一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
阅读：976发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种解淀粉芽孢杆菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种解 淀粉 芽孢杆菌，保藏在中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13359。该菌株能够降解瓜尔 豆粕 ， 发酵 瓜尔豆胶与麸皮的混合物时，还原糖的产率能够提高150％以上；发酵生产含有瓜尔豆粕的混合 饲料 ，其 抗营养因子 可被完全去除， 粗蛋白 含量增加，极大提高其饲用价值，并且特殊气味明显改善，可提高其适口性，增加动物采食量，提高日增重以及饲料转化率,提高 家禽 免疫 力 ,改变家禽肠道状态使之有利于养分吸收，可取得与添加抗生素相当的效果，可提高断奶仔猪的日增重和饲料转化率等。，下面是一种解淀粉芽孢杆菌及其应用专利的具体信息内容。
1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) ，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13359，以D-甘露糖为碳源，以多聚蛋白胨为氮源时，所述保藏编号为CGMCC NO.13359的菌株的胞外酶酶活最高。
2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 在降解瓜尔豆粕中的应用。
3.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 在降解瓜尔豆胶中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 降解瓜尔豆胶的降解产物为甘露寡糖。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述降解产物为甘露二糖、甘露三糖。
6.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 在制备含有瓜尔豆粕的饲料中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述含有瓜尔豆粕的饲料为瓜尔豆粕与麸皮的混合物。
8.根据权利要求7所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 的应用，其特征在于，所述瓜尔豆粕与麸皮的质量比为1:1或3:2。
9.一种用于降解瓜尔豆粕的生物菌剂，其特征在于，包括解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) ，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC NO.13359。
一种解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 瓜尔豆粕(guarmeal)为瓜尔豆通过一定的加工工艺提取其中的瓜尔豆胶后所余下的副产品。一般瓜尔豆粕中都含有一定数量的瓜尔豆胶。瓜尔豆粕的基本营养价值指标为：干物质80％～90％，粗蛋白质30％～80％。其营养价值高。目前研究较少，被誉为待开发的无转基因优质纯豆蛋白。瓜尔豆粕与大豆豆粕相比，能量、粗蛋白和脂肪明显高于豆粕，钙磷相当。在必需氨基酸方面，各项指标均不亚于豆粕。瓜粕中残余的瓜尔豆胶的主要成分为半乳甘露聚糖，而其降解产物半乳甘露寡糖是很好的免疫调节促进生长的物质。作为饲料添加剂使用时能够提高动物免疫力，降低胃肠道疾病发生率和死亡率，提高日增重和饲料转化率。因此，瓜尔豆粕有望作为一种新型的蛋白质饲料原料，可以缓解目前国内蛋白质饲料资源不足、豆粕价格过高对于饲料行业和畜牧业造成的不利影响。
[0003] 但瓜尔豆粕作为饲料应用时，在瓜尔豆粕中残留的瓜尔豆胶，其主要成分半乳甘露聚糖，可增加消化道中食糜的粘稠度，因此会降低饲料中各种营养成分的消化率。和豆粕及其他杂粕相似，瓜尔豆粕也存在一定的营养缺陷，如含有胰蛋白酶抑制因子等，这在一定程度上影响了其蛋白在动物体内的利用率，并且瓜尔豆粕自身具有特殊味道，动物直接应用口感欠佳，因此如何解决瓜尔豆粕的营养缺陷，降低其毒性并增加其适口性，是目前研究的热点。
发明内容
