本发明涉及编码睫状神经营养性因子（CNTF）的重组DNA分子，及其衍生的肽和蛋白质。该CNTF和按本发明生产的有关分子均可用于治疗各种神经性病症。

神经营养性因子的生物学已鉴定的许多因子均影响神经系统的生长和发育。可以相信，在成熟及未成熟神经系统中这些因子对维持神经种群的生存起着重要作用。

在许多神经种群的正常发育过程中，有一个确定的细胞死亡期，在此期间，原始种群的许多成员死亡（Hamburger  and  Levi-Montalcini，1949，J，EXP，Zool.Ⅲ：457-501;Hamburger，1958，Amer.J.Anat.102：365：410;Hamburger，1975，J.Comp.Neurol.160：535-546;Cowan  and  Wenger，1968，Z，EXP.Zool.，168：105-124;Rogers  and  Cowan，1973，J，Comp.Neurol.147：291-320;Clarke  and  Cowan，1976，J.Comp.Neurol.167：143-164;Clarke  et  al.，1976，J.Comp.Neurol.167：125-142;Hollyday  and  Hamburger，1976，J.Comp.Neurol.170：311-320;Varon  and  Bunge，1978，Annu.Rev.Neurosci.1：327-362;Cowan  et  al.，1984，Science  225：1258-1265）。已证明神经元的存活与神经支配区域大小成比例;给定的神经种群的靶区域越小，在细胞死亡期存活的神经元数目减少。这表明，靶区域中存在的神经营养性因子的量与神经元的存活有关。

神经生长因子（NGF）是这些神经营养性分子中得到最充分表征的，体外和体内试验均表明，在小鸡和大鼠早期发育过程中，NGF对交感神经和神经

衍生的感觉神经元的生存是必不可少的（levi-Montalcini and Angeletti，1963，Develop.Biol.7：653-659;levi-Montalcini et al.，1968，Physicl.Rev.48：524-569）。现已发现，将已纯化的NGF注入正在发育的小鸡胚胎中，可引起脊髓感觉神经元和交感神经元的大量增生和过度生长（Levi-Montal-cini and Booker，1960，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46：373-384;Hamburger et al.，1981，J.Neurosci.1：60-71）。相反，通过在新生鼠中每日注射抗-NGF抗体，而去除或分离内生NGF的同时可有效破坏交感神经系统（Levi-Montalcini and Booker，Proc.Natl.Acad..Sci.U.S.A.46：384-391;Levi-Montalcini and Angeletti，1966，Pharmacol.Rev.18：619-628）。试验表明，通过子宫内注射抗体或通过母体抗体经胎盘的被动转移，而在发育早期暴露于NGF抗体，结果也会明显损伤神经脊衍生的感觉神经元，如脊髓的和背中线的三叉感觉神经元（Goedert et al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：1580-1584;Gorin  and  Johnson，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76：5382-5386）。直到最近，几乎所有对NGF的研究均集中在其对外周神经系统的作用，然而现在看来，在中枢神经系统中NGF也会影响神经元的特定种群的发育和生存（Thoenen  et  al.，1987，Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.109：145-178;Whittemore  and  Seiger，1987，Brain  Res.Rev.12：439-464）。

还未象NGF那样表征的神经营养性因子包括脑衍生的神经营养性因子（BDNF）和睫状神经营养性因子（CNTF）。

睫状神经营养性因子这些睫状神经营养性因子（CNTFs）是小鸡胚睫状节神经元在体外生存特异性需要的蛋白质（Manthorpe  et  al.，1980，J.Neurochem.34：69-75）。解剖学上将该睫状神经节定位于眶腔内，处于外侧直肌和视神经鞘之间;它接收来自动眼神经的副交感神经纤维，该动眼神经支配睫状肌和瞳孔括约肌，还支配存在在眼脉络层中的平滑肌。

现已发现，睫状节神经元是具有确定细胞死亡期的神经元种群之一种。在小鸡的睫状神经节中，已观测到在第8天的胚胎（E8）中有一半神经元，在E14以前死亡（Landmesser  and  Pilar，1974，J.Physoil.241：737-749）。在这相同的时间期间，生成了睫状节神经元，它与其靶组织（即眼的睫状体和脉络层）有关。Landmesser  and  Pilar（1974，J.Physiol.241：715-736）观测到在细胞死亡期以前切除一只眼，结果几乎完全丧失同侧神经节中的睫状节神经元。相反，Narayanan和Narayanan（1978，J.Embryol.Ex.Morphol.44：53-70）观测到，植入另外一只眼原基，从而增加有用靶组织的量，可减少睫状节神经元细胞的死亡。这些结果与作用于睫状节神经元的神经营养性因子的存在相一致。

现已发现，在培养时睫状节（CG）神经元的存活需要一种或多种因子。睫状神经营养性因子（CNTF）的活性已在如下培养基中鉴定：在小鸡肌细胞限制性培养基中（Bennett  and  Nurcombe，1979，Brain  Res.173：543-548;Nishi  and  Berg，1979，Nature  277：232-234;Varon  et  al.，1979，Brain  Res.173：29-45），在肌肉浸提液中（Mclennan  and  Hendry，1978，Neurosci.Lett.10：269-273;Bonhady  et  al.，1980，Neurosci.Lett.18：197-201），在小鸡胚胎提取液中（Varon  et  al.，1979，Brain  Res.173：29-45;Tuttle  et  al.，1980，Brain  Res.183：161-180），以及在心脏细胞限制的培养基中（Helfand  et  al.，1976，Dev.Biol.50：541-547;Helfand  et  ai.，1978，Exp.Cell  Res.113：39-45;为便于讨论，还可参见Adler  et  al.，1979，Science  204：1434-1436和Barbin  et  al.，1984，J.Neurochem.43：1468-1478）。

Adler等人（1979，Science  204：1434-1436）采用基于CG神经元微孔培养物的分析体系，表明在CG神经元支配的眼内靶组织中存在丰富的CNTF源。8000多个营养单位（TU）存在在12天的胚胎中，已发现2500个TU存在眼组织中;看来活性只限于含有睫状体和脉络层的部分，具有的比活性比完整的胚胎提取液中的比活性约高20倍。

其后，Barbin等人（1984，J.Neurochem.43：1468-1478）报道了从小鸡胚胎眼组织中纯化CNTF的方法。还发现CNTF活性与非-CG组织（包括鼠坐骨神经）有关（Williams等人，1984，Int.J.Develop.Neurosci.218：460-470）。Manthorpe等人（1986，Brain  Res.367：282-286）报道用分馏方法（类似于从小鸡眼中分离CNTF活性所用的方法）从成年鼠坐骨神经提取液中纯化哺乳动物CNTF活性。此外，Watters和Hendry（1987，J.Neurochem.49：705-713）描述了一种用肝素亲和色谱法在非变性条件下从牛心组织中使CNTF活性纯化约20000倍的方法。在已损伤的脑组织中也已鉴定CNTF活性（Manthorpe  et  al.，1983，Brain  Res.267：47-56;Nieto-Sampedro  et  al.，1983，J.Neurosci.3：2219-2229）。

Carnow等人（1985，J.Neurosci.5：1965-1971）和Rudge等人，（1987，Develop.Brain  Res.32：103-110）描述了一种从组织提取液中鉴定CNTF活性的方法，包括将细胞提取液经电泳分离后，影印到硝酸纤维膜滤纸上（Western吸印试验），然后用CG神经元接种该硝化纤维素膜，识别含有CNTF活性的蛋白质带。用活体染色鉴定细胞存活的面积。这些方法可用于测定粗提取液中活性多肽的表观分子量。用该方法，Carnow等人（1985，J.Neurosci.5：1965-1971）观测到成年鼠坐骨神经和脑衍生的CNTF活性与小鸡CNTF（20.4kd）相比显示具有不同的大小（24kd）。

睫状神经营养性因子的功能性现已认为许多生物效应是由CNTF引起的，尽管这些活性分子性质尚不清楚。如上所述，最初将CNTF描述成一种活性物，该活性物可维持E8小鸡睫状神经元的生存，它是副交感神经系统的一种成分。含有CNTF活性的已知制剂的其它生物性质描述如下：Saadat等人（1989，J.Cell  Biol.108：1807-1816）观测到鼠坐骨神经CNTF的高纯制剂能诱导培养液中新生鼠上颈节神经元的胆碱能分化。Hoffman（1988，J.Neurochem.51：109-113）也发现由小鸡眼衍生的CNTF活性可增加视网膜单层细胞培养物中胆碱-O-乙酰转移酶的活性程度。

Hughes等人（1988，Nature  335：70-73）对产期鼠视神经和脑中的两种潜力神经胶质祖先细胞的种群进行了研究;认为该细胞种群首先产生少突神经胶质细胞，然后，再产生2型星形胶质细胞。研究表明，在缺少任何特定生长因子时从少突神经胶质细胞-2型-星形胶质细胞（O-2A）祖先细胞中可发生少突神经胶质细胞分化，而2型星形胶质细胞分化显然需要有特异诱导蛋白质存在。Hughes等人观测到2型星形胶质细胞诱导蛋白质与CNTF相类似或相同（也参见Anderson，1989，Trends  Neurosci.12：83-85）。

Heymanns和Unsicker（1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：7758-7762）观测到成神经细胞瘤细胞浸提液的高速上清液可产生类似于由小鸡眼或鼠坐骨神经衍生的CNTF活性的效应;这说明存在的蛋白质与CNTF（分子量）相类似但不相同。

Ebendal（1987，J.Neurosci.Res.17：19-24）在各种鼠和鸡组织中寻找CNTF活性。他们在鼠组织而不是在鸡组织中观测到很宽范围的睫状神经存活促进活性;且发现鼠肝、脾脏T细胞和下颌腺细胞具有低的CG存活促进活性。在试验的组织中观测到鼠肾脏的CNTF活性最高。

虽然上述研究已经表明，许多组织和细胞提取液具有与CNTF性质类似的活性（例如，在组织培养液生物检定中它们能维持E8小鸡睫状节神经元的生存），但它不能推断单一或相同蛋白质是产生这些活性的主要原因。正如成纤维细胞生长因子（FGFs）类所示，在单一生物检定中，许多特殊多肽或蛋白质具有相同的生物活性。

最初发现小鸡眼和鼠坐骨神经CNTF的神经元特异性与对NGF应答的神经元种群相一致。但是在研究CNTF和NGF对正发育的神经元种群的作用时CNTF和NGF之间的区别特征极为明显。Skaper和Varon（1986，Brain  Res.389：39-46）研究了在6.5天（E6.5）和E15的胚胎期间小鸡后根神经节（DRG）神经元存活条件。这些DRG神经元最初只对NGF响应，后来观测到也对CNTF应答，最后似乎与这二种因子越来越不反应。除了在发育过程所起作用不同之外，CNTF与NGF的差别还包括分子量、等电离点、不能用NGF的抗体使之失活，以及CNTF能维持NGF不响应的CG神经元在体外生存（Barbin等人.，1984，J.Neurochem.43：1468-1478）。

本发明涉及编码睫状神经营养性因子（CNTF）的核酸序列、蛋白质、肽及其生成的衍生物。在本发明的各种实施方案中，本发明的核酸序列、蛋白质和肽均可用于治疗各种神经性疾病和神经错乱，包括（但不限于）早老性痴呆病和帕金森氏病。

在另一些实施方案中，本发明的CNTF核酸、蛋白质和肽可用于治疗运动神经疾病，包括（但不限于）肌萎缩的外侧硬化（Lou  Gehrig氏病）。在本发明的一个特定实施方案中，可用CNTF恢复贝耳氏（Bell′s）麻痹的面神经功能。在本发明的另一个特定的实施方案中，CNTF可用于帮助脊髓神经元的生长，从而为外伤、梗死、感染、营养不良或有毒试剂引起的脊髓损伤提供了治疗方法。

而且，本发明提供了化学方法生产纯CNTF的新方法。

本发明还涉及含有效量CNTF基因产物的药物组合物，该组合物可用于诊断和治疗各种神经性疾病和失调。

本发明涉及CNTF的克隆、序列分析和表达，并首次提供了利用人体CNTF编码核酸序列生产人CNTF的方法。而且，本发明的CNTF核酸序列可用于识别各种物种和组织中的编码CNTF或CNTF-同源分子的核酸序列。在本发明另一种特定的实施方案中，已鉴定了具有CNTF活性的肽片段，并生产了中和CNTF活性的CNTF肽的抗体。

缩写词BRCN  溴化氢CG  睫状神经节CNTF  睫状神经营养性因子DRG  后根神经节E8、E9、etc  8天或9天胚胎，等GFAP  胶质原纤维酸性蛋白质NGF  神经生长因子TU  营养单位，每毫升一个营养单位等于每毫升培养介质中维持半数最大神经元生存所需的CNTF活性的量。

图1.（a）表示CDNA克隆，（b）表示鼠CNTF的核苷酸顺序及由它推导出的氨基酸顺序，（c）表示用作引物的寡聚核苷酸及该引物在（b）中所处的位置。在（b）中划线的氨基酸对应于CNTF的胰蛋白酶解片段（T1-T8）以及BRCN（溴化氰）解片段（CB1-4）的多肽序列。以核苷酸水平表示，对应于编码区的顺序用黑体字印刷，并在多聚腺苷酸化信号顺序下划线。（d）表示由纯化的CNTF得到的CNTF的氨基酸组成及由CNTF CDNA推导出的结果。

图2.（a）表示用DEAE离子交换层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶制备电泳纯化后，CNTF的二维凝胶电泳分析;（b）表示先用DEAE离子交换层析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶制备电泳纯化，再用Bakerbond Gold C4Widepore柱层析进一步纯化后，CNTF的二维凝胶电泳分析。

图3.表示在有转染的Hela细胞上清液和提取物存在时，培养的E8鸡睫状神经元的存活状况：8天的胚胎睫状神经元在Hela细胞的上清液（a）中及提取物（b）中生长，该Hela-细胞用下列质粒转染，即无插入（△）的质粒及在正意义定向（O）和反意义（■）定向中含有鼠CNTFCDNA克隆E的质粒。

图4中（a）表示成年鼠组织中CNTF-mRNA的Northern印迹分析（所用的缩写为：BR，脑;LIV，肝脏;KID，肾脏;MC，肌肉;SK，皮肤;SCI，坐骨神经;SP，脊髓）;（b）表示从新生幼鼠（PO），生长4天的幼鼠（P4）以及生长13天幼鼠的坐骨神经中得到的RNA。

图5表示在三种不同的大肠杆菌（E.coli）菌株中重组的rCNTF。M道表示标准蛋白质标记物;图中注明了三种蛋白质的分子量。1-3道分别表示从大肠杆菌W3110qF-、HB101和MC1061中提取的总蛋白质，这三个菌中都含有pCP-rCNTF-C-1，按上述方法制备蛋白质提取物，并在8-25%聚丙烯酰胺梯度凝胶中进行分析（见Panayotatos，N.和Fontaine，A.，1988，J.Boil.Chem.260：3173-3177）。

图6（a）表示用PCR方法产生的人CNTF探针与经ECOR1消化的人和鼠基因组DNA的Southern印迹杂交。（b）表示放射性活性鼠CNTF探针与经ECOR1消化的人和鼠基因组DNA的Southern印迹杂交。

图7表示用PCR方法扩增的人基因组DNA中得到的部分CNTF编码序列与已知鼠CNTF编码顺序相比较。用（＊）表示推断出的人和鼠的氨基酸顺序之间的差别，用不等号（≠）表示二者的DNA序列的差别。

图8表示人的CNTF序列。（a）为人的CNTF的核酸序列和氨基酸序列;（b）是人和鼠CNTF的氨基酸序列的比较;（c）为人和鼠CNTF的核苷酸序列的比较;（d）为人基因组CNTF序列的整个内切酶图谱。

图9表明，根据CNTF（C-端区）顺序合成的肽（14个氨基酸-ISALESHYGAKDKQ）的抗体在免疫沉淀反应中能抑制纯化的鼠CNTF的生物活性。

图10说明一个含28个氨基酸的合成CNTF肽片段的神经营养活性。

图11.表示间接免疫荧光分析结果，该分析中用抗具有生物活性的28个氨基酸CNTF肽的兔抗体与固着的鼠坐骨神经结合，然后再用若丹明（rhodamine）标记的抗兔IgG反应。大箭头表示周围轴突的染色情况;小箭头表示标记的中轴结构。

图12表示在含有聚鸟氨酸底物的培养基中生长72小时得到的E14鼠中脊髓细胞的分离培养物的相衬光显微照片，培养是在下列情况下：A.对照培养基B.培养基中补充有鼠神经生长因子（NGF）;或C.培养基中补充有大肠杆菌产生的重组鼠睫状神经营养性因子（CNTF）。

注意观测存在CNTF时，外延神经元的存活以及轴突的过度生长，标尺＝100μm。

图13表示单侧面神经受损的新生鼠的面神经细胞核中运动神经元和胶质细胞发生的变化。含有明胶海绵的BSA产生的单侧神经损伤植入，（A）位于损伤面的面部细胞核的尼氏染色的运动神经元;（B）非损伤面的面部细胞核中的尼氏染色运动神经元（对照）;（C）用抗-GFAP抗体染色损伤面的面部细胞核;以及（D）用抗-GFAP抗体染色的非损伤面的面部细胞核。

图14表示单侧面神经损伤的新生鼠面神经细胞核中运动神经元及胶质细胞的变化。具有含明胶海绵的CNTF的单侧神经损伤植入，（A）受损面面部细胞核中尼氏染色的运动神经元;（B）未损伤面的面部细胞核中尼氏染色的运动神经元（对照）;（C）用抗-GFAP抗体着色的受损面的面部细胞核;（D）用抗-GFAP抗体着色的未受损面的面部细胞核。

图15为计算机作图，它表示鼠（a）和人（b）CNTF的亲水性、表面特性、柔曲性、抗原性、两性螺旋、两性折叠以及它们的二级结构。

图16表示表达质粒的主要特性，图中注明了启动子（LacUV5）核糖体结合位点（rbs  1）、CNTF、amp  R和Kan  R基因以及Cop  1（O）和Kan  1（O）突变，如正文所述，在构建质粒的过程中用AseⅠ、EagⅠ、NdeⅠ和Pvu1限制性位点。

图17表示人CNTF的序列以及克隆中所用的PCR引物。蛋白质编码区域的DNA序列以黑体字印刷，并在它的上方注明了推导出的氨基酸顺序。实心箭头（ ）表示外显子1的最后一个核苷酸和外显子2的第一个核苷酸;箭头上方的括号表示5′和3′端的内含子的顺序。箭头表示选用的寡聚脱氧核糖核苷酸引物的定位以及它的5′到3′的极性。星号表示错配处。寡聚脱氧核苷酸引物序列（5′到3′）如下：CNTF. 23:GCTTTCACAGAGCATTCACCG；CNTF. 21:AGGCCCTGATGCTTCACATAGGATTCCGTAAGAG；CNTF. 22:CTCTTACGGAATCCTATGTGAAGCATCAGGGCCT；CNTF. 24:GAGACGGCCGTAACTGTTACATTTTCTTGTTGTTAG；CNTF. 10:CCAAGCTTCTAGAATTCGCAGGCATCCCATCAGCCT；CNTF. 11:GACTCGAGTCGACATCGGAGATGACTGAGGCAGA。

图18为用不同的载体表达人和鼠CNTF的比较，图中注明的各种菌株的总蛋白质在8-25%的聚丙烯酰胺凝胶上进行分析并用考马斯亮兰染色。（M）表示标记物的分子量（×100），图中还注明了人CNTF、鼠CNTF、ampR以及Kan  R蛋白质的带的位置。

图19表示纯化的CNTF。（A）：鼠CNTF;（B）人CNTF。溶胞物：细胞总蛋白质;8M  GuHCl：已透析的提取物;0.5，5，10和50：经DEAE-Sephacel或Fast-S处理后加到每道上的蛋白质的微克数。

图20表示睫状神经元对天然的和重组的鼠CNTF的剂量反应。按12.7部分所述方法测得在鼠CNTF量增加时，离体的E8鸡睫状神经元的存活情况。

图21为E10鸡胚后根神经节（DRG）的外植体培养物（A，B）和离体的E8鸡胚睫状神经节（CG）的富含神经元的培养物（C，D，E）的显微照相。A、B是对照（A）和CNTF处理的（B;5ng/ml）DRG外植体在培养48小时后的暗视野显微照相。C，D，E是对照（C）、CNTF处理过的（D，100pg/ml;E，5ng/ml）睫状神经节神经元的离体培养物的相衬显微照相，标尺＝400μm（A，B）和50μm（C，D，E）。

图22为CNTF蛋白质的线状序列。图中显示了人（hu）、鼠（rt）以及兔（rb）的CNTF的氨基酸顺序，在右边表示编码这些分子的表达载体。在组（A）中，点（·）表示与野生型的人CNTF顺序相同的残基。在组（B）中，点（·）表示与相同物种的野生型顺序相同的残基。与野生型不同的残基以大写字母表示，融合成为外源肽的部分的额外残基用小写的斜体字表示。

图23表示培养六天以后的腹脊髓细胞的相衬显微照相。以密度为0.5×106个细胞/35mm培养皿培养细胞，并保持在F12MEMHS5FCS5·20×中。

图24表示在腹脊髓神经元培养物中神经纤丝（NF）的水平。在平板培养的当天，用CNTF（10ng/ml）或NGF（50ng/ml）处理培养物，然后在第7天分析NF的水平，用NF-抗体（RT97）检测NF蛋白质，用OPD作底物观测反应产物，并在490nm，n＝3测定OD（mean±SEM）的值。

图25表示CNTF对含Ach  E神经元存活的作用，使腹脊髓神经元在培养物中生长7天，然后处理、分析Ach  E组织化学性。在32×镜下对染色的细胞计数，表示为每35mm培养皿中的总数，n＝3。

图26中A.表示在腹脊髓培养物中生长因子对乙酰胆碱转移酶（CAT）活性的影响。在培养物平板培养的当天，用FGF（50ng/ml）、CNTF（10ng/ml）、NGF（50ng/ml）或PBS/BSA（0.5mg/ml）处理。然后在第七天进行收集并测试CAT水平。CAT用CPM/35mm培养皿（平均SEM）表示，n＝3。B.为CNTF剂量增加时对CAT活性的影响，在平板培养的当天，用不同剂量的CNTF（ng/ml）处理腹角质细胞。在第7天，收集该培养物并测定CAT活性（以pmole/小时/35mm培养皿表示，平均值±SEM），各剂量n＝3。

