腐霉属抗性的遗传基础
阅读：339发布：2020-05-08
专利汇可以提供腐霉属抗性的遗传基础专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种黄瓜 植物 ，其包含导致腐霉属抗性的QTL、拷贝数变异区、ERF基因的至少两个拷贝或导致增加的ERF基因表达的突变。本发明还涉及适于生产这种黄瓜植物的繁殖材料。本发明还涉及生产这种黄瓜植物的方法以及鉴定和选择这种植物的方法。另外，本发明还涉及用于鉴定QTL或拷贝数变异区，或用于鉴定导致黄瓜中腐霉属抗性的ERF基因的至少两个拷贝的存在的标志物，以及所述标志物的用途。本发明还涉及包含所述QTL、拷贝数变异区、ERF基因的至少两个拷贝或导致增加的ERF基因表达的突变的 种子 ，它们在从这种种子生长的植物中引起腐霉属抗性。，下面是腐霉属抗性的遗传基础专利的具体信息内容。
1.一种在3号染色体上SEQ ID No.1与SEQ ID No.2之间包含QTL的黄瓜植物，所述QTL的存在导致对腐霉属的抗性。
2.如权利要求1所述的黄瓜植物，其中所述腐霉属抗性是由于所述QTL内存在拷贝数变异区而导致的，所述拷贝数变异区侧翼连接有SEQ ID No.4和SEQ ID No.5。
3.如权利要求2所述的黄瓜植物，其中所述拷贝数变异区的存在可通过确定选自由以下组成的组的至少一个标志物的存在来鉴定：SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。
4.如权利要求1-3中任一项所述的黄瓜植物，其中所述腐霉属抗性是由于在所述拷贝数变异区内存在ERF基因的至少两个拷贝，和/或在所述拷贝数变异区内存在突变型ERF基因而导致的。
5.如权利要求4所述的黄瓜植物，其中ERF基因的至少两个拷贝和/或所述突变型ERF基因的存在导致所述ERF基因的表达增加。
6.如权利要求1-5中任一项所述的黄瓜植物，其中所述QTL、或所述拷贝数变异区、或ERF基因的所述至少两个拷贝是如同包含在其代表性种子以保藏号NCIMB 42776保藏在NCIMB的黄瓜植物的基因组中一样的。
7.适于生产如权利要求1-6中任一项所述的黄瓜植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料适合于有性繁殖，并且特别地选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊或卵细胞，或适于营养繁殖，并且特别地选自插条、根、茎、细胞或原生质体；或适于可再生细胞的组织培养，并且特别地选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎，并且其中所述繁殖材料包含如权利要求1中定义的QTL、如权利要求2或3中定义的拷贝数变异区、或如权利要求4中所定义的拷贝数变异区内的ERF基因的所述两个拷贝或如权利要求4或5中定义的突变型ERF基因。
8.一种用于鉴定黄瓜植物中的腐霉属抗性的标志物，所述标志物选自SEQ ID No.1-
16。
9.如权利要求8所述的标志物用于鉴定黄瓜植物中的腐霉属抗性中的用途。
10.一种生产腐霉属抗性黄瓜植物的方法，其包括引入如权利要求1中定义的QTL，或引入如权利要求2或3中定义的拷贝数变异区，或引入至少一个额外拷贝的如权利要求4中定义的ERF基因，或引入如权利要求4或5中定义的突变型ERF基因。
11.一种用于选择腐霉属抗性黄瓜植物的方法，包括确定如权利要求1中定义的QTL、或如权利要求2或3中定义的拷贝数变异区的存在，或确定如权利要求4或5中定义的ERF基因的至少两个拷贝或权利要求4或5中定义的突变型ERF基因的存在，以及选择包含所述QTL、或所述拷贝数变异区、或所述ERF基因的至少两个拷贝或所述突变型ERF基因的植物作为腐霉属抗性植物。
12.一种种子，其中所述种子包含如权利要求1中定义的QTL，或如权利要求2或3中定义的拷贝数变异区，或如权利要求4或5中定义的ERF基因的至少两个拷贝或突变型ERF基因。
13.一种产生抗腐霉菌的黄瓜植物的方法，所述方法包括：
a)将如权利要求1-6中任一项所述的植物与另一植物杂交以获得F1群体；
b)任选地将来自F1的植物进行一轮或多轮自交和/或杂交以获得下一代的群体；
c)从所述群体中选择包含如权利要求1中定义的QTL、或如权利要求2或3中定义的拷贝数变异区、或权利要求4或5中定义的ERF基因的至少两个拷贝或突变型ERF基因的植物，所述植物对腐霉属具有抗性。
14.如权利要求13所述的方法，其中如权利要求1-6中任一项所述的植物是从以NCIMB登录号42776保藏的种子或其后代生长的植物。
腐霉属抗性的遗传基础
[0001] 本发明涉及腐霉属(Pythium)抗性黄瓜植物，其包含QTL或拷贝数变异区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因。本发明还涉及生产这种黄瓜植物的方法以及鉴定和选择这种植物的方法。本发明还涉及腐霉属抗性黄瓜植物的后代、种子和果实，涉及适于生产所述黄瓜植物的繁殖材料，以及包含这种黄瓜果实或其部分的食品。本发明还涉及用于鉴定在黄瓜中引起腐霉属抗性的QTL或拷贝数变异区或ERF基因的至少两个拷贝的标志物，以及涉及所述标志物的用途。
[0002] 在许多农作物中，植物的育苗或初始生长阶段都被称为“猝倒病(dampingoff)”的现象所阻碍。猝倒病是可由多种病原体引起的土传问题。这些病原体中最常见的是各种腐霉属、疫霉属(Phytophthora)、丝核菌属(Rhizoctonia)和镰刀菌属(Fusarium)物种。猝倒病也称为根腐病，因为症状通常表现为土壤表面上下的茎和根组织的腐烂。猝倒病会发生在出苗前，因此最初可能会将其与差的种子活力相混淆。然而，刚发芽的植物的组织常常在土壤表面附近被水浸泡，然后幼苗倾倒并死亡。
[0003] 猝倒病的原因常常被证明是相当大量的腐霉属的种之一。腐霉属与疫霉属一样，是卵菌纲(Oomycetes)的属。腐霉属的种通常非常笼统，并有大量宿主。因此，各种腐霉属的种之间的差异不在于它们的宿主范围，而在于它们最佳地影响植物的环境条件不同。尽管腐霉属主要感染幼苗，但较老的植物也可能受到感染。由于它们的非宿主特异性，诸如轮作的栽培方法在控制此疾病方面不是非常有效。另外，腐霉属可以很容易地在土壤和植物碎片中存活数年，这使得难以根除该病原体。
[0004] 针对腐霉属的遗传抗性是未知的，因此腐霉属是被广泛使用生化控制的疾病之一。腐霉属可在许多不同的环境中发生，这也取决于其种；其通常见于保护性耕作中，并且可存在于土壤以及高端耕作系统中使用的各种基质中。通常，湿润的土壤、较大的温度变化和高水平的肥料有利于该病的发展。可使用各种杀真菌剂和生物防治剂来预防疾病的发生或传播。一旦植物受到感染，治愈它们的治疗就无效。施用可以例如作为种子处理、土壤浸湿或叶面喷雾来进行。然而，最有效的方法是维持严格的卫生系统和高水平的农作物维护，以防止病原体进入生长系统。