[0004] 本发明针对以上现有技术中的缺陷提供了一种解淀粉芽孢杆菌，该菌株能够将瓜尔豆粕中的半乳甘露聚糖分解为甘露二糖、三糖等功能性寡糖，提高瓜尔豆粕饲用营养价值，并解决其特殊气味，满足其应用的适口性。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0006] 一种解淀粉芽孢杆菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13359。
[0007] 保藏说明：
[0008] 菌种名称：解淀粉芽孢杆菌
[0009] 拉丁名：Bacillus amyloliquefaciens
[0010] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0011] 保藏机构简称：CGMCC
[0012] 地址：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0013] 保藏日期：2016年11月30日
[0014] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No.13359
[0016] 上述解淀粉芽孢杆菌在降解瓜尔豆粕中的应用。
[0017] 上述解淀粉芽孢杆菌在降解瓜尔豆胶中的应用。
[0018] 进一步的，所述解淀粉芽孢杆菌降解瓜尔豆胶的降解产物为甘露寡糖。
[0019] 进一步的，所述降解产物为甘露二糖、甘露三糖。
[0020] 解淀粉芽孢杆菌在制备含有瓜尔豆粕饲料中的应用。
[0021] 进一步的，所述含有瓜尔豆粕的饲料为瓜尔豆粕与麸皮的混合物。
[0022] 进一步的，所述瓜尔豆粕与麸皮的质量比为1:1或3:2。
[0023] 一种用于降解瓜尔豆粕的生物菌剂，包括上述解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC NO.13359。
[0024] 与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
[0025] 1、本发明从土样中筛选出一株能够降解瓜尔豆粕中的半乳甘露聚糖的菌株，经鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，该菌株能够降解甘露糖、半乳糖、可溶性淀粉等，并将瓜尔胶降解为甘露二糖、甘露三糖等功能性寡糖。
[0027] 3、利用本发明提供的解淀粉芽孢杆菌发酵生产含有瓜尔豆粕的混合饲料，其抗营养因子可被完全去除，粗蛋白含量增加，极大提高其饲用价值，并且特殊气味明显改善，可提高其适口性，增加动物采食量。
[0028] 4、利用本发明提供的解淀粉芽孢杆菌发酵生产含有瓜尔豆粕的混合饲料，可提高日增重以及饲料转化率,提高家禽免疫力,改变家禽肠道状态使之有利于养分吸收，可取得与添加抗生素相当的效果，可提高断奶仔猪的日增重和饲料转化率等。
[0029] 5、利用本发明提供的解淀粉芽孢杆菌发酵瓜尔豆粕以后的降解产物甘露寡糖能够促进肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌群的增值，能够吸附病原菌，长期使用可有效防止沙门菌、肉毒杆菌等致病的感染，抑制致病菌的繁殖，从而改善菌群结构，减少有害细菌的产生，减少抗生素的添加量，同时甘露寡糖也有利于牲畜的生长，提高饲料的转化率。附图说明
[0030] 图1为对保藏号为CGMCC NO.13359的菌株的培养基中的碳源进行优化的实验结果图；
[0031] 图2为对保藏号为CGMCC NO.13359的菌株的培养基中的氮源进行优化的实验结果图；
[0032] 图3为NaCl对保藏号为CGMCC NO.13359的菌株产生还原糖的影响的实验结果图；
[0033] 图4为保藏号为CGMCC NO.13359的菌株发酵不同时间时的酶活测定结果图；
[0034] 图5为保藏号为CGMCC NO.13359的菌株发酵瓜尔豆粕与麸皮混合饲料的实验结果图；
[0035] 图6为保藏号为CGMCC NO.13359的菌株发酵不同饲料后的发酵液薄层层析的实验结果图。
具体实施方式
[0036] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。因此，以下对本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037] 本发明所采用的培养基：
[0038] 富集培养基：蛋白胨(市售)10.0g/L，酵母粉(市售)3.0g/L，瓜尔胶(市售)5.0g/L。
