATC  CAGAAATAGA  AGGCTGGTGA GTGACAAAGT  AGGGCAGGCA  TGTTGCAGAC  CCATCGCCTT TGATGATGAC  CTGTCGTTTT  TAGATGATAA  CCTGGTTTAC CATATTCTAA  GAAAGCATTC  CGCTAAAAGG  TGTGGATGTA TCTGA

m＝0或1，n＝0或1 成熟的GDNF为下列蛋白质组成的二聚体： 【(Met)mPro Glu Asp Tyr Pro Asp Gln Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gln Ala Thr Ile Lys Arg Leu Lys Arg】nSer Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala Lys Arg Cys Gys Gly Cys Ile m＝0或1，n＝0或1

目前GDNF的研究工作包括：鉴定它们的生物学活性(特异性)，以及 设计一种借助DNA重组技术或其他纯化和提取技术获得少量生长因 子的方法。

发明目的：

1 本发明涉及编码GDNF的DNA序列获取及借助DNA重组技术 生产GDNF的方法。用该方法可获得商业上有价值的、具生物学活性 的且不含人源污染、且符合临床使用要求的均质GDNF，在临床上能 够治疗各种神经性疾病和错乱。

2 本发明还涉及含有GDNF，或由GDNF与神经节苷酯(包括天然存 在的神经节苷酯、神经节苷酯衍生物，以及半合成的神经节苷酯类似 物)，多糖(包括天然多糖或化学修饰多糖)或其它生长因子合并而成的医 药组合物。

3 本发明还进一步涉及GDNF及上面提到的医药组合物的医疗应 用。 技术方案、效果和实施实例：

GDNF是目前正在研究的许多生长因子之一，研究工作包括鉴定 它们的生物学活性之特异性，以及设计一种借助DNA重组技术或其他 纯化和提取技术而得到生长因子的方法。这些包括GDNF在内的生长 因子在治疗上可用于维持神经功能之目的，并可用于防止和恢复在急、 慢性病理状态下，包括影响周围、中枢和植物神经系统神经退化或免 疫神经退化性质的各种病理状态下所造成的神经功能丧失和错乱。

A.一般性方法

某些方法是本专业领域内技术人员熟知且已描述过的，如参见 Maniatis，T.et al.Moleoular Cloning.A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，1989。

某些方法按产品制造商提供的使用说明进行。

B.编码GDNF的DNA获取

方法一

本实验用TRIzol试剂(Gibcol BRL公司)从人胶质细胞瘤C6细 胞株(上海生化及细胞生物学研究所)中抽提总RNA。以1μg总RNA 为模板，oligo(dT)16-18为引物，用Superscript逆转录酶在42℃逆转 录RNA，生成cDNA。根据文献报道的人GDNF的cDNA序列，经微机分 析，设计两个引物： 引物1：5’GAGGATCCTCACCAGATAAACAAATGG 3’ 引物2：5’GGAAGCTTTCAGATACATCCACACC 3’ 引物1为人GDNF成熟肽N端的编码序列，引入BamH I酶切位点。引 物2为人GDNF成熟肽C端编码序列的互补序列，在终止码后有-Hind III酶切位点。以上述合成的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR条件为： 94℃ 1min、56℃ 1min、72℃ 1min，30个循环，最后一个循环的延伸 时间为10min。PCR扩增后得到一约400bp的扩增产物即是编码GDNF 的DNA。

方法二

为了获取编码GDNF的DNA，我们参照GENBANK(保藏号为 L15306)中GDNF的基因序列，合成了48个寡核苷酸片段。这些片段分 别是GDNF基因DNA互补链的部分序列。 P1 CCAGAGGATTATCCTGATCAG