[0005] 本发明的一个目的是提供对腐霉属具有抗性的黄瓜植物。
[0006] 黄瓜和小黄瓜(gherkin)均属于黄瓜种，是受各种腐霉属物种(其中有瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)、宽雄腐霉菌(Pythium dissotocum)和终极腐霉菌(Pythium ultimum))严重影响的农作物。由于没有对腐霉属具有抗性的品种，因此开始了一项研究计划，以开发对这种病原体具有抗性的黄瓜植物。
[0007] 该研究计划确定了对腐霉属表现出非常好的抗性的植物群。然而，该植物群具有在其可用于育种计划以开发商业上适合的腐霉属抗性黄瓜品种之前需要克服的许多农艺特性，诸如明显的深色疣和刺。必须付出很大的努力，将这些植物与各种内部育种品系组合起来，以开发出具有不同背景的黄瓜材料，然后可将其进一步用于不同的组合中，以开发不同类型的黄瓜品种。
[0008] 为了确定抗性并在育种过程中追踪种群中的抗性，定期对相关材料进行腐霉属抗性的生物测定(实施例1)。然而，由于生物测定通常很耗时，并且由于例如需要合适的区域、足够的接种物和良好的时间安排进行评估而在逻辑上具有挑战性，因此开发标志物筛选更为有效。为此目的，进行了QTL定位研究，并在3号染色体上在SEQ ID No.1与SEQ ID No.2之间鉴定了QTL区域(实施例2)。与该QTL连锁的该区域内的一个标志物由SEQ ID No.3表示。可用SEQ ID No.1和SEQ ID No.3中之一或两者来识别导致腐霉抗性的QTL的存在。SEQ ID No.1和SEQ ID No.3与该抗性连锁；SEQ ID No.1和SEQ ID No.2指示该QTL的位置。
[0009] 本发明涉及一种QTL，其存在于黄瓜基因组的3号染色体上SEQ ID No.1与SEQ ID No.2之间，并且优选地存在于SEQ ID No.4与SEQ ID No.2之间。当存在于黄瓜植物中时，该QTL导致腐霉属抗性，并且在本文中被进一步称为“本发明的QTL”。“本发明的QTL”还涵盖可通过选自由以下组成的组的至少一个标志物标识该QTL的存在：SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。“本发明的QTL”还涵盖该QTL包含选自由以下组成的组的至少一个标志物并因此与其连锁：SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。
[0010] 本发明提供了包含本发明的QTL的黄瓜植物。
[0011] 通过进一步的研究，确定了当在3号染色体上的QTL中约30个基因的某个区域在黄瓜植物中重复存在时，这种重复导致了腐霉属抗性(实施例3)。当基因或基因区域的重复或其它倍增存在于基因组中的染色体上时，这称为拷贝数变异。某个基因的多个拷贝的存在可以导致所述基因的表达增加，和/或由所述基因产生的产物增加。这种增加随后可能导致抗性。在本发明中，确定了存在于SEQ ID No.4与SEQ ID No.5之间的区域中的基因的重复，即拷贝数变体，与对腐霉的抗性相关。
[0012] 本发明涉及拷贝数变异区(CNV)，该拷贝数变异区存在于黄瓜基因组的3号染色体上SEQ ID No.4与SEQ ID No.5之间。当存在于黄瓜植物中时，该CNV导致腐霉属抗性，并且在本文中被进一步称为“本发明的拷贝数变异区”或“本发明的CNV”。“本发明的CNV”还涵盖可以通过选自由以下组成的组的至少一个标志物来鉴定该CNV的存在：SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。“本发明的CNV”还涵盖该CNV包含选自由以下组成的组的至少一个标志物，从而与所述标志物连锁：SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。
[0013] 本发明提供了包含本发明的拷贝数变异区域的黄瓜植物。
[0014] 进一步确定了3号染色体上该重复区域的两个拷贝的序列不完全相同。鉴定了两个SNP，它们存在于两个拷贝中或仅存在于两个拷贝之一中。可通过使用多态性标志物来鉴定仅存在于CNV区域的两个拷贝之一中的SNP。在CNV拷贝之间具有多态性的标记的实例由SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16表示。这些标志物在本文中表示为“杂合CNV标志物”。
[0015] 可使用一方面在CNV区域的两个拷贝之间具有多态性而另一方面仅有单个野生型拷贝来鉴定两个拷贝中存在的SNP。一方面在CNV区域的两个拷贝之间存在多态性而另一方面仅是单个野生型拷贝的标志物的实例由SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13表示。在本文中称为“纯合CNV标志物”。
[0016] 表2显示存在一个拷贝的标志物评分，以及用于鉴定拷贝数变异区的存在、从而鉴定抗性植物的标志物评分。当标志物的序列位于基于Cs9930的黄瓜的公开可得的基因组参考序列的版本2上时，所述标志物序列中的SNP多态性所对应的物理位置也示于表2中。基于Cs9930的公共黄瓜基因组参考序列可以例如访问http://www.icugi.org/cgi-bin/gb2/gbrowse/cucumber_v2/，并且是如本文使用的“公共黄瓜基因组”的参考。因此，QTL或CNV区域以及本发明的标志物的位置也可从该公共图谱得出，并且这些位置是相对于所述物理位置的。
[0017] 如本文中所用，标志物是遗传上“连锁的”，并且当所述标志物的序列存在于本发明的QTL或CNV中时，可用于鉴定本发明的QTL或CNV区域。
[0018] 图2显示QTL和CNV区域内各种标志物的位置，并表示了所谓的杂合CNV标志物与纯合CNV标志物之间的评分差异。
[0019] 在本发明的CNV区域内，存在三个ERF基因。CNV区域内的ERF基因可通过AP-2结构域的存在来鉴定。AP-2结构域是在植物的转录调控因子中发现的保守的DNA结合结构域，并且本领域技术人员知道如何鉴定基因中AP-2结构域的存在。例如，AP-2结构域可通过使用EMBL-EBI数据库(通过http://pfam.xfam.org/family/AP2)来鉴定。随后可通过例如HMMER 3.1b2的hmmsearch，利用1e-4的e-值进行相关序列的搜索。