图27表示后期加入CNTF对CAT活性的影响。分别在第0，2或6天将CNTF10ng/ml加入培养物中，并分别于第7，9和13天收获细胞以测定CAT活性。CAT用CPM/μg蛋白质/35mm培养皿（平均±SEM）表示，n＝3。

图28表示CNTF（10ng/ml）对减少了神经胶质的腹脊髓培养物中CAT活性的影响。在第2天将AraC（0.5μM）加入培养物中，在第7天收获细胞并分析CAT活性（以CPM/35mm培养皿表示，平均值±SEM），n＝3。

图29表示CNTF（10ng/ml）和NGF（50ng/ml）对甲泛影酰胺（metrizamide）梯度纯化的腹脊髓神经元的CAT活性的影响。CAT（平均±SEM）以pmole/小时/16mm、孔表示，n＝3。

图30表示在CNTF处理过的海马状突起培养物中吸收的高亲和GABA随时间而增加的过程。海马状突起神经元在培养基中生长，在存在或缺少CNTF（10mg/ml）的情况下保持不同时间期间，然后测定吸收的GABA（A），并测定神经丝蛋白质的含量（B）。结果表示与未经处理的对照培养物相比，经处理的培养物中活性百分数。

图31为海马神经元对CNTF的剂量响应曲线。在含有或不含有不同浓度CNTF（0.001～10ng/ml）的情况下，培养海马状突起神经元8天，在培养期末，测定高亲和GABA的吸收（A），神经丝蛋白质含量（B），以及GAD酶活性（C）。

图32为CNTF对NSE-，GAD-和Calbindin-阳性细胞数目的影响。在含有或不含有CNTF（10ng/ml）的培养基中培养海马状突起神经元8天，对NSE、GAD和Calbindin进行免疫染色如在A和B中所示。

图33CNTF对GABA-、AchE-免疫阳性神经元数目的剂量依赖性响应。在含有不同浓度的CNTF（0.001～10ng/ml）培养基中生长海马状突起神经元，对GABA和AchE进行免疫染色，如A和B所示。

图34表示延缓加入CNTF对CNTF诱导的高亲和GABA吸收量增加的影响。A.将海马状突起细胞放入培养物中后延迟0、1、2、3或4天加入CNTF（10ng/ml）。在培养的第8天检测所吸收的高亲和性GABA。B.延后0或3天，将CNTF（10ng/ml）加入到海马状突起细胞培养物中，在培养的第11天检测所吸收的高亲和性GABA。

图35为延后加入CNTF对CNTF诱导的神经丝蛋白质水平增加的影响。A.在将海马状突起细胞放入培养物中后的不同时间（0、1、2或3天）内加入CNTF（10ng/ml），在第8天检测神经丝蛋白质水平。B.延后0或3天，将CNTF（10ng/ml）加到海马细胞培养物中，在第11天测定神经丝蛋白质水平。

图36表示在富含神经元的培养物中CNTF的影响。使海马状突起培养物在含有或不含有不同浓度的CNTF（0.001-10ng/ml）中生长8天，在海马状突起培养物中加入阿拉伯糖胞苷（0.3μM）24小时以减少神经胶质量。在第8天测定培养物所吸收的高亲和性Gaba。

图37表示CNTF诱导的GABA吸收增加以及神经丝蛋白质水平的增加与密度的依赖关系。海马状细胞以71400细胞/cm2浓度平板培养。该细胞在含有或不含有CNTF（10ng/ml）的培养基中生长8天后测定所吸收的GABA（A）以及神经丝蛋白质水平（B）。

图38表示CNTF对海马状突起培养物中谷氨酸诱导的毒性的保护作用。海马状突起神经元在含有或不含CNTF（10ng/ml）的培养基中生长7天，加入各种浓度（100-1000μM）的谷氨酸15分钟后，将该细胞在无谷氨酸和CNTF的培养基中生长20小时。基于活细胞可使MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物）转变为紫色产物的MTT分析法，检测培养期末存活的细胞。加入的MTT染料的最终浓度为0.5mg/ml，活细胞所摄取的染料可通过加入在异丙醇中的0.08N  HCl以后5小时，使其溶解，然后测定O、D（570-650nm）。

图39表示鼠CNTF浓度增加对鼠海马状星形胶质细胞有丝分裂的影响。将星形胶质细胞在指定浓度的CNTF中培养24小时，在培养的最后2小时用3H-胸腺嘧啶（1mc/孔/150μl）标记。

图40表示CNTF的双抗体夹心试验。

用50μl/孔的4μg/ml的山羊抗鼠IgG 2b（GaM-IgG2b，Caltag）覆盖ELISA（酶联免疫吸附试验）标板（Falcon 3915 Probind）。将酶标板在4℃保温过夜，冲洗，并用50mM碳酸氢盐缓冲液（PH为9.6），在室温下阻止2小时，冲洗后加入50μl/孔的捕获抗体RP3-12（杂交瘤培养物上清液的1∶5稀释液），并在室温下保温1小时，冲洗后再加入系列稀释（10ng/ml-7pg/ml）的标准人CNTF或加入一系列测试样品的稀释液，在室温下保持1小时，接着冲洗，加入50μl/孔的显示抗体RP12-2（培养物上清液的1∶5稀释液），在室温下保温1小时，冲洗后每孔加入50μl的碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG1（GaMIgG1，Galtag）试剂的1∶1000稀释液。将酶标板在室温下保温1小时，接着冲洗，用pNPP显色，并在ELISA读数计（Molecular Devices Thermo Max）中记录405nM处的值。

图41表示双抗体夹心分析人CNTF的结果。在图40所述反应中，用单克隆抗体RP3-12和RP12-2分析重组人CNTF的增加量。

图42用若丹明异硫氰酸酯反标记鸡胚脊髓运动神经元。培养5小时后的细胞用4%的甲醛固定。（A）为相衬照片;（B）为同一视野的荧光照片，标尺＝25μm。注意，右方较小的细胞没有标记。

图43为在存在（闭环）或不存在（开环）重组鼠CNTF（5ng/ml）时，鸡胚脊髓运动神经元存活的时间曲线。

图44为在不含（A）或含有（B）1ng/ml重组鼠CNTF的培养基中，生长6天的鸡胚脊髓运动神经元。标尺＝100μm。

图45中（A）为培养基中重组鼠CNTF处理的鸡胚脊髓运动神经元的存活活性以及对CNTF（B）和FGFS（C）的浓度效应曲线。存活活性在培养3天后测定。在B中，为避免由于肝素过多而引起细胞分离，只在开始24小时加入肝素（1μg/ml），而酸性FGF在生长的3天中存在。

本发明涉及编码睫状神经营养性因子（CNTF）的核酸顺序以及CNTF蛋白质、多肽片段及其产生的大量衍生物。此外，本发明还涉及药物组合物和睫状神经营养性因子在治疗和诊断中的应用。

为便于清楚叙述起见（但不是想限制本发明），将本发明分成如下八部分加以说明：（ⅰ）CNTF的纯化（ⅱ）CNTF的生物检定（ⅲ）CNTF的序列分析（ⅳ）编码CNTF的DNA的克隆（ⅴ）CNTF基因的表达（ⅵ）CNTF基因和蛋白质

（ⅶ）抗CNTF抗体的产生（ⅷ）本发明的应用（ⅰ）睫状神经营养性因子的纯化用现有技术中公知的方法可以任何合适的源包括（但不限于）小鸡胚眼、坐骨神经和心肌中纯化CNTF。

例如（但不是为了加以限制），按Barbin等人（1984，J.Neurochem.43：1468-1478，已全文列入本文参考文献）所述方法，从鸡胚眼中制备CNTF。简单地说，按Manthorpe等人（1980，J.Neurochem.34：69-75）所述方法，从15天鸡胚眼中解剖得到脉络膜，虹膜睫状体和粘附色素上皮（统称为CIPE），并将它收集在平衡用的盐溶液中。最好，从大约300只胚眼中得到提取液，用聚四氟乙烯玻璃匀浆器，使该提取液匀混在约76ml的冷水中，在约4℃，在105×g离心1小时。然后收集上清液，配制在PH为7的NaH2PO4中，浓度为0.01M，再加到离子交换柱（即用磷酸盐缓冲液中平衡过的Whatman DE52纤维素）中。分别用含有20ml浓度为0.07、0.25和0.5M NaCl的磷酸盐缓冲液，以大约30ml/小时的流速洗该柱。再将0.25M的NaCl洗出液通过超滤〔例如，用50ml Amicon细胞和PM10（10000dalton cutoff）超滤膜〕浓缩到约2ml体积。收集剩余物，与二份0.5ml含0.25M NaCl缓冲液的细胞洗出液混合，再浓缩到0.4ml（例如：用3ml Amicon cell和PM10滤膜）。使已纯化的提取液在蔗糖梯度溶液中分层（例如，200μl提取液加在4.6ml5-20%线性蔗糖梯度溶液中），然后离心（例如，用SW65转头，以65000rpm的转速，在4℃离心15小时）。在5个管中收集4.8ml的梯度溶液;管1为2ml，管2为0.3ml，管3为1.2ml，管4为0.3ml，管5为1.0ml。将管3的溶液配制在Triton  X-100中，得到浓度为0.1%，然后用上述的超滤方法浓缩到0.2ml。

用15%解析平板和4.5%堆积平板SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分析凝胶电泳，分析已纯化的CNTF。电泳已纯化的CNTF或分子量标准物，而将凝胶切出，并进行如下处理：在将凝胶浸泡在0.25M  KCl的过程中，通过沉淀与蛋白质结合的SDS观测没有固着的多肽，记录标准分子量和CNTF带的位置。然后使带固定，用考马斯亮兰染色。将其它带切成薄片，用Triton  X-100保温洗提，然后测定洗出物的CNTF活性。

用纯化鸡眼CNTF（上文所述）的相同方法（DEAE离子交换层析，蔗糖密度梯度离心和制备SDS-PAGE）分离坐骨神经提取物，所不同的是，最好对上述方法作如下三点变更：（1）将神经提取物装入DEAE离子交换柱以后，直接用0.15M  NaCl分批洗脱交换柱（而不是用0.07M  NaCl冲洗和用0.25M  NaCl洗脱）;（ⅱ）从制备SDS凝胶的24kd区（而不是20kd区）切出薄切片;（ⅲ）通过将各凝胶薄片混匀在0.1%  Triton  X-100去污剂中，再在4℃保温过夜（而不是通过尿素凝胶电泳洗提过夜）而洗提CNTF活性。然后在4℃，用100μl  Extractagel（Pierce  chemicals  Rockford  IL）串珠的悬浮液与上清液一起保温2小时以除去Triton  X-100去污剂，然后按现有技术中任何公知方法测定蛋白质的浓度。

优选的是，将上述方法再作如下修改：从制备的SDS-PAGE凝胶上洗脱出以后，用FPLC或HPLC柱（在惰性柱内含有生物适合流动性体系）通过反相色谱分析，将CNTF纯化到同质和移走SDS;在一个最佳实施方案中，FPLC柱是一个Bakerbond Gold C4Widepore柱（填有金的7.75mm×10cm柱，能在含水流动相中以1.0ml/分流速，在反压为200-250磅/英寸2的条件下操作）用0-60%乙腈梯度溶液洗脱。可观测到在50-55%乙腈中CNTF以单峰洗出（见下文第6部分）。用高速真空方法（用惰性气体如氩气将空气彻底除去）浓缩含有CNTF的单峰洗出液。该惰性气体对防止由于一种或多种蛋氨酸残余物氧化而引起CNTF活性损失是极为重要的。当CNTF不再在溶液中时，它显然最不容易氧化。

而且，按Watters和Hendry所述方法（1987，J.Neurochem.49：705-713，已全文列入本文参考文献中）用肝素亲和层析法可从心组织中制备睫状神经元存活促进活性物。

（ⅱ）睫状神经营养性因子的生物检测用现有技术中公知的CNTF敏感的体内或体外试验体系可测定睫状神经营养性因子的活性。例如（但不限于）已研制的体外检测体系，通过测定单层培养物中E8鸡胚睫状神经节（CG）神经元生存24小时的数目，从而测定CNTF活性。

例如，从E8鸡胚中收集睫状神经节，使其解离（每个神经节约产生20000个细胞），然后按Varon等人所述方法（1979，Brain  Res.173：29-45）用含20%马血清的HEBM介质稀释。再将含1000个神经元（2000个细胞的）大约50μl的细胞悬浮液接种在微滴板培养皿中，加入预定的CNTF活性物。然后将培养平板在5%CO2，37℃时保温24小时，加入200μl溶于HEBM介质中的2%戊二醛以使该培养物固定，再在相衬显微镜下用肉眼直接计数以确定存活的神经元数目。

（ⅲ）睫状神经营养性因子蛋白质的序列CNTF蛋白质可直接进行序列分析，或先用蛋白酶或现有技术中公知的其它化合物，包括（但不限于）金黄色葡萄球菌V8，胰蛋白酶和溴化氰使其分裂。按Hewick等人（1981，J.Biol.Chem.256：7990-7997和Hunkapillar等人（1983，Methods Enzy mol.91：399-417）的方法，在气相微序列分析仪上通过自动埃德曼降解对多肽进行序列分析。再按Lottspeich（1985，Chromatography 326：321-327）方法进行乙内酰苯硫脲氨基酸的检测。测定重叠片段的氨基酸顺序，并用以推导出更长的连续延伸顺序。

（ⅳ）编码睫状神经营养性因子的DNA的克隆从鼠坐骨神经中纯化出能进行微序列分析的合适量的CNTF蛋白质以能进行CNTF  CDNA的克隆。用来进行这种克隆的经典方法是根据已知氨基酸顺序的片段，生产一个互补的寡聚核苷酸探针，用该探针筛选由假定能合成编码CNTF的mRNA的组织产生的cDNA文库，但是由于mRNA量相对比较低，这种方法存在问题，因为用微序列分析（图1）测定CNTF多肽的实际顺序（图1）需要在低核苷酸探针中，在各种情况下均有不良的高度简并性，以便为特殊的氨基酸残基提供所有可能选择的密码子。本发明通过cDNA的合成，为基因的克隆提供一对低核苷酸引物的衍生物，基于CNTF多肽的微序列分析，用这些引物去扩增CNTF编码顺序的片段，用第三个简并低核苷酸确定扩增片段的同一性，测定该片段的精确核苷酸顺序，合成并使用精确低核苷酸引物扩增剩余的CNTF基因。在本发明方法中，最好的扩增方法是利用聚合酶连锁反应（PCR）（Saiki  et  al.，1985，Science  230：1350-1354）扩增组织核酸序列。优选方法的详细说明如下：首先将由纯化CNTF蛋白质得到的氨基酸序列用于推断在PCR中使用的低核苷酸引物。由于遗传密码的简并性，数个三联体可特异性地对应相同的氨基酸，合成数个低核苷酸用于给定的氨基酸顺序，以便提供多种可能的核苷酸序列联合体;所得到的低核苷酸被称为简并引物。

PCR需要有意义链及反意义链引物。因此，可用对应于CNTF氨基酸序列的一部分的简并低核苷酸引物作一条DNA链（如有意义链）的引物。用对应CNTF氨基酸顺序的第二部分的另一个简并低核苷酸引物作第二条DNA链（如反意义链）的引物。

最好根据已知氨基酸顺序的邻近延伸方法来选择这些引物。结果在PCR中使用这些引物而得到的相关DNA反应产物为预定大小〔即，产物的长度、碱基对数目等于二个引物加三倍对应于二个引物的片段所束缚的蛋白质片段的氨基酸残基数目的总长度〕。然后将这些引物用于具有假定含有CNTF编码序列的核苷酸模板的PCR中。CNTF编码序列是如，基因组DNA或最好从推断能合成CNTF的组织或细胞中收集到的mRNA中制备的cDNA。然后通过电泳分析DNA反应产物以确定DNA反应产物的分子大小是否与预定值相同。用已标记的探针通过杂交进一步分析该DNA反应产物，该标记探针是由相应于PCR所用的二个引物部分之间的氨基酸顺序的简并低核苷酸制备的。将预定大小DNA反应产物的顺序分析结果与确定的氨基酸顺序相比以证实扩增的核酸顺序事实上是编码CNTF肽片段。虽然可用现有技术中公知的任何核酸顺序分析方法，但是最好用二脱氧核苷酸链终止方法（Sanger等人，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3918-3921）。用凝胶纯化的，最好用克隆的DNA反应产物进行顺序分析，可将用于选择限制性核酸内切酶的含已知靶顺序的“尾”整合到用于PCR的每个低核苷酸的5′端，以利于DNA反应产物的克隆。

然后用DNA反应产物的顺序设计对应于确切的编码CNTF的顺序的低核苷酸引物。再将该引物与PCR中的第二个引物一起用来扩增编码CNTF的顺序量使其超出最初测定的精确顺序的片段。例如（但不限于），用“cDNA端的快速扩增”（RACE）（M.A.Frohman，M.K.Dush，G.R.Martin，1988，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：8998-9002）方法将已知确切的顺序区域内多个片段分别克隆到cDNA分子的5′和3′端。因此，为得到扩增到3′端的克隆，使有意义链引物对应于确切的CNTF核苷酸顺序，而反义链引物同源于所要分析的序列片段下游存在的已知顺序片段，例如，mRNA的3′多聚腺苷尾，用于cDNA的逆转录中;在此情况下，该引物包括低聚-dT延伸区。必须用类似的方法重新得到所要分析的序列;例如，反义链引物对应于确切的CNTF核苷酸顺序，有义链引物同源于进行序列分析片段的上游区域，例如，用末端脱氧核苷酸转移酶在cDNA的5′端加上5′多聚鸟苷尾部（在此情况下，该引物包括低聚-dC延伸段）。

然后对扩增的片段进行序列分析，或最好将该片段克隆，然后序列分析。在测定cDNA5′和3′端的确切低聚核苷酸以后，该确定的核苷酸用于PCR反应中以得到所插入的核酸的顺序，然后克隆PCR反应产物。

用现有技术中公知的方法可克隆DNA反应产物。可用现有技术中公知的许多载体寄主体系。适用的载体包括（但不限于）Cosmid、质粒或经修饰的病毒，但该载体体系与所用寄主细胞必须是亲和的。这些载体包括（但不限于）细菌噬菌体如入衍生物，或质粒如，PBR322，PUC，或BLUESCRIPT（层聚基因）质粒衍生物，可通过转化、转染、感染、电击穿等将重组分子引入寄主细胞中。

将CNTF基因插入克隆载体中，该载体可用于转化、转染、或感染合适的寄主细胞，从而产生许多该基因顺序的拷贝。这可通过将DNA片段连接到具有互补粘性末端的克隆载体而实现。但是，若克隆载体中不存在DNA片段上含有的互补限制性位点，则可用酶修饰该DNA分子的末端。结果证明，在用于聚合酶链反应的低聚核苷酸引物中掺入限制性核酸内切酶切割位点有利于插入载体。另一方面，在DNA末端连接核苷酸顺序（连接物），可得到所要的任何位点。这些接入的连接物含有特定化学合成的编码限制性核酸内切酶识别顺序的低聚核苷酸。在另一种方法中，用均聚嵌入部分修饰已切开的载体和CNTF基因。

在具体实施方案中，用掺入离体的CNTF基因、cDNA或合成的DNA顺序的重组DNA分子转化寄主细胞能产生基因的多个拷贝。因此，通过生长转化体，从转化体中分离重组DNA分子，若必要时，可从分离的重组DNA中重新得到插入的基因，从而可得到大量的基因。

按本发明的优选实施方案，一旦产生编码CNTF的cDNA衍生的克隆，即可用现有技术中公知的一般方法分离编码CNTF的基因组克隆。例如，从CNTF克隆中产生标记的核酸探针，并用Benton和Davis所述的（1977，Science  196：180）关于细菌噬菌体文库的方法以及Grunstein和Hogness（1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3961-3965）关于质粒文库的方法通过核酸杂交，用该探针筛选基因组DNA库。然后按现有技术中众所周知的方法用限制性片段图谱和顺序分析技术对重新得到的克隆进行分析。

此外，用本发明得到的序列可从cDNA库中鉴定其它的cDNA克隆。

（ⅴ）睫状神经营养性因子基因的表达编码CNTF蛋白质的核苷酸顺序或其一部分可插入合适的表达载体中，该载体含有该插入的编码蛋白质的顺序的转录和转译所用的必要要素。必要的转录和转译信号也能由天然的CNTF基因和/或它的侧面区域供给。许多寄主-载体系统均可用来表达该蛋白质编码序列。这些体系包括（但不限于）用病毒（如牛痘病毒，腺病毒等）感染的哺乳动物细胞体系;用病毒（如杆状病毒）感染的昆虫细胞体系;微生物如，含酵母载体的酵母，或用噬菌体DNA、质粒DNA或Cosmid  DNA转化的细菌。这些载体的表达要素其强度和特征会发生变化，这取决于所用的寄主-载体体系，可用许多合适转录和转译要素之任一种。

