잡종 종자 및 식물의 속성 재배방법

본 발명은 수박, 채소, 곡물, 마초, 섬유 식물 및 기타 자웅 동체종을 포함한 잡종 종자 및 식물의 속성 재배방법에 관한 것이다. 개량된 성질을 가진 새로운 잡종 식물들은 신속하게 발육되며 이것의 잡종 종자들도 증가된 수율로 생산된다. 육성 번식과 영양생식(또는 채소류 증식)의 방법을 배합시킨 방법은 양친의 동질체와 이형제에 제한을 주지 않는다. 또한 부가적인 장점은 본 발명을 고순도 브라시카(Brassica)종자를 고소율로 생산하고자 하였을 때 근친-교배시킬 수 없는 양친 식물계열을 생성시키기 위하여 노동집약적인 수분(授粉) 작용을 시키는 종래의 필요성을 제거할 수 있다는 것이다.

새로운 잡종을 개발하기 위한 방법들은 공지되었고 문헌에 기술되었다. 브리타니카 백과사전내에는 "원예"와 "식물증식"의 광범위한 부분에 걸쳐 기술하고 있으며 이러한 방법들은 광범위하게 실용되고 있으나 이들의 한계성도 잘 알려진 사실이다.

새로운 잡종을 개발하기 위한 육종학자의 연구는 각각 가능한한 동질 접합체(순종)인 식물로 구성된 2개의 종자계를 교배시키는 것이다. 그러나 동질 접합법은 서서히 이루어 지는데 즉 실물은 여러 새대동안 동계 번식시켜 순수한 번식을 얻는다. 순종을 얻기 위하여서는 보통 8-12세대를 요하므로 다른 동질계와 교배시켰을 때 일군의 유정학적으로 균일한 잡종을 얻는다.

더우기 배교적 제한된 수의 순종 계열만을 이용할 수 있는데 이것은 교배의 가능한 수 및 주어진 기간내에 이루어질 수 있는 잡종의 유전학적 다양성을 제한한다.

새로운 잡종의 개량에 따른 다른 제한은 성적으로 번식시키고자 하는 종묘들은 한세대에서 다른 세대로 갈 때 원하지 않는 유전학적 변화(유정학적 경향)를 일으킨다는 것이다.

잡종 식물 개량의 방법에 내재하는 다른 제한은 많은 식물들이 식물당 제한된 수의 종자만을 생산한다는 사실인데 이것은 근친교배 계열이 낮은 생장력을 가지므로 낮은 채종 수율을 나타내기 때문에 더욱 문제성이 있다. 우수한 잡종이 개량된 후 일지라도 다음 해에 잡종 종자는 판매가 가능한 대량 생산이 불가능하다.

상기 조건들은 도마도 캔(can)과 쥬스의 개발로 요약된다. 다양한 순종은 얻을 수 있으나 상기의 제한때문에 매넌 소량의 잡종만이 나타난다.

새로운 잡종 계량에 존재하는 문제성에 부가하여 어떤 브리시카(브리시카스는 화야채, 양배추, 꽃양배추, 중국배추 및 순무를 포함한다)와 같은 어떤 식물에서 고순도의 잡종 종자의 상업적 생산을 위하여 사용되는 현재의 방법은 가격 및 씨앗의 순수도에 심각한 제한이 있음은 널리 알려진 일이다. 종래의 모든 방법은 각 이형체의 반복된 자체 수분작용에 의하여 안정한 동일체의 동계번식을 요한다. 그러나 이러한 동계번식 계열의 하나 또는 둘은 근친교배가 성립될 수 없다(이것의 같은 족산의 수분작용이 용이하게 이루어질 수 없음). 많은 브라시카 이형체들은 강한 자체 번식성이 없은므로(자체 수분작용을 거의 할수 없음) 결과적으로 원종 계열을 유지하기 위한 동계교배는 단지 꽃봉오리를 손으로 열은 다음 동일 식물상의 다른 꽃으로 부터 수분(授粉) 작용시킨 후 다시 손으로 닫는다.

동계 번식계열을 유지시키는데 이러한 어려운 점들은 노동력 때문에 잡종 씨앗의 가격을 비싸게 하므로 실제로는 이러한 번식은 노동 집약적인 나라에서만 행하여 질 수 있다. 더우기 원종(原種) 계열은 고도의 동계 번식을 요하고 이러한 식물들은 생장력이 저하되므로서 낮은 F1, 잡종 수확율을 초래한다.

종래의 방법에 의한 브라기카 잡종 씨앗의 생산에서는 상기 두 가지 방법중 한 방법을 사용한다. 한 방법은 한 원종 계열의 꽃을 손으로 화분을 제거시키고 교배 계열로 부터의 화분으로 수정시키는데 이러한 방법은 노동 집약적이므로 비용이 많이 든다. 상업적인 대규모로 널리 사용되는 둘째 방법은 화분 제거를 생략한다. 하나 또는 둘이 근친교배가 될수 없을 뿐만 아니라 자체 수정이 되지 않는 두개의 근친교배 양친계열을 자연적 수분 작용에 의하여 교배시키고 근친-교배가 되지 않는 번식 계열만으로 부터 잡종씨앗을 채종한다. 통상의 경우, 즉 한 동계번식이 근친 교배될 수 없는 경우 통상의 동계번식에 대한 근친 교배할 수 없는 동계번식의 높은 비율, 일반적으로 3 : 1을 사용하며 근친 교배되지 않는 동계번식으로 부터 생성된 씨앗만을 판매용으로 수확한다. 만일 동계 번식이 둘다 근친 교배될 수 없는 것이라면 두개가 1 : 1의 비율을 사용하면 유전학의 호헤규칙 때문에 전체의 씨앗을 수확할 수 있다.

잡종 브라시카 종자 생산을 위한 근친 교배부적합한 방법은 화분제거의 많은 난점을 피할 수 있는 반면, 실제상에는 많은 문제성들이 있는데 이러한 문제들의 하나는 이들이 성적으로 번식되므로 많은 잡종 식물들이 유전학적 전락을 일으킨다는 것이다.

특히 근친교배 부적한 잡종방법의 사용은 심각한 씨앗의 질문제가 야기된다. 만일 "미스니크"(misnick)(개화할 때 두 개의 동계번식간의 시기가 나쁜 때)가 일어나면 어떤 시빙(sibbing)이 근친 교배 불능 양친상에 일어나는데 이것은 현재 평준화 법칙에 따라 질이 우수한 씨앗을 얻을 수 없는 결과를 초래하며 잡종 종자는 적어도 95%의 표시된 잡종을 포함한다. 마지막으로 근친 교배되지 않는 잡종은 적어도 10년의 동계번식을 요한다.

식물 번식방법(무성 생식)이 많은 청과류와 견과(堅果), 엉겅퀴과, 마늘, 대황, 감자, 고구마 같은 식물의 생산에 사용된다. 종래의 무성 생식방법은 무성 씨앗, 특정식물구조(포복지, 구근, 뿌리, 묘) 휘물이와 전지, 접목과 발아, 보다 최근에는 조직 배양을 포함한다. 조직 배양 방법은 다른 목적이나 다른 식물중에 널리 이용된다. 이에 관한 문헌으로는 브리타니카, 마크로페디아 백과사전내에서 "조직배양", "조직과 과류, 식물", "원예", "식물번식", "과일과 과일농작" 및 "채소와 채소농작"이란 제목을 참조할 수 있다.

상기 방법은 녹스빌소재의 테네시 대학의 국제 심포지움에서 1978년 4월 16-19일에 "조직배양을 통한 고등식물의 번식"이란 제목으로 발표된 논문(미국 동력부의 기술정보쎈터, 미국상무성의 국가기술정보국, 스프링필드, 버지니아 22161, 협의회 T-80411) E. 토마스와 MR 다베이의 "단일 세포로 부터 식물까지"(위켄함 출판사, 1975), DN 버처와 DS 인 그람의 "식물조직배양"(카멜로트 출판부, 1976) 등이 기술되었다.

조직 배양 방법은 어떤 잡종 식물자체 또는 양친 식물계열(예컨데 난초, 카아네이션, 화야채, 및 아스파라기스)를 번식시키는데 사용되었다. 적당한 참고문헌으로는 J. Am. Hort. Sci., 102(1), 69-73(1977)에 수록된 WC 엔더슨과 JP 파스텐의 "F1 잡종종자 생산에 사용하기 위한 화야채, 브라시카 올레라새(이탈리카군)의 조직배양번식"을 들 수 있다.

아스파라가스에서 조직배양의 사용은 American Vegetable Growor, 5월(1978, pp. 8-9와 10월(1978)pp. 8-9에 기술되었다. 참고 특허로는 카드카데의 미국특허 제4,038,778호 맥코르미크 브리트의 제1,387,821, 시비의 제4,003,156호, 로우틴의 제2,747,334호, 투칵스의 제3,009,289호, 맥다드의 제3,514,900호, 코레트의 제3,683,550호, 구딘의 제3,816,960호, 스토틀메이어의 제3,821,864호, 칼슨의 제3,832,801호, 패터슨의 제3,861,079호, 구딘의 제3,955,317호, 복수스의 제3,972,146호, 세이버트의 제4,051,817호, 카드카데의 제4,060,933호 및 스타바의 제3,846,937호 등을 포함한다. 본 출원인이 아는 바에 의하면 상기 방법들중 어느 것도 새로운 잡종의 속성번식 및 잡종의 상업적 생산에 대한 방법은 기술된 바 없다.

본 발명의 기본 목적은 순도가 높은 잡종을 속성으로 생산하고 잡종 씨앗을 증가된 수율로 생산하는 것으로 대규모의 상업적 생산 및 시판방법을 제공하는데 있다. 본 발명은 새로운 잡종 및 잡종종자를 개량하기 위한 육성 번식(교배)의 방법과 본래 교배체의 대규모 복사를 위한 본래 양친 식물의 영양번식(식물성 번식)의 방법을 합친 방법이다.

본 발명은 하나 또는 양쪽이 이질체인 유전적으로 상이한 각각의 양친 식물의 교배식 유전적으로 서로 다를 때 고도의 외형적 균일성(다시 말하면 유사한 외형 특성)을 나타내는 일권의 F1잡종을 수득할 수 있다는 이론에 기초를 두고 있다.

본 발명의 다른 이론은 각개의 양친이 영양번식체로 부터 유도된 잡종 종자는 본래의 원종이 유도한 F1잡종과 원형적으로 유사할 뿐만 아니라 유전적으로도 일치한다는데 근거를 두고 있다. 본래 개체의 양친식물(이것의 하나나 양쪽이 이형체임)의 교배는 외형적으로 균일한 본래 양친으로 부터 유도된 잡종을 수득하는 반면 양친의 영양 번식체의 교배는 보통 외형적으로 유사한 영양번식된 양친으로부터 유도된 잡종이 수득된다.

이러한 이론은 본 발명의 기본적 장점을 제공하는데 본래 양친 식물의 하나 또는 양쪽이 이형질체이기 때문에 양친 또는 양친들은 생장력이 낮은 근친 교배 대신에 생장력이 강한 잡종이 되므로 결과적으로 잡종 종자의 수율은 높게된다.

또한 양친 계열이 숫자적으로 제한이 없기 때문에, 제한없는 유전적으로 다양한 번식 계열에 적응할 수 있다. 결과적으로 잡종은 고도로 근친 교배된 동질형 양친의 종래 교배체로 부터 유도된 잡종과 동일하거나 보다 우수한 특성을 가진 것이 생산되며 더우기 이것은 종래에는 없었던 경제성을 이룰 수 있다.