[0020] 本发明涉及ERF基因，所述ERF基因的至少两个拷贝存在于黄瓜基因组的3号染色体上SEQ ID No.4与SEQ ID No.5之间的本发明的CNV内。当存在于黄瓜植物中时，所述ERF基因的至少两个拷贝的存在导致针对腐霉属的抗性，并且在本文中被进一步称为“本发明的ERF基因的至少两个拷贝”。“本发明的ERF基因的至少两个拷贝”涵盖了ERF基因的所述至少两个拷贝的存在可通过选自由以下组成的组的至少一个标志物来鉴定：SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16。“本发明的ERF基因”涵盖可通过确定由SEQ ID No.20或SEQ ID No.21或SEQ ID NO：22，或由与这些序列中的任一个具有至少70％的序列同一性的序列表示的AP-2结构域的存在来鉴定的ERF基因。按增加的偏好性顺序，本发明的ERF基因的AP-2结构域序列与由SEQ ID No.20或SEQ ID No.21或SEQ ID No.22表示的序列中的任一序列具有75％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性(图3)。“本发明的ERF基因”还涵盖包含由SEQ ID No.17或与其具有至少95％的序列同一性的序列表示的编码序列的ERF基因，在本文中称为ERF1B基因；包含由SEQ ID No.18或与其具有至少95％的序列同一性的序列表示的编码序列的ERF基因，在本文中称为ERF098基因；或包含由SEQ ID No.19或与其具有至少95％的序列同一性的序列表示的编码序列的ERF基因，在本文中称为ERF096基因。优选地，本发明的ERF基因的至少两个拷贝的存在导致所述ERF基因的表达增加。
[0021] 本发明还提供了本发明的突变型ERF基因，当该突变型ERF基因存在于黄瓜植物中时，所述突变型ERF基因的存在导致腐霉抗性。该突变型ERF基因具有比野生型ERF基因更高的表达，并且在本文中被进一步称为“本发明的突变型ERF基因”。“本发明的突变型ERF基因”包括在启动子区域中具有突变、在5'-UTR中具有突变、在编码序列中具有突变和/或在3'UTR中具有突变的本发明的ERF基因。
[0022] 如本文中所用，“序列同一性”百分比是在两个序列正确比对之后在这些序列之间相同的核苷酸或氨基酸的百分比。本领域技术人员知道如何比对序列。为了获得最重要的结果，应该获得给出最高序列同一性评分的最佳可能比对。在评估中以最短序列的长度比较各序列。
[0023] 增加的表达是与包含单个野生型拷贝的ERF基因的植物(该植物对腐霉属没有抗性)相比时的表达。任选地在存在腐霉属感染的情况下确定表达的增加。增加的表达是至少1.5倍增加的表达，按照递增的优先顺序为至少1.9倍、2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、
4.5倍、4.8倍、5倍、7倍、9倍、10倍、12倍、15倍、16倍、18倍、20倍、22倍、22.9倍、25倍、30倍、
35倍或更高、高达至少100倍增加的表达。
4.5倍、4.8倍、5倍、7倍、9倍、10倍、12倍、15倍、16倍、18倍、20倍、22倍、22.9倍、25倍、30倍、
35倍或更高、高达至少100倍增加的表达。
[0024] 本发明提供了对腐霉属具有抗性的植物，该植物包含本发明的ERF基因的至少两个拷贝，或包含本发明的突变型ERF基因。
[0025] 本发明的植物优选包含两个拷贝的ERF基因，所述ERF基因包含由SEQ ID No.17或与其具有至少95％的序列同一性的序列表示的编码序列，在本文中称为ERF1B基因；两个拷贝的ERF基因，所述ERF基因包含由SEQ ID No.18或与其具有至少95％的序列同一性的序列表示的编码序列，在本文中称为ERF098基因；以及两个拷贝的ERF基因，所述ERF基因包含由SEQ ID No.19或与其具有至少95％的序列同一性的序列表示的编码序列，在本文中称为ERF096基因。
[0026] 如本文中所用，ERF基因的拷贝是这样的基因，其与存在于本发明的CNV中的另一个基因具有至少95％的序列同一性，优选地以递增的优先顺序为至少96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
[0027] 如本文中所用，基因包含该基因的启动子5′-UTR、编码序列(CDS)或gDNA序列和3′UTR。该启动子合适地包含该基因的CDS的ATG起始密码子上游多达2kb的序列。
[0028] 本发明提供了对腐霉属有抗性的黄瓜植物，该黄瓜植物包含本发明的至少一种ERF基因的至少两个拷贝，或包含本发明的突变型ERF基因，其中与包含单个野生型拷贝的所述ERF基因的黄瓜植物相比，本发明的突变型ERF基因的至少两个拷贝的存在导致所述ERF基因的表达增加。
[0029] 如本文中所用，腐霉属抗性是对一个或多个腐霉属的种的抗性，特别是对包含瓜果腐霉菌、宽雄腐霉菌和终极腐霉菌的组中至少一个或多个种的抗性。如本文中所用，腐霉抗性包括对至少瓜果腐霉菌的抗性。
[0030] 本发明的腐霉属抗性以单基因的、不完全显性的方式遗传。如本文中所用，不完全显性意指当本发明的QTL、拷贝数变异区、ERF基因的所述至少两个拷贝或突变型ERF基因纯合存在时，其产生比当本发明的QTL、拷贝数变异区、ERF基因的所述至少两个拷贝或突变型ERF基因杂合存在时更高水平的腐霉属抗性。然而，本发明的QTL、拷贝数变异区、ERF基因的至少两个拷贝或突变型ERF基因的杂合存在仍然赋予改善的腐霉属抗性。纯合和杂合植物的腐霉属抗性均得到改善，使得所述植物更适合在腐霉属存在的条件下进行栽培。因此，两种水平的抗性都被认为是改良的农艺特性。
[0031] 腐霉属抗性的存在可通过在适合于腐霉属感染的条件下进行生物测定来确定。例如，可使用Chen等，1987中所述的黄瓜幼苗生物测定法。(Factors affecting suppression of Pythium damping-off in container media amended with composts.Chen等，Phytopa thology77:755-760,1987)。作为容器培养基，可使用适合待测植物的生长培养基。常规盆栽土壤是容器培养基的实例，其可用于黄瓜的腐霉属生物测定。
[0032] 如本文中所用，腐霉属抗性是通过与已知对腐霉属易感的对照品种进行比较来确定的。在某个待测品系或其他待测植物群的10-12株植物上适当地评估抗性。建议使用重复，尤其是在无法最佳控制条件的情况下。由于腐霉属表现出非常严重的症状，并且一旦植物受到感染就无法充分治愈，因此只能在两种类别中进行评分：抗性或死亡/枯萎。接种后10至14天适当进行评分。当在生物测定法中与同一生物测定中的易感对照品种相比显著更多的植物评分为抗性时，认为基因型是抗性的。取决于测定中所用植物的数量，本领域技术人员已知的统计方法可任选地用于确定显著差异性。