上述将DNA片段插入载体的方法可用于构建含嵌合基因的表达载体，该嵌合基因由合适的转录/转译控制信号和蛋白质编码顺序组成。这些方法包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组（遗传重组）。编码CNTF蛋白质或肽片段的核酸顺序的表达可通过第二个核酸顺序加以调节以使CNTF蛋白质或肽在用重组DNA分子转化的寄主中表达。例如，用现有技术中已知的启动子/加强子控制CNTF的表达。能用于控制CNTF表达的启动子包括（但不限于）SV40早期启动子区域（Bernoist and Chambon，1981，Nature 290：304-310），劳氏肉瘤病毒3′长末端重复区域所含的启动子（Yamamoto，et al.，1980，Cell 22：787-797），疱疹胸苷激酶启动子（wagner et.al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：144-1445），金属硫堇基因的调节顺序（Brinster et al.，1982，Nature 296：39-42）;原核表达载体如，B-乳胺酶（Lactamase）启动子（villa-Kamaroff，et.al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731），或tac启动子（DeBoer，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25），还可参见“得自重组细菌的有用蛋白质”（in Scientific American，1980，242：74-94）;含有咽脂碱（nopaline）合成酶启动子区的植物表达载体（Herrera-Estrella et al.，Nature 303：209-213）或花椰菜嵌合病毒35SRNA启动子（Gardner，et al.，1981，Nucl.Acids.Res.9：2871），以及用于光合酶核酮糖二磷酸盐羧基酶的启动子（Herrera-Estrella  et  al.，1984，Nature  310：115-120）;来自酵母或其它真菌的启动子元素如Gal  4启动子，ADC（乙醇脱氢酶）启动子，PGK（磷酸甘油激酶）启动子，碱性磷酸酶启动子和下列动物转录控制区，该控制区具有组织特性，已用于转基因的动物：弹性蛋白酶Ⅰ基因控制区，它在胰腺的腺泡细胞中有活性（Swift  et  al.，1984，Cell  38：639-646;ornitz  et  al.，1986，Cold  spring  Harbor  Symp.Quant.Biol.50：399-409;MacDonald，1987，Hepatology  7：425-515）;胰岛素基因控制区，它在胰腺的β细胞中有活性（Hanahan，1985，Nature  315：115-122），免疫球蛋白基因控制区，它在淋巴样细胞中有活性（Grosschedl  et  al.，1984，Cell  38：647-658;Adames  et  al.，1985，Nature  318：533-538;Alexander  et  al.，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444），鼠乳房肿瘤病毒控制区，它在睾丸、胸、淋巴和肥大细胞中有活性（Leder  et  al.，1986，Cell  45：485-495），白蛋白基因控制区，它在肝中有活性（Pinkert  et  al.，1987，Genes  and  Devel.1：268-276），α-胎蛋白基因控制区，它在肝中有活性（Krumlauf  et  al.，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648;Hammer  et  al.，1987，Science  235：53-58）;α1-抗胰蛋白酶基因控制区，它在肝中有活性（Kelsey  et  al.，1987，Genes  and  Devel.1：161-171），β-球蛋白基因控制区，它在髓样细胞中有活性（Mogram  et  al.，1985，Nature  315：338-340;Kollias  et  al.，1986，Cell  46：89-94）;髓磷脂碱性蛋白质基因控制区，它在脑中的少突神经胶质细胞中有活性（Readhead  et  al.，1987，Cell  48：703-712），肌球蛋白轻链2-基因控制区，它在骨骼肌中有活性（Sani，1985，Nature  314：283-286），以及促性腺释放激素基因控制区，它在丘脑下部中有活性（Mason  et  al.，1986，Science  234：1372-1378）。

用下列三种一般的方法可鉴定含CNTF基因插入物的表达载体：（a）DNA-DNA杂交，（b）存在或缺少“标记”基因功能，（c）插入顺序的表达。在第一种方法中，用含有与插入的CNTF基因同源顺序的探针，通过DNA-DNA杂交检测在表达载体中存在的外源基因插入。在第二种方法中，根据某种“标记”基因功能（例如，胸苷激酶活性，抗菌素抗性，转化表型，在杆状病毒中形成吸留体等）的存在或缺少，可鉴定和筛选重组载体/寄主体系，该功能是由于在载体中插入外源基因而产生的。例如，若在载体的标记基因顺序内插入CNTF基因，通过标记基因功能的缺少，可鉴定含CNTF插入物的重组体。在第三种方法中，通过分析重组体表达的外源基因产物可鉴定重组表达载体。这类分析是基于如上文（ⅱ部分）所述的在生物检定体系中CNTF基因产物的物理或功能性质。

在鉴定和分离特定的重组DNA分子以后，可用现有技术中公知的一些方法使其繁殖。一旦确定了合适的寄主体系和生长条件，就能大量繁殖和制备重组表达载体。如上所述，所用的表达载体包括（但不限于）下列载体或其衍生物：人或动物病毒如牛痘病毒或腺病毒;昆虫病毒如杆状病毒;酵母载体;噬菌体载体（如，lambda），质粒和粘粒（Cosmid）DNA载体，仅列举这几种。

此外，选择寄主细胞菌株，以调节插入顺序的表达，或修饰和加工处理基因产物以达到所要的特定形式。在存在某种诱导物的情况下可提高某些启动子的表达;这样可控制遗传工程CNTF蛋白质的表达。而且，对于转译和转译后蛋白质的处理以及修饰（如糖基化作用，切割）不同寄主细胞具有其特征和特异机制。选出合适的细胞系或寄主体系以确保表达出的外源蛋白质按所要的方式修饰和加工。例如，在细菌体系中表达能用于产生未糖基化的核心蛋白质产物。

在酵母中的表达将产生糖基化产物。在哺乳动物细胞中表达能用于确保异源CNTF蛋白质的“自然”糖基化。而且，不同载体/寄主的表达体系影响加工处理反应，如不同程度的蛋白水解分裂。

在本发明的具体实施方案中，使编码CNTF的DNA克隆到pCMV质粒，扩增，并用DEAE-葡聚糖方法使其用于转化Hela细胞;然后从细胞提取物中收集CNTF活性物（参见下文第6部分的实施例）。

在本发明另一个特定实施方案中，使编码CNTF的DNA整合到合适表达载体中，并用于转化大肠杆菌（E.coli），得到生物活性CNTF（参见下文第7部分的实施例）。

在本发明的特殊实施方案中，在大肠杆菌中CNTF的表达最好用含有下列之一的载体进行：一个lac  UV5启动子，它能用乳糖操纵子阻遏物控制;强核蛋白体结合位点如，噬菌体T7的核蛋白体结合位点;在质粒复制控制区中突变，它可增加复制拷贝数;或限制抗菌素抗性蛋白质表达的突变。在本发明优选的具体实施方案中，用载体pRPN12进行CNTF的表达，结果相对于其它载体来说，CNTF的表达可增加30-50倍（下文第12部分）。在本发明另一个优选实施方案中，表达载体pRPN38可用于在大肠杆菌中生产CNTF。在本发明的另一个优选实施方案中，用载体pRPN40可在大肠杆菌中表达人CNTF。本发明还提供了多种分子，该分子功能与质粒pRPN12、pRPN38、pRPN39和pPRN40相同，这些质粒含有相同的要素（启动子、核旦白体结合位点等），其产生相当水平的CNTF的表达。

表达基因产物的鉴定和纯化在鉴定出表达CNTF基因的重组体以后，分析该基因产物。根据该产物的物理或功能性质来完成这种分析。

在鉴定CNTF蛋白质以后，则可用普通方法包括层析法（例如，离子交换，亲和性，不同大小的柱的层析）、离心，溶解度差异测定，或用于纯化蛋白质的其它一般方法使其分离和纯化。用对已知的CNTF的分析包括（但不限于）鸡胚睫状节神经元试样可估测其功能性质。

值得注意的是，由于存在残余的SDS，从坐骨神经组织中制备CNTF所用的方法（因为它们包括作为最终步骤的制备凝胶电泳）所产生的CNTF不十分活泼。相反，本发明提供的纯化CNTF的方法，所得到的CNTF具有最佳生物活性，它适用于用FPLC柱进行蛋白质顺序分析;本发明还分离出由重组核酸分子或化学合成中产生的重组CNTF，该分离物中无SDS且很活泼。

ⅵ睫状神经营养性因子基因和蛋白质用上述方法和下文实施例部分6和8，测定下列核酸顺序，推导出相应氨基酸顺序。测定鼠CNTF  cDNA顺序，如图1所示。测定人基因组CNTF顺序，如图8所示。按本发明，这些顺序的任一种或其功能等价物都可使用。此外，本发明涉及从猪、羊、牛、猫、鸟、马或狗以及灵长类动物源或存在CNTF活性的任何其它物种中分离的CNTF基因和蛋白质。本发明还涉及至少含有10个核苷酸的CNTF核酸亚顺序，这些亚顺序含有CNTF顺序的杂交部分，该部分已用于如核酸杂交分析，Southern和Northern印迹分析等。本发明还提供了具有图1和8中所示的氨基酸顺序的CNTF蛋白质、片段及其衍生物或它们的功能等价物。本发明还提供了含有抗原决定族或具有功能活性的CNTF蛋白质片段或衍生物。本文所用的功能活性意思是指在已知CNTF功能物如鸡胚睫状神经节分析中具有阳性活性。

例如，图1和8中所示的核酸顺序可通过取代、叠加或缺失而改变从而提供功能等价的分子。由于核苷酸编码顺序的简并，在实施本发明时还可用图1和8中所示的实质上编码相同氨基酸顺序的其它DNA顺序。这些顺序包括（但不限于）含有图1和8中所示的所有或部分CNTF基因的核苷酸序列，这些基因可通过编码顺序内功能等价的氨基酸残基的不同密码子的取代而使其变化，结果产生静止变化。而且，本发明的CNTF蛋白质或片段及其衍生物包括（但不限于）那些含有，作为原始氨基酸顺序的基本上如图1和7所示的所有或部分氨基酸顺序，包括已用功能等价氨基酸残基代替顺序内残基而发生静止变化的已改变的顺序。例如，顺序内的一个或多个氨基酸残基能用极性类似的起功能等价物作用的另一个氨基酸代替，结果发生静止变化。用作替代顺序内氨基酸的替代物选自属于氨基酸类的其他成员。例如，非极性（疏水的）氨基酸，包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。正电荷（碱性的）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。负电荷（酸性的）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。包括在本发明范围内的还有转译过程或转译以后经特异性修饰的CNTF蛋白质或片段或其衍生物，这种修饰如通过糖基化作用、蛋白水解分裂，键合一个抗体分子或其它细胞配体等，下文第8部分举例说明了在大肠杆菌中表达生物活性重组CNTF，从而表明非一糖基化CNTF具有生物活性。

此外，本发明编码重组CNTF的核酸顺序可被设计用于修饰处理或表达CNTF。例如（并不限于），将信号顺序插入CNTF编码顺序上游，以便分泌CNTF，从而有利于收获或生物利用。

另外，可在体外或体内使给定的CNTF突变以产生和/或破坏转译起始和/或终止顺序，或使编码区发生变化，和/或生成新的限制性核酸内切酶位点或使预先存在的位点破坏，以有利于在体外的进一步修饰。可用现有技术中公知的诱变技术，包括（但不限于）体外位点定向诱变（Hutchin  Son，et  al.，1978，J.Biol.Chem.253：6551），TAB衔接物（pharmacia）的使用等。

（ⅲ）抗睫状神经营养性因子抗体的生产按本发明，可用CNTF蛋白质，或其片段或衍生物作免疫原生产抗一CNTF的抗体。用合成蛋白质的重组技术（基于本发明的CNTF核酸顺序）。可提供比较大量的CNTF蛋白质产品，能解决CNTF量有限的问题。

为进一步提高产生抗-CNTF免疫应答的可能性，可分析CNTF的氨基酸顺序以便鉴定与免疫原性增加有关的部分分子。例如，用计算机分析该氨基酸顺序，以鉴定表面抗原决定基，如图15（a）和（b）所示，分别得到鼠和人CNTF的亲水性、表面特性、柔曲性、抗原性、两性螺旋、两性折叠及＝级结构的由计算机产生的曲线图谱。另外，比较由不同物种导引的CNTF氨基酸顺序，鉴定相对的非同源区域;这些非同源区更可能是交叉各种物种的免疫源。

为制备直接抗CNTF的单克隆抗体，可用培养延伸的细胞系生产抗体分子的方法。例如，最初由Kohler  and  Milstein研制的杂交瘤技术（1975，Nature  256：495-497）以及trioma技术，人β-细胞杂交瘤技术（Kozbor  et  al.，1983，Immunology  Today  4：72），以及生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术（Cole  et  al.，1985，in“Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy，”Alan  R.Liss，Inc.pp.77-96）以及类似方法都属于本发明范围内。

治疗中使用的单克隆抗体可以是人单克隆抗体或嵌合的人-鼠（或其它物种）的单克隆抗体。用现有技术中公知的许多方法可生产人单克隆抗体（如Teng  et  al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：7308-7312;Kozbor  et  al.，1983，Immunology  Today  4：72-79;Olsson  et  al.，1982，Meth.Enzymol.92：3-16）。可制备含鼠抗原结合区以及人不变区的嵌合抗体分子（Morrison  et  al.1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851，Takeda  et  al.，1985，Nature  314：452）。

现有技术中公知的各种方法均能用于生产CNTF抗原决定基的多克隆抗体。为生产抗体，可通过注射CNTF蛋白质或片段或其衍生物，免疫接种各种寄主动物，这些寄主动物包括（但不限于）兔、小鼠、大鼠等。可根据寄主种类利用各种佐剂增加免疫应答。该佐剂包括（但不限于）弗氏佐剂（完全和不完全）、矿物胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂，普卢兰尼克多羟基化合物，聚阴离子，多肽，油乳胶，钥孔

属血兰蛋白，二硝基苯酚，可能用的有效的人佐剂如BCG（Bacille Calmette-Guerin）和棒状杆菌。

用公知方法可制备CNTF抗原决定基抗体的分子克隆。重组DNA方法（参见，Maniatis  et  al.，1982，Molecular  Cloning，A  Laboratory  Manual，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  Spring  Harbor，New  York）可用于构建编码单克隆抗体分子或其抗原结合区的核酸顺序。

用公知技术，如免疫吸附或免疫亲和层析，色谱法如HPLC（高效液相色谱）或联合使用上述方法等可纯化抗体分子。

用公知技术能生产含个体遗传型分子的抗体片段。例如，这些片段包括（但不限于）：用胃蛋白酶消化的抗体分子产生的F（ab′）2片段;通过还原F（ab′）2片段的二硫键而产生的Fab′片段;用木瓜蛋白酶和一种还原剂处理该抗体而产生的2Fab和Fab片段。

实施例部分9叙述抗CNTF蛋白质的14个氨基酸肽片段的多克隆抗血清的制备。

实施例部分17叙述本发明提供的4个抗CNTF单克隆抗体，即RP3-12、RP12-1、RP12-2、和RP12-9。

（ⅷ）本发明的应用本发明涉及CNTF的核酸顺序、基本上纯的蛋白质、肽片段或由它们生产的衍生物。CNTF蛋白质、多肽和衍生物、抗CNTF的抗体、以及CNTF核酸探针均可用于诊断和治疗用途中。对大多数情况而言，最好用来自相同种的CNTF基因或基因产物进行诊断或治疗，虽然在本发明特定的实施方案中用了交叉种类的CNTF。

诊断用途本发明所涉及的编码CNTF的核酸和蛋白质、肽片段或由它们产生的衍生物，以及直接抗CNTF蛋白质、多肽或衍生物的抗体均可用于诊断与CNTF表达方式变化有关的神经系统的疾病和错乱。

在本发明的各种实施方案中，CNTF基因和相关的核酸顺序和亚顺序，包括互补顺序可用于诊断杂交分析。CNTF核酸顺序或其至少含有约10个核苷酸次级顺序可用作杂交探针。杂交测定可用于检测、预测、诊断或监控病状、错乱或与CNTF表达变化有关的疾病状态，包括，特别是对CNTF反应的已知神经元造成损伤和变性的情况，例如副交感神经系神经元、胆碱能神经元、脊髓神经元、成神经细胞瘤细胞及肾上腺髓质细胞。这些疾病和病状包括（但不限于）CNS创伤、梗塞、感染、变性神经疾病、恶性肿瘤或手术后病变，包括（但不限于）早老性痴呆病、帕金森氏病、享特顿氏午蹈病和肌萎缩性脊髓侧索硬化。例如可测定病人组织样品中的总RNA以鉴定CNTF  mRNA的存在，其中CNTF  mRNA量的减少表示神经元变性。

在本发明的另一个实施方案中，抗CNTF蛋白质、肽片段或衍生物的抗体能用于诊断神经系统的疾病和错乱，包括，特别是，神经元种群和临床病症及上文所述的那些疾病。本发明的抗CNTF蛋白质的抗体能用于例如，需要进行测定的病人组织切片或活体解剖的CNTF活性的免疫组织化学鉴定。在另一个实施例中，本发明的抗体能用于ELISA方法中以检测和/或测定在组织或液体样品中存在的CNTF量;同样，本发明的抗体能用在Western印迹分析中以检测和/或测定组织或液体样品中存在的CNTF。在下文第11部分叙述了结合和免疫沉淀CNTF的本发明的一种抗体。

在本发明的另一个实施方案中，可用CNTF蛋白质、肽片段或衍生物诊断神经系统的疾病和错乱。在一个具体实施方案（但不是为了加以限制）中，可用标记的CNTF蛋白质或肽片段鉴定表达CNTF受体的组织或细胞，以便鉴定CNTF受体表达的迷乱，从而鉴定与CNTF反应的组织或细胞中可能出现的反常。

本发明还提供了测定液体样品中的CNTF量的免疫测定方法即双抗体夹心分析法，该方法包括使第一个抗CNTF抗体与一个固体载体相结合，然后在允许第一个抗体结合到CNTF的条件下将结合的第一个抗体置于一种含有CNTF的溶液中，然后使与第一个抗体结合的CNTF与第二个抗CNTF的抗体接触，这第二个抗体是对抗不同于第一个抗CNTF抗体的CNTF抗原决定基的，这是在允许CNTF与第二个抗体相结合的条件下进行，然后用现有技术中公知的技术检测第二个抗体与CNTF的结合，包括（但不限于）结合有指示剂的抗免疫球蛋白抗体相结合的第二个抗体，该指示剂如荧光化合物或含放射性同位素的化合物，或一种酶，或在比色测定中能产生信号的物质。在本发明的优选实施方案中，单克隆抗体RP3-12和RP12-2能用于人CNTF的双抗体夹心分析中（见下文第17部分）。该方法可作为灵敏测试方法以测定CNTF的水平，也可用于与CNTF表达异常有关的神经性错乱的诊断。

治疗诊断与本发明有关的编码CNTF的核酸、蛋白质、肽片段、或由它们产生的衍生物，以及抗CNTF蛋白质、多肽或衍生物的抗体均可用于治疗与CNTF表达方式改变有关的或对CNTF或抗CNTF抗体的加入有效的神经系统疾病和错乱。

在本发明的各种实施方案中，可将CNTF蛋白质、肽片段或衍生物施药给神经系统受到损伤的病人，这种损伤包括创伤、外科损伤、局部缺血、感染（例如骨髓灰质炎或A.I.D.S.），代谢性疾病、营养缺乏、恶性肿瘤、有毒试剂或不知道病因的变性疾病。在本发明的各种特定实施方案中，将CNTF施用于已受损伤的脊髓神经元，例如，创伤、梗塞、感染、变性疾病或外科损伤;实施例10说明使用CNTF可促进脊髓神经元的生存。

本发明的CNTF核酸、肽和衍生物可用于治疗运动神经元疾病。实施例11说明CNTF对促进离体的面神经中运动神经元的生存有明显效果。因此，在本发明的特定实施方案中，CNTF或肽或其衍生物可用于治疗面瘫（贝耳氏麻卑）或其它麻卑（包括面神经麻卑）以及其它运动系统的疾病（运动神经元疾病），包括（但不限于）肌萎缩脊髓侧索硬化，进行性脊柱肌萎缩，进行性延髓的麻卑，初期侧索硬化，以及脊柱肌萎缩（韦-霍二氏麻卑型病和Kugelberg-Welander病）和后-脊髓灰质炎综合症。在肌萎缩脊髓侧索硬化（ALS;Lou  Gehrig′s病），脊髓损伤和有关的疾病中，脊髓前侧角中运动神经元变性和死亡是病理生理学过程的主要方面。下文第10和14部分的实验结果表明，在这些疾病的治疗中，可用CNTF延长其存活期并促进脊髓运动神经元中胆碱能的表达。

此外，下文第18部分的实施例数据表明，含有碱性成纤维细胞生长因子或最好是CNTF和碱性成纤维细胞生长因子的harmaceutical组合物可用于促进运动神经元的生存并用于治疗上述运动神经元疾病。

本发明还能用于例如，促进糖尿病性神经病（如单神经病加剧或阳萎）患者的康复。在本发明另一个实施方案中，可用CNTF蛋白质或肽片段或由它们产生的衍生物治疗先天性或神经变性病症，包括（但不限于）早老痴呆病，衰老，外周神经病，帕金森疾病，Huntington′s午蹈病以及运动神经元疾病和错乱;特别是，本发明能用于治疗与胆碱能神经元机能障碍有关的先天或神经变性病症。试验表明，早老痴呆病包括在基前脑中胆碱能神经元的选择性损失，试验表明，约35%的帕金森氏病患者患有早老痴呆型痴呆;按本发明生产的CNTF成为治疗这类综合病症的有效单一试剂。同样，用本发明制得的CNTF可治疗与Down′氏综合症并发的早老痴呆。本发明制得的CNTF还可用于治疗各种痴呆以及先天性学习障碍。

如下文第15和16部分实施例所述，已测得CNTF在海马状突起细胞中具有很高活性，包括GABA吸收增加，提高神经丝蛋白质和GAD酶的表达，GABAergic神经元的存活数增加，海马状突起神经元的存活数增加，海马状突起的星形胶质细胞存活数增加。因此，在本发明的各种实施方案中，CNTF可使这些活性在体外或体内的海马状突起细胞中产生影响，并用于治疗海马状突起的各种神经病，包括（但不限于）早老痴呆病、梗塞和毒性损伤。

本发明的CNTF、CNTF肽、抗体或衍生物还可用于治疗神经系统组织产生的肿瘤，包括成胶质细胞瘤和黑素瘤（由神经胚衍生的黑素细胞产生）。

最好使与CNTF有关的肽或CNTF蛋白质吸附在一种膜上（例如，硅橡胶膜，凝胶或能植入到受损神经附近的海绵状物），然后给药。在本发明的特定实施方案中，在治疗早老痴呆病，肌萎缩性脊髓侧索硬化和其它运动神经元疾病（包括如，韦-霍二氏麻卑病）和帕金森氏病时，可将CNTF蛋白质、肽片段或衍生物与组织的外科移植或其它持续释放组合物（包括微球、微胶囊或合成的植入物）一起给药。

在本发明的另一个实施方案中，可将CNTF蛋白质、片段或衍生物与其它胞质分裂物一起使用以达到所要的神经营养效果。例如（但不限于），按本发明，将CNTF与NGF一起使用以达到促进神经元生长和生存的效果。可以预见，CNTF与其它CNS-衍生的肽因子（尚未完全定性）对于中枢和外周神经元系统的神经元次级种群的wide  array的生长、发育和生存具有协同作用。