본 발명의 한 방법에 따르면 한쪽 또는 양쪽이 이질체인 2종의 식물을 교배시킨다. 각 본래 양친식물은 조직 배양 방법을 사용하여 식물번식이나 영양 번식시킨다. 교배체로 부터의 잡종 종자를 심고 본래 양친으로부터 유도된 잡종 식물은 형태학적으로 균일성을 나타낸다면 각계의 양친 식물의 영양생식체가 번식되고 만일 그렇지 않다면 배원질(germplasm)이 파괴된다. 각 영양 생식체의 교배시 본래 양친으로 부터 유도된 잡종의 종자가 수득된다.

본 발명의 다른 형태에 따르면 양친의 이형체 또는 동형체에 제한없이 유전자적으로 상이한 개개의 양친 식물간에 다수의 실험적 교배(톱(top)교배)를 실시한다. 교배에 사용된 개개의 본래 양친식물들은 조직 배양방법을 사용하여 식물적으로 번식시키거나 영양생식 시킨다. 야외 실험에서 다수의 실험적 교배로부터 수득한 잡종을 평가하고 번식시키기 위하여 제한된 수(소수)의 최적 잡종을 선택한다. 이렇게 선택한 것들은 잡종내 유전자적 균일성의 배합을 나타내고 원하는 잡종특성을 갖는다. 선택 즉시 선택된 최적의 본래-양친으로 부터 유도된 잡종을 식물적으로 번식시켜 각 잡종의 각 양친들의 영양생식체를 만든다음 각 잡종에 대하여 2개의 영양생식된 양친 계열을 대규모로 고배시켜 종자를 만든다. 이러한 방법으로 생산된 종자는 상업적으로 선택된 최적의 실험적 본래 양친으로부터 유도된 잡종과 외형적으로 유사한(유전자적으로 동일) 일군의 영양생식된 양친으로 부터 유도된 잡종 식물을 수득한다.

이러한 방법은 식물 재배자가 식물 생장력, 성장습성, 수율, 내질병성, 내수성이나 염에 대한 스트레스, 과일이나 쥬스의 질등과 같은 원하는 유전적 특성을 나타내는 양친식물의 최적의 우수한 식물이나 종을 선택할 수 있도록 한다. 소수의 생장력이 낮은 동질체 양친 계열에 제한을 받지 않고 재배자는 교배시 이형질의 정도에 관계없이 어떠한 식물이나 이용할 수 있으므로 새로 실험된 잡종은 전례없는 유전적 다양성을 나타낸다.

다수의 톱(top) 교배가 이루어지면 외형적 균일성과 원하는 잡종 특징을 나타내는 수득한 잡종군을 이들의 각 원종 식물에 적용한 영양생식방법을 사용함에 의하여 잡종 종자 생산에 이용한다. 영양생식된 양친 식물을 교배하면 선택된 최적의 본래 양친으로 부터 유도된 잡종 종자와 유전학적으로 동일한 영양 생식된 양친으로 부터 유도된 잡종 종자를 대규모로 생산할 수 있다.

본 방법을 고순도의 브라시카 종자의 상업적 생산에 사용시 선택된 양친의 하나 또는 둘이 자체 교배가 성립되지 않을 때는 예상외의 장점을 얻는다. 최대의 자체-교배 불농도를 나타내는 양친식물을 영양번식시킬 때 근친 교배 불가능한 식물로 구성된 양친 계열이 이루어진다. 만일 자체 교배 불능의 식물을 영양생식시켰다면 수득한 영양생식체는 상호 용이하게 수분작용이 일어나지 않는다. 따라서 양친 식물 계열의 영양생식체는 효과적으로 근친 교배될 수 없을뿐만 아니라 자체 교배될 수 없다.

결과적으로 한 영양생식된 양친 계열이 다른 양친 계열과 자연적으로 교배-수분작용되었을 때 후자의 양친 계열의 화분만이 전자의 양친 계열을 수정시킨다. 그러므로 전자 계열로 부터의 종자는 균일한 높은 잡종순도를 나타내며 자체-수정의 가능성은 거의 없다. 만일 양쪽의 양친 계열이 영양생식된 양친이라면 각각은 자체-교배 불가능한 것으로 선택한 다음 두 계열의 자연적 교배-수분작용을 시켜 두 계열로부터 얻을 수 있는 종자를 수득한다.

영양 생식방법은 잡종 종자를 만드는 현존 방법중 가장 많은 장점을 갖는데 이것은 노동력이 많이 드는 수공적 수분작용을 요하는 자체-교배될 수 없는 동일체의 양친 번식계열을 유지하는 힘든 비싼 공정을 생략할 수 있다. 자체 교배 불가능성은 강한 반응이기 때문에 영양생식체의 근친 교배 불가능성은 보다 강한 반응이어야 한다. 최적의 양친을 영양생식 시킴에 의하여 영양 생식체는 양친의 최적의 유전적 특성을 유지한다. 영양생식이 본 발명에 따라 실시된다면 본래 양친으로 부터 유도된 잡종은 영양생식된 양친으로 부터 유도된 잡종과 유전학적으로 동일하다.

번식방법의 개발

새로운 잡종의 개발 및 생산의 초기단계로서 번식방법을 개발하였다. 광범위하게 설명하자면 본 번식방법의 요점은 각 실물들을 교배하여 각 양친 계열의 원하는 특성을 합친 잡종을 생산하는 것이다. 특성은 시장의 상업적 요구(예컨대 내질병성 수확율, 식용식물에 대한 종자 질, 장식용 외관 등) 및 사용될 농장형태에 의하여 정의된다. 현재까지 식물 재배자는 많은 식물에 대한 동형체 양친계열의 수가 비교적 작기 때문에 잡종을 생산하기 위하여 교배용 양친 계열을 선택하는데에는 적절한 판단을 요한다.

또한 집합성 자체생식의 비교적 높은 가격, 동일체 양친 계열을 번식시키는데 필요한 야외 실험의 선택, 교배 및 잡종의 질을 변화시키기 위한 실험의 제한이 있다. 그러나 본 발명에 따르면 양친 육종계열의 수에 제한이 없으며 육종계열로 작업을 하지 않는데 즉 단일 식물을 육종계열로 사용할 수 있다. 따라서 육종 방법은 어떤 단일 식물에서 발견되는 어떤 원하는 특성의 장점을 취할 수 있고 이러한 식물은 어떤 다른 식물과 교배시켜 원하는 특성을 배합시킬 수 있다. 환언하면 육종자는 소수의 동질 양친계열에 한정시키지 않고 동질체이거나 아니거나간에 개개의 식물은 많은 다른 식물(다시, 이들의 동질체에 관계없이)과 교배시킬 수 있고 보다 가치가 있고 외형적 균일성을 나타낸 어떤 수득한 잡종은 상업적으로 신속하게 번식시킬 수 있다.

더우기 단일 성장 계절에 번식될 수 있는 많은 상이한 잡종들은 이들중에서 최적의 잡종으로 선택할 수 있다.

개별적 양친 식물의 선택

본 발명의 둘째 단계로서 개별적인 양친 식물들을 선택한다.

상술한 바와 같이 원하는 특성을 가진 식물을 이형질체나 동형질체에 제한없이 선택한다.

개별적인 본래 양친 식물들의 교배

한계열이 단일 이형질체 식물일지라도 본래의 양친 계열로부터 원하는 육종 방법에 따라 다수의 톱(top) 교배를 시킨다.

본 발명의 방법은 본래 양친 식물의 거의 무한정한 복사를 허용하기 때문에 해당하는 많은 수의 톱교배를 실시한다. 그러므로 원하는 특성을 나타내는 어떤 개개의 식물을 사용하여 사용한 식물의 이형질체 또는 동형질체에 관계없이 꽃가루로 다른 식물을 수정시키거나 다른 식물로 부터 얻은 꽃가루로 수정시킨다.

따라서 높은 생장력, 성장습성, 수확율, 내질병성, 내수성, 내염성, 자체 교배 불가능성이나 어떤 다른 특성 같은 원하는 특성을 나타내는 개개의 식물들을 교배에 사용한다. 만일 결과된 교배체가 원하는 복합특성을 나타낸다면 양친 식물을 영양생식시킴에 의하여 나머지 식물(배원체)을 대규모 교배에 이용하고 그렇지 않다면 잡종뿐만 아니라 이것의 양친을 시간이나 금전상의 최저 비용으로 파기시킬 수 있다.

적당한 실시예에서 한계열로 부터 일군의 5-20개 식물을 교배시키기 위하여 선택하고 이것의 한계열을 수개의 다른 계열과 교배시키든가 수개의 계열을 한 계열과 교배시킨다.

하기에 상술한 바와 같이 한계열은 수개의 다른 잡종에 원하는 유전적 특성을 부가시킨다.

개개의 양친 식물의 교배는 선택한 종에 대한 종래의 잡종화 방법으로 실시한다. 한 표시된 개개의 식물로 부터의 화분(양성 또는 꽃가루 제공체)을 보통 거세된 식물인 암술에 공급하여 식물의 특별한 형태에 따라 한 식물의 꽃밥으로의 인공적 수분작용을 시키든가 또는꽃가루의 수집 및 수정의 기계적 방법을 사용한다.

영양 생식할 수 있는 이식부 조직의 수득

개개의 양친 식물을 표시한 후 보통 교배전 각 본래 양친 식물로 부터 적당한 이식부 조직을 얻으며 이 이식부는 조직 배양의 방법에 의하여 개개의 본래 양친 식물의 식물적 번식의 기초를 이룬다.

수득한 이식부 조직은 주로 특정 식물에 따르면 조직 배양번식은 영양생식에 사용할 수 있으므로 각 식물의 그 부분은 수적으로 증식시키기 위하여 조직 배양 조건하에서 번식될 수 있는 것으로 선택하여 토양에 이식한 다음 야외로 이식될 수 있는 모종을 형성할 수 있는 것으로 선택한다. 유해한 유전적 변화를 일으킬 위험없이 번식시킬 수 있는 엽액 봉오리나 묘목상부(예컨데 토마토 식물과 양배추), 커드(CURDS) (예컨데 꽃 양배추에 대하여), 뿌리와 줄기나 기타 식물 부분을 사용한다.

배양을 위한 영양 생식될 수 있는 이식부를 얻기 위하여 본래 양친 식물 자체 또는 원예적이나 식물학적으로 번식될 부분을 사용한다.

이식부 조직을 얻는 첫번째 단계는 식물 자체를 곤충, 질병 및 진균류로 부터 유리시키는 것이다. 오염미생물을 가능한한 배제시키기 위하여 온상 주위를 살충제 처리를 이용하는 것이 좋으며 살충제와 살진균제를 예방적으로 사용하거나 식물을 분리 성장시킬 수도 있다.

이식부 조직을 얻기 수일전 식물 및 식물부위를 베어내어 이식부를 회수하며 식물을 살진균제 용액으로 분무시키고 또한 각 식물 둘레의 토양에도 주입시키는 것이 바람직하다.

이식부를 수득 직전 적당한 방부제 즉 70% 에탄올-물 용액으로 소독한다. 조직 배양을 위한 이식부를 베어내어 이식하는데 소독된 메스, 집게 및 장갑을 사용한다.

각 식물로 부터 수개의 이식부를 취한다. 현재 사용할 조직 배양방법은 높은 생존율을 나타내나 사망율을 보충하기 위하여 충분한 이식부를 얻음에 의하여 각 식물의 배원질 이용성을 유지시키는 것이 바람직하다.

무성 생식시키는데 무균의 실험 조건이 유지되어야 하며 매체도 미생물이 성장하므로 식물을 번식 시키기 위한 영양매체로 소독되어야 한다. 따라서 실험실 주위는 무균으로 유지하고 식물학적으로 번식시킬 묘나 다른 물질의 모든 이식은 무균환경에서 이루어진다.