[0033] 对腐霉属易感并且不具有本发明的QTL或拷贝数变异区以及仅具有一个拷贝的本发明的野生型ERF基因的黄瓜品种例如为杂交品种Ventura和杂种品种Roxanna。这些品种可用作易感对照品种。这些品种的ERF基因表达也可用作对照，以与本发明植物的增加的ERF表达进行比较。其他可公开获得且普遍生长的各种类型的黄瓜品种也可用作易感对照，诸如Marketmore 70或Poinsett 76。
[0034] 将具有本发明的腐霉属抗性的黄瓜基因型以NCIMB42776保藏。从NCIMB 42776生长的植物或其后代可在腐霉生物测定中用作抗性对照品种。当待评估的植物、品系或群体在生物测定中显示出与NCIMB42776相同的抗性水平时，该植物、品系或群体被认为是腐霉属抗性的，因此是本发明的植物。
[0035] 本发明的植物优选为具有改良的农艺特性的栽培植物，所述改良的农艺特性使其适于商业栽培。本发明还涉及从本发明的植物收获的黄瓜果实，其中所述黄瓜果实在其基因组中包含在植物中导致腐霉属抗性的本发明的QTL、拷贝数变异区、ERF基因的至少两个拷贝或突变型ERF基因。该黄瓜果实在本文中也被称为“本发明的果实”或“本发明的黄瓜果实”。如本文中所用，“黄瓜果实”包括由黄瓜的植物产生的果实。
[0036] 本发明涉及生产腐霉属抗性黄瓜植物的方法，该方法包括将本发明的QTL引入黄瓜植物中，或将本发明的拷贝数变异区引入黄瓜植物中。
[0037] 本发明还涉及产生腐霉属抗性植物的方法，该方法包括增加植物中本发明ERF基因的表达，从而通过在植物中引入额外拷贝的本发明ERF基因或通过突变本发明的ERF基因来增加表达。ERF基因的突变包括启动子区域的突变、5'-UTR的突变、编码序列的突变和/或3'UTR的突变。
[0038] 在一个优选实施方案中，腐霉属抗性植物是黄瓜植物，特别是栽培的黄瓜植物。
[0039] 可通过常用的育种技术，诸如杂交和选择(当植物具有性相容性时)，从包含QTL、或拷贝数变异区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因的另一株植物引入所述本发明的QTL、本发明的拷贝数变异区、本发明的ERF基因的至少两个拷贝或本发明的突变型ERF基因。同样地，可从包含不止一个ERF基因的另一植物中引入额外拷贝的ERF基因。这样的引入可来自通常可容易杂交的同一物种的植物，或者来自相关物种的植物。杂交的困难可通过本领域已知的技术(诸如胚拯救)来克服，或者可以应用顺式基因学(cis-genesis)。合适地，使用标志物物跟随QTL、或拷贝数变异区、或ERF基因的所述至少两个拷贝、或突变型ERF基因至另一株植物中的整合。
[0040] 上述方法可以特别地用于将本发明的QTL或拷贝数变异区，或两个拷贝的ERF基因或突变型ERF基因引入适合于掺入此类遗传信息的植物物种中。可使用标准育种方法，将QTL、拷贝数变体区、两个拷贝的ERF基因或突变型ERF基因从包含所述QTL、拷贝数变体区、两个拷贝的ERF基因或突变型ERF基因的黄瓜植物中引入到缺乏所述遗传信息的黄瓜植物中。
[0041] 可从其代表性种子以保藏号NCIMB 42776保藏在NCIMB的黄瓜植物，或从保藏的种子NCIMB 42776或从其有性或营养后代引入本发明的QTL、拷贝数变体区或两个拷贝的ERF基因。在黄瓜中引入所述QTL或拷贝数变异区或ERF基因的拷贝导致腐霉属抗性。
[0042] 从NCIMB 42776生长的植物(其中存在本发明的QTL)具有本发明的腐霉属抗性。从NCIMB 42776生长的植物也具有本发明的拷贝数变异区。
[0043] 在从NCIMB 42776生长的植物或其后代中，可通过确定SEQ ID No.1和SEQ ID No.3之一或二者的存在，特别是通过与野生型序列相比确定SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中SNP的存在来鉴定所述QTL的存在。SEQ ID No.5-16也可用于确定本发明的QTL的存在。显示鉴定抗性的标志物的序列的SNP的位置和评分示于表2中。
[0044] 在从NCIMB 42776生长的植物或其后代中，可通过确定选自由SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16的至少一个标志物的存在，特别是通过确定与野生型序列相比SEQ ID No.5-16中的一个或多个中SNP的存在来鉴定拷贝数变异区的存在。显示鉴定抗性的标志物的序列的SNP的位置和评分示于表2中。
[0045] 从NCIMB 42776生长的植物或其后代在3号染色体上具有两个拷贝的包含以SEQ ID No.17表示的编码序列的ERF基因、两个拷贝的包含以SEQ ID No.18表示的编码序列的ERF基因以及两个拷贝的包含以SEQ ID No.19表示的编码序列的ERF基因。
[0046] 或者，可以例如通过使用转基因方法，从另一种有性不相容的植物中转移本发明的QTL或拷贝数变异区、或ERF基因的所述至少两个拷贝、或突变型ERF基因。可以适当使用的技术包括技术人员已知的一般植物转化技术，诸如土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化方法的使用。基因组编辑方法，诸如CRISPR/Cas系统的使用也可能用于获得本发明的植物。基因组编辑可用于通过重复包含约30个基因的区域或重复ERF基因，或通过修饰基因增加ERF基因的表达来开发腐霉属抗性植物。ERF基因的修饰包括启动子区的修饰、5'-UTR的修饰、编码序列的修饰和/或3'UTR的修饰。
[0047] 本发明的植物可纯合地或杂合地包含本发明的QTL、或本发明的拷贝数变异区、或本发明的ERF基因的至少两个拷贝、或本发明的突变型ERF基因。
[0048] 本发明的植物可以是近交系、杂种、双单倍体的植物或分离群体的植物。优选地，本发明的植物是非转基因植物。
[0049] 本发明还涉及黄瓜种子，其包含本发明的QTL、或本发明的拷贝数变异区、或本发明的ERF基因的所述至少两个拷贝、或本发明的突变型ERF基因，其中从所述种子生长的植物是抗腐霉属的植物。本发明还涉及由本发明的植物产生的种子。这些种子具有本发明的QTL、或本发明的拷贝数变异区、或本发明的ERF基因的至少两个拷贝、或本发明的突变型ERF基因，因此，从所述种子生长的植物为本发明的植物。
[0050] 此外，本发明还涉及包含本发明的黄瓜果实或其一部分的食品或加工食品。所述食品可能已经过一个或多个加工步骤。这样的加工步骤可以包括但不限于以下处理中的任何一种或其组合：去皮、切割、洗涤、榨汁、烹饪、冷却或包含本发明的水果的沙拉混合物。所获得的加工形式也是本发明的一部分。