根据CNTF分子的所有特性，还可预见，研制新型的CNTF的肽片段、衍生物或突变体可用作某些兴奋剂或拮抗物或所有具有CNTF生物功能的制剂。

在本发明的另一个实施方案中，可将抗CNTF蛋白质、或肽片段或其衍生物的抗体施给患有各种神经性错乱和疾病而需要进行治疗的病人。例如，患有过多产生CNTF的病人需要进行这种治疗。抗-CNTF的抗体能用于预防感觉神经元的异常再生（如手术后）或治疗慢性病痛综合症。

药用组合物本发明的活性组合物含有所有或部分CNTF基因产物包括蛋白质、肽片段或由它们产生的衍生物，或直接抗CNTF蛋白质、肽片段或衍生物的抗体（或抗体片段），或CNTF和第二种试剂的结合物，例如在无菌的合适的生物药用载体，包括（但不限于）盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水中施用的NGF。

CNTF蛋白质、肽片段或衍生物含有实质上如图1（鼠）或图8（人顺序）中所示的氨基酸顺序或亚顺序。CNTF可从相应于合适物种包括（但不限于）人、猪、鼠、鸡、牛、狗、羊、山羊、猫、兔等的CNTF基因的顺序中得到。

对治疗特定病症或症状有效的CNTF蛋白质、肽片段、衍生物或抗体的量取决于该病症或症状的性质，且可用标准的临床技术进行测定）。若可能的话，最好测定剂量-反应曲线，将本发明的药物组合物在人体中试验前，首先在如上述的CNTF生物检定体系进行体外试验，然后在有效的动物模拟体系中试验。在本发明的特定实施方案中，根据体外试验数据，能有效促进睫状节神经元生存的药物组合物能提供定于患处的CNTF蛋白质浓度约2μg/ml。在本发明的另一个特定实施方案中，能有效促进胆碱能神经元生长和生存的药物组合物所具有的定于患处的CNTF蛋白质浓度约为40营养单位/ml。

引入的方法包括（但不限于）皮内、肌肉、腹膜内、静脉内、皮下、口内和鼻内引入。最好用合适的方法，包括心室内和鞘内注射将本发明的药物组合物引入中枢神经系统;用心室内导管，例如，连接一个贮器（如ommaya贮器）可方便地进行心室内注射。

而且，最好将本发明的药物组合物定位地施用到需要治疗的区域;这可通过下列方法完成，例如（但不限于）在外科治疗过程中通过输液、注射、借助导管或借助一个植入物，所说植入物是有孔、无孔或胶质材料，包括膜，如sialastic膜或纤维。

本发明还提供借助脂质体、微球、小胶囊而施用的含CNTF蛋白质、肽片段或衍生物的药物组合物。在本发明的各种实施方案中，可用这些组合物有效地使CNTF和与CNTF有关的产物持续释放。

可以预见，在需要增加或减少CNTF浓度的区域中引入产生CNTF，与CNTF有关的顺序、CNTF拮抗物或CNTF-兴奋剂，抗-CNTF的抗体的活性细胞是可能的。

用本发明分子探针鉴定新型的CNTF同源分子在不同物种和组织中已鉴定出具有类CNTF活性，但分子量与CNTF不同的分子，该组织包括鸡胚眼、鼠坐骨神经、已损伤的脑组织、心细胞、成神经细胞瘤细胞上清液（Heymanns  and  Unsicker，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：7758-7762）和肾上腺髓质细胞（Unsicker  et  al.，1985，Neurosci.Lett.60：127-132）。这些分子中有多少与本文所述的CNTF相同或不同还不知道。可能会发现CNTF的其他的来源和种类。本发明的重组DNA分子，抗本发明的CNTF蛋白质，或肽片段的抗体可用于表征新型的CNTF同源分子。

例如（但不限于），编码CNTF的重组DNA分子可用作探针以鉴定与图1和8中所示的CNTF分子同源但不相同的新型分子。这些同源分子可具有或不具有CNTF活性，它们由图1和8所示的分子相关的相同或不同基因组顺序产生。最好用图1和8所示的部分编码CNTF的顺序作PCR反应中的低聚核苷酸引物，用得自能表达CNTF同系物的细胞的基因组DNA或RNA作模板来鉴定这些新型的分子。而且，可用抗-CNTF抗体沉淀多核蛋白体合成的CNTF同源蛋白质;然后用本发明的低聚核苷酸引物对收集到的RNA进行PCR扩增。用这种技术，可鉴定和克隆许多与CNTF有关的分子。

6.实施例：鼠睫状神经营养性因子（CNTF）的分子克隆表达和区域分布6.1材料和方法6.1.1  CNTF的纯化和切割按上述方法（Saadat，et al.，1989，J.Cell Boil，108：1807-1816）纯化CNTF：而且从制备聚丙烯酰胺凝胶中电泳洗提CNTF以后，将它加到7.75×100mm的Bakerbond Gold C4widepore柱上，用0.1%三氟乙酸和0-60%乙腈梯度溶液洗脱。在50-55%乙腈的一个峰中洗出具有生物活性的蛋白质。在4μg已纯化的CNTF的2D-凝胶分析中，第一级包括等电点聚焦在PH为3.5-10.0的梯度，第二级由12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳组成，该分析显示这种蛋白质以单点迁移（Saadat et al.，1989，J.Cell Biol.108：1807-1816）（图2）。同时进行没有在Bakerbond Gold C4widepore柱中进行附加纯化步骤的CNTF的2D-凝胶分析。

在高速真空器（其中的空气已用氩气赶出）中浓缩含有CNTF的单峰。已发现氩对防止由于一种或多种蛋氨酸残基氧化而引起的CNTF活性损失极为重要。为进行BRCN分裂，将甲酸（最终浓度为70%V/V）和BRCN（10%V/V）加到30μg已纯化的CNTF中。在室温下放置3小时以后，加入500μl H2O，将该材料浓缩到50μl，立即加到Bakerbond Gold C4widepore柱中。为进行胰蛋白酶分裂，将30μg经色谱分析纯化的CNTF干燥，重新溶解在含10mM CaCl2和3μg经TPK处理的胰蛋白酶钠（sigma）的50μl 0.1M TRIC/HCL（PH为8.0）中。在37℃保温过夜。将所得到的片段装在Bakerbond Gold C4widepore柱内，在相同情况下进行洗提（以1ml/分的流速，用0-60%乙腈梯度溶液洗60分钟，在214nm处监测）。人工收集各峰。用自动运用的生物系统顺序分析器测定该肽的氨基酸顺序（Eckerskorn et al.，1988，Electrophoresis，9：830-838）。

通过5μg  CNTF的水解和用水合茚三酮衍生测定已纯化的CNTF的氨基酸组成（Tsugita  et  al.，1987，Biochem.，102：1593-1597）。

6.1.2.cDNA  CNTF克隆的繁殖用低聚引物5（图1c所示低聚核苷酸引物）和逆转录酶（Bethesda Research.Laboratories）由培养的鼠星形细胞的总RNA来合成CDNA（Okayama et al.，1987，Methods Enzymol.154：3-29）。CDNA的第一条链作为使用PCR增殖CNTF特异片段的模板（Saiki et al.，1988，Science，239：487-491）。克隆A是利用退化的引物-低聚物1和2繁殖的，该PCR产物是用低聚物11进行鉴定，之后亚克隆，再进行序列分析。按所描述的方法（Frohmann et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：8998-9002），这种部分克隆的序列可用于合成在cDNA末端扩增（RACE）中所用的引物3和4。将所得到的cDNAs亚克隆到Bluescript SK+载体，并进行序列分析（克隆B和C）。低聚核苷酸7是由基因组克隆顺序产生的（Carroll unpublished results）。利用用于克隆C的相同的RACE步骤，将该引物用于产生克隆D。使用PCR的引物9和10，可获得能在真核生物细胞中表达的完整长度的cDNA克隆（E）。

6.1.3.Northern吸印试验分析采用胍硫氰酸盐提取法从各种鼠组织中提取RNA（Chomczynski，P.and  Sacchi，N.，1987，Anal.Biochem.，162：156-159）。将等量的总RNA（30μg  RNA，但肌肉的mRNA是50μg）乙醛酸化后，在1.2%琼脂糖凝胶上电泳（Lindholm  et  al.，1988，Biol.Chem.263：16348-16351）。为了测定鼠坐骨神经中CNTF  mRNA的发育中的表达，按上文所述电泳由鼠坐骨神经得到的25μg总RNA;图4（b）中的PO、P4和P13涉及的RNA分别来自新生的，4天的和13天的鼠坐骨神经。已知量的847bp CNTF转录物（使用ribo探针系统，PROMEGA体外合成的）分别在各泳道一起电泳，以便对样品中的CNTF-mRNA定量。在电泳分析后，将RNA真空吸印到尼龙滤纸（Hybond-N，Amersham），利用双链32P标记的适于CNTF（600bp）编码区的CDNA探针，将该滤纸在50℃的50%甲酰胺中杂交（Lindholm et al.，上文），随后洗涤滤纸，暴露于X射线胶片下60小时，之后摄取放射自显影图。

6.1.4.重组体CNTF的表达具有巨细胞-病毒-启动子的表达载体（由David  Russell提供）以两个方向定向用于亚克隆完整长度的CNTF克隆。Hela细胞用于转染，在这些细胞中能检测，作为增进胚胎鸡睫状神经元存活活性的非基础表达，利用DEAE-Dextran法在每一培养皿（100mm直径）用10μg的载体转染（spandidos，D.A.，and  wilhie，N.M.，1984，Transcription  and  Translation-A  Practical  Approach，1-48）。培养48小时后移走上清液，细胞用冷PBS洗涤三次并于含30mM  NaCl的5mM磷酸盐缓冲液（PH7.0）中溶解，在溶胞蛋白超离心（100，000xg，30分钟）后测定浓度并将不同浓度的上清液加到培养的E8-睫状神经元中。培养24小时后，按前述（Hughes  et  al.，1988，Nature，335：70-73）方法计算存活的神经元。图3各点表示三次测量的平均值;横线表示标准误差。

6.2.结果6.2.1.CNTF氨基酸顺序的测定按上文所述，从鼠坐骨神经中纯化CNTF，为了定量氨基酸数目，生产溴化氰（BRCN）和胰蛋白酶片段（N-末端被阻断）必须增加Bakerbond  Gold纯化步骤。由气相-微序列分析测定的各种片段的氨基酸顺序大于总序列的50%以上，该顺序与根据CDNA推断的顺序相一致并且用示于图1的核苷酸顺序表示。纯化的CNTF氨基酸组分示于图1（d）。

6.2.2.CNTF  CDNA克隆的产生和顺序分析鼠脑星形细胞培养物用作分子克隆中RNA的来源;以前曾证明过这些细胞能产生大量的CNTF（Lillien et al.，1988，Neuron.1：485-494）。在各种PCR步骤之后（使用按上文6.2.1.所述获得的氨基酸顺序资料产生的合成寡聚核苷酸作引物），克隆A、B、C的核苷酸顺序显示有一个短的77bp的5′末转译区域和600bp的开放式阅读框架，同时预测出带有436bp的3′末转译区域的200个氨基酸长的蛋白质，它以多聚（A）尾结束（图1）。一个框架内的转译起始位点定位于核苷酸顺序位置的78-80位。定位于位置72-74的起始位点5′的终止密码子和位置75和81的G′S，能满足按照Kazak，M.J.所公开的（1989，J.Cell Biol.，108：229-241）常规转译起始位点的要求。位置678-680的终止密码子跟在编码肽CB2顺序后面。由微序列分析鉴定的最后氨基酸是高丝氨酸，表明根据核苷酸顺序预测的甲硫氨酸已进行转译后修饰并代表C-末端。

虽然在预测的顺序位置13和14上，二元（Arg-Arg）顺序表示可能的转译后的裂解位点，针对该裂解位点而言，纯化的CNTF的氨基酸组成（图11d）中：在N-末端区域内存在的氨基酸苯丙氨酸、精氨酸和氨基丙酸相对于该区域不存在的其它氨基酸来说（如异亮氨酸），并没有被还原。然而，予测的200个氨基酸顺序的MW（22.8KD）与PAGE分析所确定的值（22.5KD）完全吻合（Saadat  et  al.，上文）。因此，CNTF的氨基酸顺序表明胞液蛋白的特性，即无信号肽，序列没有糖基化和仅在17位上有一个半胱氨基酸残基。已确定的CNTF顺序与FIR和EMBL数据基底相比未显示与任何其它已知蛋白具有意义的相似性。尤其是，不同源于神经生长因子（NGF），由脑产生的神经营养因子（BDNF）、或成纤维细胞生长因子（FGF）和红紫素，其中每一种都与类似于CNTF的存活活性有关（Unsicker  et  al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：5459-5463;Schubert  et  al.，1986，J.Cell  Biol.，102：2295-2301）。

6.2.3.重组CNTF的表达CNTF是一种细胞质蛋白的可能性，通过观察全长CDNA克隆在Hela细胞中表达而得到证实。该细胞能导致活性CNTF的表达但未释放到培养基中（图3）。因此，CNTF似乎是一种类似于对细胞起深远影响的FGF和Interleukin-1（IL-1）分子，但是它们是胞液蛋白。对于FGF，还没有建立释放机制（Abraham  et  al.，1986，Science，233：545-548）。相反，可证明IL-1是通过特异酶（转化酶）切割后，借助于非常规机制由受刺激的巨噬细胞释放（Kostura  et  al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86：5227-5231）。尤其感兴趣的是近来发现大分子可借助载体将它从酵母胞液运输出来，它与哺乳动物细胞中多药物-抗性糖蛋白具结构同源性（Mc  Grath  and  Varshasky，1989，Nature，340：400-404）。这种糖蛋白能否在哺乳动物细胞中作为蛋白载体，有待于证实。

6.2.4.Northern印迹分析法在成年鼠组织中CNTF-mRNA的分布Northern印迹分析（图4）揭示出一种大小为1.2kb的单一带。这比坐骨神经Northern印迹中存在的信号强得多，而且在脊髓提取液中存在一个弱带。然而，在肌肉和皮肤的mRNA中不存在可检测的信号，即在50μg的总RNA中CNTF-mRNA＜2pg。肌肉和皮肤中的低水平CNTF-mRNA表明在坐骨神经中存在的大量的CNTF并不表示从周边倒退地运送CNTF，正如NGF的情况，然而却表示局部地合成CNTF。

此外，CNTF-mRNA表达的发育时间-途径不同于NGF（Thoenen  et  al.，1987，Biochem.Pharmacol.，109：145-178）。CNTF-mRNA在新生鼠的坐骨神经中是检测不到的，只有4天后才变明显（图4（b））。CNTF-mRNA表达的发育时间-途径表明产期中的神经元存活调节不涉及CNTF，因为靶-调节的神经元细胞的死亡早已超过CNTF合成开始增加的时间（Oppenheim，1986，J.Comp.Neurol，246：281-286;Johnson  et  al.，1980，Science.210∶916-918）。

6.3讨论上述纯化CNTF的方法第一次提供生产适于进行氨基酸序列分析的CNTF的方法。缺少在Bakerbond Gold C4Widepore柱上纯化的最后一步，许多污染的肽存在于CNTF制剂中，如图2（a）所示。然而，在Bakerbond Gold C4Widepore FPLC/HPLC柱上的纯化后，用2D凝胶电泳法法鉴定只有一个斑点（图2（b）），实际上证明是完全纯化的。值得注意的是在发现Bakerbond Gold C4Widepore柱是有效的之前，许多利用HPLC柱纯化CNTF计划都没有成功。可以假设金培养皿的惰性有利于CNTF的纯化。

尽管CNTF活性开始时定性为鸡睫状神经元体外存活因子（Adler  et  al.，1979，Science，204：1434-15362），然而最近，已证明由鸡或鼠组织产生的描述为CNTF的活性物能增进各种其它神经元细胞型的存活（Barbin  et  al.，1984，J.Neurochem.，43：1468-1478;Manthorpe  et  al.，1986，Brain  Res.，367：282-286），且也已证明通过阻断其复制和通过诱导肠血管（Vasointestinal）肽（VIP）免疫活性和胆碱乙酰转移酶（CHAT）活性（Ernsberger  et  al.，1989，Neuron  2：1275-1284）以及新生鼠的交感链神经节神经元（Saadat  et  al.，1989，J.Cell  Biol.108：1807-1816），鼠坐骨神经CNTF能影响E7鸡交感神经元的分化。然而，纯化的鼠坐骨神经CNTF能增进2型-星形细胞两性潜在02A祖先细胞体外分化（Hughes  1988，Nature  335：70-73）。为了有助于确定CNTF在体内是否具有这些功能，必须测定其一级结构、细胞表达、发育中的调节和定位。由CDNA推导的氨基酸顺序和随后的全长CDNA克隆在Hela-细胞中的表达证实CNTF是胞液蛋白。这个结果与其区域分布和其发育中的表达一起表明CNTF不可能是靶-产生的神经营养因子。因此，CNTF只有在通过细胞损伤或按已知机制释放后变成有效之后，才能显示神经营养和分化的性质。

总之，由于缺乏已知基本的释放机制，以及在发育过程中其表达的时间-途径以及其区域分布不同，CNTF不同于已知的神经营养因子NGF和BDNF。很有可能CNTF具有作为分化因子的生理作用，它的神经营养功能可能只有在病理生理学条件下而不是在胚胎的发育过程中起作用。

7.例：CNTF在大肠杆菌中的表达7.1.材料和方法7.1.1.CNTF表达载体的构造利用与覆盖基因5′终端的顺序互补的合成的低聚脱氧核苷酸引物和与相对的DNA链上覆盖基因3′终端的顺序互补的第二引物，将鼠CNTF（rCNTF）基因插入表达载体pCP93，两种引物均被设计成含有限制性酶BspMI的识别顺序，其顺序如下所示：5′－CAGTTACCTGCGGGGATGGCTTTCGCAGAGCAAACAC－3′5′－CAGAGGTATGAGCAGGTGGCTACATCTGCTTATCTTT

GG－3′使用作为模板的pCMV-rCNTF-C-1  DNA和市售的试剂盒，在标准聚合酶链反应（PCR）中由这些引物产生几微克的637bp片段，该片段在6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳纯化之后电洗脱。洗脱下来的片段再用BspMI消化，所得到的619bp片段用同样的方法再次纯化。利用Klenow  DNA聚合酶，进行标准反应使伸出的BspMI末端变成平齐末端，然后将该片段连接到pCP93载体的唯一的SalI.限制性位点，该位点已通过标准反应用S1标准酶处理而成为平齐末端。

7.1.2.含CNTF表达载体的细菌鉴定用上述连接体DNA转化感受态的E.Coli  W3110iqF细胞，之后筛选质粒大小，随后通过限制性分析而定性，用标准方法进行DNA序列分析（Panayotatos，N.，1987，In  Plasmids：A  practical  Approach，Hardy，K.G.，ed.IRL  Press.Oxford）。

7.2.结果和讨论在这些质粒当中发现有一种质粒（pCP-rcNTF-C-1）质携带有以正确方向融合的完整rCNTF基因和载体的核蛋白体结合信号的转译阅读框架。这种质粒的拷贝数高于亲代三倍，原因在于载体DNA缺失1400bp。

E.Coli W3110iqF-/rCNTF-C-1细胞在有乳糖的液体培养基内培养（以便能进行rCNTF基因的活性转录和转译），并且发现含有有效量的（2-5%的总细胞蛋白）生物活性rCNTF。这一点可通过8-25%梯度聚丙烯酰胺凝胶的电泳，随后如图4所示的考马斯亮兰着色得到证实。另外，蛋白提取物是由溶菌酶处理，随后，进行三次冷冻和融化的循环而裂解的相同细胞制备的。采用这种方法由几微升的培养液提取的蛋白，发现在体外24和48小时后能增进大于50%的E10鼠睫状神经节神经元和大约30%的E8背根神经节神经元的存活和神经突派生。可看到低于1毫微克的rCNTF具最大活性。这样的活性决不可能在由带有不含rCNTF基因的质粒载体的同种寄主细胞制备的对照提取物中检测到。

人CNTF顺序，已设计成缺少内含子的顺序，被插入pCP93载体并用于转化感受态的E.Coli。已转化的带有重组人CNTF顺序的细菌能表达合适分子量的人CNTF蛋白，还发现这些培养物的蛋白提取物在DRG试验中具有CNTF活性。

8.例：人CNTF基因的克隆8.1.材料和方法8.1.1.DNA.质粒和噬菌体载体人基因组DNA可从人胎盘DNA（Clontech）获得。pBLUESCRIPT质粒载体可由Stratagene获得。细菌噬菌体载体EMBL-3  SP6/T7可由Clontech获得。

8.1.2.聚合酶链反应在按制造试剂盒（Perkins-Elmer/Cetus）所提出的标准条件下，循环40次完成PCR，每次循环包括在94℃下保温1分钟，或40°或50°下保温2分钟，或在72℃下保温2分钟。

8.2.结果和讨论

8.2.1.人CNTF基因的存在证据在严格条件下，用EcoRI限制性核酸内切酶消化的人基因组DNA的Southern印迹杂交，表明大约10kb的单链DNA片段显示出与鼠CNTF探针具有弱同源性（图6，泳道6）。为了从分子水平上克隆推断出的人CNTF基因，通过采用相应于鼠CNTF基因的准确顺序的成对低聚核苷酸引物的聚合酶链反应（PCR）扩增这种基因的片段方面作了努力。为了使这种方法成功，需要鼠和人CNTF基因的两个短片段，在DNA序列上相同或几乎相同。

检验五对低核苷酸（每一对长17-21碱基）在利用总人基因组DNA作模板的PCR中作为DNA片段扩增合成的引物的能力。所有5个低核苷酸对都是从鼠CNTF基因的第二个外显子中选择出来的。假设人CNTF基因具有与鼠基因相类似的内含子-外显子结构。只有一对引物，定名为CNTF.10和CNTF.11，使人基因组DNA的一个DNA片段得到扩增，该片段与使用鼠DNA模板（270bp）和相同引物而获得的片段大小（270bp）相同。通过较高（更严格）温度（50℃）下发生DNA合成来完成PCR时，观察到的放大程度更高而背景更小。CNTF.10和CNTF.11的顺序如下：CNTF.10（36-mer，氨基酸EADGMPA的反意义链;每一末端氨基酸2碱基;以多克隆位点结尾）。