아식부나 묘목의 저장

본 발명을 사용하여 새로운 잡종의 번식 및 상업적 생산에는 적어도 1세대 보통 2세대가 요하기 때문에 실제로 상업적으로 생산하기전 해당하는 기간 동안 각 양친 개열의 배원질을 보관할 필요가 있다. 이식부조직으로 부터 번식된 묘목과 같은 조직 배양의 이식부나 기타 형태는 이 기간 동안 유전적으로 원형대로 보존되어야 한다.

다년생의 경우 자체를 수년간 분리하여 성장시키고 어느 때나 이식부를 채종 할 수 있는데 이것은 가장 간단한 방법이고 이것이 효과적일 때 최적의 방법이 된다.

1 또는 2번의 성장 계절만을 가진 식물에 대해서는 2가지 방법중 어느 하나를 취할 수 있는데 첫번째 방법은 이식부나 절단가지를 식물적으로 번식시키며 본래 양친의 무성 생식체로부터 보다 많은 잡종을 생산할 필요가 있을 때에는 수주간 번식을 반복시킨다.

현재까지 충분히 개발되지 않은 둘째 방법은 이식부나 묘목을 보관 및 유지시키기 위하여 한제 방법을 사용하는 것이다. 수개월이나 수년을 보관하는데 액체 질소 온도를 사용하는 것이 이상적이다. 다른 방법으로는 저온 저장을 이용하는 것이데 예를 들면 세이버트의 미국특허 제4,052,817호는 조직파괴를 방지하기 위하여 냉각 보호제를 첨가하는 것을 기술하였고 세이버트는 또한 조절 냉동한 다음 녹인후 -70℃이하에서 저장함을 시사하고 있다.

이삭부 조직의 무성 생식

각 양친 식물로 부터 채종된 이식부나 절단가지를 조직 배양조건하에서 식물적으로 번식시키거나 영양번식시켜 양친 인자형과 유사한 다수의 모종을 생산한다.

실재로는 한 식물의 일부를 합성 영양 매에내에서 살균 조건하에 실험실적으로 성장시키는 데매체의 조성물은 통상의 유체 평형을 유지하고 어떤 효소와 작용하는 데 필요한 무기 이온세포 구성분을 형성시키기 위하여 탄소 원자의 주요원인 자당과 같은 에너지원, 세포의 단백질을 위한 기본 구성원인 아미노산 같은 질소 함유 화합물, 필수비타민, 특별한 식물 구조의 성장을 위한 오옥신이나 시토키닌 같은 어떤 호르몬을 포함한다. 영양 매체는 예컨데 무라시게와 같은 스쿡, 스쿡, 헬러, 노프, 감브로그, 화이트와 스트리트에 의한 표준문헌에 기술되었다.

특히 유기적 방법을 사용할 때 실험적 영양번식을 위하여 한천겔 매체를 사용하는 것이 적당하다. 겔번식 방법뿐만 아니라 바람직하지 않은 액체 현탄액 배지 방법은 예컨데 토마스와 EMR 다베이의 "단일세포로 부터 식물까지"(위켄함 출판사 1975), DN 버춰와 DS 인그람의 "식물조직 배양"(카멜토트 출판사 1976)의 책자에 기술 되었다.

특정 식물에 따라 상이한 실험실적 방법이 적용될 수 있다. 하기에서 보다 상세히 설명된 바와 같이 토마토에 대하여서는 3가지 단계방법이 사용될 수 있는데 ; 첫번째 단계 또는 초기단계에서저 농도의 오옥산을 포함한 기본 매체내에서 엽액 봉우리로부터 묘목 배양을 실시하고, 둘째단계 즉 증식 단계에서는, 초기 단계에서의 묘목을 성장 및 번식 시키기 위하여 영양 매체는 고농도의 오옥신을 포함하며 셋째단계 즉 뿌리 번식단계에서는 보다 높은 오옥신 함량을 사용한다. 유사한 셋째단계 방법은 화야채에 대한 것에서 발견할 수 있다. (J. Amer. Soc. Hort. Sci., (102 (1), 69-73 (1977)의 책자에 수록된 WC 앤더슨과 JB 카스덴의 "F ₁ 잡종 종자 생산에 사용하기 위한 화야채, 부라시카 오레라세의 조직 배양 방법"을 참조) 다는 조직배양 방법도 공지 되었거나 다른 식물에 대하여 시도되고 있다.

특히 토마토를 번식 시키는 조직 영양번식방법에 의한 본 발명의 대표적인 공정에는 3가지 단계공정을 사용한다. 각 양친 식물로부터 채종한 10-20개의 엽색 봉우리를 초기 매체내에서 4-5주간 성장 시키는데 각 봉오리는 이러한 조건 하에서 묘목이 된다.

최종 단계에서 한천 매체로부터 묘목을 제거하고 현미경의 도움으로 묘목으로부터 엽액봉오리를 조심스럽게 다시 채종한 다음 봉오리를 증식 매체내로 이식하여 여기에서 1개월 내에 각 봉오리는 3 이상의 부가적인 봉오리를 가진 묘목으로 성장한다. 이때 봉오리를 분리하여 높은 오옥신의 함량을 가진 셋째 매체로 이식하여 뿌리내리게 하여 완전한 식물이 형성되거나 또는 수를 더 증식시키기 위하여 증식 매체내에서 다른 순환과정을 반복한다.

끝으로 재배지로부터 충분한 식물이 이루어 졌을때 이들을 분리하여 본래 양친 식물의 무성 생식체인 통상의 식물로 성장시키기 위하여 온실로 이식한다.

양배추에 대한 본 발명의 적당한 연구에서 1-2개의 초생엽을 가진 분리된 묘목을 선택한 식물로부터 베어서 단일 단계조직 배양 방법으로 처리한다. 이 단계는 식물의 새로나온 기지 형성, 증식 및 뿌리 정착단계를 합친 것이다. (다단계 방법 즉 재배지 형성, 증식 및 뿌리 정착단계를 따를수도 있으나 필수적인 것은 아니다.)

양배추에 대하여 식물적 번식을 위한 방법은 분리된 봉오리로부터 세가지를 배양시키는 것이데 이것은 오옥신(0.25-5.0㎎/l)와 시토키닌(1-10㎎/l)를 포함한 한천을 기초로 한 영양 매체내에서 한 단계로서 효과적으로 이루어 질수 있음을 발견하였다.

이렇게 생성된 묘목은 투기한으로 증식 시키거나 필요에 따라 저장될 수 있다. 냉동저장 방법은 아직 양배추에 대하여 완전하지는 못하나 유사한 방법들이 다른 식물중에 사용되고 있다. (세이버트의 미국 특허 제4,052,817호를 참조)

3-4주후 실험실에서 증식에 의하여 더 증식할 수 있도록 묘목의 충분한 성장이 이루어지면 번식된 묘목을 야외에서 성숙 시키기 위하여 온상 조건으로 이식 시킨다. 묘목을 안개 및 높은 습도에 조건하에서 소독(이탄/(베르미큐라이트)혼합) 포팅(potting) 매체내에서 유지시켜 강화 처리하여 묘목을 이전에 적당하도록 한다.

화야채에 대한 본 발명의 적당한 실시예에서 선택한 식물로부터 화야채커드(curds)를 베어내어 3단계조직 배양 공정으로 처리하며 이단계들은 각 단계내 식물 호르몬의 함량을 조절함에 의하여 식물 묘목을 만들고, 증식하며 뿌리 정착시키는 단계들이 적당하다.

화야채에 대한 식물적 번식 공정에서의 첫번째 단계는 화야채커드(curds)의 분열 조직으로부터 묘목 배양을 실시하는 것인데 이 단계는 "오옥신의 함량이 비교적 높으나(예컨데 2.5-10㎎/l) 시토키닌은 낮은(예컨데 0.5-2.5m/gl) " 한천을 기초로한 영양 매체내에서 효과적으로 실시할 수 있음을 발견하였다. 첫번째 단계의 번식 매체내 있는 커드는 개별적인 묘목으로 성장한다.

첫번째 단계 매체내에서 2-3주간 성장 시킨 후 묘종을 둘째단계에서 증식기키기 위하여 분리 시킨다.

묘종을 둘째 단계에서 증식 시키고자 할 때 묘종 이식부를 둘째 영양 매체내에 놓는다. 이것은 낮은 함량의 오옥신(0.5-2.5m/gl)과 보다 높은 함량의 시토키닌( 2.5-10㎎/l)을 포함하여 시토키닌은 증식 또는 분아번식을 유도한다. 이러한 매체는 인산염을 함유하며 다음에 기술한 조성물은 매 2주간에 13개 묘종의 증식율을 제공한다.

둘째 단계에서 성장된 묘종은 무재한으로 증식 되거나 필요에 따라 저장된다. 냉동 저장방법은 화야채에 대하여 아직 개발되지 않았으나 유사한 방법들이 다른 식물종에 사용되고 있다. (세이버트의 미국 특허 제4,052,817호를 참조)

둘째단계로 부터의 묘종은 뿌리 발단이 되지 않았기 때문에 셋째단계 즉 낮은 오옥신(0.5-2.5mg/l)과 대단히 낮은 시토키닌(0.001-0.5mg/l)을 포함한 뿌리 정착 단계를 거친다.

2-3주후 번식시킨 묘종이 야외에서 성장시키기 위하여 소독한(이탄/버미큐라이트) 혼합물 포팅매체내에서 안개와 높은 습도의 조건하에서 묘목을 유지시켜 강화 처리한다.

최적의 잡종 선택

각 양친 톱(top)고배체로 부터 유도된 본 래의 실험적 잡종을 성장체로 성장시킨 다음 이들로부터 원하는 특성을 나태내는 제한된 소수의 최적 잡종을 선택한다.

먼저 각 그 배체로 부터의 일군(25-200개)의 잡종 식물을 유전자의 균일성에 대하여 시험한다. 개별적 고배시 고도의 유전자적균일성을 나타내는 고배체를 선택하여 더 평가하고 심각한 유전적 차별(비균일성)을 나타내는 고배체들은 버린다.

상기 시험에 통과된 잡종들은 잡종 생장력, 내질병성, 수확율 식물과 과일의 질 및 최대의 상업적 용도를 가진 원하는 다른 특성들에 대하여 시험한다.

토마토의 경우 토마토 형태와 과일과 과일 쥬스의 질이 최대의 관심사이며 시들음에 대한 저항성, 염에 대한 관용도등이 최적(본래 양친으로부터 유도된)의 잡종을 선택하는데 고려된다.

잡종을 기계적으로 수확하고자할 때 특히 중요한 사실은 모든 수확물을 동시에 수확할 수 있는 성장도이다. 이것은 수확시 과일을 손으로 선택하거나 거절할 수 있는 기회가 없을때 중요하다.

다수의 실험 잡종중에서 소수의 최적의(본래 양친으로부터 유도된) 잡종이 선택된후, 선택된 잡종의 무성 번식을 실시하고 식물자체, 절단가지, 이식부나 뿌리든간에 선택되지 않은 양친 식물의 모든 배원체는 버린다.

선택한 최적의 실험적(본래 양친으로부터 유도된) 잡종의 각 본래 양친 식물의 무성생식체를 번식 및 증식시켜 다수의 무성번식체를 만들고 한 세트의 무성번식체는 각 선택된 잡종의 두 본래 양친 식물의 각각에 해당한다. 번식 및 증식의 방법은 위에서 설명하였으며 실시예에서 보다 상세히 기술하였다.