[0051] 本发明还涉及适于生产本发明的黄瓜植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料适合于有性繁殖，并且特别地选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊或卵细胞，或适于营养繁殖，并且特别地选自插条、根、干细胞或原生质体，或适于可再生细胞的组织培养，并且特别地选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎，其中繁殖材料包含赋予腐霉属抗性的本发明的QTL、或本发明的拷贝数变异区、或本发明的ERF基因的至少两个拷贝、或本发明的突变型ERF基因。本发明的植物可用作繁殖材料的来源。
[0052] 本发明还涉及本发明植物的细胞。这样的细胞可呈分离的形式，或者是完整植物或其部分的一部分，并且仍然构成本发明的细胞，因为这样的细胞具有导致栽培的黄瓜植物的腐霉属抗性的遗传信息。本发明的植物的每个细胞携带导致腐霉属抗性的遗传信息。本发明的细胞还可以是可再生为本发明的新植物的可再生细胞。在本发明的说明书中，遗传信息在本发明的细胞中的存在是本文中定义的QTL、或CNV区、或ERF基因的所述至少两个拷贝、或突变型ERF基因的存在。
[0053] 本发明还涉及本发明植物的植物组织，其包含本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的所述至少两个拷贝、或突变型ERF基因。该组织可以是未分化的组织或已经分化的组织。未分化的组织例如是茎尖、花药、花瓣或花粉，并且可以用于微组织繁殖
(micropropagation)以获得能够生长成本发明的新植物的新的小植株。组织也可以从本发明的细胞生长而来。
(micropropagation)以获得能够生长成本发明的新植物的新的小植株。组织也可以从本发明的细胞生长而来。
[0054] 此外，本发明还涉及本发明的植物、细胞、组织或种子的后代，所述后代包含导致腐霉属抗性的本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因。这样的后代本身可以是植物、细胞、组织或种子。
[0055] 如本文中所用，“后代”旨在指来自与本发明的植物杂交的第一和所有其他后代。
[0056] “后代”还包括具有本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因的黄瓜植物，该植物具有本发明的腐霉属抗性，通过营养繁殖或增殖从本发明的另一植物或植物的后代获得。
[0057] 本发明还涉及本发明的黄瓜植物的一部分，其适于有性繁殖并且包含本发明的QTL、或CNV区域、或ERF基因的至少两个拷贝或突变型ERF基因。这样的部分例如选自由小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。另外，本发明涉及适合营养繁殖的本发明的黄瓜植物的一部分，其特别地是包含本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因的插条、根、茎、细胞或原生质体。如前所述的植物的一部分被视为繁殖材料。由繁殖材料产生的植物包含导致腐霉属抗性的本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因。
[0058] 本发明还涉及本发明植物的组织培养物，所述组织培养物也是繁殖材料并且包含本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因。组织培养物包含可再生细胞。可以从植物的任何部分，特别是从叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织、根、根尖、花药、花、种子和茎选择或衍生得到这样的组织培养物。可将组织培养物再生为包含本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因的黄瓜植物，其中再生的黄瓜植物表达本发明的性状，并且也是本发明的一部分。
[0059] 本发明另外还涉及本发明的植物在植物育种中的用途。因此，本发明还涉及用于培育对腐霉属有抗性的栽培黄瓜植物的育种方法，其中使用了包含赋予所述抗性的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝的种质。代表种质的种子以登录号NCIMB 42776保存在NCIMB中。
[0060] 本发明还涉及本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝或突变型ERF基因用于培育对腐霉属具有抗性的黄瓜植物的用途。
[0061] 本发明还涉及用于鉴定黄瓜植物中的腐霉属抗性的标志物，该标志物选自SEQ ID No.1-16。选自SEQ ID No.1-16的至少一种标志物的存在，优选选自SEQ ID No.5-16的至少一种标志物的存在，指示着存在对腐霉属的抗性。由SEQ ID No.1-16表示的任何标志物，优选SEQ ID No.5-16表示的任何标志物用于鉴定黄瓜植物中的腐霉属抗性的用途也是本发明的一部分。所有这些标志物物也可用于开发用于鉴定导致腐霉属抗性的本发明的QTL、或CNV区域，或用于鉴定ERF基因的至少两个拷贝的存在或所述ERF基因中的突变的存在的其他标志物，该用途也是本发明的一部分。
[0062] 本发明还涉及用于选择腐霉属抗性黄瓜植物的方法，该方法包括确定本发明的QTL、或拷贝数变异区的存在、或ERF基因的至少两个拷贝或突变型ERF基因的存在，以及选择包含本发明的QTL、或拷贝数变异区、或本发明的ERF基因的至少两个拷贝或突变型ERF基因的植物作为腐霉属抗性植物。
[0063] 本发明还涉及选择腐霉属抗性植物的方法，该方法包括确定至少一种本发明的ERF基因的表达增加，以及选择表达增加的植物作为腐霉属抗性植物。可通过如实施例4中所述进行qPCR测定来确定表达增加。至少一个本发明的ERF基因的表达增加的植物合适地是包含所述ERF基因的至少两个拷贝的植物，或包含本发明的突变型ERF基因的植物。
[0064] 本发明还涉及对黄瓜植物测试赋予腐霉属抗性的本发明的QTL或拷贝数变异区在其基因组中的存在的方法，该方法包括在黄瓜植物的基因组中检测选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16的标志物序列，或者检测其任意组合。
[0065] 本发明还涉及对黄瓜植物测试本发明的ERF基因的至少两个拷贝的存在的方法，其包括在黄瓜植物的基因组中检测选自SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16的标志物序列，或检测其任意组合。选自SEQ ID No.6-16的至少一个标志物，即SNP的B等位基因的存在指示存在本发明的ERF基因的至少两个拷贝。