TGATGTCATGGATTTTATTC

AAGCCACCATTAAAAGAC

TGAAAAGGTCACCAGATAAAC

AAATGGCAGTGCTTCCTAG

AAGAAGCGGAATCGGCAG

GCTGCAGCTGCCAACCCAG

AGAATTCCAGAGGAAAATGTC

CGGAGAGGCCAGAGGGGCAAAAAC

CGGGGTTGTGTCTTAACTGC

AATACATTTAAATGTCAC

TGACTTGGGTCTGGGCTATG

AAACCAAGGAGGAACTGATTTTTAG

GTACTGCAGCGGCTCTTGCG

ATGCAGCTGAGACAACGTAC

GACAAAATATTGAAAAACC

TATCCAGAAATAGAAGGCTGG

TGAGTGACAAAGTAGGGCAGG

CATGTTGCAGACCCATCGCC

TTTGATGATGACCTGTCG

TTTTTAGATGATAACCTGG

TTTACCATATTCTAAGAAAGC

ATTCCGCTAAAAGGTGTGG P24ATGTATCTGAAGCTT(Hind III)AGTC P25GACTAAGCTT(Hind III)CAGATACATCCACACC

TTTTAGCGGAATGCTTTCTTAG

AAIATGGTAAACCAGGTTATC

ATCTAAAAACGACAGGTC

ATCATCAAAGGCGATGGG

TCTGCAACATGCCTGCCCTAC

TTTGTCACTCACCAGCCTTC

TATTTCTGGATACGTTTTTC

AATATTTTGTCGTACGTTGTC

TCAGCTGCATCGCAAGAGCC

GCTGCAGTACCTAAAAATCAG

TTCCTCCTTGGTTTCAIAGCCC

AGACCCAAGTCAGTGACATTTAAATG

TATTGCAGTTAAGACAC

AACCCCGGTTTTTGCCCCTCTG

GCCTCTCCGGACATTTTCCTC

TGGAATTCTCTGGGTTGGC

AGCAGCCTGCCGATTCCGC

TTCTTCTAGGAAGCACTGCC

ATTTGTTTATCTGGTGACC

TITTCAGTCTTTTAATGGTG

GCTTGAATAAAATCCATGAC P48 ATCACTGATCAGGATAATCCTCTGG

上述片段用ABI 380A型DNA合成仪，按照制造商提供的方法，固相 合成。产物在NH3环境下55℃处理12小时，真空干燥后重新悬浮于2.5 mol/L乙酸铵中，2倍体积冷乙醇(-20℃)沉淀，80％冷乙醇重新悬浮，用 分光光度计估侧其浓度。

取上述片段各1Pmol，按Promaga公司说明书方法进行磷酸化，连 接。反应体积为20ul。取上述反应液5ul，以P1 P25为引物，按DNA TM 扩增仪试剂盒(Per Kin Elmer-Cetus)方法进行扩增。

取扩增产物经低融点琼脂糖电泳回收480bp DNA片段即得到编 码GDNF的DNA片段即GDNF cDNA。

将该DNA片段克隆入pBluscript载体，制备单链DNA，测定DNA 序列。该序列如附图1所示。图2为上述DNA序列编码的GDNF多 肽序列。

C.GDNF的原核表达载体，工程菌及GDNF粗品的制备

1.将PCR得到的GDNF cDNA片段分别经Klenow酶。HindIII酶 切

2.将载体pTT005用NcoI酶切，补平再用HindIII酶切。

3.将步骤1.2所得的片段用连接酶连接，即得GDNF原核表达载体 质粒。

4.将该质粒转化大肠杆菌E.coli NM522.得到GDNF工程菌。

5.将原核表达GDNF工程菌单菌落接种于含有50ug/ml氨苄青霉 素的5ml LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.5，加入IPTG至终浓度 为1mmol/L.继续培养3小时。培养液经离心收集菌体，破除细胞周质， 收集周质蛋白，即得GDNF粗品。

D.GDNF真核表达载体及GDNF粗品的制备

1.为将编码GDNF的DNA序列插入pSVT7真核表达质粒 (Sambrook J.et al.1989)中。为此我们合成了两条新的寡核苷酸片段， 第一条在该基因的5＇端，第二条在该基因的3＇端。这两条寡核苷酸片段 的序列如下：

5＇TTGAATTC(EcoR I)ATGCCAGAGGATTATCCT 3＇

5＇TCGTCGAC(Sal I)TGATACATCCACA 3＇

这两条寡核苷酸片段还含有两个非天然存在的限制性位点， EcoR I和Sal I，而有利于克隆。

2.将PCR产物经EcoRI-SalI酶切，将其连接到质粒pSVT7的 EcoR I和Sal I位点之间，所得的表达载体pSVT7-GDNF。

3.用磷酸钙沉淀法或其它方法，将pSVT7-GDNF转染中国仓鼠 卵(CHO)细胞中经筛选得表达GDNF的CHO细胞株。

4.上述表达GDNF的CHO细胞株经大量培养离心收集上清液后 即得GDNF之粗品。

E.GDNF酵表达载体，工程菌株及粗品制备

1.将编GDNF的DNA序列插入酵母表达质粒YEP001。为此我们 合成另外两条新的寡聚核苷酸片段，第一条在该基因的5＇端，第二条在 该基因的3＇端。其序列如下：