무성 번식된 양식 계열의 교배

실험에서 선택한 최적의 본래-잉친으로부터 유도된 잡종의 각 본래 양친 식물의 각각을 식물적으로 번식시키면 무성 번식된 양친 식물들을 교배시켜 무성 번식된 양친으로부터 유도된 잡종의 종자를 생산할 수 있다. 이렇게 무성 번식된 양친으로부터 유도된 잡종은 본래 잡종과 유전적으로 동일하고 본래 양친의 무성 번식체는 본래 양친과 유전적으로 동일하다.

무성 번식된 양친 식물을 교배하여 무성 번식된-양친-유도된 잡종의 종자를 생산하는데 사용되는 방법은 본래 양친 식물을 교배하여 실험적으로 본래-양친-유도된 잡종을 생산하는 방법과 유사하며 주된 차이는 각 본래 양친 식물에 해당하는 많은 무성 번식체를 이용한다는 것이다.

최적의 실행을 위하여 개개의 본래-양친 유도된 잡종 교배를 위한 화분을 얻는데 사용된 본래 양친 식물의 무성 생식체로부터의 화분이 무성 생식된 양친 계열의 교배에 이용된다. 따라서 쌍중에서 여성(종자양친)인 식물의 무성 생식체가 무성생식체의 교배에서 여성으로서 사용된다.

포함된 식물의 형태에 따라 무성 생식된 양친으로부터 잡종 종자의 대규모 생산이 첫번째 예에서 본래-양친-유도된 잡종의 생산에 사용된 바와 같은 방법으로 이루어질 수 있고 요구되는 잡종 종자의 양에 따라 규모가 보다 커질 수도 있다.

야외 시험에 의한 확인

개개의 잡종군에 속하는 식물들은 상업적 이익이 있는 허용되는 균일한 유전체를 가져야 한다. (물론 유전적 균일성은 두 양친이 동질체가 아니면 이루어질 수 없다) 유전적 유사성은 식물군의 눈으로 볼 수 있는 특성이 증명 되었으나 다른 기준도 존재할 수 있다. 잡종 토마토의 다른 기계적으로 수확되는 식물의 동시 성장(성장도)이다.

본 발명의 방법에 따를 때 이론적으로 무성 번식된 양친-유도된 잡종에 속하는 모든 식물들은 서로 외형적으로 유사하며 본래-양친-유도된 잡종과 유전자적으로 동일하다.

외형적으로 균일성을 나타내는 본래-양친-유도된 잡종만을 선택하므로 외형적 유사성이 무성 번식된 양친-유도된 잡종들 중에 존재함을 예상할 수 있다. 그러나 실제로는 생산에 포함이 많은 경비 지출의 견지에서 잡종 종자를 사용할 때 야외시험에 의하여 외형적 균일성을 확인하는 것이 경제적으로 바람직하다.

무성 생식된 양친-유도된 잡종과 본래 양친-유도된 잡종간의 유전자적 동일성을 검사할 뿐만 아니라 일군의 무성 생식된 양친-유도된 잡종들 내에서 식물들의 외형적 균일성을 검사하기 위하여 야외 시험을 준상업적 규모로 실시한다.

동일성을 확인하기 위한 야외 시험은 야외 시험에 필요한 종자의 양을 제공하기에 충분한 규모로 각 본래 양친 식물들의 무성번식채를 교배시킴에 의하여 얻은 잡종을 사용하여 실시한다. 야외 시험의 성공은 본 발명의 합친 교배와 무성 번식 공정의 성공이다.

야외 시험 준위에서 선택된 잡종들의 실현성이 조절되며 상업적 생산 규모로 시작하기 전에 어떤 문제가 있는 가를 조사한다. 만일 문제가 심각하다면 잡종을 이것의 양친과 함께 버린다.

상업적 생산

무성 번식된-양친-유도된 잡종이 성장되어 수확후 야외 시험에서 예비 상업적 검사에 성공하면 잡종종자의 전규모의 상업적 생산을 시작한다.

이미 기술된 식물적 번식에 의한 각개의 본래 양친 식물을 무성번식시키는 공정을 반복하여 부가적인 무성 번식된 양친 식물을 얻는다. 다음에 각 본래 양친의 무성 번식체들을 교배시켜 판매용으로 다량의 잡종 종자를 생산한다.

생산에 성공시 무성번식된 양친-유도된 잡종의 종자를 생산하기 위한 교배용으로 무성 번식된 양친들의 다음 세대를 생산하기 위한 배원체를 얻기 위하여 각 본래 양친 식물들의 부가적인 투성번식체를 번식시킨다. 이것은 무성 번식된 양친-유도된 잡종의 전세대 및 본래 양친-유도된 잡종과 유전적으로 동일하다.

응 용

본 발명의 방법은 다양한 자웅동주곡물에 적용할 수 있다. 만일 양친 식물이 무성 번식될 수 있고 배원체가 여러세대에 걸쳐 유지될 수만 있다면 잡종화가 가능한 어떠한 식물들도 새로운 잡종의 생산에 사용될 수 있다.

야채 식물은 새로운 잡종 생산의 본 방법에 특히 접합하다. 종자의 높은 가격, 식물당 낮은 종자 수확율, 빠른 질병 감염, 해충 형태 및 우수한 재배물의 경제적 가치의 증진은 새로운 잡종의 신속한 번식 및 상업적 생산을 이루어질 수 있게 한다. 토마토가 특히 중요하며 실시예에서 예를 들었다.

수박과 같은 다른 원예 작물들도 본 발명에 따라 처리될 수 있다. 이러한 곡물종에 많은 개량이 이루어졌으며 새롭고 보다 우수한 변종이 요구되고 있다.

다른 채소 특히 화야채, 양배추등과 같은 브라시카 종들도 본 발명에 따라 새로운 잡종을 만들어 이들의 신속한 번식에 의하여 개량될 수 있다. 이 경우 선택된 양친의 하나 또는 양쪽이 자체-수정이 될 수 없을 때 예상외의 장점을 없을 수 있다. 자체수정 불능의 양친 식물들의 무성 번식은 근친 및 자체-교배될 수 없는 양친계열이 이루어 진다. 그러므로 자체 교배될 수 없는 식물들을 근친 교배시키기 위한 종래의 수분 작용의 필요성이 제거된다.

곡물들은 본 공정을 적용할 수는 있으나 경제적으로 본 발명에 적합한 것으로는 나타나지 않는다. 벼와 같은 어떤 식물에 대하여서는 경제적으로 되기 위해서는 식물당 종자가 너무나 적으며 다른 곡물에 대하여서도 이미 존재하는 식물의 변종들과 비교할 때 잡종의 가치가 크지 않다.

그러므로 본 발명의 방법은 동형질체가 아닌 각 식물들의 교배로부터 새로운 상업적으로 유용한 잡종을 신속하게 번식시켜 적업적으로 생산하는 방법을 제공한다. 본 방법은 (a)실험적 본래-양친-유도된 잡종을 생산하기 위하여 선택한 본래 양친 식물의 쌍을 교배 (b)의 외형적 균일성과 유용한 잡종 특성을 나타내는 최적의 본래-양친-유도된 잡종을 선택 (c) 무성 번식된 양친 식물을 얻기 원하여 선택한 실험적 본래-양친-유도된 잡종의 각 본래 양친 식물들을 식물적 번식에 의하여 무성 번식 및 (d)선택한 본래-양친-유도된 잡종과 유전적으로 동일한 무성 번식된 양친 유도된 잡종을 원한 종자를 제공하는 무성번식된 양친 식물들을 교배시키는 단계들로 구성되었다.

[실시예 1]

토마토

본 실시예에서 토마토를 교배시켜 4종의 새로운 변종을 개량하였다. 이들의 각 원종은 부성 생식으로 번식 시키고 무성 생식체의 교배체를 만들었다. 이 4종의 변종과 동일하거나 보다 우수한 수확율, 성숙도, 과일의 질 및 체질을 나타냈다.

개별적 양친 식물들의 선택

각각이 유전자적으로 서로 다른 60개의 토마토를 선택한다. 대부분이 이형질체이고 약간은 F ₁ 잡종이다. 이러한 계열로 부터의 종자를 온상에 심고 100개의 묘목을 만든 다음 이것으로부터 소수의 개별적 식물들(예컨데 1-10)을 선택하고 이들 각 식물들을 다음 교배에서 양친으로 사용하기 원하여 꼬리표를 붙어 표시한다. 144개의 양친 식물들이 이렇게 표시되어 잡종화를 위한 유전자체로서 선택한다.

개개의 양친 식물들의 교배

선택한 144개의 양친 식물로부터 다수의 교배를 실시하며 교배의 목적은 과일 형태와 질의 원하는 특성을 가진 토마토를 얻기 원한 것이다. 과일 형태학에 기초를둔 13가지의 분류법, 다시 말하면 형태가 평방 둥글기 대평방 둥글기, 평방 둥글기 대뭉툭함, 둥글기 대둥글기, 장방형 대장방형, 뭉툭함 대둥글기 등의 분류법을 이용한다.

한 계열에 속하는 표시된 양성 식물로 부터의 화분을 수개의 표시된(거세된) 음성 식물에 교배시킨다. 표시된 음성 식물상의 거세된 꽃들을 수정시키기 위하여 한 표시된 식물 내의 꽃들로부터 얻은 화분을 사용하여 종래의 수공적 수분작용 방법이 이용된다.

각 특정 교배로 부터의 종자들을 비교 실험하기 위하여 야외시험 경작하는 데 각 교배로부터 약 50-100개의 식물들을 심으며 재배는 종래의 농사방법이 신시된다.

성장 단계에서 내병원성, 생장력, 과일형태, 식물당 과일의수 및 아래에 명시된 다른 오인들에 대하여 데이타를 수집한다.

본래의 많은 교배치들중에서 4개의 잡종이 두드러지게 나타났는데 이것은 다음과 같다.

(a) 6290-5×6269-2 : 푸사리움 레이스 Ⅱ 레지스턴트 어리 라운드(Fusarium Race Resistant Early Round) 이것은 캘리포니아 대학(Davis)로부터 F ₅ 로 수득한 번식 계열의 단일 식문을 GS12 잡종(골드스미드)로 부터의 단일 식물상에 교배시킴에 의하여 얻었다.

(b) 6240×6238-2 : 푸사리움 레이스 Ⅱ 레지스턴트 메디움 어리 스퀘어 라운드 (Fusarium Race Ⅱ Resistant Medium Early Square Round), 이것은 UC 82A 변종의 단일 식물을 케이스톤 Exp. 9976의 단일 식물상에 교배시킨 것이다.

(c) 6274-26250-2 : 푸사리움 레이스 Ⅱ 레지스턴트 메디움 레이트 스퀘어 라운드(Fusarium Race Resistant Medium Late Square Round), 이것은 케이스톤 Exp. 9976과 UC(Davis) 번식 계열간의 F ₁ 교배체의 단일 식물을 케이스톤 고동도 물질에 교배시킨 장방형 과일 198형태로부터 유도된 F ₇ 번식 계열(케이스톤)의 단일 식물에 교배시켜 얻는다.

(d) 6276-2×6250-2 : 푸사리움 레이스 Ⅱ 레지스턴트 메디움 마투리티 스퀘어 라운드(Fusarium Race Ⅱ Resistant Medium Matruity Square Round) UC(Davis) 번식 계열과 미지의 백분율로 교배된 m Race Ⅱ Resistant 의 케이스톤 번식 계열간의 F ₁ 교배체의 단일 식물. 메디움 마투리티 스퀘어 라운드(Medium Matruity Square Round) UC(Davis) 번식 계열과 상기 교배에서 사용된 것과 동일한 F ₇ 번식 계열에 미지의 백분율로 교배된 케이스톤 번식계열간의 F ₁ 교배체의 단일 식물. 여러가지 교배로부터 없은 토마토의 반-정량적 검사 결과가 아래에 수록되었다.