[0066] 在本发明的一个实施方案中，对黄瓜植物测试赋予腐霉属抗性的本发明的QTL、或拷贝数变异区、或本发明的ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因在其基因组中的存在的方法还包括选择在其基因组中包含本发明的QTL、或拷贝数变体区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因的黄瓜植物作为腐霉属抗性植物。
[0067] 本发明还涉及生产抗腐霉属的黄瓜植物的方法，所述方法包括：
[0068] a)将本发明的植物与不包含本发明的QTL、或本发明的CNV区、或本发明的ERF基因的至少两个拷贝、或本发明的突变型ERF基因的植物杂交，以获得F1群体；
[0069] b)可选地将来自F1的植物进行一轮或多轮自交和/或杂交以获得进一步世代的群体；
[0070] c)适当地通过使用与本发明的导致ERF基因表达增加的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变的存在连锁的分子标志物，从群体中选择包含导致增加的ERF基因表达的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变并且对腐霉属具有抗性的植物。
[0071] 该方法的步骤c)的标志物可以是由SEQ ID No.1-16中的任何一个，优选地由SEQ ID No.5-16中的任何一个表示的标志物。还可就具有对腐霉属的抗性对植物进行表型选择。
[0072] 用于生产抗腐霉属的黄瓜植物的方法中使用的本发明的植物任选地是由以NCIMB登录号42776保藏的种子生长的植物或其后代。
[0073] 本发明另外地提供了将另一种所需性状引入包含腐霉属抗性的黄瓜植物的方法，该方法包括：
[0074] a)使本发明的黄瓜植物与包含所述另一种所需性状的第二黄瓜植物杂交，以产生F1后代；
[0075] b)选择包含腐霉属抗性和所述另一种所需性状的F1后代；
[0076] c)将选择的F1后代与任一亲本杂交，以产生回交后代；
[0077] d)选择包括腐霉属抗性和所述另一种所需性状的回交后代；以及
[0078] e)任选地连续重复步骤c)和d)一次或多次以产生
[0079] 选择的第四或更高回交子代，其具有所述另一种所需性状并具有腐霉属抗性。
[0080] 在将另一所需性状引入对腐霉具有抗性的黄瓜植物中的方法中使用的本发明的植物任选地是由以NCIMB登录号42776保藏的种子生长的植物或其后代。
[0081] 任选地，在所述方法中的任何杂交或回交步骤之后进行自交步骤。可选择地，可在该方法的任何杂交或自交步骤之后进行对包含腐霉属抗性和所述另一种所需性状的植物的选择。所需性状可选自但不限于以下组：对细菌、真菌或病毒性疾病的抗性、对昆虫或害虫的抗性、改善的萌发、植株尺寸、植物类型、改善的保质期、水分胁迫和热应激耐受性以及雄性不育。本发明包括通过该方法生产的黄瓜植物和从其获得的黄瓜果实。
[0082] 本发明还涉及通过使用植物材料的组织培养物生产黄瓜植物的方法，所述黄瓜植物包含导致对腐霉属的抗性的本发明的QTL、或本发明的CNV区、或本发明的ERF基因的至少两个拷贝、或本发明的突变型ERF基因，所述组织培养物在其基因组中包含本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变ERF基因。
[0083] 本发明还涉及通过使用植物材料的营养繁殖来生产包含导致对腐霉属的抗性的本发明的QTL、或CNV区、或本发明的ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因的黄瓜植物的方法，所述植物材料在其基因组中包含本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因。
[0084] 本发明还提供了通过使用双单倍体生成技术生成双单倍体品系而产生具有如本文定义的对腐霉属的抗性的黄瓜植物的方法，所述双单倍体品系纯合地包含本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型的ERF基因，并且对腐霉属具有抗性。
[0085] 本发明还涉及生产包含本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因的黄瓜植物的方法，其中本发明的所述QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因导致腐霉属抗性，该方法包括将包含本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因的种子生长成所述黄瓜植物中。该方法中使用的种子任选地是以保藏号42776保藏在NCIMB的种子，或其后代种子。
[0086] 本发明还涉及用于种子生产的方法，该方法包括从本发明的种子生长黄瓜植物，使所述植物产生具有种子的果实，以及收获那些种子。种子的生产适当地通过杂交或自交完成。优选地，如此产生的种子具有生长成对腐霉属具有抗性的植物的能力。
[0087] 本发明还涉及杂交种子和生产所述杂交种子的方法，包括将第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得杂交种子，其中第一亲本植物和/或第二亲本植物是本发明的植物。所得的包含本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝或突变型ERF基因并表现出对腐霉属的抗性的杂交植物也是本发明的植物。
[0088] 显然，提供本发明的性状的亲本不一定是直接从保藏的种子生长的植物。亲本也可以是来自保藏的种子的后代植物，或来自被鉴定为已通过其它方式获得了本发明的性状的种子的后代植物。
[0089] 本文所用的本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因的渗入是指通过标准育种技术，将本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因从包含所述QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因的供体植物引入到不具有所述QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因的受体植物中，其中可通过观察对腐霉属的抗性在表型上选择包含本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因的植物，或者可通过标志物辅助育种使用标志物进行选择，或这些的组合。适当地通过使用如本文中由SEQ ID No 1-16标识的标志物，在F1代或来自受体植物与供体植物之间的杂交的任何进一步的世代中开始选择。技术人员熟悉生成和使用可用于鉴定本发明的性状或与本发明的性状连锁的新的分子标志物。此类标志物的开发和用于鉴定和选择本发明植物的用途也是本发明的一部分。