[0039] 筛选培养基(固体)：瓜尔胶(市售)3.0g/L，磷酸二氢钾(市售)0.05g/L，氯化钠(市售)0.8g/L，MgSO4·7H2O(市售)0.025g/L，硝酸钾(市售)0.7g/L，酵母粉(市售)2.0g/L，蛋白胨(市售)5.0g/L，琼脂(市售)18.0g/L，pH 7.0。
[0041] 碳源优化中使用到的葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、棉籽糖、可溶性淀粉、槐豆胶、瓜尔胶、魔芋粉、椰肉粉均为市售产品。
[0043] DNS试剂的配制：
[0044] 甲液：将6.9g结晶苯酚溶于15.2mL质量分数为10％的NaOH溶液，蒸馏水稀释至69mL，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠，搅拌混合均匀。
[0046] 将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，储于棕色瓶中放置7-10d后使用。在棕色瓶内保存一年有效。
[0047] DNS试剂的配制中所用的结晶苯酚、NaOH、亚硫酸氢钠、酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸等均为市售试剂。
[0048] 薄层层析实验中：
[0049] 展开剂：正丙醇：乙酸：水(V：V：V)＝1:1:0.1
[0051] 薄层层析实验中所用的正丙醇、乙酸、1-萘酚、磷酸、乙醇等均为市售试剂。
[0052] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0053] 实施例1分离、筛选够降解瓜尔豆粕的菌株
[0054] 从北京市怀柔区某一田地中采集土样作为实验材料，将其经接入到灭菌后的富集培养液中，于30℃，200rpm的条件下，富集培养2-5天。富集培养过程中，目测经灭菌后呈粘稠胶状的瓜尔胶粉被降解的程度。若发现瓜尔胶粘稠胶状物被明显分解，即将其培养液接转至新的富集培养液中，同样条件下进行第二次富集培养。
[0055] 选取分解瓜尔胶较好的培养液，按常规梯度稀释后，取稀释度为10-8涂布于含有筛选培养基的平板中，于恒温培养箱中30℃培养过夜。
[0056] 先测量菌落直径(C)，然后在初筛平板中滴加适量碘液染色，静置5分钟，弃掉碘液，用自来水缓慢冲洗平板，将具有水解透明圈的菌落全部选出，并采用划线分离法反复进行分离纯化，直至得到单菌落的菌株。测量分离纯化以后的菌株的透明圈水解直径(H)，计算H/C的比值。经过筛选得到一株降解瓜尔胶较好的菌株，其H/C为18。并对该菌株进行保藏，保藏号为CGMCC CGMCC NO.13359。
[0057] 实施例2保藏号为CGMCC NO.13359的菌株鉴定
[0058] 1.形态特征：将保藏号为CGMCC CGMCC NO.13359的菌株在基础培养基中的菌落为圆形，表面光滑、扁平，灰白色，无光泽、不透明；液体培养时，上层有膜状，稍混浊，无沉落物。革兰氏染色呈阳性，菌体杆状，链状排列，运动，芽胞不明显膨大，无夹膜。
[0059] 2.生理生化特征：根据《常见细菌系统鉴定手册》中记载的实验内容和实验方法，对筛得的保藏号为CGMCC CGMCC NO.13359的菌株进行鉴定。经过生理生化特征鉴定，该菌株可以利用葡萄糖、甘露糖、半乳糖、可溶性淀粉等，也可分解瓜尔胶产生还原糖。
[0060] 3.16S rRNA基因序列同源性分析
[0061] 以筛选得到的菌株的基因组DNA为模板，利用购自上海生工生物工程有限公司的真细菌引物27f和1492r，进行PCR扩增。
[0062] 27f引物序列为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
[0063] 1492r引物序列为：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
[0064] PCR反应体系为25μl，反应体系为：基因组DNA 1μL，10×PCR buffer 2.5μL，27f引物0.5μL，1492r引物0.5μL，dNTPs 2μL，Taq酶(5U/μL)0.25μL，ddH2O 18.25μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃10min。