5′－CCAAGCTTCTAGAATTCGCAGGCATCCCATCAGCCT－3′CNTF.11（34-mera，对氨基酸EMTEAE有意义;末端aa2碱基，最终A;低聚核苷酸5′端有多克隆位点）。

5′GACTCGAGTCGACATCGGAGATGACTGAGGCAGA－3′（相应于鼠CNTF的顺序下边加横线;添加另外的核苷酸以便为随后的克隆步骤提供多克隆位点）。

通过在2%的琼脂糖凝胶（低熔点;NuSieve）上的电泳分离出PCR反应的产物。接近270bp的阳性谱带切去后，用相同引物对通过PCR循环35次（93℃30秒，50℃1分钟，72℃1分钟）重复放大。再放大的DNA片段用2%琼脂糖电泳再次纯化，并且在使用市售得到的试剂盒（由IBI得到的“FASTaq”kit），采用二脱氧核苷酸链终止法进行的DNA序列分析中作为模板。用于序列分析的引物是CNTF.10和CNTF.11，以及两种根据由末端引物获得的初顺序资料而选择的内引物。人DNA扩增片段的完整顺序如图6。所述顺序包括一个与鼠CNTF非常相似但又不相同的多肽片段的开放阅读框架。

8.2.2.由PCR放大的人CNTF基因片段的克隆通过用EcoRI和Xhol切割（并且与用相同2种酶切割的载体DNA连接）。而将放大的人CNTF基因片段亚克隆到pBLUESCRIPT质粒载体。DNA被引入E.Coli菌株XL1-Blue（Stratagene）的感受态细胞内，并选择具α-氨基苄青霉素抗药性的转化体。用标准方法纯化质粒DNA，用EcoRI和Xhol切割插入的人DNA片段，分离后，标记以用作杂交探针，完成标记使用的是用约20ng DNA作为模板和低聚核苷酸CNTF.10和CNTF.11作引物的PCR进行的，在含有Taq DNA聚合酶（Perkin-Elmer/Cetus）、dATP、dGTP、dTTP和32P-dCTP的反应混合物中，94℃下1分钟，50℃2分钟，和72℃下3分钟循环6次，采用标准色谱法使标记的片段与未掺入的dCTP分开。

为了测定用鼠CNTF探针在人基因DNA中检测的DNA片段是否含有能通过以CNTF.10和CNTF.11作为引物的PCR加以放大的序列，将放射性标记的人片段，用作用EcoRI消化的人和鼠基因组DNA的Southern印迹杂交的探针（图6，泳道a）。探针与约10kb的带明显地杂交，与用鼠CNTF探针杂交很弱的区带不能区分。相反地，人探针与鼠基因DNA的约4kb的谱带杂交很弱，与用鼠CNTF探针强烈杂交的区带很难区分，这些结果，加上顺序数据，有力地表明人DNA与鼠CNTF基因具同源性。

8.2.3.基因库产生的人CNTF基因的克隆利用上文所述的放射性标记的人CNTF探针选择细菌噬菌体载体EMBL-3  SP6/T7中的人DNA基因组文库，该文库含有通过使用限制性核酸内切酶Sau3a的部分消化，再在BamH1位点上插入载体的人胎盘DNA片段，细菌噬菌体平板培养于E.Coli菌株LE392上，使用基本上与Benton和Davis  （1977，Science  196：180-182）和Mahmaudi和Lin（Mahmoudi，M.和Lin，V.K.，1989，Biotechniques  1：331-333）所述相同条件，用探针杂交，重复筛选出大约750，000个噬菌斑。通过使用人CNTF探针杂交以鉴定阳性斑点的方法，鉴定阳性噬菌斑，并且通过三个回合的单一噬菌斑分离使重组噬菌体得以纯化。带有人CNTF基因的重组细菌噬菌体被定为λhCNTF-G-1，为进一步分析，使用LE392细菌作寄主在液体培养中生长的办法制备繁殖母株。

存在于λhCNTF-G-1中的人CNTF顺序可通过PCR放大和DNA序列分析进一步得到分析，使用具有原来已编码的（见上）270bp人片段的一对内引物的放大反应证实了在纯化的噬菌体克隆中存在正确的片段;低核苷酸被定为CNTF.13和CNTF.16（顺序如下）。正如所希望的，在用λhCNTF作模板和这些引物的PCR反应中，约128bp的产物谱带被放大。如上所述完成PCR，然后使用包括94℃下1分钟，50℃下2分钟，72℃下2分钟的35次保温循环。

CNTF.13：5′－GCAGCGACTTGGAGAAG － 3′（反意义链）CNTF.16：5′－TACCTTCCATGTTTTGTTGG － 3′（有意义链）（该引物含有具多克隆位点的顺序的5′“尾”-仅显示该顺序的CNTF部分）。

为了确定λhCNTF-G-1克隆是否含有CNTF编码顺序的5′和3′末端，PCR反应是用相应于鼠CNTF编码顺序末端的精确顺序（即非退化）引物来完成的。应当注意放大来自人基因组克隆的DNA的能力表明存在相应于人基因的区域，但是放大DNA的失败既是因为缺乏来自克隆的编码顺序的末端，也可因鼠和人之间的顺序差异。

为检验可能存在的人CNTF编码顺序的5′末端，使用CNTF.13（上述）和CNTF.14作引物。后面的低聚核苷酸含有相应于鼠CNTF（有意义链）编码顺序5′末端的22碱基，而且在5′末端还含有另外不相关的顺序（未显示），该序列含有有利于放大片段可能克隆的多个限制性内切酶识别位点CNTF.14：5′－ATGGCTTTCGCAGAGCAAACAC－3′采用CNTF.13和CNTF.14低聚核苷酸对，由λhCNTF-G-1模板放大大约1.4kb的片段。假若人CNTF基因含有的内含子与在鼠CNTF基因中发现的大小差不多相同（接近1kb）时，这个大小即是所希望的。

对于放大介于已知的人CNTF基因的内顺序和编码顺序的3′末端间的区域所作的类似努力未获成功。引物是CNTF.16（上述）和CNTF.15，它们含有鼠编码顺序（反意义）3′末端的顺序：CNTF.15 5′－CTACATCTGCTTATCTTTGG － 3′顺序分析是由克隆的人CNTF基因的部分完成的，并且证实与鼠CNTF基因的相似性，然而在编码蛋白中出现大量的氨基酸替代（subtitutions）。人CNTF编码区域内的DNA顺序分析结果和与鼠顺序比较的结果示于图8。所述数据与在相同于鼠CNTF基因的位置上具有单一内含子的人基因相符，还存在复盖内含子-外显子连结的氨基酸顺序等同物（ESYVKHQGLNKN）延伸段。在内含子内人顺序显著区别于鼠的，与基本编码区保存物形成明显的对照。还有一延伸段，其中6个氨基酸中有5个在人和鼠之间有差别（人：HVLLAR;鼠：QGMLTK），另外还有两段，其中4个氨基酸中有3个是不同的（人：TEHS;鼠：AEQT，位置4到7;和人：NNKK;鼠：KDKQ，在位置196到199上;图8（b））。

9.例：CNTF中产生的肽片段的利用9.1.材料和方法9.1.1.肽的合成利用f-moc化学现象在应用生物系统固相肽合成仪上合成肽。

9.1.2.细胞培养按（Hughes  et  al.，1988，Nature  335：70-73）提出的方法产生鸡胚胎睫状神经节培养物并维持存活。

9.1.3.免疫方法对于14氨基酸CNTF肽的抗体（SALESHYGAKDKQ）是通过使用与KLH（Keyhole  Limpet  haemocyanin）结合的肽免疫兔的方法制备的。为了能偶联KLH，14氨基酸肽在C-末端用一个Cys残基加以延伸。KLH和肽的偶联是用过量100倍的肽和MBS（m-马来酰亚胺苯甲酰基-n-羟琥珀酸亚胺酯）作偶联剂完成的。

用在弗氏完全佐剂中的1mg连结物（肽-KLH）促进兔免疫。3周后用另外在弗氏不完全佐剂中的1mg结合物增加兔免疫。2周后再次免疫该动物，2周之后采血，制备血清，发现这种血清能免疫沉淀免疫源，及纯化鼠坐骨神经CNTF。

9.2.结果和讨论9.2.1.抗合成肽的抗体中和CNTF活性的能力饱和量的CNTF与蛋白质-A-琼脂糖结合的抗体一起培养，该抗体来自于由14氨基酸合成肽（ISALESHYGAKDKQ）免疫的兔得到预免疫血清或免疫血清，经培养和离心以后，检定上清液，维持E8鸡睫状神经节神经元生长的能力。在对照上清液中可看到正常的CNTF剂量应答。在用抗-CNTF肽片段抗体免疫沉淀后，基本上检测不出CNTF的活性（图9）。

9.2.2.合成的CNTF肽片段的神经营养活性E8鸡胚胎睫状神经节神经元在一系列浓度的28氨基酸合成肽片段存在时培养两天，所述片段是由原始的CNTF顺序数据产生的，然后定量测定神经元的存活。在介于肽浓度和神经营养活性之间，观察剂量-应答的相互关系（图10）。所使用的肽顺序是MVLLEQKIPENEADGMPATVGDGGLFEK。

9.2.3.抗合成肽的抗体对鉴定含CNTF细胞的能力抗28氨基酸肽的抗体用于鼠坐骨神经组织的免疫荧光研究。抗28氨基酸肽的兔抗体与鼠坐骨神经的固定部分共同培养，接着神经部分再与rhodamine标记的抗-兔IgG抗体反应。如图11所示，能看到周边轴突染色，从而假设CNTF可能是由Schwann细胞合成的。另外还有，轴突胞质中存在的结构能被目测（图11，小箭头），该结构与轴突的合成或CNTF转移到轴突相一致的。通过加入过量CNTF肽阻断标记反应（MVLLEQKIPENEADGMPATVGDGGLFEK）。

10.例：睫状神经营养因子增进脊髓神经元的存活10.1.材料和方法10.1.1.实验动物Sprague-Dawley鼠（HSD）用于所有的实验。怀孕鼠用二氧化碳窒息致死，然后迅速取出胚胎，放在冰-冷Puck生理盐水G中，以进行后面的解剖。

10.1.2.组织培养技术在无菌条件下由妊娠14天的鼠胚胎中取出脊髓。从延髓尾部切下脊髓，不含感觉神经节和脑膜。脊索再细分成腹部和背中部片段以便分开培养。将脊髓组织切成小片再用捣碎机械方法离解，通过巴斯德移液管吸至规定的培养基中，该培养基含有50%基本培养基Eagle（BME;Gibco）和50%Ham营养混合物F12（Gibco），并补充有葡萄糖（33mM）、谷氨酰胺（2mM），NaHCO3（15mM）、HEPES（10mM）、胰岛素（25μg/ml）、铁传递蛋白（100μg/ml）、腐胺（60μm）黄体酮（20nM）、亚硒酸钠（30nm）、青霉素G（0.5μg/ml）、链霉素（0.5μg/ml）和牛血清清蛋白（2.5μg/ml）。重复捣碎两次并将上清液收集起来，通过尼龙（Nitex，Tetko）过滤器（40μm）过滤，所产生的总细胞在有锥虫兰存在下用血球计数板计数、分离的腹细胞以0.5百万细胞/35mm培养皿的密度涂于平板上，培养皿用聚-D-赖氨酸（10μg/ml）覆盖。分离的背中部细胞以1.5百万细胞/35mm培养皿的密度涂于平板上，培养皿已用聚-D-赖氨酸（10μg/ml）、聚-L-鸟氨酸（10μg/ml）或带有昆布氨酸（Laminin）的聚-L-鸟氨酸（5μg/ml）覆盖。在平板培养时间，对这些培养物进行处理。培养保持在37℃下，接近100%相对湿度的95%空气/5%CO2的大气中。每3-4天换一次培养基。一周时，这些培养液主要含有只具有几个星形细胞（用纤维状神经胶质酸性蛋白抗体着色的;Bignami and Dahl，1973，Brain Res，49：393-402）神经元（用神经丝单克隆抗体RT97着色的;Wood and Anderton，1981，Biosci.Rep.1：263-268），正如免疫细胞化学所证实的。

10.2.结果和讨论10.2.1.睫状神经营养因子（CNTF）对背中部（MD）脊髓神经元的作用在规定的培养基第一个48-72小时后，背中部（MD）培养物不能存活，细胞开始结块最后与基质分离。然而，在平皿培养时间内用CNTF处理一次后（每ml培养液中，2μl的E.Coli提取物有20ng的重组鼠CNTF），到48小时时显示出MD神经元的存活数增加;它们紧紧地附着在基质上并延长了神经突（图12）。这种差别不可能是细胞附着程度的结果，因为平皿培养3小时后，在对照和CNTF处理的两种培养液中细胞都紧密地附着情况。此外，使用不同的基质得到结果类似。因此，这种结果表明CNTF能提高这些培养物中MD神经元的存活。还测定了蛋白水平。CNTF-处理过的培养物含有的蛋白/皿较未处理的对照物和NGF处理过的（50ng/ml）培养物高6倍（表1）。由于培养液一开始含神经元，所以蛋白质水平的提高就可认为提高了神经元的存活。

10.2.2.CNTF对腹部脊髓神经元的作用腹部脊髓片段培养液富有体细胞的运动神经元，正如在有关鸡胚胎运动神经元论文所证实的（Dohrman等人，1986，Dev.Biol.118：209-221并可参见例8，下文）并且如本文通过使用胆碱乙酰转移酶（CAT）抗体进行的免疫细胞化学对鼠胚胎运动神经元的研究所证实。在规定培养基中，腹部神经元存活得相当好，然而最终于一星期后变坏，大概是由于缺乏神经胶质细胞分泌的因子（因为这些培养物含有的神经胶质较少），在CNTF（2μl/ml）存在条件下，腹部神经元存活超过一周，与对照相比，增加的蛋白质和CAT酶水平较低（表Ⅱ）。

表Ⅰ平皿培养时间内，背中部神经元用CNTF（2μl/ml）、NGF（50ng/ml）处理或不处理。7天时，收集培养物，用Bradford方法测定蛋白质（Bradford，1976，Anal.Biochem.，72：248-254）。

对照物  CNTF  NGFμg蛋白质平皿  20  120  20表Ⅱ在平板培养期间，腹部神经元用CNTF（2μl/ml）、NGF（50ng/ml）处理或不处理。7天时，收集培养物测定CAT酶水平（Hartika和Hefti，1988，J.Neursci.8：2967-2985）并测量蛋白质。

蛋白质  CAT活性μg/皿  cpm/皿对照  33  590±26.52CNTF  45  959.5±24.32NGF  38  621.25±33.5911.例：纯化鼠坐骨神经CNTF防止新生鼠面部神经（第7颅侧神经）中的运动神经元损伤-诱导细胞死亡。

11.1.材料和方法新生鼠仔的面部神经单侧分段并且将含5μg牛血清白蛋白或5μg  CNTF的小明胶海绵植入物放在受伤部位。一组未接收明胶海绵植入物的受伤动物用作对照。一周后，杀死动物制作，含有与损伤的神经同侧（与损伤同侧）的面部神经核和损伤处对面一侧（与损伤处对侧）面部神经核的脑干切片。对侧面的面细胞核作体内对照。面部核切片用Nissl染色（染色运动神经元）或用纤维状神经胶质酸性蛋白的抗体染色（为检测神经胶质细胞对伤痛的应答）。

11.2.结果和讨论如图13A和B所示，面部神经的损伤和含BSA明胶海绵植入物的替代导致其中运动神经元数量的降低;此外，剩余运动神经元出现凝聚和皱缩。然而，面部神经的损伤和安置CNTF的明胶海绵植入物本质上好象与较大的运动神经元的存活有关（图14A和B）;图14A中的运动神经元与图13A的皱缩的、退化的运动神经元相比，似乎与未损伤侧面的健康运动神经元（图14B）更相似。而且，能观察到CNTF的作用主要是促进运动神经元的存活，而不是防止神经胶质增生;在BSA处理和CNTF处理的鼠中在与面部神经损伤对侧面的面部核中，能观察到相当量的神经胶质增生（图13C和14C）。

计数未处理鼠、BSA-明胶海绵和CNTF-明胶海绵处理鼠的面部核中运动神经元的数量，数据列于表Ⅲ。

在未处理或用明胶海绵+BSA处理的损伤动物中，观察到损伤对侧面的运动神经元损失有90%。在用浸过CNTF的明胶海绵植入物处理的动物中，损伤对侧面的运动神经元库有70%正常（损失

12.例：重组人和鼠睫状神经营养因子在Escherichia  Coli（大肠杆菌）中高水平表达和纯化。

12.1.材料和方法12.1.1.细菌菌株和质粒E.Coli  W3110  laclqF-，一种能过量产生乳糖操纵子阻遏物的菌株，和亲代质粒载体pCP93、pCP110、pblko和pblkl已用于早先的研究中（Panayotatos，N.，1988，Gene  74：357-363;Panayotatos  et  al.，1989，J.Biol.Chem.264：15066-15069）。为CNTF的表达设计的载体按下面方面产生并且它们的相关性质综述于表Ⅳ中。

12.1.1.1.鼠CNTF载体12.1.1.1.1.pRPN11编码完整鼠CNTF蛋白质的622bpDNA片段，是通过聚合酶链反应（PCR）由cDNA克隆获得的（Stockli  et  al.，Nature  342：920-923）。用于获得这种片段的合成低聚脱氧核苷酸引物被指定产生编码蛋白质氨基末端的丙氨酸的5′末端，以及产生3′末端的TAG终止密码子以外的结尾19bp。表达载体pCP93用SalI线性化，再通过使用Sl核酸酶处理得到平齐末端，得到的3920bp片段用琼脂糖凝胶电泳法纯化。这样制备的载体和PCR片段连结起来，转化到E.Coli  W3110  LacIqF-。按所期望质粒的大小和限制性图谱筛选转化体（图16），通过DNA序列分析证实阳性候选物（pRPN11）携带期望中的与正确的阅读框架中转译起始信号融合的全长基因。然而，如下文讨接近30%）总之，新生鼠面部神经损伤后，发现有90%的面部神经核的运动神经元在一周内退化。应用CNTF切割新生鼠面部神经的剩余部分，显著地降低了细胞的损失。见示于图14A和表Ⅲ中的神经切片;发现CNTF能挽救至少60%的面部神经运动神经元，通常这些神经元在axotomy后都会死去。因此证明CNTF是体内运动神经元的存活因子。

表ⅢCNTF挽救新生鼠面部神经运动神经元免于Axotomy-诱导细胞死亡处理  面部神经核中运动神经元数损伤侧  对侧（对照侧）对照（无凝胶海绵）  685  2985330（530）明胶海绵+BSA  775  3360（5μg）  645  3300440  315（620）  （3271）明胶海绵+CNTF  2205  3425（5μg）  34451270  29903095  3490（2120）  （3301）

论的，发现在pRPN11的CNTF基因中有单一bp突变，与原始鼠cDNA相关，导致在蛋白质顺序的193位处天冬酰胺取代酪氨酸掺入。可能在PCR的放大过程中发生的这种突变，被转到所有携带鼠CNTF基因的其它载体中。

12.1.1.1.2.pRPN12这种质粒与pRPN11相同，但该质粒在拷贝对照区（copl）有一单bp突变，该突变可使寄主细胞中的拷贝数提高5倍。可将Eag  Ⅰ和PvuⅠ位点（顺时针）之间的DNA用由pCP110产生的相同序列置换而构建该质粒（Panayotatos  et  al.，1989，J.Biol.Chem.264：15066-15069）。

12.1.1.1.3.pRPN37PRG12中复盖b-内酰胺酶基因的两个AseⅠ限制性位点间的DNA区域（图16），用产生卡那霉素（KanR）抗药性的DNA片段置换。在该载体内，KanR基因是处于其天然启动子的转录控制之下。

12.1.1.1.4.pRPN38这种质粒和pRPN37是一样的，但它有4个碱基对的位点-特异性突变，该突变能减弱KanR启动子的强度（Panayotatos，N，1988，Gene74：357-363）。

12.1.1.2.人CNTF载体12.1.1.2.1.pRPN32这种质粒与pRPN11相类似，除了它带有人的而不是鼠的基因。为了能在细菌中表达人CNTF蛋白，必须除去分隔蛋白质-编码顺序的内含子。这一点是通过使用PCR放大和连结内含子侧面区域完成的，步骤如下。进行两个反应，每一个使用100ng的gen  C.1DNA作为模板（图17）：一个含1M  CNTF.23引物和10nM  CNTF.21引物，而另一个含1μM  CNTF24引物和10nM  CNTF.22引物。10个PCR循环后（每次循环包括在94℃下保温1分钟，50℃2分钟，72℃2分钟），混合两个样品再在DNA  Thermal  Cycler（热循环器）中进行另外的25次循环，由于内引物CNTF.21和CNTF.22彼此完全互补，第一阶段PCR反应的产物随后能退火。此外，在第二阶段反应中，存在浓度显著高的外引物CNTF.23和CNTF.24引起所需要的全长产物的大量合成。选择内引物以桥键合编码区的两个片段，因此导致内含子缺失。最终PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，而且经溴化乙锭染色后只检测到一个主带。大小约600bp，和部分核苷酸顺序表明这个带表示一个精密地连接的人CNTF编码区域。

设计5′外引物CNTF.23（图17）能产生编码蛋白质氨基末端上丙氨酸平齐末端3′外引物CNTF.24（图17）在CNTF编码顺序末端以外提供一个12bp的EagⅠ限制性位点。该引物也能用TAA置换天然出现的TAG终止密码子，这种替代在E.Coli中不易转译通读。PCR片段用EagI限制后，所得到的612bp片段用聚丙烯胺凝胶电泳纯化。可提供ATG起始密码子的表达载体pCP93用SalI线性化后，通过Sl核酸酶处理得到平齐末端，再用EagI消化，所得到的3，636bp片段用琼脂糖凝胶电泳纯化。这样制备的载体和PCR片段连结起来转化到E.Coli  W3110LacIqF-，通过限制性图谱鉴定带有期望分子的转化体再检验诱导产生的所需大小的蛋白的存在。