[0090] 在本申请的说明书中，短语“性状”是指栽培的黄瓜植物的表型。特别地，词语“性状”是指本发明的性状，更特别地是指对腐霉属的抗性。当栽培的黄瓜植物表现出本发明的性状时，其基因组包含引起本发明性状的本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因。因此，如本文中所用，“本发明的性状”旨在指由本发明的QTL、或CNV区、或ERF基因的至少两个拷贝、或突变型ERF基因引起的对腐霉属的抗性的性状。
[0092] 保藏
[0093] 黄瓜EX5.014的种子于2017年7月11日由NCIMB Ltd,Ferguson Building,Craibs tone Estate,Bucksburn,Aberdeen AB21 9YA,UK以保藏登录号NCIMB 42776保藏。保藏物的种子纯合地包含本发明的QTL、拷贝数变异区和ERF基因的至少两个拷贝。因此，从该种子生长的植物对腐霉属具有抗性。
[0094] 附图
[0095] 图1–SEQ ID No.17、SEQ ID No.18和SEQ ID No.19的基因组编码序列。
[0096] 图2–标志物的存在、ERF基因的位置(包括基因的起始位置)以及杂合CNV标志物与纯合CNV标志物的评分之间的差异的表示。当QTL或CNV区纯合地存在于植物中时，CNV-hom显示标志物评分。当QTL或CNV区杂合地存在于植物中时，CNV-het显示标志物评分。
[0097] 图3–存在于CNV区中的3个ERF基因的AP-2结构域序列SEQ ID No.20、SEQ ID No.21和SEQ ID No.22。
[0098] 图4–存在于本发明的植物的CNV区中的ERF基因的相对表达。ERF1B是由SEQ ID No.17表示的基因。ERF098是由SEQ ID No 18表示的基因。ERF096是由SEQ ID No.19表示的基因。实施例
[0099] 实施例1
[0100] 黄瓜中腐霉属抗性和保藏物培育(deposit development)的生物测定
[0101] 首先将在种质筛选中鉴定出的腐霉属抗性黄瓜来源与各种内部育种品系杂交，以产生许多其中存在抗性的背景。将这些杂交经历了几轮回交和近交，以开发具有商业上可接受的标准的栽培品系。在此过程中，对腐霉属抗性进行了连续选择，因为所述抗性在来源中不是均匀存在的，并且确保抗性在此过程中不会损失。
[0102] 腐霉属抗性的选择通过生物测定进行。在正常黄瓜生长条件下，在日间温度约为23℃下，将植物播种在温室中的装有盆栽土壤的托盘中。播种后7天，在含有燕麦培养基的标准琼脂平板上开始繁殖腐霉属病原体。播种后第14天，通过将约2个腐霉属琼脂平板与一升水混合在一起来制备接种物。从土壤中取出幼苗并浸入接种物中约5分钟。接种后，将植物重新种植在具有常规盆栽土壤的盆中。接种后14天进行抗性评估，其中每株植物按以下2类评分：0(抗性)和1(死亡/枯萎)。对于每个测定，至少进行了10株植物的2次重复试验。由于评分可能会根据条件而有所不同，因此必须包括足够的易感对照植物以验证测试强度。
当在同一实验中某一群体中具有抗性的植物的平均数量在统计学上高于易感对照中抗性植物的数量时，则认为该群体具有抗性。然而，如果差异不是很令人信服，则将重复进行实验以确认抗性的存在。
当在同一实验中某一群体中具有抗性的植物的平均数量在统计学上高于易感对照中抗性植物的数量时，则认为该群体具有抗性。然而，如果差异不是很令人信服，则将重复进行实验以确认抗性的存在。
[0103] 在获得了几个其中抗病性不再分离的均一品系后，将这些品系再次与内部开发的腐霉病易感育种品系杂交。再次进行回交和一些近交，以开发具有腐霉属抗性的改良材料。从两个分离群体(一个基于与易感内部品系021的杂交，另一个基于与易感内部品系029的杂交)，创建DH品系以获得其中抗性可以得到最佳评估的完全纯合的品系。选择来自与品系
021的组合的DH品系002，并选择来自与品系029组合的DH品系027和053。所有三种品系均显示出良好水平的腐霉属抗性(表1)。
021的组合的DH品系002，并选择来自与品系029组合的DH品系027和053。所有三种品系均显示出良好水平的腐霉属抗性(表1)。
[0104] 表1–黄瓜品系的腐霉属生物测定。
[0105]
[0106]
[0107] 在品系002与品系027之间，以及品系002与品系053之间进行杂交。所有得到的种子在腐霉属抗性方面是纯合的。杂交的种子以登录号NCIMB 42776保藏。
[0108] 实施例2
[0109] QTL定位和标志物开发
[0110] 为了定位本发明的赋予腐霉属抗性的QTL，通过回交和自交开发了来自与易感内部育种品系组合的1137来源的两个群体。随后将两个具有相同来源但背景不同的群体与易感品系021杂交，以开发代表栽培的黄瓜植株的另外的回交群体。从一个群体中获得最终的BC4F1，从另一个群体中获得BC3F1。
[0111] 从BC4F1群体和BC3F1群体使用用于黄瓜的标准DH生成技术生成DH系。以这种方式，可获得最适合作图目的的纯合品系。
[0112] 从BC4F1群体对42个DH品系的腐霉属抗性进行了基因分型和表型分析。从BC3F1群体对43个DH品系进行了基因分型和表型分析。总共选择了9个高抗腐霉属的品系用于进一步育种。如实施例1中所述进行表型分型。也以相同方式对易感和抗性亲本进行基因分型和表型分型。表型评分被用作作图的输入。
[0113] 从66个SNP标志物的一个内部组开始获得85个DH品系及其亲本的基因型数据。获得了覆盖所有7个黄瓜染色体的良好连锁图，其中标志物被相对等同地表示。由于所有材料均为纯合的，因此仅给出A和B评分，表明存在来自抗性来源的等位基因或来自易感栽培背景的等位基因。
[0114] 进行了QTL分析，对数据进行映射导致在3号染色体上鉴定了QTL，该QTL仍然覆盖了8.3至46.1cM的相对较大的区域。为了在该域内放大，将更大量的已知位于该区段中的SNP标志用于进一步基因分型，从而导致对QTL的精细定位。以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2指示在3号染色体上在精细定位为侧翼连接QTL后由QTL分析所得的标志物。SEQ ID No.1侧翼连接该区域，而且还与QTL共分离，因此等位基因B与赋予抗性的QTL连锁。SEQ ID No.2侧翼连接该区域并且指示QTL的位置，但取决于背景，等位基因B将存在于抗性背景中，而易感背景可以评分为A或B等位基因。
