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杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法

阅读:784发布:2020-05-08

专利汇可以提供杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法。本方法以杜仲下胚轴为外植体材料,转基因得到抗性芽,再将抗性芽微嫁接至野生杜仲苗上。本发明方法解决了 现有技术 中转基因杜仲生根率和存活率很低,生长的根常为畸形根,植株无法生长的问题。本发明方法能获得生长健康、完整的转基因植株。,下面是杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法专利的具体信息内容。

1.杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法,包括如下步骤:
(一)接穗材料准备
(1)将种子剥去果皮,消毒后切去种皮仅留下胚在MS固体培养皿进行培养至14天,(2)将培养14天的杜仲下胚轴切至0.5cm作为浸染材料,在YEP液体培养基中培养含有目标载体的工程农杆菌菌液至OD6000.1-0.4,3000rpm离心10min,弃去上清,用重悬液等体积混匀菌体,加入切好的下胚轴,由农杆菌介导转入杜仲的下胚轴中,
(3)无菌滤纸吸取多余菌液后,将侵染后的下胚轴放置于共培培养基中于25℃暗条件培养3d,
(4)将暗培养3d的下胚轴置于筛选培养基中使其发生脱分化和再分化过程,产生带有目的基因的抗性芽;
(5)待抗性芽长至3-4片叶子且长有茎,切下抗性芽作为接穗;
(二)砧木材料准备
将种子剥去果皮,消毒后切去种皮仅留下胚在MS固体培养皿进行培养7天,再转至MS固体培养瓶中,选取长至4周以上,根茎生长正常的杜仲苗作为砧木材料;
(三)嫁接
切除步骤(二)中杜仲无菌苗砧木材料下胚轴以上部分作为砧木,将接穗嫁接到砧木上,使两个伤面的形成层靠近并扎紧在一起,因细胞增生,彼此愈合成为维管组织连接在一起形成完整植株。
2.根据权利要求1所述的方法,所述YEP培养基为10g/L酵母粉+10g/L肉膏蛋白胨+
5g/L氯化钠+8g/L琼脂,重悬液为MS+3%蔗糖;所述MS固体培养基为MS+3%蔗糖+0.75%琼脂;所述共培培养基为MS+3%蔗糖+α-乙酸NAA0.1mg/L+6-苄基嘌呤6-BA2mg/L+乙酰丁香AS 200mg/L+0.75%琼脂;所述筛选培养基为MS+3%蔗糖+0.1mg/Lα-萘乙酸NAA+2mg/L+6-苄氨基嘌呤6-BA+0.75%琼脂+100mg/L替汀TIM+50mg/L卡那霉素KAN。
3.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(二)中在固体培养瓶中的培养方式为根朝下生长点朝上插入培养基生长,使苗更好的向上生长。
4.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(1)消毒处理方法:将剥去果皮的杜仲种子在超净工作台中用75%酒精消毒30-40s,无菌冲洗2-3次,再在10%的次氯酸钠溶液中浸泡
10min,无菌水冲洗4-5次,,将消毒好后的杜仲种子切去种皮用于接种。
5.根据权利要求1所述的方法,所述农杆菌为根瘤农杆菌菌株LBA4404,目标载体为携带橡胶转移酶(Cis-prenyltransferases)基因CPT1及卡那霉素(kanamycin)抗性基因和GUS基因的载体。
6.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(2)重悬液中加入乙酰丁香酮AS。
7.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(5)中的抗性芽为有完整茎叶的芽。
8.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(三)嫁接采用套管法。
9.根据权利要求1所述的方法,所述步骤(4)、(5)的培养过程中,光照强度2000lx,每日光照12h,温度25℃。
10.根据权利要求1所述的方法,所述方法还包括步骤(四)GUS组织化学染色及PCR鉴定,筛选出GUS染色阳性植株和PCR扩增阳性的杜仲植株。

说明书全文

杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物生物繁殖技术,具体涉及到杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法,一种利用微嫁接的方法解决杜仲抗性芽生根困难的问题。

背景技术

[0002] 杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是我国特有的珍贵树种,仅一属一种,极其珍稀。杜仲还是传统上十分重要的中药材,药用杜仲,即为杜仲科植物杜仲的干燥树皮,是中国名贵滋补药材。其味甘,性温。有补益肝肾、强筋壮骨、调理冲任、固经安胎的功效。可治疗肾阳虚引起的腰腿痛或酸软无,肝气虚引起的胞胎不固,阴囊湿痒等症。杜仲能产杜仲胶,这是一种天然高分子材料,是一种重要的化工原料,在工业上有很高的经济价值。杜仲胶为反式聚异戊二烯,杜仲胶可以用于开发热塑性功能材料、热弹性形状记忆材料。它可以用于航空及有关行业轮胎的开发,顺应了国际上以反式胶为主,发展长寿命、高强度、安全、节能″绿色轮胎″的趋势,可以解决长期以来困扰航空业及相关行业中轮胎强度、轮胎寿命、轮胎摩擦放热等一系列重大问题,最大限度地减少由于飞机轮胎爆裂而造成的灾害,为我国国防工业、航空航天工业的发展提供了新型橡胶材料。此外,由于杜仲适生范围广,病虫害少,也是很好的园林绿化及土保持树种,具有较高的生态效益。通过建立杜仲遗传转化体系来更好的研究其生理生化机制,以此培育更加优良的杜仲新品种,使杜仲更精确服务于人类需求有着重要的意义。
[0003] 目前已知的杜仲遗传转化体系存在的问题就是抗性芽生根率低,根生长畸形,(Chen R,Namimatsu S,Nakadozono Y,et al.Efficient regeneration of Eucommia ulmoidesfrom hypocotyl explant[J].Biologia Plantarum(Prague),2008,52(4):713-717.),无法得到一株生长完整的转基因杜仲。现有技术中多数的遗传转化体系仅停留在抗性芽和不定芽的阶段。