通过凝胶电泳分析携带有一个候选质粒（pRPN32）的E.Coli  W3110LacIqF-的诱导培养物中，蛋白质合成结果显示有约27.000MW蛋白带存在，它在携带pCP93质粒载体的细菌诱导对照培养物中是不存在的。快速从这些培养液制备的蛋白提取液显示有生物活性CNTF。

12.1.1.2.2.pRPN33、pRPN39和pRPN40除了有人的而不是鼠的CNTF基因外，这些质粒分别与pRPN12、pRPN37和pRPN38是类似的，而且同样用pRPN32作亲代质粒构造。介于pRPN32中的EagI和PvuI位点间的拷贝对照区域（顺时针）可由pCP110产生的相同顺序取代以产生pRPN33，之后，pRPN33中的AseI限制性位点间的β-内酰胺酶编码区域可由pblkl的突变KanR区域（Panayo-tatos，N.，1988，Gene74：357-363）置换以产生pRPN40。最后，pRPN40和pblko的NdeI和BglⅡ限制性位点之间的区域（Panayotatos，N.，1988，Gene  74：357-363）交换以产生pRPN39，其中KanR基因在其野生型启动子控制之下。

12.1.2.蛋白合成的诱导细胞在LB肉汤内于37℃下振荡培养至OD590＝1。添加乳糖至终浓度为1%并连续培养16-20小时。

12.1.3.“快速”蛋白质提取凝胶电泳样品的制备是通过将0.5ml培养液OD590＝2产生的细胞沉淀重新悬浮于0.16ml溶解缓冲液中（100mMTris  HCl、10%甘油、4%十二烷基硫酸钠、1mM二硫苏糖醇、0.5mg/ml溴酚兰，PH6.8）并煮沸5分钟。

最初描述使用于重组人白细胞干扰素α2的方法选择性提取/溶解-（Thatcher，D.and  Panayotatos，N.，1986，Methods  Enzymol.119：166-177），按下列修改。由诱导培养液产生的细胞重新悬浮并储存于-20℃以下。在溶菌酶处理后，粘性悬浮液在8，000psi下通过French  Press（SLM-Aminco），以11，000xg速度离心，再处理，加工得到的沉淀（Thatcher，D.and  Panayotatos，N.，1986，Methods  Enzymol.119：166-177）。将溶于8M胍盐酸盐中的样品在缓冲液D（10mM  Tris-Hcl，PH8.0，5mM  EDTA，0.1mM二硫苏糖醇）中充分透析，在11，000xg离心，在无菌条件下，将清亮上清液通过Millipore  Sterifil  D-GV过滤。

12.1.4.色谱法滤液调整至25mM  NaCl中，以0.5ml/min速度加到5×10cm  DEAE  Sephacel柱（Pharmacia）该柱已用缓冲液E（20mM  Tris  HCl  PH8.0，0.1mM  EDTA，0.1mM二硫苏糖醇，25mM  NaCl）平衡处理过。该柱用基底体积的相同缓冲液洗涤，再用3倍基底体积的线性梯度25-500mM  NaCl的同样缓冲液洗脱，在250-350mM  NaCl梯度处洗脱出重组鼠CNTF。同时在50-100mM  NaCl梯度处洗脱出人CNTF。

对于鼠CNTF，将收集的峰馏份在缓冲液E中渗析，无菌过滤和储存于-70℃。

对于人CNTF，从DEAE  Sephacel柱收集到的峰馏份经调整至40mM  MES（Boehringer）PH6.0，0.1mM  EDTA，0.1mM二硫苏糖醇（缓冲液G），通过0.22μm  Millex  GF过滤器，以1.0ml/hr速度施加于5×10cm  Fast-S柱（Pharmacia），用含250mM  NaCl的两倍基底体积的缓冲液G洗涤后，再使用3倍基底体积的含250-1000mM  NaCl梯度的缓冲液G洗。在约600mM  NaCl处洗脱出人CNTF。峰馏份在缓冲液E中渗析，无菌过滤，储存于-70℃。

12.1.5.肽分析12.1.5.1.鼠CNTF按（Stockli et al.，Nature 342：920-923）描述用BrCN离解重组鼠CNTF（50μg）。所得到的肽用RP C4的反相HPLC分离，所得色谱图与BrCN离解的鼠坐骨神经CNTF相比较。将曾鉴定作为大多数C-末端肽进行氨基酸分析。另外，鉴定N-末端肽再进行氨基酸分析。

12.1.5.2.人CNTF使1.5ml  0.1%TFA/50%乙腈中的重组人CNTF（400皮摩尔）在Speedvac中浓缩至终体积为300μl。该样品载于微型柱（Vydac  C-4，214TPB，300A，10μm），用0.1%TFA/10%乙腈洗涤两次，再用0.1%  TFA/70%乙腈洗脱。洗脱液在Speedvac中浓缩至约10μl。完成C-末端裂解是用在33℃下用柠檬酸钠（终浓度为0.025～0.05M）调节PH为3.79、5.0和6.12的总体积为20μl的2%羧肽酶Y和P（Boehringer  Mannheim，Sequencing  grade），在保温10到60分钟过程中，添加3μl的99%甲酸和200pmol的氨基乙醇（作为内标），并按上述方法将样品加于微型柱中。裂解的氨基酸洗脱后，用0.1%TFA/10%乙腈洗涤该柱两次。氨基酸经干燥，再用O-phtal-二醛衍生后进行分析。用0.1%TFA/70%乙腈由微型柱洗脱出CNTF，浓缩至10μl再重复裂解。

12.1.6.生物活性重组CNTF的生物活性是按Lindsay和Rohrer（1985，Devel.Biol 112：30-48）所述在鸡胚胎背根神经节（DRG）的外植体和睫状神经节（CG）的离体培养物上进行。简单地说，由培养10天（E10）的鸡胚胎解剖得DRG和5-6神经节植入盛有1ml胶原凝胶间质的35mm组织培养皿。在凝胶固化之后，加入补充有5%热-失活马血清（GIBCO）的1ml组织培养生长基质F14（Imperial Labs.，U.K.），然后加入人CNTF（1-20 l）达到终浓度为100pg-100ng/ml。E8鸡胚胎解剖后得CG在含0.25%胰蛋白酶（worthington）的无钙和镁的磷酸盐缓冲生理盐水中培养30分钟，神经节再用含5%马血清的F14培养基洗涤三次，捣碎后，通过Pasteur移液管的孔分离成单细胞悬浮液，可在一个60mm培养皿内培养细胞悬浮液3.5小时，得到丰富的CG神经元，在这过程中，非神经元细胞（成纤维细胞和Schwann细胞）牢固地附着于塑料壁上，相一明亮的神经元在悬浮液中。纯化的神经元以8，000-10，000神经元/皿的密度涂在已覆盖聚乌氨酸-昆布氨酸的35mm培养皿上培养。通过与对照相比来评价处理过的培养物纤维派生程度而测定外植体培养液CNTF活性，采取比较培养物对外植的DRG和NGF的剂量-应答照片将纤维派生程度分作0-5+。在离体的CG神经元培养物中，CNTF活性的测定是在48小时计算对照和CNTF处理的培养物中加工过神经元的百分数。在各种情况下结果都是从三份培养物得到的。

12.1.7.其它方法用于这些研究中的酶反应的条件，DNA电泳和其它技术都已详细描述（Panayotatos，N.，1987，In  K.G.Hardy（Ed.），Plasmids：A  Practical  Approach.IRL  Press，Oxford，U.K.，pp.63-176）。使用4mg超螺旋质粒作模板借助Sequenase  Version  2.0Kit（USB  Corporation）完成DNA序列分析。

12.2.结果与讨论对外源蛋白在E.Coli中表达的早期研究已鉴定了几个参数，这些参数有助于高水平的表达和有利于回收生物活性产物。我们已利用具有一些重要特征的表达载体，特征包括：受乳糖操纵子阻遏物调节的LacUV5启动子;由细菌噬菌体T7产生的很强的核蛋白体结合部位;在质粒复制控制区有一个提高拷贝数的突变;以及限制抗菌素抗性蛋白表达的突变。尤其是，我们仔细研究了后面两个特征对CNTF在E.Coli中生产的影响。

12.2.1.鼠CNTF的表达

12.2.1.1.拷贝数的影响用凝胶电泳法分析乳糖-诱导的E.ColiW3110  LacIqF-/pRPN11培养物中的蛋白质合成结果显示较弱地表达约24，000KDa的多肽，相当于鼠CNTF的期望的大小，它在带有pCP93载体的细菌的诱导对照培养物中是不存在的（图18）。带有pRPN11的细胞提取物也含有有效水平的CNTF活性。值得注意的是在E.Coli  W3110  LacIqF-/RPN12诱导培养物中，与pRPN11不同之处在于拷贝数突变copl的存在，使CNTF的生产量提高到约为总细胞蛋白的30-50%（图18）。于是，相对于pRPN11来说，pRPN12的拷贝数增加5倍，导致重组蛋白水平增加30-50倍（表Ⅳ）。copl突变的这一作用已为其它重组蛋白所证明（Buell，G.and  Panayotatos，N.1987，In“From  Gene  to  Protein：Steps  Dictating  the  Maximal  Levels  of  Gene  Expression”，Reznikoff，W.S.and  Gold，L.eds  Butterworths，Stoneham，Mass.）。

12.2.1.2.抗菌素抗药性的作用在有关重组蛋白在E.Coli中表达的早期研究中，人们注意到由载体编码的抗菌素抗性蛋白的合成受适当的重组蛋白产物的干扰。这种干扰是由于细胞的限制性细胞合成机理中而种种基因发生竞争引起的（Panayotatos，N.，1988，Gene  74：357-363）。为了进一步验证这一假设，和有可能提高CNTF生产的水平，在其天然启动子（prpn37）的转录控制之下，或在较弱的突变启动子（pRPN38）控制之下。pRPN12中的β-内酰胺酶基因被卡那霉素抗药性（KanR）基因置换，分析寄生有pRPN37的诱导细胞中。蛋白质水平，表明鼠CNTF组成总细胞蛋白的10-20%，和合成的KanR蛋白约为该水平的一半。相反，在寄生有pRPN38的细胞中，它带有突变KanR启动子，CNTF组成总细胞蛋白的50-70%，而没有检测到KanR蛋白（图18和表Ⅳ）。所观察到的用pRPN38非常高水平地表达CNTF，估计可能直接起因于抗菌素抗药性基因表达水平的降低。正如有关用这些载体高水平表达其它重组蛋白所观察和讨论的（Panayotatos，N.，1988，Gene  74：357-363），减少KanR启动子的强度就会减少明显限制细胞合成能力方面的竞争。

12.2.2.人CNTF的表达用几种载体获得的相关水平的人CNTF表达列于图18中，而且概括于表Ⅳ。就每一载体的最高水平低于带有鼠基因的类似载体所具有的水平，然而总图谱是一样的;用更高拷贝数（copl）质粒，可再一次看到增长30-50倍，而且借助于高拷贝数和卡那霉素抗药性的低表达结合，可再次获得最高水平。还原的KanR（pRPN39对pRPN40）对人CNTF的表达的作用与对鼠CNTF表达（pRPN37对pRPN38）的作用相比明显减少。所以希望当细胞合成机构达到限度时如重组蛋白水平特别高，两种转录单位竞争才变得明显。

本文报导的鼠CNTF在E.Coli中生产水平是例外地高：很明显这是由于一些因素的有利结合，包括使用适度强度的启动子，强核蛋白体转译起始信号，在稳定保持相对高拷贝数的载体质粒和选择性抗菌素抗药性蛋白的最低合成。另外，重组蛋白生产取决于蛋白本身的物理性质及其在寄主中的稳定性，在这方面，鼠CNTF似乎特别适合于在E.Coli中表达。人CNTF也非常有效地得到表达，尽量水平有些低。

12.2.3.鼠和人CNTF的纯化类似于在E.Coli中高水平表达的其它重组蛋白质，CNTF大部分是在不溶性内含体中发现：85-90%的鼠和60-70%的人蛋白质对于用中性缓冲液的提取是稳定的。用8M胍盐酸盐能有效地提取和溶解截留在内含体中的CNTF和其它（大部分是疏水的）蛋白。随后用渗析法缓慢除去胍盐使疏水性寄主蛋白沉淀并且使留在溶液中的鼠CNTF纯度95%以上，而人CNTF纯度高于90%（图19）。在这一点上，单纯色谱步骤（DEAE  Sephacel）足以纯化重组鼠CNTF达到99%以上纯度，正如从有意超载的聚丙烯酰胺凝胶上得到的相对强度（图19A）和通过HPLC分析测定的。部分是由于人蛋白对DEAE  Sephacel亲和力较弱，所以必须增加第二个色谱步骤（Fast  s）以取得高于99%的纯度（图19B）。

12.2.3.1产率得到确定的表达水平并推断湿细胞沉淀的总蛋白含量5-15%蛋白（按重量计），理论产率每克湿细胞沉淀产生30-90mg鼠CNTF和15-45mg人CNTF。发现实际产率是鼠CNTF约20mg而人CNTF约6mg。对人蛋白质的情况，大部分损失是由于在制备内含体的过程中，“溶解的”CNTF提取和抛弃。

12.2.3.2特征由上述程序制备的鼠和人两者的重组CNTF纯度高于99%。通过Limulus  Amebocyte  Lysate检验法（Associatesof  Cape  Cod）测得蛋白质具有的发热性（！5ng/mg蛋白）。此外，如下述讨论的，发现它们的生物活性在皮摩尔水平。

重组鼠和人CNTF蛋白用BrCN处理并鉴定N-末端和C-末端肽后进行氨基酸组成和/或顺序分析。N-末端肽的分析表明在鼠和人两种蛋白质中定量回收N-末端氨基酸为丙氨酸。这结果暗示起始的甲硫氨酸可定量除去，当第二残基是非庞大的氨基酸丙氨酸时，在E.Coli中通常出现这种的情况。反之，从鼠坐骨神经中纯化到的CNTF  N-末端被阻断，估计可能留下末端的甲硫氨基残基。

在羧基末端，获得用于重组人CNTF的末端BrCN肽的期望顺序。反之，鼠的CNTF的N-末端肽氨基酸组分分析表明当它具有希望的组分时;它就缺少期望的酪氨酸残基，并且，具有额外的天冬酰胺。DNA顺序分析表明存在一个点突变，在密码子193上产生由酪氨酸到天冬酰胺的替代;很明显，这一点的出现是在通过PCR而拷贝克隆鼠CNTF  cDNA过程中以构建原始表达载体pRPN11。我们已经确定突变位于对生物活性非必需的CNTF区域内。

鼠和人CNTF具有相同数目的氨基酸（在除去N-末端甲硫氨酸后，计算的分子量分别为22，780和22，700）并共有它的顺序的很大部分。在还原和非还原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，人CNTF迁移较鼠CNTF慢些（图19）。介于结构相似和长度相等的这两种分子之间的这种运动性上的差异反映出在人蛋白质中一些异常的结构上的强制力。

12.2.4生物活性由上述程序纯化的重组鼠CNTF完全是活性的，图20表明离体的、富含神经元的E8鸡胚胎睫状神经节培养物的剂量-应答曲线，是由从鼠坐骨神经纯化到的CNTF（Stockli et al，Nature 342：920-923）和重组鼠CNTF获得的。从坐骨神经纯化到的蛋白质的活性可检测量在5pg/ml，而且最大神经元存活量为1-2ng/ml（EC50＝80pg/ml）。在相同检验中，发现纯化的重组鼠CNTF在2pg/ml时具活性，并观测到饱和度为0.5-1.0ng/ml（EC50＝35pg/ml或1.5PM）。因此，纯化的重组鼠CNTF具有至少和从坐骨神经中纯化的天然蛋白质一样的活性。

在平行实验中，检测纯化的重组人CNTF的生物活性。开始，10天鸡胚胎（E10）DRG的外植体被用于快速和半定量检测E.Coli溶胞物中CNTF的活性。在CNTF存在下，可见纤维派生，同时在缺少外源神经营养因子的情况下，在对照神经节中很少或几乎没有派生（图21A、B）。饱和水平CNTF出现的最大纤维派生约为用饱和水平的NGF而出现的派生的50-75%。

一种更特异性的检验法测量了E8鸡睫状神经节的离体、富含神经元的培养物中神经元存活。在对照培养液48小时后，几乎所有的神经元都退化（图21C），而在饱和水平的CNTF存在下。培养时至少有60-70%的神经元存活并且精心做成很长的神经突（图21D、E），对睫状神经元产生的这些特异性作用，是用亚ng量的细菌细胞粗裂解液和纯化的重组蛋白观察到。根据用逐渐增加的纯蛋白质进行的这些实验中，可以发现重组人CNTF对鸡睫状神经元的活性与鼠CNTF相同。

本文所述的CNTF的表达和纯化，可以按比例增加用于药物生产。根据近来的论证CNTF能增进实验动物中受伤运动神经元的存活，这一点是很重要的（Sendtaner  et  al.，1990，Nature  345：440-441）。

13.例：修饰和截断睫状神经营养因子蛋白对生物活性的影响13.1.材料和方法13.1.1.亲代表达载体的构造亲代rCNTF表达载体pRPN11、pRPN37和pRPN40的遗传工程描述于12.1.1.1.1、12.1.1.1.3和12.1.1.2.2各部分。

13.1.2.构建经修饰人睫状神经营养因子载体质粒pRPN108是通过用一个片段置换pRPN33中介于唯一的AatⅡ和NheⅠ限制性位点间的DNA顺序而产生的，所述片段带有在Nhel位点上游15bp的两个位置上经过修饰严格相同的顺序。完成这一点是用复盖Nhel位点和包含三个残基的合成低聚脱氧核苷酸“3引物”，所述残基是用编码丙氨酸的GCA密码子置换TGT半胱氨酸密码子。该3′引物与复盖AatⅡ位点的5′引物结合以通过聚合酶链反应（PCR）获得来自于pRPN33的所期望的顺序。因此pRPN108与pRPN33是相同的，除了hCNTF的17位氨基酸的丙氨酸密码子（图22）。

质粒pRPN109按与pRPN108完全相同的方式由pRPN33产生，不同的是复盖Nhel位点的3′引物包含两个残基，它们转化TGT半胱氨酸密码子成为编码丝氨酸的AGT密码子。因此，pRPN109，与pRPN108是一样的，不同的是编码hCNTF17位点氨基酸的丝氨酸密码子（图22）。

质粒pRPN59是通过在pRPN33中移走介于唯一的限制性位点，BamH1和Nru1之间的DNA顺序而产生的，在pRPN59中，hCNTF基因顺序在第185位密码子后被阻断并且保证有编码与hCNTF不一致的另外10个AA的序列和一个转译-终止密码子（图22）。

当带有介于Ase1位点之间的部分hCNTF基因的限制性片段的定向倒转时，可将来自于pRPN33（MS2）的pRPN40经遗传工程方法产生质粒pRPN112。在pRPN112中，hCNTF基因在第145密码子之后立即阻断并且保证的顺序导入两个密码子;一个密码子编码与hCNTF不相应的一种氨基酸（亮氨酸）和一个转译一终止密码子（图22）。

通过将一个以Bst×1位点为末端，编码hCNTF的最后133个氨基酸的CPR片段插入编码与CNTF非同源的蛋白质的基因的Bstx1位点，而产生pRPN82质粒。在pRPN82中，所得到的融合蛋白含有外源蛋白的开始35个氨基酸以及跟随它们2个甘氨酸残基和133个hCNTF的残基（图22）。

13.1.3构建经修饰的鼠睫状神经营养因子载体质粒pRPN65的产生是通过插入介于pRPN12的唯一的限制性位点Sacl和Nru1之间一个规定的PCR片段以便在紧接着rCNTF的第165个密码子后导入转译-终止密码子（图22）质粒pRPN110的产生是通过用一个片段置换介于pRPN12中的唯一的Nhe1和Eag1限制性位点之间的DNA顺序，所述片段带有在单核苷酸上经修饰的严格相同序列，所述核苷酸将TAT酪氨酸密码子转化成编码天冬酰胺的AAT密码子。完成这一点是借助于3′引物，该3′引物是从发生突变的位置延伸到rCNTF基因的3′末端而且随后是Eag1的识别顺序。该3′引物结合复盖Nhel位点的5′引物使用，为的是能通过PCR获得来自于pRPN12的所期望的顺序。在pRPN110中，rCNTF基因编码的蛋白质与由鼠DNA编码的蛋白质相同（图22）。

13.1.4睫状神经营养因子质性的生物检验分析背根神经节和/或离体的睫状神经元的生物活性，是按12.1.6部分的描述进行的，可溶蛋白是按描述于12.1.3部分中的“快速”蛋白提取法从寄生各种质粒的诱导细菌中提取的。

13.2.结果和讨论检验生物活性结果表明在pRPN108和pRPN109中编码的修饰hCNTF蛋白和在pRPN59中编码的截断蛋白的活性与亲代质粒pRPN33中编码的全长蛋白的活性相同。反之，在pRPN112中编码的截断蛋白是无活性的。

这些结果表明为人、鼠和兔CNTF顺序在位置17上共有的唯一半胱氨酸残基能被修饰而无明显的活性损失。同样地，hCNTF最后的15个氨基酸对于活性并不是必不可少的。反之，除去hCNTF羧基末端的最后55个氨基酸则活性消失。因此，活性hCNTF的临界区域位于氨基146和186之间。

分析截断和修饰的鼠CNTF蛋白的结果与这种解释是一致的并且进一步缩小了具CNTF活性的临界区域。在由pRPN65编码的蛋白中，移走最后的35个氨基酸使蛋白失活，同时用天冬酰胺残基在193位上置换酪氨酸，对活性没有影响。这些结果能进一步限定，具CNTF活性的临界区域是介于氨基酸166和186之间的顺序。

14.例：CNTF对腹部脊髓神经元的其它作用14.1.材料和结果14.1.1.实验动物所有实验都使用Sprague-Dawley鼠（HSD或Zivic-Miller）。怀孕鼠（E14）按10.1.1所述致死。