[0065] PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR条带大小约为1500bp的PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序后，将获得的DNA序列(见序列1)，输入NCBI数据库，用Blast程序与数据库中的所有序列进行比较分析。利用MEGA4.1进行系统发育树的构建。经过序列分析显示，保藏号为CGMCC NO.13359的菌株序列与解淀粉芽孢杆菌16S序列相似度为100％，结合其形态和生理生化特征可以断定，该菌株是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
[0066] 实施例3保藏号为CGMCC NO.13359的菌株的发酵条件优化
[0067] 将保藏号为CGMCC NO.13359的菌株接入到培养基中，测定胞外酶酶活，以所产还原糖浓度为参考优化培养基中的碳源、氮源等。
[0068] 1.碳源的优化
[0069] 保持基础培养基中的其他条件不变，只改变碳源进行优化。所选取的碳源包括：1.葡萄糖；2.D-甘露糖；3.D-半乳糖；4.棉籽糖；5.可溶性淀粉；6.槐豆胶；7.瓜尔胶；8.魔芋粉；9.椰肉粉。
[0070] 以上述产品分别作为碳源进行优化，以所产还原糖浓度为指标测定胞外酶酶活，实验结果如图1。
[0071] 从图1中可以看出，选用D-半乳糖时，保藏号为CGMCC NO.13359的菌株所产生的还原糖的量最多，其胞外酶酶活最高，余下的依次为葡萄糖＞D-甘露糖＞可溶性淀粉＞魔芋粉＞瓜尔胶＞棉籽糖＞椰肉粉，保藏号为CGMCC NO.13359的菌株几乎不能降解槐豆胶。考虑到以后大规模生产中的成本问题，由于葡萄糖价格低，为了节省成本，在下一步的氮源优化过程中，同时考虑将D-半乳糖和葡萄糖作为碳源进行优化。
[0072] 2.氮源的优化
[0073] 以D-半乳糖和葡萄糖分别作为碳源，保持基础培养基中的其他条件不变，只改变氮源进行优化。所选取的氮源包括1.水解酪蛋白；2.牛肉浸膏；3.细菌蛋白胨；4.多聚蛋白胨；5.胰蛋白胨；6.大豆蛋白胨；7.谷氨酸钠；8.尿素；9.硫酸铵；10.氯化铵；11.磷酸二氢铵；12.乙酸铵。
[0074] 以上述产品分别作为氮源进行优化，以所产还原糖浓度为指标测定胞外酶酶活，实验结果如图2。
[0075] 从图2中可以看出，①相同氮源的情况下，保藏号为CGMCC NO.13359的菌株以D-半乳糖为碳源时，所产生的还原糖量均比以葡萄糖为碳源时产生的还原糖量多，即以D-半乳糖为碳源时，其胞外酶酶活较高。
[0076] ②以D-半乳糖为碳源，以多聚蛋白胨为氮源时，保藏号为CGMCC NO.13359的菌株所产生的还原糖的量最多，其胞外酶酶活最高，剩下的依次为水解酪蛋白≈胰蛋白胨＞牛肉浸膏≈乙酸铵＞硫酸铵≈氯化铵＞细菌蛋白胨＞尿素＞谷氨酸钠＞大豆蛋白胨＞磷酸二氢铵。
[0077] ③以葡萄糖为碳源时，以乙酸铵为氮源时，保藏号为CGMCC NO.13359的菌株所产生的还原糖的量最多，其胞外酶酶活最高，剩下的依次为尿素＞氯化铵＞磷酸二氢铵＞牛肉浸膏＞谷氨酸钠＞多聚蛋白胨＞硫酸铵＞水解酪蛋白＞胰蛋白胨＞大豆蛋白胨＞细菌蛋白胨。
[0078] ④考虑以后大规模生产中的成本问题，以下实验选取葡萄糖为发酵碳源，乙酸铵为发酵氮源进行优化并生产。
[0079] 3.培养基中NaCl对保藏号为CGMCC NO.13359的菌株产生还原糖的影响
[0080] 保持基础培养基中的其他条件不变，以葡萄糖为发酵碳源，乙酸铵为发酵氮源，试验NaCl对保藏号为CGMCC CGMCC NO.13359的菌株产生还原糖的能力。实验结果如图3。
[0081] 从图3中可以看出，添加NaCl后，保藏号为CGMCC CGMCC NO.13359的菌株产生的还原糖量降低，NaCl对保藏号为CGMCC CGMCC NO.13359的菌株的酶活产生不利影响，因此，在以后所用的培养基中不再添加NaCl。
[0082] 最终通过对培养基中碳源、氮源的优化及从节约成本方面考虑，选定的培养基为每1L培养基中含有：葡萄糖10g，乙酸铵10g，酵母粉2g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸镁0.2g，pH 7.0。
[0083] 实施例4保藏号为CGMCC NO.13359的菌株甘露聚糖酶酶活测定
[0084] 酶活定义：本实验以0.5％瓜尔胶为底物，每小时产生1umol还原糖所需的酶量为一个酶活单位(IU)。
[0085] 0.5％瓜尔胶溶液的配制：用5ml 0.2mol/L的KH2PO4与2.936ml 0.2mol/L的NaOH混合，定容至20ml，配制成0.05mol/L、pH＝7的磷酸缓冲液，用该缓冲液溶解瓜尔胶，配制浓度为0.5％的瓜尔胶溶液作为底物。