5＇ATGCCAGAGGATTATCCTGATCAG3＇

5＇TCGGATCC(BamH I)TGATACATCCACA3＇

3＇端引物中含有非天然存的BamHI位点。

2.将PCR产物经BamHI酶切将其连接到YEP001质粒的 EcoRV和BamHI位点之间所得的表达载体YEP001-GDNF；

3.将YEP001-GDNF转化大肠杆菌，抽提质粒，再转化酵母菌(S. CereVisiaee)即得酵母表达GDNF工程菌。

4.工程菌经发酵培养，收集菌体，破菌等工艺后即得GDNF粗品。

所述的人胶质细胞衍生的神经营养因子以单体或二聚形式存在，聚 合方式为二硫键共价结合。

F.GDNF粗品的纯化，精制

上述各种方法得到的GDNF粗品，经纯化、精制后可得到符合临 床使用要求的基本上纯的GDNF即GDNF纯品。其含有如附图3所示 的氨基酸序列。纯化、精制步骤如下：

1.肝素亲和层析

采用Biopilot(Pharmacia)层析系统，Heparin-Sepharose Cl-6B柱(根据样品的体积和GDNF的含量选择不同规格的柱流动相速 度)，上样后用含0.15-2.5mol/L Nacl的磷酸盐缓冲液(PH8.0)洗脱。收集 GDNF活性峰，得GDNF纯化品。

2.离子交换层析

设备同上，采用CM-Sepharose Fast Flow柱，(规格及流速依情况而 定)，将上述GDNF纯化品上样后，用含0.1～1.0mol/L NaCl的磷酸盐缓冲 液(pH8.0)洗脱，收集活性峰，得含盐的GDNF精制品。

3.脱盐

将含盐GDNF精制品经Superdex-75脱盐后即得GDNF精制品，即 符合临床使用要求的GDNF纯品。

如前文所讨论的，本发明还涉及GDNF的医疗应用，以及通过该 因子的单独或联合有其他活性物质的医药方法。利用GDNF能有效地 保持神经功能，或阻止神经功能的丧失，并应用于治疗由于急性或慢性 病理状态引起的神经功能损害，包括急病征如脑血管性的、感染的、 炎症性的、压迫性的或代谢性的病理缺陷，以及慢性或神经退化性病 变。GDNF也可用于治疗因神经系统老化或影响免疫系统的疾病引起 的神经病变。包括神经退化疾病、涉及脊髓索的退化疾病、涉及运动 神经元的退化疾病、涉及面神经的运动神经元的退化疾病、选自肌萎 缩侧索硬化症、早期侧索硬化、渐进性髓麻痹、脊髓肌肉萎缩和后脊 髓灰质综合症相关的运动神经疾病或退化、外周神经病、帕金森氏病、 亨廷顿氏舞蹈病、包含神经系统损伤、如由创伤、外科、梗塞、传染 和恶性肿瘤等因素引起的神经系统疾病或错乱、受有毒试剂作用引起 的神经系统疾病或错乱、由营养缺乏引起神经系统疾病或错乱、脊髓 索、胆碱能和多巴胺能神经元。

含有GDNF的药物制品可经口服、局部、直肠、非胃肠道、吸入 或脑内等途径给药。因此它们可以是固体或半固体形式的，如丸剂、 片剂、乳膏、胶囊、胶囊、栓剂、软明胶胶囊、凝胶、薄膜、小管等 剂型。对于非胃肠道或脑内给药的剂型，可以制成活性化合物的溶液 或活性化合物的冻干粉末，以便与一种或多种医药上可接受的赋形剂 或缓释剂混合，制成适于上述给药途径，并具有与生理体液等渗压的 制剂。对于局部给药，可考虑制成喷雾液体和喷雾剂。

本发明的制剂可用于人或动物。对于溶液、喷雾剂、软膏和乳膏， 制剂中最好含有0.01％至10％的活性成分；对于固体制剂，可含有0.1％ 至100％。给药剂量依据个体需要、预期的效果及选择的给药途径而定。

本发明还包括所有由神经节苷酯或透明质酸衍生物或这些衍生物 与生长因子GDNF形成之复合物在治疗上述适应症上的应用。

可利用已知制备这类用于病人之医药上可接受配方，制备含GDNF 分子，不含或含有有神经节苷酯、磷酯、透明质酸，海藻糖等.且以有 效量之GDNF分子与一种医药上可接受的载体混合而成的药物组合 物。