잡종 토마토 과일의 질

^* 결과는 신험과 관계없는 수개의 복사물로부터의 데이타를 나타낸다.

^** 이것은 기계적 수확의 신험적 결과로서 "줄기부"와 "총 적색과일"이 최적이다.

무성 번식할 수 있는 이식부 조직의 수득

온상내 묘목단계에서 표시된 각 양친 식물을 무성 번식 시킬 수 있는 이식부 조직을 얻기 위하여 만든다. 표면을 소독하지 않고 각 양친식물로 부터 1-4개의 절단가지를 얻어서 조직 배양체를 만든다. 절단가지를 (a) 비타민과 자당을 생략하고 (b) 오옥신이 인도레부티리크산 1mg/l이며 한천농도를 1% 증가시킨 것 이외에는 무성 번식에 대하여 하술한 바와 유사한 한천 매체가 들어있는 배양관 내에 넣는다.

1주내 조직 배양이 이루어 졌을 때 절단 가지를 배양관으로 부터 회수하여 온도가 조절된 온상 내의 축축한 소독된 포팅 토양(1/1 이탄/진주암) 내에 심는다. 절단가지로 부터 성장한 식물은 배지 성장을 위한 이식부 조직원으로서 실제 사용할 수 있다.

다음의 조직 배양을 위하여 소독한 질병부재의 식물을 얻기 위하여 식물을 절단시키는데 몇가지 주의를 요한다. 식물을 언제나 곤충으로 부터 유리시키기 위하여 살충제를 사용하고 만일 곤충 부재의 온상을 사용한다면 식물을 분리하여 성장시킬 수 있다. 근거가 있다면 살진균제를 사용할 수도 있다. 이식부 조직을 만들기 2일전 살진균제(칼리포니아주 화이티어 소재의 콘산 패시피크회사제 피산 20, 2.6mg/l)로 분무시키고 0.5-1.0mg/l의 동일한 용액을 식물주위의 토양에 주입한다. 이것은 이식부조직을 만들기 1일전에 반복한다.

무성 번식을 위하여 선택한 방법은 엽액 봉오리의 증식으로서 각 식물로 부터 10개의 봉오리를 취한다.

봉오리를 회수하기 위하여 먼저 조직 부위를 70% 에탄올 용액으로 분무시키고 꽃봉오리-부위를 소독한 메스로서 베어낸 후 조직을 소독한 핀세트나 70% 에탄올로 세척한 장갑으로 잡아서 소독수가 포함된 배양관에 넣는다.

이식부의 소독은 개면 활성제(트윈 20, 2mg/l)를 포함한 차아염소산 나트륨액(20% 클로록스)로 처리함에 의하여 효과적으로 이루어진다. 용액과 조직을 30초간 교반시킨 다음 진공 데시케이터 내에 넣고 차아염소산나트륨과 완전 접촉되도록 30㎝ Hg 진공을 15분간 가한다.

진공 처리후 용액을 따라내고 소독한 증류수로 3회 헹구고 각각 헹굴 때에는 교반시킨다.

파괴된 조직을 제거하고 엽액봉오리를 배양 초기에 대하여 하술한 소독 한천 매체상에 놓는다.

이식부나 분맥의 저장

각 양친 유전자의 배원질을 수세대간 유지하기 위하여 2종의 상이한 방법을 사용한다.

첫 번째 방법에서는 각 양친 식물의 절단가지로 부터 온상식물의 작은 구간을 만들어서 그 내에 심고 모든 식물들이 무곤충과 무질병으로 유지시킨다.

둘째 방법에서는 각 유전자의 20-30배양균체을 다음의 무성번식에서 기술한 바와 같이 분맥들의 일련이식에 의하여 유지시킨다.

어느 방법에서든지간에 7개의 각 양친 유전자가 무성 번식 또는 식물성 번식에 의하여 복사된 것이 확인되며 다른 137개의 유전자들은 버린다.

이식부 조직의 무성 번식

무성 번식은 각각 선택한 조직 성장 조건하에서 3단계 즉 초기 중식 및 뿌리 정착 단계에서 이루어진다. 먼저 배지를 저농도의 인돌아세트산(IAA)를 포함한 초기 영양매체상에 만들고 4-5주간 성장시킨다. 단일지맥은 각 봉오리로 부터 번식시킨다.

초기 단계로부터 유도된 각 지맥으로부터 베어낸 엽액 봉오리를 증식시키기 위하여 둘째 단계로 이식시키거나 2차배양시킨다. 둘째 단계는 고농도의 IAA를 포함한 영양 매체내에서 효과적으로 이루어지며 초기단계에서 얻은 엽액 봉오리로부터 지맥의 성장 및 번식이 이루어진다. 증식은 배양관내에서 엽액 봉오리를 충분히 성장한 지맥로 성장시킴에 의하여 이루어진 후 지맥으로부터 엽액 봉오리를 베어낸다. 각 봉오리는 분리된 관에 넣고 각 봉오리로부터 새로운 지맥이 생기도록 영양매체내에 고농도의 IAA 함량을 사용한다.

다음은 기본적 영양 겔 매체 조성물이다.

토마토의 실험실적 배지의 매체 조성물

a/ : T.뮤라시에이즈와 F.스쿡, 속성성장을 위한 수정 및 매체 및 담배 조직 배양에서의 생리적 평가

(Physiol. Plant., 15,473-497(1962)

b/ : 저장 용액을 신선하게 유지

c/ : 121℃ 및 16-18psi에서 15분간 처리하기 전 5.7의 pH 20ml 매체/배양관 25×150mm.

보다 상술하면 각 표시된 양친 식물로부터(또는 이들의 절단가지로부터) 베어낸 소독한 엽액 봉오리를 먼저 오옥신과 같은 0.03mg/l의 인돌초산(IAA)을 포함한 상기 포에 있는 기본 매체를 포함한 초기 매체에 이식한 다음 4-5주간 성장시킨다.

이 성장 단계후 지맥을 이들의 배양관으로부터 회수하여 무균 조건하에 각 지맥으로부터 엽액 봉오리를 베어낸다.

이러한 봉오리를 IAA함량이 0.03mg/l인 것 이외에는 상술한 바와 같은 조성물을 가진 증식 매체에 이식시킨다. 4주내에 각 엽액 봉오리는 2-7개의 엽액 봉오리를 가진 지맥으로 성장한다.

증식 싸이클을 매 4주간 반복하는데 각 경우 성장한 지맥을 회수하여 엽액 봉오리를 베어내며 부가적인 지맥 증식을 위하여 초기의 증식 단계를 반복한다. 본래-양친-유도된 잡종이 충분히 성장하여 상술한 바와 같이 소수의 최적 잡종을 선택할 수 있을때 각 본래 양친 식물들이 최적의 잡종을 만들었는가를 결정한다. 본 명세서에 기술한 실시예에서 7개의 각 식물들이 확인 되었다. 7개의 배원질을 유지하고 남은 137개의 식물은 버린다. 이러한 7개의 특정 양친들의 배원질은 더 증식시킨다.

7개의 선택된 본래 양친 식물로부터의 충분한 수의 엽액 봉오리를 이용할 때 각 지맥들로 뿌리 정착을 위한 3.0㎎/1 lAA르 포함한 셋째 매체로 이식시킨다. 2주후 배양된 지맥은 우수한 뿌리 성장을 나타내며 조직 배양 조건으로부터 온상으로 이식한 준비가 되었다.

초기 및 증식 단계중 25°±3℃의 온도, 백색형광등으로부터 3500룩스의 광도가 16시간 동안 유지된다. 뿌리성장을 위하여서는 6,000-10,000룩스의 광도를 요한다.

상기 조건들은 유전적으로 보전되며 이때 외형적 변화는 관찰되지 않았다. 조건들은 일련의 이식을 증식 매체내에서 반복시킴에 의하여 배원질을 은행으로서 유지될 수 있게 하며 무성번식된 식물들을 수년간 교배시킬 수 있도록 한다.

묘목을 심음

무성 번식 조직 배양의 최종 단계로부터 수득한 묘목이나 뿌리가 있는 지맥을 조절된 성장실에 조심하여 심는다. 각 선택된 양친 유전자에 대하여 본래의 7개 양친 식물로부터 상기 공정에 의하여 무성 번식된 48개의 식물을 온상에 심는다.

먼저 묘목은 이들의 배양관으로부터 회수하여 뿌리에 묻은 한천을 세척한 다음 묘판(2in×2in)내 축축한 이탄/베르미큐라이트 토양내에 10-15mm깊이로 심는다. 모판을 플라스틱 관내에 넣어서 수분 손실을 조절하고 성장실내를 28℃와 백색 형광등으로부터 15000-2000룩스를 16 조사시간하에서 유지시킨다.

선장실내에서 2일 후 플라스틱관을 열어서 식물을 단련시키고 3일후 관을 제거한다. 선당실에서 다시 3일이 경과후 식물을 완전 햇빛이 비치는 온상의 모판에 이식시킨다.

온상 묘판상에서 1주간 성장시킨 다음 식물을 온상의 멘땅에 이식하여 각 양친식물의 무성 번식된 양친 계열을 생산한다.

본래 양친 식물의 교배

전술한 바와 같이 톱교배는 144개의 원종 양친 식물들은 계별적으로 이용하여 이루어졌다.

종래의 토마토 교배기술을 이용하고 각각의 교배를 시키기 위해서, 화분립이 발육하기 전에 꽃밥은 제거하여 한 시물상의꽃들을 거세시켰다. 다른(웅성) 식물이 여러 꽃에서 화분을 수집하여 그것을 짝을 이루는 거세된(자성) 식물의 암술에 손으로 분배함으로서 수정시켰다.

이러한 자성 식물은 성숙하여 토마토를 맺도록 하고 개개의 자성식물에서 생겨난 토마토를 수집하고 이렇게 얻어진 종자는 포장(圃場)시험에서의 재배를 위한 잡종종자가 된다.

상기 과정에서 각각의 양친 계열로부터의 수개의 각 양친을 초기에 선택한 다음 한계열의 가장 생장력이 있는 양친을 다른 계열의 가장 생장력 있는 양친과 교배를 시킨다. 이렇게 얻어진 잡종종자는 전술한 바와 같이, 요구하는 유전적 특성을 지닌 개체군과 같은 잡종형태인지 확인하는 포장실험과정에서 실험 대상이 된다.

무성번식된 양친 계열의 고배

무성번식 양친 유래되는 잡종종자를 생산하기 위한 무성생식된 양친 식물의 교배과정은 원종양친에서 유래되는 잡종종자를 실험적으로 생산하기 위한 원종양친 식물의 교배과정과 유사하다. 단하나의 차이점은 개개의 원종양친 식물들에 해당하는 무성번식체들이 이용된다는 것이다.

최적한 실시예로서 원종 양친 식물 개체를 교배시키기 위해 사용된 원종양친 식물에서 나온 무성 번칙체의 화분이 무성번식된 양친계열의 교배를 이용된다. 이에 상등하여, 짝을 이루었던 자성식물의 무성번식체는 무성번식체 교배에서 자성으로 사용된다.

한 식물에 대한 수공적 거세와 다른 식물의 화분 수정(수공적 또는 곤충을 이용)이 원종교배에서 사용되었던 것과 같은 방법으로 행하여진다.

원종 교배용 화분을 제공하였던 식물의 무성 번식체로부터 화분을 얻는 것과, 원종화분의 수용기였던 식물의 거세된 무성번식체를 사용하는 것이 바람직한 방법이다. 이론적인 면에서 이 방법은 식물 유전학의 상반법칙으로 인해 불필요한 것 같으나 이는 어떤 변이를 최소화하기 위해 바람직한 시도인 것이다. 실제로 보다 강건한 양친은 보통 종자 생산을 최대화하기 위해 자성으로 이용된다.