[0086] 将保藏号为CGMCC NO.13359的菌株接种在优化以后的培养基中，于30℃，200rpm的条件下，恒温培养。取培养时间分别为6h、12h、24h、30h、36h、55h时的发酵液进行测定。
[0087] 测定方法：
[0088] 分别取5ml上述各个时间点的发酵液于8000r/min下离心10分钟，取上清得到粗酶液，备用。
[0089] 在0.5ml底物中加入0.5ml粗酶液，置30℃恒温水浴中反应30min，再加入DNS试剂2ml，沸水浴2min，显色，然后以流动的水迅速冷却，加蒸馏水9ml，以空白液为对照，在540nm处测定吸光度，计算还原糖量。同样方法测定酶反应0min时的还原糖量。根据单位时间还原糖的增加量及酶活力单位的定义计算出酶的活性。具体实验结果如图4所示。
[0090] 从图4中可以看出，保藏号为CGMCC CGMCC NO.13359的菌株在发酵培养30小时的时候，酶活最高，此时的酶活达到0.612IU。后续实验将选用培养30小时的菌体进行瓜尔豆粕发酵实验。
[0091] 实施例5保藏号CGMCC NO.13359的菌株发酵瓜尔豆粕的应用
[0092] 将保藏号为CGMCC NO.13359的菌株活化，然后按10％的接种量转接入到新的实施例3确定的优化培养基中，培养30h后，备用。
[0093] 取10g已灭菌的瓜尔豆粕置于100mL锥形瓶中，加入10mL上述备用发酵液于30℃的条件下，恒温培养进行发酵。以空白培养基做对照，发酵3天后共生成了304mg还原糖。降解产物甘露寡糖能够促进肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌群的增值，能够吸附病原菌，长期使用可有效防止沙门菌、肉毒杆菌等致病的感染，抑制致病菌的繁殖，从而改善菌群结构，减少有害细菌的产生以及抗生素的添加量，同时甘露寡糖也有利于牲畜的生长，提高饲料的转化率。
[0094] 实施例6保藏号为CGMCC NO.13359的菌株发酵瓜尔豆粕与麸皮混合的应用
[0095] 采用上述优化的培养过程，利用保藏号为CGMCC NO.13359的菌株进行实际的瓜尔豆粕发酵实验，探讨了瓜尔豆粕和麸皮不同的配比，对实际发酵的影响。其结果如图5所示。
[0096] 从图5中可以看出，以不接菌的(只加空培养基)为对照组，发酵3天后，与对照组相比，添加保藏号为CGMCC NO.13359的菌株的处理的体系中，总还原糖的含量明显提高，10g发酵样品总还原糖的最高量可达到504.93mg。从配比看5:5和6:4的配比效果最好。
[0097] 保藏号为CGMCC NO.13359的菌株不仅可以发酵瓜尔豆粕与麸皮的混合饲料，对玉米与瓜尔豆粕混合的饲料、小麦与瓜尔豆粕混合的饲料、秸秆与瓜尔豆粕混合的饲料均具有良好的降解功效，解决了上述饲料因半纤维素占了相当大的比例，这类非淀粉多糖成份含量高，蛋白质、淀粉等营养成份被这些非淀粉多糖混合包被，而动物自身缺乏或不能产生相对分解的酶类，极大地限制动物对饲料的利用的问题，解决食糜通过消化道速度的低下，增加动物肠道负担，降低脂肪和氨基酸的吸收，降低水的吸收导致粪便含水量过高等相关问题。
[0098] 实施例7利用薄层层析实验检测瓜尔豆粕发酵以后还原糖的种类
[0099] 薄层层析实验：
[0100] 在硅胶板底部用铅笔画一条直线(距离底部1cm)，根据样品的个数每隔一定距离点样，点样量为5μL；点样干燥后放入装有展开剂的层析缸中，当展开剂前沿离硅胶板顶部1cm处时取出。自然晾干，喷洒显色剂至整个硅胶板，立即放入140℃的烤箱中至显色。取出硅胶板，拍照保存。
[0101] 利用保藏号CGMCC NO.13359的菌株发酵瓜尔豆粕以后，使用薄层层析方法检测发酵液中的还原糖种类，其实验结果如图6所示。
[0102] 图6中，从左向右所表示的试验样品依次为甘露一糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖以及瓜尔豆粕液体发酵样本1-3、空白对照、瓜尔豆粕和麸皮5：5发酵液、空白对照、瓜尔豆粕和麸皮5：5发酵液、空白对照、瓜尔豆粕和麸皮6：4发酵液、空白对照、瓜尔豆粕和麸皮6：4发酵液从图6中可以看出，发酵液中检测到了甘露二糖、三糖等功能寡糖。
[0103] 本发明保藏号为CGMCC NO.13359的菌株可以有效的处理瓜尔豆粕或瓜尔豆粕与其他饲料混合后的饲料，并将其部分降解成功能化合物。在下一步的工业生产中具有较大的应用前景。
[0104] 以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
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