14.1.2组织培养技术按10.1.2所述在无菌状态下从鼠胚胎取出脊髓，该脊髓组织切碎成小片后在37℃下于0.1%胰蛋白酶（GIBCO）和0.01%脱氧核酸酶型1（sigma）中培养20分钟。然后除去胰蛋白酶溶液，漂洗和用培养基置换，该培养基是由45%Eagle最低基本培养基（MEM）、45%Ham营养混合物F12（F12）、5%胎牛血清（GIBCO）、5%马血清（GIBCO）、谷氨酰胺（2mM）、青霉素G（0.5U/ml）和链霉素（0.5μg/ml）组成。然后轻度捣碎和通过Pasteur移液管吸至同样培养基中，而用机械方法分离两次，合并上清液后用尼隆过滤器（Nitex，Tetko;40μm）过滤。所产总细胞数在锥虫兰存在条件下用血球计计数来测定，离体的腹细胞以约50，000细胞数/cm2的密度在涂有聚-L-鸟氨酸（10μg/ml）和昆布氨酸（5μg/ml）的培养皿上培养。在培养当天进行处理，但在延迟附加实验中，其中处理是在2或6天进行。培养物在37℃下，接近100%的相对湿度的95%空气/5%CO2的大气中培养。培养基每3-4天换一次。为了降低非神经元细胞，在2天时添加核分裂抑制剂，胞嘧啶-阿拉伯糖苷（AraC;0.5μM）。在7天时，收集细胞测量胆碱乙酰转移酶（CAT;Fonnum，1975，J.Neurochem24：407-409）和蛋白质（Bradford，1976，Annal.Biochem.72：248-254）水平或固定于4%的仲乙醛中以进行NF检验（Doherty et al.，1984，J.Neurochem.42：1116-1122）和免疫细胞化学分析。一些培养物是在指定的培养基内生长，该培养基包含50%F12和50%MEM，谷氨酰胺（2mM）、胰岛素（5μg/ml）、转铁蛋白（100μg/ml）、黄体酮（20nM）、腐胺（100uM）和亚硒酸钠（30nM）（Bottenstein and Sato，1979，PNAS76：514-517）。培养1天时，用指定培养基置换这些培养物中含血清的培养基。

14.1.3神经丝（NF）分析细胞于4℃下在4%仲甲醛中固定2小时后，按Doherty等人所述的程序将培养液渗透和阻断（1984，J.Neurochem.42：1116-1122）。神经丝蛋白的检测采用单克隆抗体RT97（Wood  and  Anderton，1981，Biosci.Rep.1：263-268）以1∶1000稀释度进行。反应产物用0-苯二胺（OPD）作为基质显色后看到并在490nm下测量光密度。

14.1.4.胆碱乙酰转移酶（CAT）检测通过将细胞溶解于含0.1%Triton X-100的20mM Tris-HCl（pH8.6）溶液中而收集培养物。取出2微升的细胞溶解物按照micro-Fonnum程序检验CAT活性（Fonnum，1975，J.Neurochem.24：407-409）。最终基质组分为0.2mM〔1-14C〕Acetyl-CoA（NEN，54.4mci/mmol），300mM Nacl，8mM溴化胆碱，20mM EDTA和溶于50mM NaH2PO4（pH7.4）缓冲液的0.1mM新斯的明。在这些酶和基质浓度上，酶反应呈线性进行90-120分钟。对于CAT的诱导的特殊性检验是通过在检测过程中添加CAT活性特异抑制剂，N-羟乙基-4-（1-萘乙烯基）苯基偶氮二氨基吡啶（HNP）（White  and  Cavallito，1970，J.Neurochem.17：1579-1589）。

14.1.5.乙酰胆碱酯酶（AchE）的组织化学着色通过利用改进的Geneser-Jensen和Blackstadt（1971，Z.Zellforsch.114：460-481）的着色法而对AchE进行组织化学染色鉴定胆碱能细胞。在培养液固定于4%仲甲醛后，细胞于4℃下在有AchE基质溶液存在下培养5-6天，所述基质溶液是由下列组成：4mM乙酰硫代胆碱碘，2mM硫酸铜，10mM甘氨酸和溶于50mM醋酸盐缓冲液（PH5.0）中10μg/ml明胶。按前述（Hartikka  and  Hefti，1988，J.Neurosci.8：2967-2985）完成反应产物的显色。

14.1.6用甲泛影酰胺密度梯度分馏腹角细胞分馏程序（Dohrman et al.，1986，Dev.Biol.118：209-221）是改进的Schnaar和Schaffner（1981，J.Neurosci.1：204-207）所述方法，甲泛影酰胺溶解于F12：MEM（1∶1）的培养基中并且制备由3ml 17%的甲泛影酰胺，3ml 12%甲泛影酰胺和3ml 8%甲泛影酰胺组成的逐级梯度。下列步骤都在4℃下完成。按前述获得的腹角细胞悬浮液（2.5ml）成层放在各等级梯度上，使用Swing-Out转头以2500×g转速离心20分钟，离心结果是细胞0-8%（馏份Ⅰ）、8-12%（馏份Ⅱ）和12-17%（馏份Ⅲ）界面上分三层。从每一界面收集很小体积（约1ml）的细胞平板培养、处理、并按所述方法检验。由馏份Ⅰ产生的神经元被保持于由培养的前角细胞产生的限制性培养基中。

14.2.结果和讨论14.2.1.培养物的普通形态学生产在含Sera培养基的腹角细胞产生混合的神经元-神经胶质细胞培养物。24小时后，神经胶质全部变平并开始增殖，而只有少数几个神经元开始延伸神经突。然而，48小时后，许多神经元长出神经突并且显示特征性的相一明亮体细胞（图23），2天时添加AraC后，非神经元细胞开始死亡并且浮起，留下含约5%神经胶质的富含神经元培养物。在规定的培养基中，培养物还含有大约5%的能为Ara  C处理进一步还原的神经胶质。在甲泛影酰胺梯度-纯化的运动神经元角培养物中（馏份Ⅰ），实际上不存在神经胶质并且有90%以上的神经元是大的胆碱功能神经元。

14.2.2  CNTF对神经丝（NF）水平的作用为了评价CNTF对神经元的作用。而测量NF水平。发现在CNTF处理（10ng/ml）的腹角培养物中就NF含量与未处理的对照物对比增长2.0倍。NGF并未产生任何重要的作用（图24）。这一结果表明CNTF能增进存活和/或促进培养的腹神经元中神经突派生。

14.2.3.CNTF对含AchE神经元存活的作用为了确定增加NF水平是否反映出增加神经元存活或神经突派生，对AchE进行组织化学着色，因为在腹角培养物中绝大多数的神经元是胆碱功能的运动神经元。发现CNTF处理的（10ng/ml）培养物比未处理的对照中AchE;阳性神经元增加2.5倍。NGF似乎具有很小的影响。这些结果表明CNTF能提高神经元的存活这可以解释为NF水平的提高。

14.2.4.CNTF对CAT活性的影响为了估计CNTF对传导物质表型表达的影响，要测量CAT活性的水平。CAT是Ach合成的一种速度限制酶，如图26所示，添加CNTF（10ng/ml）能使CAT活性在培养7天后平均增加4.0倍，而添加其它生长因子。例如NGF（50ng/ml）和FGF（50ng/ml），没有作用。这种胆碱功能活性的增加是与剂量有关的，当CNTF的浓度为1ng/ml（图26B）时能达到最大应答。在处理后，这种增长快到3天就很明显，而且好象不受培养物密度的影响。根据这些结果可以认为CNTF还可刺激胆碱功能传导物质表达，因为CAT活性的增加超过胆碱功能神经元数增长的1.6倍;也就是说，存活的胆碱功能神经元表达更多的Ach/神经元。

14.2.5延迟添加试验腹角细胞被分成如图27所示的三组。在图27A中，CNTF（10ng/ml）是在平板培养时加到细胞中的，而且细胞在CNTF存在下保持7天。在图27B和C中，在无CNTF下培养物保持2天或6天，然后在另外的7天用CNTF（10ng/ml）处理。延迟到第2天添加CNTF导致CAT活性减少增加到1.2倍。然而，延迟6天后，CNTF不再影响CAT的活性（图27）。这些结果表明存在一群对CNTF敏感的神经元，通常如果在培养的几天内没有CNTF存在，它仍会死亡。如有CNTF存在，这些细胞存活并且表达出数量增加的Ach。

14.2.6  CNTF在神经胶质缺乏条件下对腹角培养物的作用减少腹角培养物中神经胶质细胞存在的方法有2种：a）用抗有丝分裂剂处理（Arac;0.5μM），和b）使用无血清的培养基。在任一种情况下，神经胶质群可降至总细胞的5%左右，然而，CNTF对CAT活性的作用保持不变（图28）。这些结果表明CNTF对CAT活性的作用好像不是借助于神经胶质传递的，而是来自神经元的直接应答。

14.2.7.CNTF对甲泛影酰胺梯度-纯化的运动神经元的作用腹角培养物已富集胆碱功能神经元。为保证培养物的均一性，通过密度梯度从腹角培养物进一步纯化运动神经元。利用逐级甲泛影酰胺梯度根据它们较轻的浮力密度而选择运动神经元。所得到的培养物含有90%以上的运动神经元，如早先Schnaar和Schaffner（1981，J.Neurosci.1：204-207）所说明的。在纯化的运动神经元培养物中，与未处理的培养物相比，CNTF（10ng/ml）能刺激CAT活性增长10倍（图29）。甲泛影酰胺梯度能分开可能存在的来自大运动神经元的小胆碱功能神经节前的交感神经元的污染库。结果证明CNTF能增进存活并且能刺激运动神经元中的胆碱功能表达。

15.例：睫状神经营养因子对海马状突起培养物的作用15.1  材料和方法15.1.1  海马状突起细胞培养由Sprague-Dawley鼠的E18-19鼠胚胎解剖出海马状突起，并收集于F10培养基中。组织经捣碎用F10培养基（Gibco）冲洗两次再用0.25%胰蛋白酶（Gibco）在37℃下作用20分钟，胰蛋白酶可通过添加含血清的培养基作用失活，所述培养基的组成为最低基本培养基（MEM）补充胎牛血清（FCS.10%），谷氨酰胺（2mM），青霉素（25U/ml）和链霉素（25μg/ml）。收集通过轻度捣碎所获得的分离细胞，再于低速（500rpm）下离心30秒，离心重复两次，然后将细胞沉淀再悬浮于含血清的培养基中。细胞平板培养在6mm微滴板孔或35mm培养皿，它们已用聚鸟氨酸（10μg/ml）和昆布氨酸（10μg/ml）覆盖。在大多数的实验中，细胞以约71，000细胞/cm2较低密度平板培养。在细胞平板培养后的5-6小时，培养基换成无血清含1%N3和青霉素-链霉素（分别为25单位/ml和25μg/ml）的培养基，在此培养基中培养时加CNTF。每3-4天换一次培养基，同时再添加因子。

为了获得富神经元的培养物，在24小时时间内加入胞嘧啶阿拉伯糖苷（Ara-C，0.3μM）。在这种条件下，海马状突起培养物含有大约5-10%神经胶质细胞，如由GFAP免疫组织化学所估价的。

15.1.2检验GAD酶活性按照Kimura和Kuriyama（1975，Jpn.J.Pharm.25：189-195）的方法，通过测量由L-〔1-14C〕谷氨酸释放CO2而决定GAD酶的活性。用30μl含50mM KH2PO4（pH7.2）和0.25%TritonX-100的溶液溶解35mm皿中的细胞，刮出来收集。用5微升的细胞裂解液测定GAD酶活性。在典型的检验中，反应混合物含有在KH2PO4缓冲液（50mM，pH7.2）中的0.57mM的L-〔1-14C〕谷氨酸（NEN，NEC-715，52.6mci/mmol），谷氨酸（3mM），吡哆醛磷酸盐（0.2mM）和AET（1mM）。在这些反应条件下，发现酶反应呈线性直到2.5小时。培养于37℃下进行2小时，并且通过向反应混合物注射25μl的8N H2SO4而终止反应。培养延续另外60分钟。释放的14CO2用氯化苄乙氧胺（Hyamine）碱溶液中捕获并计数。

15.1.3.神经丝蛋白的测量按Doherty等人的方法（1984，J.Neurochem.42：1115-1122）定量神经丝蛋白，如14.13.部分所描述的。

15.1.4高亲合性GABA摄取的测定用经修改的Tomozawa和Appel的方法（1986，Brain Res.399：111-124）测量高亲合性GABA的摄取。细胞用GABA摄取缓冲液洗涤，该缓冲液含140mM NaCl，2.6mM KCl，1mM KH2PO4，1mM Na2HPO4，6mg/ml葡萄糖，1mM MgCl2，1mM CaCl2，0.1%BSA。洗涤后，细胞与GABA摄取缓冲液一起于37℃培养5分钟。然后加3H-Gaba（NEN、NET-191X，111.4Ci/mmol）达到最终浓度为12nM，并于37℃培养10分钟。其后将细胞保存于冰上，再用摄取缓冲液洗涤三次。细胞用0.14N NaOH于室温下培养2小时，对提取物中3H-GABA进行计数。发现在高达至少30分钟内对3H-GABA摄取是线性的。GABA摄取到非神经元细胞可通过补加2mMB-丙氨酸而抑制，而用1mM3-哌啶甲酸的抑制作用可证实神经元的特异性摄取。

15.1.5  GAD或GABA的免疫组织化学染色细胞用4%仲甲醛于室温下固定30分钟，用PBS洗涤。对于GAD染色法，用50%，70%，和50%乙醇连续浸洗而渗透细胞。使用含5%正常兔血清的PBS连续浸洗一小时阻滞培养物，并用1∶6000稀释的羊抗-GAD抗体1440于4℃培养过夜。用PBS清洗三次后，用1∶400稀释的生物素化兔抗羊抗体，于室温下培养细胞至少90分钟。对于GABA染色法，在Tris-HCl（0.1M，pH7.3）中用Triton  X-100渗透细胞，并用10%正常山羊血清阻滞90分钟，然后用兔抗GABA抗体（1∶5000）于4℃培养过夜。用PBS清洗三次后，用1∶200稀释的生物素化山羊抗兔抗体于室温下培养细胞至少90分钟。用Vectastain  ABC试剂盒（Vector实验室）观测GAD或GABA免疫活性细胞。

15.1.6神经元特异性烯醇酶（NSE）的免疫组织化学染色在用4%仲甲醛固定后，用溶于含0.1%Triton  X-100的PBS中的10%正常山羊血清（NGS）阻滞细胞。然后用第一种抗体（兔抗-NSE，1∶5000）于4℃下培养细胞过夜。再用第二种抗体（山羊抗兔按1∶200稀释）于室温培养细胞至少90分钟。用Vectastain  ABC药盒（Vector实验室）观测NSE-免疫阳性细胞15.1.7  Calbindin组织化学染色法细胞用PBS清洗两次，再用4%仲甲醛于室温下固定30分钟。在用1%正常的马血清（NHS）洗涤，再用含5%NHS的PBS于室温阻滞1小时后，细胞与溶于1%NHS中的鼠抗-Calbindin抗体（按1∶1000稀释）于4℃培养过夜。该细胞再用1%NHS清洗三次，在室温下用第二种抗体（马抗鼠，按1∶400稀释）培养90分钟。用Vectastain  ABC试剂盒（Vector实验室）观测Calbindin的免疫活性细胞。

15.1.8乙酰胆碱酯酶的组织化学染色法根据Geneser-Jensen与Blackstadt方法（1971，Z.Zellforsch 114：460-481）进行乙酰胆碱酯酶的组织化学染色。细胞用PBS洗涤三次，并用4%仲甲醛于室温固定30分钟。固定的细胞再用含有50mM醋酸盐缓冲液（pH5.0），4mM乙酰硫胆碱碘，2mM硫酸铜，10mM甘氨酸和10μg/ml白明胶的反应混合物培养。非特异的胆碱酯酶受到培养介质中含有的0.2mM爱普把嗪（ethopropazine）的抑制。胆碱酯酶染色的特异性通过添加5μm新斯的明进行检验。在培养7天结束时，在37℃短暂培养而溶解白明胶。用水洗涤细胞，用1.25%Na2S处理1分钟，再用水洗涤。然后用1%AgNO3处理1分钟，再用水和PBS洗涤。

15.1.9睫状神经营养性因子所有试验中使用的CNTF都是重组鼠CNTF，是按前面第12部分实施例中所描述的方法进行表达和纯化

15.2结果取出发育年令为E18的海马状突起，进行培养，大多数神经元群体由分裂期后的锥形神经元组成。在平板培养后五至六小时，神经元已延伸成轴突，并有证据证明在培养1天后，细胞-细胞接触。带长突起的相-明亮细胞便是证据。

在各个时间期间，有或没有CNTF的情况下，以低密度（约71，000个细胞/Cm2）培养海马状突起神经元。用CNTF（10ng/ml）连续处理海马状培养物，从而提高了该细胞摄取3H-GABA的能力（图30）。CNTF诱导的特异性神经元对GABA摄取的增加的时间进程是慢的，如图30A所示。在培养第6天;CNTF（10ng/ml）处理对GABA摄取有较少的提高，并且在加CNTF后8天观察到最大的增加，约4倍（与未处理的对照相比）。培养期长到11天没有产生更大的提高。为进一步估价CNTF对培养物中海马状突起神经元的影响，在ELISA试验之前，用一种抗神经丝蛋白质的抗体（RT97）定量分析神经丝蛋白质。已确定，到培养的第六天，神经丝只稍微提高，在第8天增加最大，约5倍（图30B）。在1ng/ml CNTF的情况下可观察到GABA摄取和神经丝蛋白质具有相似时间过程。

正如图31所示，CNTF的作用似乎是与剂量有关。在0.01ng/ml时，特异性神经元的GABA摄取是增加的，在用0.1ng/ml  CNTF处理8天的细胞时，增加最大，约3倍（图31A）。CNTF浓度高达50ng/ml，没有使GABA摄取有更大的增加。同样，CNTF处理的培养物中神经丝蛋白质也以剂量依赖性的方式增加。在0.1ng/mlCNTF时，达到平稳状态（图31B）。CNTF的浓度高达50ng/ml，没有进一步增加神经丝蛋白的量。

作为一种补充的方法研究CNTF对GABAergic神经元的影响，测定了有CNTF时培养8天的培养物中GAD酶活性。已发现CNTF以剂量依赖性方式提高海马状突起的神经元中GAD酶活性（图31C）。所得到的剂量-响应曲线的形状与对GABA摄取和神经丝蛋白的观察结果是相似的。用0.1ng/mlCNTF可观察到GAD酶活性增加到最大，为3.8倍。

为了考察CNTF对GAD酶活性的影响是否是由于对酶活性的诱导作用，或由于对GABAergic神经元的存活的影响，在有CNTF或没有CNTF时，测定生长的细胞中GAD-免疫活性神经元的数目。在浓度为10ng/ml，CNTF分别使NSE-和GAD-阳性神经元数目增加2.2倍与2.3倍（图32A）。用抗GABA的抗体进行免疫组织化学染色得到类似的结果（图33A）。曾将Calbindin定位到海马状突起的神经元的亚群包括齿状回，CAl锥体神经元和一些中间神经元（Balmbridge和Miller1982，Brain  Res.245：223-229）。CNTF（10ng/ml）处理低密度海马状培养物，使Calbindin免疫阳性细胞增加3倍（图32B），培养8天后，与对照相比，在CNTF处理的培养物中乙酰胆碱酯酶阳性细胞数也增加约17倍（图33B）。

为进一步提供证据证明CNTF是作为挽救培养物中GABAergic神经元的存活因子，而不是起诱导GABAergic表型特性的作用，进行延迟添加试验。在平板培养后不同时间里添加CNTF（10ng/ml），在培养第8天测定培养物中GABA摄取量或神经丝蛋白质水平。如图34A所示，如果延迟一天，添加CNTF，在七天后检测时，则CNTF-诱导的GABA摄取增加已降低。如在平板培养的第三天添加CNTF，则CNTF不再使GABA摄取增加。当延迟三天添加CNTF时，CNTF诱导的神经丝蛋白质增加有类似的降低（图35A）。为了排除这种观察结果是由于这种因子作用的时间不充分而产生的这一可能性，进行下面的试验。将CNTF（10ng/ml）于培养的第三天加到培养物的细胞中，该因子处理细胞达8天，然后测定GABA摄取和神经丝蛋白质。在该条件下，CNTF没有诱导GABA摄取增加，并且对神经丝蛋白质的影响大大降低（图34B，35B）。

曾证明星形细胞是许多神经营养性因子（包括CNTF）的丰富来源。为研究CNTF的作用是通过从胶质细胞释放这些因子，而不是直接对神经元起作用的可能性，研究了在富含神经元的培养物中CNTF诱导的GABA摄取的增加。如图36所示，与未处理的对照相比较时，在Arac处理的培养物中，CNTF使GABA摄取增加2.4倍。在神经元-神经胶质的混合培养物（-Arac）或在富含神经元的培养物（+Arac）中，对GABA摄取的刺激作用是相似的。另外，在Arac处理的培养物中CNTF剂量-响应曲线稍向左移动，产生最大响应所需要的CNTF浓度较低（与0.1ng/ml相比只有0.03ng/ml）。

CNTF对GABAergic神经元的影响取决于细胞平板培养时的密度。在以71000细胞/cm2的低密度平板培养时，CNTF（10ng/ml）产生的GABA摄取增加约为2.6倍

CNTF的效果可用选择性诱导GABAergic表型标记进行解释。然而，延迟添加的结果强烈地支持CNTF起存活作用的论点。我们发现，当延迟三天后添加CNTF时，CNTF不能对GABAergic细胞产生影响。尽管神经丝蛋白质水平仍显著地增加，但其作用比在零天时加CNTF所观察到的作用小得多。

CNTF的密度相关作用表明，在高密度时，细胞存活似乎不需要CNTF。这可能是由于由神经元或星形细胞局部释放内生神经营养性因子，或者是由于细胞-细胞相互作用。曾证明，在星形细胞存在下，提高海马状突起神经元存活（Banker和Cowan，1977，Brain  Res.126：397-425）。可能是所涉及这种因子是CNTF或神经营养性族的一员。在神经元富集的培养物中，CNTF对GABA摄取和神经丝蛋白质的作用不受影响。该结果与CNTF影响中的星形细胞的作用形成尖锐对立，并且认为其影响是通过对神经元的直接作用传递的。使用真菌标记的CNTF配体和真菌抗体，我们有证据证明在该神经元上有CNTF的受体存在。