포장시험에 의한 검사

잡종 종자의 전면적인 상업적 생산에 앞서서, 무성번식된 양친에서 유래된 잡종 종자와 원종 양친에서 유래된 잡종 종자간에 유전적 동일성을 확인하기 위해서 준(準) 상업적 포장시험이 요구된다. 즉 몇가지 설명할 수 없는 이유로 인하여 무성번식체 교배에서 얻어진 잡종종자가 원종 양친 식물개체의 교배에서 얻어진 잡종종자의 질에 못미칠때에는 잡종종자의 상업적 배양을 중지할 수밖에 없다.

종자간에 질의 동일성을 확인하기 위한 포장시험은 개개의 원종 양친 식물의 무성번식체 교배에서 얻어지는 잡종 종자를 사용하여 행하되, 그 규모는 상업적 재배설비를 이용하는 포장시험에 필요한 양의 종자를 제공할 수 있도록 충분히 커야 한다. 이리하여 전면적 상업생산에 들어가기 전에 발생될 수 있는 문제들이 검출되는 것이다.

상업적 생산

일단 무성번식된 양친에서 유래된 잡종종자들이 성숙하여 상업적 확인단계에 이르도록 수확되면, 잡종종자에 대한 전면적인 상업생산이 시작될 수 있다.

전술한 영양번식에 의한 원종양친 식물개체의 무성번식 과정을 반복하여 무성번식된 양친 식물들을 추가로 얻는다. 이어서 개개의 원종 양친의 무성생식체 교배시켜 판매용 잡종 종자를 많이 생산한다.

이상 설명한 실시예에서는 2개의 무성번식된 양친 식물들을 교배시킴으로서 상업적 잡종 종자 생산이 완수되었다. 본 발명의 목적을 위해 동형접합성이 아닌 (즉, 이형접합성인) 이들 양친 계통들을 무성 번식시킬 필요가 있다. 하나의 계통이 동형 접합성이면, 그것은 종자로부터 성장되거나 무성번식시킬 수 있다.

그런데 모든 이형 접합성 양친계열들은 실험적 원종 양친식물의 무성번식체가 되어야 한다.

[실시예 2]

양배추

일정

캘리포니아에서 고순도의 잡종종자를 상업적을 생산하기 위한 전형적인 일정이 아래에 서술되었으며 이 일정에 따라 행해지는 개개의 조작도 설명되어 있다.

(1) 첫해, 여름

첫해 여름에, 선택된 잡종종자를 만들때 사용되는 개개의 근친 양친계열(유전자형)을 약 50ft와 열(列)로 얇게 부린다. 이어서 종래의 영농방법을 행하여 각각의 양친계열 식물들이 완전한 시장 상품으로 성숙하도록 한다.

(2) 첫해, 가을

첫해 가을에, 식물들이 시장상품으로 성숙하였을때 약 10개의 식물이 그들의 형태적 특징을 검사하기 위하여 각각이 양친계열로부터 선택된다. 실제로 꼬리표를 다는 것과 같이 개개의 식물들에 명칭을 부여한 다음 선택된 각각의 식물을 가지를 쳐서 그루터기로 만듬으로써 이식할 준비를 한다. 식물이 다시 성장하였을때 이들을 따로 화분에 담은 다음 온실로 이동시킨다.

개개의 식물들이 선택될때, 열개의 식물의 체의 배양조직이 영양번식을 위해 취하여진다. 후술한 영양번식과정은 무균배양기내의 적당한 조직 성장조건하에서 기관형성적으로 행하여지는 한편 체의 배양조직의 몇몇은 예컨데 세이버트의 미국 특허 제4,052,817호에서 처럼 저온하에서 저장될 수 있다.

(3) 2년째, 봄

선택된 식물들은 각각 3월부터 4월에 계속 꽃이 핀다. 최대자체-교배불성립도를 결정하는 표준 원예시험을 실시하여 가장 강한 자체-교배불능의 각 계열을 규명한다. 실제로 이시험은 각각의 식물을 외적 수분작용없이 자가 수분(자체교배불능)에 대하여 가장 큰 저항을 나타내며 가장 적은 수율의 종자를 생산하는 식물을 결정하는 단계가 이루어 진다. 이 시험결과는 2년째의 7월 중순경에 적용한다.

(4) 2년째, 여름

가장 강한 자체-교배 불능성을 가진 식물개체를 결정하는 시험에 근거하여 각 식물이 각각의 양친 계열내에서 선택된다. 최대 자체 교배불능인 2개의 선택된 개체의 각각으로 부터 취한 이식부를 상술한 바와 같이 영양번식시켜 각각의 식물에 대하여 약 50개의 무성 번식체를 생산해낸다. 선택되지 않은 식물로부터의 이식부는 선택에 이루어 지자마자 곧 중단된다.

(5) 2년째, 가을

재생된 무성 번식체 2년째의 가을에 이식된후 국부적 생산규모로 무성번식된양친에서 유래되는 잡종종자를 만들기 위해 교배된다. 무성번식체는, 무성번식된 양친계열들이 서로 밀접한 관계에 있되 이존 식물의 화분에 의한 수정이 이루어지지 않도록 재배된다. 계통의 교배는 자연수분에 의하여 이루어진다. 이는 외부곤충을 막기 위해 차폐된 큰 상자내에서 가장 효과적이나 상자안의 파리, 벌등의 곤충으로 하여금 양친 계통을 교차수분시키도록할 수도 있다.

(6) 3년째, 가을

3년째 가을에는, 무성번식된 양친의 교배에서 잡종종자가 수확된다. 무성번식된 양친에서 유래된 얼마간의 잡종종자는 재배를 위해 플로리다와 같은 적당한 기후를 가진 지역으로 보내진다. 이어서 수득된 무성번식양친에서 유래되는 잡종 양배추는 2개의 선택된 양친 식물개체를 교배(뇌수분) 시키는 것에 의하여 만들어지는 원종 양친에 의한 잡종 양배추와 비교한다.

(7) 4년째, 봄

무성 번식된 양친에서 유래된 잡종 종자가 원종 양친에서 유래된 잡종 종자와 동일한가를 확인하기 위해, 국부적으로 생산된 무성번식된 양친에 의한 잡종종자는 원종 양친에 의한 종자와 함께 캘리포니아내서 파종된다.

(8) 4년째, 여름

무성번식된 양친에 의한 잡종 종자가 유전적으로 원종양친에 의한 잡종 종자와 비교될만한가를 확인했을 때, F ₁ 잡종 종자의 대규모 생산에 무성번식체를 사용하는 생산계획을 세울 수 있다. 이번에는 상업적 생산에 적당한 규모로 추가 무성생식체를 조직배양 방법에 의하여 준비한다. 무성번식과정은 아래에 설명되었다.

(9) 4년째, 가을

4년째 가을에는 잡종 종자의 상업적 생산에 착수한다. 에이 커당 약 8000개의 식물 밀도가 사용되며, 각각의 양친 계통에서와 같은 갯수의 식물이 사용된다. 이어서 이들은 곤충에 의한 자연 수분작용에 의하여 교배된다.

이들 식물에서 종자가 수확되면 곧 판매상태로 들어간다. 전술한 바와 같이, 개개의 무성 번식된 양친계통은 근친교배가 불가하고 상호 교배에 대한 유전적 동일성이 시험되었으므로 생산된 모든 종자는 시장 판매가 가능하다.

양배추의 영양번식

본 실시예는 여러 호르몬 및 영양매체가 브라시카 오레라세 L.Var 카피타타(Brassica Oleraces L. Varl. Capitata.)인 결구(結球) 배추에서 배어낸 지맥점의 시험관내에서의 발육에 미치는 영향을 연구한 것이다.

이 중요한 야채 작물의 분리된 지맥점으로 부터 통상의 식물을 생산해내는 능력을 확인할 수 있는시험관에서의 배양표가 이용되었다. 시험관내에서 성장점 또는 분열 조직을 배양하는 것은 종래부터 무병원체식물을 얻기 위하여(GM Morrel, Amer. Orchid Soci. Bull. 29, 495-497(1960)), 또는 무성생식에 의하여 식물을 번식시키기 위하여(T. Murashige, MN Shabde, PM Hasegawa, FH Takatori, and JBJones, J.Amer. Soc. t-3 97,158-161(1972)) 혹은 정단분열 조직의 형태 발생적 감응을 연구하기 위하여(E. Ball, Growth, 24, 91-110(1960), M. Shabde, and T. Murashige, "Hormonal Requirements of excised Dianthus caryophyllus L. shoot apical meristem in vitro, " Amer. J. Bot., 64, 443-448(1977) ; HS Smith and T. Murashige, "In vitro develppment of the isolated shoot apical meristem of angiosperms," Amer. J. Bot., 57, 562-568(1970). 이용되어 오고 있다.

액아(腋芽)는 들에서 자란 골든 아크제(Golden Acre) 품종의 결구 배추에서 얻었다. 이 싹을 70-75%의 에탄올에서 0.5-1.5분 동안 씻은 다음 7분동안 1%의 차아염소산 나트륨 용액에 적신후 무근수(無근水)로 세번세척함으로써 멸균 시켰다. 길이가 대량 100-150mm인 지맥점을 현미경, 해부를 이용하여 액아로 부터 무균적으로 분리해 냈다. 개개의 정단 또는 정단 분열조직후 한두개의 엽원기(葉原基)를 가진 정단 원개(dome)로 이루어졌다.

정단은 60×15mm의 유리접시에 당겨진 15ml의 무균한천배지아 25×150mm의 시험관에 당겨진 25ml의 한천 배지에서 배양되었다. 표준 MS염 형성화(T. Murashige and F. Skoog, " A revised medium for the rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture", Physiol. Plant., 15, 473-497(1962)에는 기본 배양기(培養基)외에 다음과 같은 성분 즉 100mg/l의 미오이노시톨(myoinositol), 0.4mg/l의 티아민 HCl, 30,000mg/l의 자당(sucrose) 및 7000mg/l의 한천이 포함되었다.

기본 배양기에는 다음과 같은 시험 첨가제가 첨가된다. 즉, 오옥신으로서 IAA(인돌초산, indole aceticacid)과, 시토키닌(cytokinin)으로서 키네틴(6-푸르푸린기-아미노퓨린)과 인산나트륨(NaH ₂ PO ₄ ·H ₂ O)그리고 황산아데닌(adenine sulfate)등이 포함될 수 있다.

매처리마다 10-15개의 정단이 사용되었다. 배양조건으로서 26±2℃에서 하루 16시간 동안(sylvania) 백색 형광등으로 부터 25000룩스의 광을 조사하였다. 관찰을 위해배양기간은 6주로 하였으며 배양에서 번식된 식물을 수도물로 씻어 한천을 제거한 다음 인탄-질석의 혼합물을 이식하였다. 식물을 견실하게 하기위해 처음 2주간동안 미스트 시스템(mist system)을 사용하였다.

식물은 시장에 내다 팔수 있을 정도로 성숙할 때까지 80+4℃ 온실에서 성장시켰다. 엽액 지맥점의발육을 위한 오옥신과 시토키닌의 상로작용·여러개의 다른 식물종에 대하여, 분리된 정단은 식물로 계속하여 성장하기 위해 오옥신과 시토키닌을 필요로 한다는 것이 공지되었다. (HS Smith and T. Muras-hige, "In vitro development of the isolated shoot apical meristem of angiosperms," Amer. J. Bot. 57-568(2970))

이리하여 양배추 성장점의 발육을 위한 호르몬의 요건을 조사하기 위하여 실험을 하였다. 아래 표 A에는 연구변수 및 바람직한 영양소등이 나타나있다.