发明内容

[0004] 针对上述领域中的缺陷,本发明提供一种杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法,旨在通过直接将杜仲抗性芽微嫁接到生长良好的野生型杜仲无菌苗上,使两个伤面的形成层靠近并扎紧在一起,因细胞增生,彼此愈合成为维管组织连接在一起从而得到完整的转基因杜仲。本发明成功解决了杜仲生根困难,根为畸形根从而使转基因植株无法生长的问题。
[0005] 杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法,包括如下步骤:
[0006] (一)接穗材料准备
[0007] (1)将种子剥去果皮,消毒后切去种皮仅留下胚在MS固体培养皿进行培养至14天,[0008] (2)将培养14天的杜仲下胚轴切至0.5cm作为浸染材料,在YEP液体培养基中培养含有目标载体的工程农杆菌菌液至OD6000.1-0.4,3000rpm离心10min,弃去上清,用重悬液等体积混匀菌体,加入切好的下胚轴,由农杆菌介导转入杜仲的下胚轴中,[0009] (3)无菌滤纸吸取多余菌液后,将侵染后的下胚轴放置于共培培养基中于25℃暗条件培养3d,
[0010] (4)将暗培养3d的下胚轴置于筛选培养基中使其发生脱分化和再分化过程,产生带有目的基因的抗性芽;
[0011] (5)待抗性芽长至3-4片叶子且长有茎,切下抗性芽作为接穗;
[0012] (二)砧木材料准备
[0013] 将种子剥去果皮,消毒后切去种皮仅留下胚在MS固体培养皿进行培养7天,再转至MS固体培养瓶中,选取长至4周以上,根茎生长正常的杜仲苗作为砧木材料;
[0014] (三)嫁接
[0015] 切除步骤(二)中杜仲无菌苗砧木材料下胚轴以上部分作为砧木,将接穗嫁接到砧木上,使两个伤面的形成层靠近并扎紧在一起,因细胞增生,彼此愈合成为维管组织连接在一起形成完整植株。
[0016] 所述YEP培养基为10g/L酵母粉+10g/L肉膏蛋白胨+5g/L氯化钠+8g/L琼脂,重悬液为MS+3%蔗糖;所述MS固体培养基为MS+3%蔗糖+0.75%琼脂;所述共培培养基为MS+3%蔗糖+α-乙酸NAA0.1mg/L+6-苄基嘌呤6-BA2mg/L+乙酰丁香AS 200mg/L+0.75%琼脂;所述筛选培养基为MS+3%蔗糖+0.1mg/Lα-萘乙酸NAA+2mg/L+6-苄氨基嘌呤6-BA+0.75%琼脂+100mg/L替汀TIM+50mg/L卡那霉素KAN。
[0017] 所述步骤(二)中在固体培养瓶中的培养方式为根朝下生长点朝上插入培养基生长,使苗更好的向上生长。
[0018] 所述步骤(1)消毒处理方法:将剥去果皮的杜仲种子在超净工作台中用75%酒精消毒30-40s,无菌水冲洗2-3次,再在10%的次氯酸钠溶液中浸泡10min,无菌水冲洗4-5次,,将消毒好后的杜仲种子切去种皮用于接种。
[0019] 所述农杆菌为根瘤农杆菌菌株LBA4404,目标载体为携带橡胶转移酶(Cis-prenyltransferases)基因CPT1及卡那霉素(kanamycin)抗性基因的载体。
[0020] 所述步骤(2)重悬液中加入乙酰丁香酮AS。
[0021] 所述步骤(5)中的抗性芽为有完整茎叶的芽。
[0022] 所述步骤(三)嫁接采用套管法。
[0023] 所述步骤(4)、(5)的培养过程中,光照强度2000lx,每日光照12h,温度25℃。
[0024] 所述方法还包括步骤(四)GUS组织化学染色及PCR鉴定,筛选出GUS染色阳性植株和PCR扩增阳性的杜仲植株。
[0025] 本发明通过直接将杜仲抗性芽微嫁接到生长良好的野生型杜仲无菌苗上,使两个伤面的形成层靠近并扎紧在一起,结果因细胞增生,彼此愈合成为维管组织连接在一起从而得到完整的转基因杜仲,成功解决了杜仲生根困难,畸形根以及转基因植株无法正常生长的问题。且嫁接完成的杜仲成活率达到了60%以上。在嫁接过程中保证无菌操作,可以降低污染率,提高嫁接苗的成活率。
[0026] 本发明利用微嫁接的方法解决了杜仲生根困难的问题,从而得到完整的转基因植株,不经过抗性芽生根的过程,具有繁殖系数高、不受季节影响、性状稳定、成本低等优点。本发明通过微嫁接的方式成功建立完善了杜仲遗传转化体系,在杜仲组培等科研方面提供一种新的实验方法。
附图说明
[0027] 图1携带橡胶转移酶(Cis-prenyltransferases)基因CPT1及卡那霉素(kanamycin)抗性基因的载体
[0028] 图2杜仲遗传转化过程图
[0029] 其中A:杜仲种子的萌发;B:浸染都杜仲下胚轴共培养;C:下胚轴愈伤分化;D:杜仲抗性芽嫁接;E,F:杜仲嫁接苗的移栽。
[0030] 图3杜仲嫁接示意图
[0031] 图4GUS组织化学染色
[0032] 其中A:转基因杜仲愈伤;B:转基因杜仲茎横切;C、D、E:为转基因杜仲叶F:野生型杜仲叶;
[0033] 图5CPT1基因PCR检测结果
[0034] M:2000bp DNA Marker;P:质粒;WT:代表野生型烟草植株(Wild-type plants);TP1-6:代表转基因烟草植株(Transgenic plants);