[0115] 该群体的定位还导致鉴定了许多多态性SNP标志物，其可用于鉴定QTL在3号染色体上的存在。与赋予抗性的QTL连锁的该群体的定位所产生的SNP标志物被指示为SEQ ID No.3以及SEQ ID No.5至16。这标志物的序列，它们在遗传图谱上的遗传位置以及在基于Cs 9930的可公开获得的黄瓜基因组参考序列上的相应物理位置列于表2中。因此，这些标志物可用于鉴定其他群体的个体，所述个体在其基因组的3号染色体上包含赋予抗性的QTL。
[0116] 在保藏物NCIMB 42776中，QTL和腐霉属抗性基因型的存在与具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.3和SEQ ID No.5-16的SNP标志物连锁。这些SNP序列可用作分子标志物用于鉴定从所述保藏物生长的抗腐霉属植物。此外，由于标志物也被定位在黄瓜公共基因组图上并确定了实际物理位置(表2)，因此这些标志物可用于在包含所述QTL的任何其他群体中鉴定QTL在3号染色体上的存在。
[0117] 表2–SNP标志物的序列和位置。
[0118] H>B表示杂合CNV标志物，其是由SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No.16表示的标志物。CNV区的一个拷贝具有这些标志物的易感背景的SNP评分，CNV区的另一拷贝具有抗性背景所特有的SNP，因此存在CNV区。当对H>B标志物进行标志物分析时，评分AA表示纯合地存在A等位基因-不存在CNV区，并且植物是易感的。当评分为AABB时，其表示存在CNV区且植物具有抗性。因此，在这种情况下，AABB评分指示B等位基因纯合存在。由于通常将AABB评分视为杂合的，因此该标志物在本文中称为“杂合CNV标志物”，而该评分在下面表示为‘H>B’。
[0119] 对于CNV区的存在是杂合的植物对于杂合的CNV标志物评分为AAB-无CNV区的染色体(即A等位基因)评分为A，并且具有CNV区域的染色体(即B等位基因)评分为AB。对于为由SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13表示的标志物的纯合CNV标志物，CNV区的杂合存在给出ABB评分。此AAB或ABB评分代表A和B等位基因两者的H(杂合)存在，并且存在于对腐霉属抗性是杂合的植物中。
[0120] 腐霉属抗性植物中存在以下序列的SNP的B等位基因，其为表的第2列中给出的等位基因。
[0121]
[0122]
[0123]
[0124]
[0125]
[0126] 图2显示标志物的位置以及纯合和杂合CNV标志物的评分的表示。
[0127] 实施例3
[0128] QTL中的拷贝数变异区的鉴定
[0129] 将各种黄瓜品系(包括具有腐霉属抗性的材料)的全基因组测序数据绘图，然后使用WGS读取比对可视化工具进行了分析。此后，将序列读取的数据进行比对，并与内部生成的黄瓜参考基因组序列进行比较。然后确定出在表示腐霉属抗性的3号染色体上的QTL区内可发现其中读取深度指示存在多个拷贝的区段。这意味着QTL中存在一个拷贝数变异(CNV)区。
[0130] 标志物测定法与CNV信息相结合产生了侧翼连接CNV的标志物，因此可用于指示CNV区的位置。这些侧翼连接的CNV标志物由SEQ ID No.4和SEQ ID No.5表示。因为它们不在CNV区内，所以它们仅用两个等位基因-A或B评分。在CNV区内，存在约30个注释的基因。
[0131] 为了确定该CNV区是否与腐霉属抗性相关，标志物被设计来鉴定存在于该区内的SNP。由于在CNV区内每个序列存在两次，因此也会观察到双标志物评分。发现在CNV区的一个拷贝中存在几个SNP，但另一个拷贝将具有与参考或易感(即野生型)基因组相同的序列。这些标志物的评分非常困难，因为野生型序列(在本文中表示为等位基因A)存在两次，而抗性材料中CNV的一拷贝中存在的SNP序列也存在两次。与抗性材料有关的SNP序列表示为等位基因B。这会导致表示CNV区的纯合存在的“AABB”标志物评分。这些标志物是“杂合CNV标志物”。
[0132] 以这种方式评分的标志物由SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15和SEQ ID No16表示。
[0133] 然而，除了这些标志物，还可鉴定出在CNV区的两个拷贝中都存在的SNP。由于两个拷贝的存在而再次评分为双倍的这些标志物，当CNV区纯合地存在于植物中时，将具有BBBB评分。这些标志物在本文中称为“纯合CNV标志物”。以这种方式评分的标志物由SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.13表示。
[0134] 图2显示了腐霉属抗性的这些和其他标志物的位置和评分。
[0135] 接下来确定指示CNV区的存在的标志物评分是否与腐霉属抗性共分离，并因此与其连锁和指示腐霉属抗性。确实发现植物中CNV区的存在指示该植物的腐霉属抗性。因此得出CNV区的存在导致黄瓜的腐霉属抗性这一结论。
[0136] 实施例4
[0137] 腐霉属感染的黄瓜植物的ERF基因表达
[0138] 鉴定为与腐霉属抗性连锁的CNV区包含30个基因，其中3个被指定为ERF基因。为了确定黄瓜中3号染色体上的CNV区内的这3个ERF基因的表达水平，进行了表达分析。对于该实验，将这些基因在本发明植物(以保藏NCIMB 42776的植物为代表)中的表达与作为对照的腐霉属易感杂交黄瓜品种Roxanna的植物中的表达进行比较。
[0139] 对于本发明的植物和对照品种的植物的基因型，均按照实施例1中所述的方案用腐霉属感染处理3株植物。为了促进腐霉属感染，在将根浸入接种物中之前对其造成创伤。作为处理的对照，每种基因型也使用3株植物作为对照，进行相同的处理，包括根的创伤，但没有实际的腐霉属感染。
[0140] 随后，对于每株植物，取3个茎样品和1个根样品并提取RNA。设计所有3个ERF基因的qPCR引物以检测表达。通过使用SYBR-green进行qPCR来测试所有样品，并进行相对表达分析。表3列出了茎样品的平均值的结果。
[0141] 表3–抗性与易感植物之间的ERF相对基因表达比较
[0142]
[0143] 没有腐霉属感染的处理以“-”表示；当存在腐霉属感染时，则以“+”表示。“GBN”是本发明的抗腐霉属植物；“ROX”是易感对照品种Roxanna的植物。ERF1B是以SEQ ID No.17表示的基因；ERF098是以SEQ ID No 18表示的基因；ERF096是以SEQ ID No.19表示的基因。
[0144] 实验表明，在抗性植株中每个ERF基因的表达均明显高于易感对照品种中的ERF基因的表达。结果也以图形方式显示在图4中。当存在腐霉属感染时，表达增加，但未感染的GBN植物显示所有基因的表达均高于易感对照品种。因此，可以在存在和不存在疾病压力的情况下进行确定表达增加的分析。
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