[표 A]

양배추의 분리된 성장점으로부터 식물을 발육시키기 위한 배양기의 조성

Murashige, T., and F. Skoog, Phvsiol. Plant., 473-497, 15(1962).

초기연구에서는 (여기서는 미설명되었으나 예비실험에서 선택된) 3mg/l 의 키네틴과 함께 IAA가 분리된 양배추의 정단으로부터 싹과 잎이 발육하는 과정에 미치는 영향을 결정하였다. 표 B에는 그 결과가 기록 되어있다. 잎 감응을 위한 IAA최적 농도는 0.1-10mg/l 정도로 광범위한 반면, IAA는 분화된 싹의 갯수에 영향을 미치지 않는다.

[표 B]

양배추 지맥점의 시험관내 발육에 대한 IAA의 영향

키에틴 : 3mg/l

다음 실험에서는 1mg/l 의 IAA와 함께 키네틴 농도가 분리된 양배추전단에 미치는 영향을 시험하였다. 표 VC에서 알 수 있는 바와 같이 , 분리된 정단으로부터 발육되는 싹과 잎에 최적한 키네틴 농도는 3mg/l 이다. 0.3mg/l 이하의 저농도 키네틴은 유합조직의 형성을 야기시키며 싹의 정상적인 발육을 억제하였다. 이 관찰은(Shabde)와 뮤라시즈(Murashige)의 발견(M. Shabde), and T. Murashige, "Hormonal requitements of excised Dianthus caryopyllus L.shoot opical meristem in vitro," Amer. J. Bot., 64, 443-448(1977)과 일치하는데, 이는 Dianthus caryophylus L. (카네이숀)의 분리된 분열조직의 원계가 식물로 성장하기 위하여 IAA와 키네틴을 필요로 한다는 것을 의미한다.

[표 C]

양배추 잎맥 지맥점의 실험관내 발육에 대한 키네틴의 영향

IAA : 1mg/l

인산나트륨에 의한 엽액점의 발육촉진

황산 아데닌과(모노소디움형) 인산나트륨이 싹의 기관형성을 촉진시키기 위한 성분으로서 식물세포 배양기에 사용되었다. (T. Murashige, MN Shabde, PM Hasegawa, FH Takatori, and JB Jones, J. Amer. Soc. Hort. Sci. 97, 158-161, (1972)). 표 D에는 IAA 및 키네틴의 존재하에서 황산 아데닌과 인산나트륨이 양배추의 엽액점의 시험관 내에서의 발육에 미치는 영향이 나타나 있다.

[표 D]

IAA, 키네틴, 황산 아데닌 및 인산나트륨이 양배추의 엽액 의성장점에 대한 시험관내에서의 발육에 미치는 영향

^* IAA(1mg/l ), 키네틴(3mg/l ), 황산 아데닌(80mg/l ) 인산나트륨(212mg/l )이 기초 배양기내에 주어졌다. 80mg/l 의 황산 아데닌은 발아를 지지하며 잎내의 엽록소착색을 억제하였다. 뮤라시즈(Muurashige)와 샤보드(Shabde)등 (T. Murashige, MN Shabde, PMHasegawa, FH Takatori, and JB Jones, J. Amer. Soc. Hort. Sci. 97, 158-161(1972)은 160mg/l의 황산아데닌이 아스파라기스(asparagus)의 성장점 발육에 유독하다고 발표하였다. 이리하여 황산 아데닌을 양배추 정단배양을 위한 배양기 성분에서 제외시켰다. 이와는 대조적으로 170mg/l의 인산나트륨은 정단의 발육과 발근(發根)을 촉진시켰다. 인산나트륨을 함유한 배양기내에서의 발근응답은 성장하는 싹의 왕성한 활동력에 관계된다.

시험관내의 엽액 성장점에서 발색되며 성숙한 양배추식물의 정착

표E에 기재된 배양기를 사용할 때 최소한 70%의 추출한 양배추 정단이 식물로 성장하게 된다. 별개의 발근과정은 보통필요하지 않았다. 그러나 뿌리의 성장율은 4째주(週)에 삭을 키네틴이 빠진 동(同) 배양기에서 이식시키는 것에 의하여 촉진되었다. 키네틴이 빠진 배양기에서 2주가 지난 후 발육하는 식물은 이토-질석의 혼합물을 함유한 화분에 이식되어 온실에서 보관되었다. 이식단계에서의 생존율은 상기 조건하에서 90% 이상이었다.

[표 E]

양배추의 분리된 엽액 성장점으로부터의 a) 발육을 위한 배양기의 조성

성 분 티아민. HCl 0.4

무기염 mg/l 키네틴 3

MS 염 형성화 b/ IAA 1

NaH ₂ PO ₄ ·H ₂ O 170 자당 30,000

유기물질 착물 첨가제

미오-이노시톨 100 한천(시그마 등급) 7,000

a) 배양기의 pH 는 오토클라브(압열멸균)전에 0.1 노르말의 KOH와 0.1 노르말의 HCl에 의하여 5.7로 조정되어 있다.

b) Murashige와 Skoog(T. Murashige and F. Skoog, "신속성장을 위한 교정매체 및 담배조직 배지로 생리적 평가" Physiol. Plant., 473-497(1962))

성장점에서 온실이식된 성숙식물로 발육해가는 순서를 연구하였다. 1-2주후, 성장점이 정착하기 시작하였다. 여러 개의 엽록소 착색이 이루어졌다. 4-5주까지 정단의 발육이 지속되었으며 때때로 발육하는 정단으로부터 막눈이 뚜렷하게 형성되었다. 4주가 지난 후, 여러개의 부리가 싹의 기저부에서 발생하였다. 온실 조건하에서 2달이 지난 후, 식물은 정상적인 결구를 하였다. 이 방법을 사용하여 발생된 식물은 형태학적인 면에서 일정하였다. 이 방법에 의하여 무성생식된 식물의 유전적 다양성은 아직 염색체 준위에서 시험하지 못하였다.

전술한 실시예는, 양배추의 경우 6주안에 조직된 싹이 발육하기 위해서는 IAA 및 키네틴이 필요하다는 것을 나타냈다. IAA를 함유한 배양기내의 키네틴의 농도가 0.3mg/l 이하로 낮을 때에는 유합조직이 형성되고 싹이 정상적인 발육이 억제되었다. IAA에 대한 최적 농도범위는 0.3-10.0mg/l 정도로 아주 넓은 반면 키네틴의 경우는 3.0mg/l 정도로 작았다. 황산 아데닌은 유익한 배양기 성분이 못되어 발근 응답을 억제하는 것 같았다. 한편 인산나트륨은 정단 발육과 발근을 촉진시켰다.(인산나트륨을 함유한 배양기에서의 발근 응답은 발육하는 싹의 왕성한 활동력에 관계된다). 구분된 발근과정은 표E에 보는 바와 같이 배양기내에서 필요한 것은 아니지만, 4주째때 싹이(키네틴이 빠진) 상기 배양기에 이식되면 뿌리의 감응률이 증가하였다. 2주가 지난 후 성장식물을 온실러 이식하였다. 이식단계에서의 생존율은 초기 습도가 높은 경우아주 높았다.

[실시예 3]

꽃 양배추(cauliflower)

일정

아래에는 캘리포니아에서 고순도의 꽃양배추 혼성종자를 상업생산하기 위한 전형적 일정이 나타나 있다. 이 일정에 따라 행해지는 개개의 조작도 설명되어있다.

(1) 첫째 여름

첫해 여름에는, 선택된 잡종종자를 만들 때 사용되는 개개의 근친양친계통(유전자형)을 약 50피트의 열로 얇게 파종한다. 이어서 종래의 영농방법을 행하여 각각의 양친계통의 식물이 60-120일간의 걸쳐 완전한 시장상품으로 성숙하도록 한다.

(2) 첫해 가을

첫해 가을 식물들이 시장상품으로 성숙하였을 때 약 10개의 식물이 그들의 형태학적 특징을 검사하기 위해 각각의 양친계통으로부터 선택되어진다. 실제로 꼬리표를 달아 개개의 식물에 명칭을 부여한다. 다음에는 선택된 개개의 식물을 종래의 꽃양배추 응유(curd) 처리에 의하여 이식할 준비를 한다. 식물이 다시성장하였을 때, 이들을 따로 화분에 담은 온실로 옮긴다.

개개의 식물을 선택할 때 약 10개의 식물의 이식부를 영양번식시키기 위하여 취한다. 후술한 영양번식 과정은 무균배양기 내에서 적당한 세포성장조건하에서 기관형성적으로 행하여진다. 이 대신 모든 또는 부분적인 이식부는 예컨대 세이버트의 미국특허 제4,052,817호에서 저렴 저온화에서 저장되기도 한다.

(3) 2년째 봄

선택된 식물들은 각각 3월부터 4월에 계속 개화한다. 최대 자체 교배불능을 결정하는 표준원에 시험이 가장 강한 자체 교배불능성을 가진 계통의 개체를 규명하기 위하여 행해진다. 실제로 이 시험은 각각의 식물을 외적 수분작용없이 성숙시키는 단계와, 자가수분(자체교배불능)에 대하여 가장 큰 저항을 나타내며 가장 적은 양의 종자를 생산하는 식물을 결정하는 단계로 이루어진다. 이 시험결과는 2년재의 7월중순경에 이루어진다.

(4) 2년째 여름

가장 강한 자체 교배불능힌 식물개체를 결정하는 시험에 근거하여 식물개체가 각 양친 계열내에서 선택된다. 최대 자체교배불능을 나타내는 2개의 선택된 개체로부터 미리 취해진 이식부를 영양번식시켜 각각의 식물에 대하여 약 50개의 영양번식체를 생산해 낸다. 선택하지 않은 식물로부터의 이식부들은 선택이 이루어지는 순간 곧 중단된다.

(5) 2년째 가을

재생된 무성번식체는 2년째 가을에 이식된 후 국부적 생산규모로 무성번식된 양친에서 유래되는 잡종종자를 만들기 위하여 교배된다. 무성번식체는 무성번식된 양친계열들이 서로 밀접한 관계가 있으나 이종식물의 화분에 의한 수정이 이루어지지 않도록 재배된다. 계통의 교배는 자연 수분작용에 의하여 이루어진다. 이는 외부 곤충을 막기 위하여 차폐된 큰 상자내에서 가장 효과적으로 이루어지나 상자안의 파리.벌등의 곤충으로 하여금 양친계통을 교차수분시키도록 할 수 있다.

(6) 3년재 가을

3년째 가을에는 무성 번식된 양친의 교배에서 잡종종자가 수확된다. 무성번식된 양친에서 유래된 얼마간의 잡종종자는 재배를 위해 플로리다와 같은 적당한 기후를 갖는 지역으로 보내진다. 이어서 수득한 무성번식된 양친에서 유래된 잡종 꽃양배추는 2개의 선택된 양친식물 개체를 교배(발아수분)시킴에 의하여 만들어지는 원종 양친에 의한 잡종 꽃양배추와 비교한다.

(7) 4년째 봄

무성번식된 양친에서 유래된 잡종종자가 원종 양친에서 유래된 잡종종자와 동일한가를 확인하기 위하여, 국부적으로 생산된 무성번식된 양친에 의한 잡종종자는 원종 양친에 의한 잡종종자와 함께 캘리포니아에서 파종된다.