综上所述，该药物配方可包括但不仅限于GDNF或其冻干粉末与 一种或多种医药上可接受的载体或缓释剂组合成的溶液，其中存在有 适当pH和与生理体液有等渗压的缓冲溶液。至于冻干制剂，载体赋形 剂可以是甘露醇或甘氨酸，以及所需体积的适当缓冲溶液，以配制成 具有所期望的pH适当等渗缓冲溶液。可用相同溶液在所期望体积的等 渗溶液中制备GDNF分子的药物组合物。其可含有但不仅限于适当浓 度的磷酸或柠檬缓冲盐水，以得到有所需pH，如中性pH的等渗药物制 剂。

药物制剂还可包括用于经直肠给药的栓剂，该栓剂中可含有亲水 赋形剂，半乳化赋形剂。在这些制剂中，由DNA重组衍生的GDNF 生长因子的量可占赋形剂量的0.01％至1％(W)。栓剂中还可含有但不 仅限于适当量的乙酰水杨酸盐。

下面给出某些按本发明方法制备的药物组合物的例子，旨在进一 步说明而不是限定本发明。

(A)可注射之溶液的例子

1号制剂                  一个2ml小瓶内含有：

活性物质                 适量

氯化钠                   16mg

柠檬酸盐缓冲液，pH＝7    2ml

(在注射用水中) 2号制剂                             一个2ml小瓶内含有： 活性物质                            适量 氯化钠                              16mg 神经节苷酯(钠盐)                    100mg 柠檬酸盐缓冲液，pH＝7               2ml (在注射用水中) 3号制剂                             一个2ml小瓶内含有： 活性物质                            适量 氯化钠                              16mg 海藻糖                              50mg 柠檬酸盐缓冲液pH＝7                 2ml (在注射用水中配制) 4号制剂                             一个2ml小瓶内含有： 活性物质                            适量 氯化钠                              16mg 单唾液酰四已糖基神经节苷酯(GM)钠盐  100mg 柠檬酸盐缓冲液pH＝7                 2ml (在注射用水中配制) 5号制剂 (a)一个2ml安瓶内含有：

冻干的活性物质                适量

甘露醇                        30mg (b)一个2ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠                        16mg

柠檬酸盐缓冲剂                2ml

(在注射用水中配制) 6号制剂 (a)一个3ml小瓶内含有：

冻干的活性物质                适量

甘氨酸                        45mg (b)一个3ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠                        24mg

柠檬酸盐缓冲液                3ml   (在注射用水中配制) 7号制剂 (a)一个3ml安瓶的溶剂含有：

冻干的活性物质                适量

单唾液酰四已糖基神经

节苷酯(GM1)钠盐               100mg

甘露酸                        45mg (b)一个3ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠                        24mg

柠檬酸盐缓冲液                3ml

(在注射用水中配制) 8号制剂 (a)一个3ml小瓶内含有：

冻干的活性物质                 适量

3-Sn-磷酯酰-L-丝氨酸           50mg

卵磷脂                         15mg

甘露醇                         100mg (b)一个4ml安瓶的溶剂含有：

甘露醇                         60mg

注射用水加至                   4ml B.皮下注射制剂的例子 9号制剂

(a)一个2ml小瓶内含有：

冻干的活性物质                 适量

甘露醇                         30mg

(b)一个2ml安瓶的溶剂含有：

氯化钠                         16mg

柠檬酸缓冲液                   2ml

(在注射用水中配制) C.直肠途径给药之栓剂的例子 10号制剂 活性物质                     适量 Carbowax 1540                1.75％ Carbowax 6000                0.75％ 11号制剂 活性物质                     适量 吐温60                       2.125g 羊毛脂                       0.25g 12号制剂 活性物质                     适量 甘油                         1.5g 水                           0.25g 明胶                         0.25g

很明显，基于上面所作的描述，可对这些方法做多方面的改动。这样 的改动不能被视为超出了本发明的精神和目的，对于那些在本领域内 专家看来是显而易见的改动均应包括于本发明所要求的权利范围之 内。

附图说明：

附图1为编码成熟的GDNF的部分基因序列；

附图2为GDNF前体及GDNF氨基酸序列；

附图3为GDNF氨基酸序列。