专利汇可以提供杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法。本方法以杜仲下胚轴为外植体材料,转基因得到抗性芽,再将抗性芽微嫁接至野生杜仲苗上。本发明方法解决了 现有技术 中转基因杜仲生根率和存活率很低,生长的根常为畸形根,植株无法生长的问题。本发明方法能获得生长健康、完整的转基因植株。,下面是杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法专利的具体信息内容。
1.杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法,包括如下步骤:
(一)接穗材料准备
(1)将种子剥去果皮,消毒后切去种皮仅留下胚在MS固体培养皿进行培养至14天,(2)将培养14天的杜仲下胚轴切至0.5cm作为浸染材料,在YEP液体培养基中培养含有目标载体的工程农杆菌菌液至OD6000.1-0.4,3000rpm离心10min,弃去上清,用重悬液等体积混匀菌体,加入切好的下胚轴,由农杆菌介导转入杜仲的下胚轴中,
(3)无菌滤纸吸取多余菌液后,将侵染后的下胚轴放置于共培培养基中于25℃暗条件培养3d,
(4)将暗培养3d的下胚轴置于筛选培养基中使其发生脱分化和再分化过程,产生带有目的基因的抗性芽;
(5)待抗性芽长至3-4片叶子且长有茎,切下抗性芽作为接穗;
(二)砧木材料准备
将种子剥去果皮,消毒后切去种皮仅留下胚在MS固体培养皿进行培养7天,再转至MS固体培养瓶中,选取长至4周以上,根茎生长正常的杜仲苗作为砧木材料;
(三)嫁接
切除步骤(二)中杜仲无菌苗砧木材料下胚轴以上部分作为砧木,将接穗嫁接到砧木上,使两个伤面的形成层靠近并扎紧在一起,因细胞增生,彼此愈合成为维管组织连接在一起形成完整植株。
2.根据权利要求1所述的方法,所述YEP培养基为10g/L酵母粉+10g/L牛肉膏蛋白胨+
5g/L氯化钠+8g/L琼脂,重悬液为MS+3%蔗糖;所述MS固体培养基为MS+3%蔗糖+0.75%琼脂;所述共培培养基为MS+3%蔗糖+α-萘乙酸NAA0.1mg/L+6-苄氨基嘌呤6-BA2mg/L+乙酰丁香酮AS 200mg/L+0.75%琼脂;所述筛选培养基为MS+3%蔗糖+0.1mg/Lα-萘乙酸NAA+2mg/L+6-苄氨基嘌呤6-BA+0.75%琼脂+100mg/L替门汀TIM+50mg/L卡那霉素KAN。
3.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(二)中在固体培养瓶中的培养方式为根朝下生长点朝上插入培养基生长,使苗更好的向上生长。
4.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(1)消毒处理方法:将剥去果皮的杜仲种子在超净工作台中用75%酒精消毒30-40s,无菌水冲洗2-3次,再在10%的次氯酸钠溶液中浸泡
10min,无菌水冲洗4-5次,,将消毒好后的杜仲种子切去种皮用于接种。
5.根据权利要求1所述的方法,所述农杆菌为根瘤农杆菌菌株LBA4404,目标载体为携带橡胶转移酶(Cis-prenyltransferases)基因CPT1及卡那霉素(kanamycin)抗性基因和GUS基因的载体。
6.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(2)重悬液中加入乙酰丁香酮AS。
7.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(5)中的抗性芽为有完整茎叶的芽。
8.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(三)嫁接采用套管法。
9.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(4)、(5)的培养过程中,光照强度2000lx,每日光照12h,温度25℃。
10.根据权利要求1所述的方法,所述方法还包括步骤(四)GUS组织化学染色及PCR鉴定,筛选出GUS染色阳性植株和PCR扩增阳性的杜仲植株。
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