(8) 4년째 여름

무성번식된 양친에 의한 잡종 종자가 유전적으로 원종양친에 의한 잡종종자와 비교될만한 가를 확인했을때, F ₁ 잡종종자의 대규모생산에 무성번식체를 사용하는 생산계획을 세울 수 있다. 이번에는 상업생산에 적당한 규모로 추가 무성번식체를 조직 배양방법에 의하여 준비한다. 무성번식과정은 아래에 설명되었다.

(9) 4년째 가을

4년째 가을에는 잡종종자의 상업생산에 착수한다. 에어커당 약 8,000개의 식물밀도를 이용하며, 각각의 양친계통에서 같은 갯수의 식물이 사용된다. 이어서 이들은 곤충에 의한 자연 수분작용에 의하여 교배시킨다. 이들 식물에서 종자가 수확되면 곧 판매로 들어간다.

전술한 바와 같이 개개의 무성번식된 양친계통은 근친교배가 되지 않고 상호교배에 대한 유전적 동일성이 시험되었으므로 생산된 모든 종자는 시장판매가 가능하다.

꽃 양배추의 영양번식

이 실시예는 브라시카 오래라세, Var. 보트리티스(Brassica Oleracea, Var. Botrytis.)인 꽃양배추의 시험관내에서의 번식을 기술한 것이다.

일반과정

꽃양배추 응유의 분열조직에서 유래되는 싹을 이용하여 기관형성적 영양번식을 위한 이식부의 발아 및 증식에 필요한 영양요건을 결정하는 실험을 행하였다. 브라시카(Brassica) 작물의 조직배양번식은 F ₁ 잡종종자생산(Anderson & Carstens, 1977을 위한 양친을 자체 또는 근친 교배불능상태로 유지하는 다른 수단으로서 중요하다. 종래에 시험관내에서 꽃양배추의 유합조직으로부터 기관 및 배(胚)를 형성하는 예가 보고되었다. (Baroncelli et al., 1973 ; Pareck & Chandra)

또 영양번식을 위하여 응유의 분열조직 원기로부터 발생되는 막눈이 광범위하게 연구되고 있다.(Powe, 1969 ; Walkey et al., 1970 ; Crisp & Walkey, 1974 ; Gout, 1975)

이 작물을 시험관내에서 영양번식시키는 방법에 관한 보고서가 다수 있지만, 시험관내에서 형성된 싹의 증식을 위한 적절한 배양기에 관한 지식은 국한되어 있는 형편이다. 이리하여 이들의 시험관내에서의 호르몬 및 영양요건을 결정하기 위하여 꽃양배추응유에서 발생된 이식부 무성번식체를 만든다. 뮤라시즈(Murashige)의 3단계 번식방법(Murashige, 1974)에 근거하여 꽃양배추 번식을 위한 배양기를 설치하여, 이것을 표 1에 요약해 놓았다. 번식과정은 다음과 같다.

단계 1 무균배양의 실시

전술한 바와 같이 응유조정은 초기이식부로 이용하는데, 이로부터 싹이 성장하여 분리된다. 이 단계의 배양기는 단계 2를 위한 지맥을 생산하기 위하여(많은 오옥신과 적은 시토키닌을 함유하고 인산나트륨이 결여된) 겔상태의 기본 배양기를 사용하였다. (표 I 참조).

단계 2 지맥의 증식율 최대화

단계 1에서 얻어진 싹을 분리하여 단계2에서 증식시켰다. 단계 2의 배양기는 인산나트륨, 6 mg/l의 카네틴 및 1.0 mg´l의 IAA를 함유한 기본 배양기로 되어 있다. 이배양기를 이용한 증식율은, 25 한천배지를 함유한 25×150mm 시험관내에서 배양될 경우, 13개의 싹/2주 였다. 단계 3을 위한 싹을 생산하기 위하여 이 단계를 여러번 반복 수행하였다.

단계 3 지맥의 발근

이 단계에서는 발근을 촉진시키기 위하여 0.1 mg/l의 카네틴과 1 mg/l의 IAA를 함유한 배양기를 사용하였다. 이 배양기내에서 인산나트륨은 제외시켰다. 녹색 이식부내의 정상적인 광합성활동을 회복하기 위하여 자당의 농도를 기본 배양기의 1/2 로 저하시켰다.

각 단계의 재배는 하루 16시간동안 26+2℃의 일정온도에서 2500룩스의 백색등아래에서 행하였다.

조직이식부의 합성

야생화 야채식물의 성측으로부터 커드(curd)를 얻는다. 조직은 70% 에탄올에서 30초간 씻고 1% 하이포염소산 나트륨용액에 7분간 담그고 증류소에서 3번 헹금으로서 살균시킨다. 커드(curd)를 2-3 크기로 터 자른다.

[표 I]

시험관 배양(b)의 3단계에서 꽃양배추 이식부의 무성생식을 위한 매체 조성물(a)

a) 고압용기내에 넣기전에 pH 농도는 0.1 N KOH나 0.1 N HCl과 더불어 5.7로 조절한다.

b) 각 배지단계를 위한 초기조작은 단계1에 대한 커드(curd 2 단계 2에 대한 생장지맥 및 제3단계에 대한 지맥이 성장한 것이됨. 각 단계의 상세한 설명은 원문을 보기로 한다.

c) T. 무라쉬즈와 F 스콕 "급속한 성장을 위한 교정매체와 담배조직 배지로 생리적 평가" Physiol. Plant, 15, 473-497(1962).

단계 1 예세닉(Axenic) 배지의 형성

잘라진 커드(curd)를 무라쉬즈와 스쿠지(Skoog)염과 다음 성분, 즉 IAA(indole acetic acid) 3mg/l ; Kinetin(6-furfuryl-aminopurine) 1 mg/l ; myo-inositol, 100 mg/l ; (thiamine HCl, 0.4 mg/l ; 자당 30g/l 한천 7g/l를 포함한 기본 한천 배양기(단계 1)에 접종한다.

각 처리마다 지맥이식무 10개씩을 사용한다. 오옥신으로서 IAA, 시토키닌으로서 키네틴, 오옥신으로서의 IBA(indole-3-butyric acid), 오옥신으로서 NAA(나프타렌아세트산), 시토키닌으로서 2 : lp(N ⁶ -A ² 이소펜테닐아데닐), 아데닐 설페이트 및 인산나트륨(나트륨 한개형태)의 호르몬 및 영양효과에 대하여 시험한다. 배지는 26±2℃의 일정온도에서 냉각 백색등으로부터 2,500룩스의 광을 16시간/일씩 조사시키며 2주의 배양후 관찰한다.

pH는 고압용기내에 넣기전 0.1 N HCl를 사용하여 5.7±0.1로 조절되며 조직 이식부는 60×15mm 플라스틱페트리 집시네에 함유된 15ml의 한천 매체상에서 배양된다. 2-3주후 키드(curd)로부터 식물지맥이 발육된다.

한천 매체상에서 커드(curd) 조직의 2주 배양후 조직은 엽록체 지맥으로 발육되며 이 지맥을 기본 매체에서 간단히 번식시킴에 의하여 지맥의 증식이 이루어진다. 이 지맥 이식부는 더 실험하기 위하여 지장배지로서 사용된다.

1 mg/l의 키네틴과 변수로서 IAA를 포함한 기본 매체를 사용하여 시험을 실시한다. 표 Ⅱ는 화야채지맥이식부로부터 지맥이나 뿌리 유기 유전현상에 대한 IAA농도의 영향을 나타낸 것이다. 지맥발육에 대한 최적의 IAA농도는 1 mg/l정도인 한편 보다 높은 IAA농도는 발균 자극을 요함이 밝혀졌다.

[표 Ⅱ]

화야채 지맥이식부로 지맥이나 뿌리유도시 IAA농도의 영향 80 mg/l 아데닌 설페이트 170 mg/l의 NaH ₂ PO ₄ 3 mg/l의 키네틴을 포함한 배양체(변위 ; + SE)

다음 실험에서는 IAA농도를 1mg/l로 일정하게 유지하고 키네틴 농도를 0-10 mg/l으로 변화시켰다. 표 Ⅲ에서 지맥과 뿌리 유기 유전자에 키네틴의 극적인 영향을 볼 수 있다. 1 mg/l이상의 키네틴은 지맥형성을 촉진하나 뿌리 분화를 억제한다.

[표 Ⅲ]

화야채 지맥이식부로 지맥이나 뿌리 형성에 키네틴농도의 영향 80 mg/l 아데 닌 설페이트 170 mg/l의 NaH ₂ PO ₄ 및 1 mg/l의 일정한 IAA를 포함한 배양체(변위; + SE)

BA, a2ip나 NAA 같은 다른 성장 조절제를 사용하여 다른 실험을 실시하였다(데이타는 기술하지 않았음). BA는 IAA와 배합하였을 때 키네틴과 같이 지맥효과를 효과적으로 촉진하였으며 2 : ip는 키네틴보다 효과가 적었다.

NAA를 키네틴, BA나 2 : ip의 어느 하나와 함게 공급하였을 때 극적인 결과가 관찰되었다. IAA 비교시험에서는 나타나지 않은 다량의 뿌리세모(細毛)가 NAA 매체상에서 발견되었다.

표 IV는 IAA와 키네틴의 존재하에 아데닌 설페이트(80mg/l)와 NaHPO ₄ (170mg/l)의 효과를 요약했다. 이 비교의 목적은 기본 매체의 존재내에서의 IAA나 키네틴 단독의 효과를 비교하는데 있다. 아데닌 설페이트는 화야채지맥 이식부내 지맥초기현상을 억제하는 반면 아데닌 설페이트의 부재하에 NAH, PO는 지맥 유전현상을 자극하였다.

단계 1의 배지로부터 얻은 지맥들을 무균조건하에 조직으로부터 분리하여 단계 2의 증식에 사용한다.

단계 2 지맥 증식

식물 지맥의 신속증식을 위하여 기본 매체를 170mg/l의 NaH ₂ PO ₄ , 1mg/l의 IAA 및 6mg/l의 키네틴으로 보충한다. 표 1을 참조, 증식율은 25×150mm 배양관내 25ml의 한천 매체를 사용하였을 때 13지맥/2주였다.

단계 3 지맥의 발근(發根)

1mg/l의 IAA와 0.1mg/l의 키네틴을 보충한 기본매체를 사용하여 증식된 지맥들의 발근을 촉진시켰다. 상기 표을 참조, 낮은 키네틴 농도는 발근을 촉진시켰다. 녹색 이식부내 광합성 작용을 회복시키기 위하여 기본 매체의 절반을 사용하여 자당 농도를 증가시켰다.

[표 Ⅳ]

화야채 지맥 이식부의 시험관내에서 지맥이나 뿌리상의 키네틴, 아데닌 설페이트 및 NaH ₂ PO ₄ 의 효과 IAA(1mg/l), 키네틴(3mg/l), 아데닌 설페이트(80mg/l) 및 NaH ₂ PO ₄ (1700mg/l)를 기본매체에 첨가 (변위 ; ±SE)

묘목의 심음

배지로부터 유도된 화야채 묘목을 온상내 이탄/베르미쿠라이트 혼합물을 포함한 모판상에 이식한다.

이식후 식물을 처음 2주중 높은 습도를 제공하는 안개하에서 식물을 강화시키는데 이러한 공정은 이미 보고된 바와 같이 (그로트, 1975 : 그로트와 아스톤, 1977 : 그로트와 아스톤, 1978) 충분한 줄기와 뿌리발육 및 완전한 광합성 능력을 촉진시킨다. 생존 식물들은 95% 이상이었다.

무성번식된 식물은 약 2개월후 통상의 커드(curd)로 발육됨과 동시에 종자로 유도된 식물과 같이 꽃이 핀다.

화야채 식물번식에 대한 본 발명은 종자생산을 위한 근친계열의 대규모 번식방법을 제공한다.