具体实施方式

[0035] 下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0036] 实施例1一种快速高效的微嫁接方法解决杜仲抗性芽生根困难的问题遗传转化过程见图2.
[0037] 1.1选取饱满的种子为实验材料,将种子剥去果皮,消毒后切去种皮仅留下胚进行培养至14d,作为侵染的接穗材料,一部分作为砧木材料培养至7天后转到MS固体培养瓶中,根朝下生长点朝上培养;所用到的培养基为MS固体培养基(MS+3%蔗糖+0.75%琼脂);所使用消毒处理方法:将剥去果皮的杜仲种子在超净工作台中用75%酒精消毒30-40s,无菌水冲洗2-3次,再在70%的次氯酸钠溶液中浸泡10min,无菌水冲洗4-5次,将消毒好后的杜仲种子切去种皮。所述农杆菌为根瘤农杆菌菌株LBA4404,目标载体为携带橡胶转移酶(Quinolinate phosphoribosyltransferases transferase)基因CPT1及卡那霉素(kanamycin)抗性基因、和GUS基因的载体,结构见图1所示。
[0038] 1.2将培养14天的杜仲下胚轴切至0.5cm作为浸染材料,调整含有目标载体的工程农杆菌菌液至适当浓度,将农杆菌导入杜仲的下胚轴中;所述菌液中农杆菌菌液OD600为0.1-0.4;,重悬液为MS+3%蔗糖,重悬液中加入乙酰丁香酮AS。
[0039] 1.3无菌滤纸吸取多余菌液后,将侵染后的下胚轴放置于共培培养基(MS+3%蔗糖+α-萘乙酸NAA0.1mg/L+6-苄氨基嘌呤6-BA2mg/L+乙酰丁香酮AS 200mg/L+0.75%琼脂)中于25℃暗条件培养3d;
[0040] 1.4将暗培养3d的下胚轴置于是筛选培养基(MS+3%蔗糖+0.1mg/Lα-萘乙酸NAA+2mg/L+6-苄氨基嘌呤6-BA+0.75%琼脂+100mg/L替门汀TIM+50mg/L卡那霉素KAN)中进行脱分化及再分化;
[0041] 1.5切除良好的杜仲无菌苗砧木材料下胚轴以上部分,余下部分作为砧木;将长至3-4片叶子且长有明显茎的抗性芽嫁接到砧木上,使两个伤面的形成层靠近并扎紧在一起,结果因细胞增生,彼此愈合成为维管组织连接在一起形成一个完整植株;所述的嫁接完成的苗在MS固体培养基上,所选择的嫁接苗应该选择生长至4周以上根茎生长正常的苗,所选择的接穗应该选择有完整茎叶的芽。杜仲嫁接示意图见图3。
[0042] 表1
[0043]
[0044] 1.6转基因植株鉴定、筛选。
[0045] 所述除了暗培养过程,其他培养条件均为光照强度2000lx,每日光照12h,温度25℃;嫁接方法为套管法。由于苗太细,伤口处使用直径为0.5mm的软皮针管,再在针管外套一层直径1mm的嫁接管,嫁接过程一直戴有无菌手套。所述转基因植株鉴定为GUS组织化学染色和PCR分析。图4为GUS组织化学染色,从结果看,本发明的愈伤组织,杜仲茎、叶均呈蓝色,表明目的基因在这些部位有表达,而野生型的无表达。图5为CPT1基因的检测。所有GUS检测为蓝色为植株,PCR检测均为阳性。
[0046] 总共嫁接69株杜仲,共有42株存活,有新叶长出。嫁接过程易于污染,保证无菌操作,可以提高存活率。
[0047] 表2
[0048]
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