CNTF对海马状突起神经元的存活促进活性似乎不限于GABAergic神经元。我们有证据证明，在CNTF存在下，乙酰胆碱酯酶-免疫阳性细胞数目也增加。在CNTF处理的培养物中，AchE-组织化学染色的强度比预计的大得多。可能CNTF对侧正隔的胆碱能神经元的退化存活与分化因子的作用方面具有重要的意义。

在CNTF存活下，神经元表型的两种一般标记NSE和NF的表达都是增加的。使用酶结合的免疫吸附剂试验测定NF蛋白质累积。使用的单克隆抗体（RT97）显著地识别该NF蛋白质三联体的（图37A）。在较高的平板密度（143000细胞/cm2），在饱和浓度（10ng/ml）下，CNTF没有诱导GABA摄取的有效增加。类似地，CNTF对神经丝蛋白质水平的影响也取决于细胞密度（图37B）。这或许是由于在高密度培养物中神经培养性因子水平提高。以前曾证明培养物中海马状突起神经元对谷氨酸神经毒性是很敏感的（Mattson，M.P.等人（1988）J.Neurosu.8：2087-2100）。正如图38所示，我们曾用比色MTT试验研究了不同浓度的谷氨酸（10-1000μM）的神经毒性作用。在1mM浓度，谷氨酸使细胞存活降到约10%。在CNTF存在下（10μg/ml），细胞接触谷氨酸后，细胞存活有提高。

15.3  讨论已证明CNTF提高了培养物中几种不同神经元群体的存活与生长。另外，已证明类似CNTF的活性物能诱导培养物中来自胶质先祖细胞的类型-2星形细胞的分化（Hughes等人，1988，Nature 335：70-73，Lillien等人，1988，Neuron 1：485-494）。我们已提供在CNS中CNTF新作用的证据，也就是说，CNTF维持从E18海马状突起中分离出的神经元的体外存活。CNTF处理海马状突起的神经元能使对GABA摄取的增加，并伴随GAD酶活性的增加。在CNTF存在下，海马状培养物中神经丝蛋白质水平有类似的增加。剂量-应答研究表明这些各种标记之间有相关性，以及在0.1ng/ml CNTF时达到CNTF的最大效果。更高浓度的CNTF似乎得不到更大的效果。

200KDa形式，以及在较小程度上识别150KDa亚单位。以前曾证明，RT97的结合水平可能作为培养的神经元中神经突派生，尤其是轴突派生的任意指数（Doherty等人，1984，Neurosci.Lett.51：55-60）。用CNTF保持八天的海马状突起的培养物中存在一个稠密和复杂的突起网络。NF蛋白质相对量的这种增加对改善的神经元存活来说仅仅可能是次要的。换句话说，CNTF对诱导轴突派生可能具有选择性的影响。

CNTF促进存活活性的专一性曾通过研究海马状突起中存在的已知的其它神经营养性因子的作用进行过讨论（Maisonpierre等人，1990.Science  247：1446-1451）。以前的观测结果表明NGF不是海马状突起的神经元的存活因子，与此结果相一致的是，未能检测到NGF对GABAergic神经元的任何影响。神经营养性族中的另一个成员，BDNF，似乎也不会促进培养物中GABA  ergic神经元的存活。另一方面，已证明bFGF是海马状突起的一个重要的存活因子（Wallicke  et  al.，1986，PNAS  USA  83：3012-3016），并且已推断bFGF作为CNS的神经营养性因子的作用（Morrison  et  al.，1986，PNAS  USA  83：7537-7541;Anderson  et  al.，1988，Nature  332：360-361）。与bFGF相类似，CNTF在非常低的浓度下是有活性的。

已证明海马状突起受到几种神经退化错乱疾病的影响，其中包括Alzheimer病。现在还未弄清楚导致海马状突起产生选择性退化的基本机制。曾假定，兴奋性氨基酸神经递质谷氨酸可能在致病过程中起作用。论证CNTF可以维持海马状突起神经元体外存活，这对于设计治疗神经退化病的方法可能具有重要的意义。正如曾对FGF所作的观察一样（Mattson  et  al.，1986，PNAS  83：7537-7541），确定CNTF是否可以保护海马状突起神经元免受谷氨酸神经毒性是重要的。近来曾用Northern印迹分析检测海马状突起中的CNTF信使RNA（Masia  Kowski，个人通讯）。体内CNTF合成的细胞类型特异性至今仍未确定。在体内，CNTF对发育中的海马状突起的生理作用仍需继续证实，但根据本文的发现，CNTF可能是一种内生神经营养性因子，具有调节海马状突起的神经元存活的潜在作用。

16.实施例：大鼠CNTF提高培养物中鼠海马状突起的星形细胞增殖的速率16.1  材料和方法16.1.1  制备鼠海马状突起的星形细胞从E18鼠胚胎切割出海马状突起，并收集到含有24mM HEPEs的F10培养介质中（Gibco）。该组织切碎成小块并用0.25%胰蛋白酶（13海马状突起/5ml 0.25%胰蛋白酶）于37℃消化20分钟。在另外10分钟里加DNA酶，达到最终浓度为0.2mg/ml。其反应用等体积DME终止，该DME补充10%胎牛血清，其组织再洗涤两次。用轻度研磨得到的分离细胞收集到DME/FCS中，悬浮液通过20mm Nitex筛（Tetko）除去原料中的碎块。用锥虫兰排斥法测定细胞生存性。然后将细胞培养于组织培养塑料T75瓶中，浓度为4.82×106细胞/瓶。在培养的第1、3、5、7和9天分别用DME-FCS（10ml）更换培养介质。在第7天和第9天，用手摇瓶除去少突神经胶质细胞和任何存活的神经元。在第10天，用0.25%胰蛋白酶除去星形细胞，并用培养于96孔平板上供试验。

16.1.2.在鼠的海马状突起星形细胞中CNTF有丝分裂试验对于有丝分裂试验，以密度为16000细胞/孔将星形细胞培养于含有10%胎牛血清的介质（DMEM）中4小时，使细胞粘连。然后清洗细胞，再加150μl规定的介质（DMEM，0.5% BSA）。将如上述第7节实施例所述制备的重组鼠CNTF加入介质中24小时。在24小时培养期的最后2个小时，用1μc/孔3H-胸苷（NEN，20ci/mM）标记上述细胞。培养之后，细胞作如下处理：用PBS洗涤培养孔两次，并在50ml 10%三氯乙酸（TCA）中于4℃培养过夜。除去TCA后，用冷水洗涤细胞，溶于100μl 1N NaOH中，并在10ml水溶胶中用液体闪烁计数器计数。

16.1.3（125I）CNTF结合试验在37mm2培养皿中使海马状突起星形细胞生长达到约80-90%连生。星形细胞单层首先用Ham′s F-12培养质清洗两次，然后加Ham′s F-12（1ml），细胞在冰上培养15分钟。再用等体积的冷Ham′s更换培养介质。在作为非竞争结合测定的井孔里，加入未标记CNTF（100×过量的未标记CNTF），并在4℃将培养物再培养物60分钟。在每份培养物中加入125I-CNTF（用Bolton-Hunter试剂制备，10μl含每毫微摩尔约112μci的280，000dpm），再在4℃继续培养不同的时间，最高达60分钟。用含10mg/ml BSA的冷PBS溶液洗涤细胞3次（每次2ml）除去未结合的CNTF。然后将该培养物在室温下在0.5ml 20mM Tris-HCl，pH7.2，0.15M  NaCl，1%Triton，0.1%SDS，1%脱氧胆酸盐中培养至少20分钟，使细胞溶解。除去细胞裂解物，并用含10μl/ml  BSA的PBS清洗培养物二次（每次250μl）。将清洗液和细胞溶解产物一起收集，在γ计数器进行计数。

16.2  结果增殖试验的结果示于图39，其结果表示随着鼠海马状突起的星形细胞中CNTF浓度增加的双相剂量响应曲线。CNTF引起3H-胸苷掺入增加，直到剂量为0.01ng/ml。浓度高于0.1ng/ml时，CNTF失去刺激细胞增殖的能力。

星形细胞对CNTF的生物响应表明这些细胞具有功能性CNTF受体。另外两个证据支持起初的发现，类1星形细胞表达它们细胞表面上CNTF受体。在单层培养物中用（125I）CNTF进行的结合试验证明可竞争的配体-受体的位置;所观察到的最大特异结合的125I-CNTF约为加到每种培养物中的总CNTF的1%。此外，Northern印迹分析表明CNTF强烈地诱导很早的基因C-fos的表达。到1小时观察到最大的mRNA诱导作用，而到2小时则返回到正常的基部水平。

17.实施例：睫状神经营养性因子的新单克隆抗体和人体睫状神经营养性因子的双抗体夹层试验17.1  材料与方法17.1.1睫状神经营养性因子的单克隆抗体的产生17.1.1.1  免疫方法用完全的弗氏佐剂中的10-40μg重组人CNTF（按实施例12中描述的方法制得的）接种CB6F1/J雌鼠，然后用完全弗氏佐剂的rCNTF再接种，每三星期一次，直到约6个月。

17·1·1·2杂种瘤的形成用PEG4000将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按2∶1比例（淋巴细胞∶骨髓瘤细胞）融合，然后在有2%HAT（次黄嘌呤，氨蝶呤、胸苷）的完全RPMI中，细胞密度为每井孔约105淋巴细胞培养细胞12选择杂交瘤。

17·1·1·3筛选对CNTF具反应性的杂交瘤用与塑料试验盘结合的重组体hCNTF，通过酶结合的免疫吸附剂试验（ELISA）对人体CNTF（hCNTF）反应性抗体进行初步鉴定。抗体与重组体hCNTF、重组体大鼠CNTF（rCNTF）以及下面叙述的修饰过的hCNTF的反应能力，进一步用ELISA和Western免疫吸附法表征。

17.1.2  人体CNTF变异体的制备人体CNTF的变异形式当通过在第13.1.2节中叙述的载体的表达与纯化产生的。简要地说，人体CNTF变异体蛋白质＃112是通过载体pRPN112的表达得到的，并在人体CNTF羧基末端上缺少55个氨基酸残基。蛋白质＃49是用pRPN59产生的，且缺少hCNTF的羧基端的15个氨基酸。蛋白质＃82是一种融合的蛋白质，其中缺失人体CNTF的开始的66个氨基酸，该分子的剩余部分融合到一种未鉴定的人体蛋白质（图22）。

17.1.3双位点免疫试验方法学为了测定生物原料样品中CNTF的量，对蛋白质进行免疫学分析试验是有利的。一种灵敏方便的免疫分析是双抗体夹层法（参见如E.Harlow和D.Lane，Anti  bodies：A  Laboratory  Manual.，1988，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  Spring  Harbor，NY，P.578-583）。在该方法，第一个抗体与固体载体结合，使它们能与含有相关抗原的溶液反应;然后将通常对应于该抗原上的不同表位的第二个抗体，与第一个抗体结合的抗原反应，并对所结合的第二个抗体的量（它应与结合的抗原的量成正比）进行定量。本方法的一个实施方式中第一个和第二个抗体两者都是单克隆抗体。

图40表示对人体CNTF进行的双位点分析。实质上，对鼠免疫球蛋白G的一个亚类（在所指的情况下为IgG2b）特异性的亲和纯化的第二抗体吸附到分析平板上，并用于从杂交瘤细胞的消耗尽的培养物上层清液中第一单克隆抗体（RP3-12，鼠的IgG2b）然后加人体CNTF，使其与第一种单克隆抗体结合。再加入与第一种单克隆抗体不同亚类的第二种抗-CNTF单克隆抗体（RP12-2，一种鼠的IgG1），该抗体来自未分离的杂交瘤培养物上层清液，并使其与由第一种单克隆抗体俘获的CNTF结合。任何结合的RP12-2分子按如下方法检测，使用对鼠IgG1特异性的亲合-纯化的第二抗体，与碱性磷酸酶结合，然后用磷酸酶底物对硝基苯磷酸酯培养，磷酸酯分裂产生有颜色的反应产物（测定405nm处的吸收值）。

17.2结果与讨论用RP3-12和RP3-17表示的该类单克隆抗体是利用单次免疫老鼠的脾细胞由同样的融合试验产生的。RP3-12和RP3-17两者都不与试验用的两个羧基末端缺失的hCNTF中的任何一个反应，而且也不与表Ⅴ中所列的大鼠CNTF结合。然而，它们与融合蛋白质＃82反应，该融合蛋白质＃82中保留有hCNTF羧基末端。因此，这些抗体识别位于hCNTF羧基末端附近的表位（或相近空间结构的表位），该表位位于hCNTF蛋白质＃59中缺失的羧基一端部的15个氨基酸残基片段内或与该片段重叠，相反地，单克隆抗体RP12-2和RP12-9与hCNTF蛋白质＃59和hCNTF蛋白质＃112两者反应，也与融合蛋白质＃82反应。因此，这两种抗体应该识别大约位于在hCNTF的66位氨基酸与145位氨基酸的表位。其图谱资料表明，由RP12-2和RP12-9识别的表位应该是由RP3-12或RP3-17识别的表位上游至少约40个氨基酸残基（图22）。RP12-2与RP12-9抗体（表Ⅴ）在于识别大鼠CNTF的能力上的差别，意味着它们识别不同的表位，其中之一（由RP12-9识别的）在啮齿动物和灵长类动物中或许很好地保存着。在Western免疫吸印测定法中，所有这些单克隆抗体有与变性CNTF结合的能力，由此可假定它们识别单一的表位，包括邻近的或间隔很近的氨基酸残基，而不是构象表位。

进行初步实验确定对hCNTF的成对单克隆抗体是否适应这种配体的双抗体夹层分析。在大规模生产或纯化这种抗体之前，设计一种试验来评价早期阶段的这种抗体，即利用亚类专一的抗鼠免疫球蛋白试剂使一种单克隆抗体固定到固体载体上，并分别测定第二种“指示器”单克隆抗体。由于要求两种单克隆抗体属于不同的亚类，仅仅某些单克隆抗体对能用这种方法评价。采用在已描述双位免疫测定法中的RP-3-12和RP-12-2这一对单克隆抗体可以得到极好的结果。图41示出二个抗体夹层试验结果，滴定时重组体人体CNTF的量逐渐增加（通过两个因子）由每次试验7.8微微克（0.156ng/ml为50μl）增加到每次试验500微微克（10ng/ml为50μl）。用15.6微微克人体CNTF就可测得背景（0.044±0.010吸收单位）上的可信信号，并且直到所试验的最高水平，其试验结果都是线性的。用适当亚类的不相于的鼠骨髓瘤蛋白质取代该单克隆抗体中的任何一种（Mopc-141，一种IgG2b，取代RP3-12;或Mopc-21，一种IgG1，取代RP12-2）都使信号降低到背景水平。

因此，甚至使用未经纯化的培养物上层清液，用单克隆抗体RP3-12和RP12-2都可以证明人体CNTF的双抗体夹层试验极好。这些单克隆抗体都可用常规的方法由在无血清的介质中生长的杂交瘤细胞的上层清液中纯化得到。可以预料将更直接地研制一种较简单的夹层试验，其中一种单克隆抗体可以直接与固体载体结合，而第二种抗体将直接接到指示器上（例如：如放射性同位素125碘，或一种酶，如碱性磷酸酶，辣根过氧化酶，或β-半乳糖苷酶;或一种半抗原，如生物素，它可用标记的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白测定），因此避免需要类型专一的第二种抗体。

这里描述的高专一性的灵敏抗体夹层测定法在很多情况下都可使用，在这些情况下希望定量测定人体CNTF的存在。例如，可以用于纯化步骤中监测人体CNTF。同样地，该测定方法可以用于监测在注射到实验动物之后的CNTF，以确定它所定位的组织。最后，该测定方法还可以用于测定健康人与病人的人体组织和/或体液（如：血清或脑脊髓液）中CNTF的水平。因为发现CNTF在神经细胞内，并且具有神经营养性活性，表明在对各种类型神经损伤或疾病的应答中释放该蛋白质。因此，合适的胞外液中CNTF水平所以为诸如神经病或神经元退化之类的症状提供定量的诊断性测量。

18.睫状神经营养性因子促进培养物中脊髓运动神经元的存活18.1材料与方法18.1.1组织培养技术在立体显微镜下，从发育六天的鸡胚胎的脊髓索的腹部切下运动神经柱，贮存在补充有葡萄糖（4g/l）冷的无钙镁的Hanks平衡的盐溶液（HBSS）中。组织用HBSS洗涤，在轻度摇动下于37℃用0.03%胰蛋白酶在HBSS溶液中处理20分钟，用冷的HBSS清洗，在1ml 0.1%冷的大豆胰蛋白酶抑制剂（Sigma）的HBSS溶液中，用8孔搅拌器进行3个步骤的轻度研磨后，通过烧边的硅化巴斯德移液管。每份上层细胞悬浮液用50μm尼龙筛过滤，收集并倒到置于12ml硅化锥形玻璃管管中的溶于HBSS-25mM HEPES（pH7.4）的4ml 6.8%的冷的metrizamide（Fluka）上。该管于4℃用400g离心15分钟，并将中间层（0.5ml）收集到另一个装有6.5ml冷培养介质的硅化管，该介质是补充葡萄糖（4g/l）的Leibovitz′s L-15培养介质（Gibco）。0.15M碳酸氢钠、热失活的和已过滤的马血清和青霉素G（105单位/ml）的混合物，其比例为75∶15∶10∶0.1，新鲜制备并用5%CO2缓冲。在4℃以100×g离心7分钟后，除去上清液，再将细胞缓慢地再悬浮在培养介质中，并在Greiner 4-井培养皿（井直径，10mm，C.A.Greiner and Sohne GmbH，Nurtingen，West Germany）以1000-2000细胞/井密度平板培养。该皿已用聚-DL-鸟氨酸（Sigma，在0.15M硼酸钠缓冲液（pH8.3）中0.5mg）在4℃预覆盖过夜，再用磷酸盐缓冲的盐水（PBS）清洗，其后用昆布氨酸（Gibco;溶于血清已除去的培养介质中为10μg/ml）覆盖，再放到5%CO2-培养箱中直到细胞平板培养（5-6小时）。细胞于37℃在潮湿的5% CO2-和95%空气的培养器中培养。在平板培养后1小时加入样品，在24小时和72小时后更换培养介质。在平板培养后3小时计算初始的细胞数。

18.1.2.退化标记运动神经元与估算运动神经元培养物的纯度在某些实验中，细胞制备前在体内用荧光染料退化标记运动神经元（U.Dohrman等人，1986，Dev.Biol.118：209-221）以鉴定运动神经元细胞群体。在培育了5天的蛋壳上打一个小孔，将小片若丹明异硫氰酸盐晶体（Sigma）在二个或三个位置上插入各个后肢大腿中，其蛋壳孔用玻璃纸带封住。该蛋再培养24小时，在甲醛固定之后，一将处理过的胚胎制成冷冻切片。在脊髓索内，仅发现侧运动神经元柱被标记。对于使用上述方法（18.1.1）制备细胞时使用其他胚胎。在培养5小时后，细胞用温热的HBSS清洗，用含4%甲醛的PBS溶液于室温固定20分钟，用PBS清洗，然后用玻璃盖片置到甘油-PBS（1∶1）中。细胞总数的约83%被标记，并鉴定如图42运动神经。这些标记的运动神经大部分都是大细胞，其余的是中等大小的细胞。小细胞没有被标记。另一方面，在荧光染料未标记细胞的实验中，细胞总数中近70%是具有园细胞体的大的相一亮细胞，约20%是中间大小神经元（其中大部分可能是运动神经元）和约10%是小的未成熟神经元（它们同生长锥体具有类似神经元的突起，而具有相一暗半平细胞体）。非神经元细胞或者不存在，或者总计不到2%。一并参考，人们可以得出结论，至少83%的细胞是运动神经元，而其余的由非标记的运动神经元，及少量未鉴定的中等大小神经元和约10%未成熟的小神经元组成。我们还发现，如果用鸡的胚胎肌提取物培养已标记的细胞（U.Dohrman等人，1986，DeV.Biol.118：209-211），其荧光-阳性细胞数在数天内降低。因为总细胞数或大细胞数减少慢得多，这表示荧光的损失和/或衰减而不是细胞死亡。因此，要估算常规试验中样品的存在活性，大的相-明亮细胞而不是荧光阳性细胞计数作为运动神经元。

18.2  结果与讨论18.2.1睫状神经营养性因子（CNTF）对培养物中鸡胚胎脊髓运动神经元的影响空白对照的培养物中，大部分运动神经元在3天内死亡。在重组鼠CNTF存在下，3天后培养物中约70%是活的，6天后培养物约60%是活的（图43和图44）。因为空白对照中大部分运动神经元在3天内死去，所以存活活性在第3天计算。CNTF的浓度-响应曲线（图45）表明，CNTF的EC50（存活50%所要求的浓度）是如约20pg/ml（1PM）一样低，几乎与在睫状神经元的结果相同。EC50很低的CNTF，其存活活性很大，这可充分地认为，正如已证明的那样（参见上面的实施例11;Sendtner等人，1990，Nature 345：440-441），CNTF对体内运动神经元存活可能起关键作用。

18.2.2特定的神经营养性分子与细胞运动的存活影响在所有已试验的分子中，CNTF和碱性成纤维细胞生长因子（FGF）证明是最有效的分子（表Ⅵ）。当培养物补充有肝素时，酸性FGF的存活活性可能增加，肝素干扰酸性FGF的蛋白水解降解。类似胰岛素的生长因子（IGF）Ⅰ和Ⅱ和胰岛素都显示小的影响，这些活性分子的浓度-响应曲线（图46）表明，可以用下述条件得到最高的存活作用：（a）1ng/ml的CNTF＝64%存活;（b）30ng/ml的碱性FGF＝51%;（c）300ng/ml的酸性FGF＝18%;（d）在1μg/ml肝素存在下，100ng/ml酸性FGF＝35%;（e）100ng/ml的IGF-Ⅰ＝15%;（f）300ng/ml的IGF-Ⅱ＝15%;（g）25μg/ml的胰岛素＝16%。CNTF的EC50值是0.023ng/ml与碱性FGF的是0.26ng/ml。对于IGFⅠ和Ⅱ以及胰岛素，可信的EC50值还不能测出来，因为与对照相比时，其最大的效果也是很小的。

肝素的浓度对提高酸性FGF的活性是至关重要的。本实验中使用的浓度（1μg/ml），相对于提高酸性FGF的存活活性来说似乎不是最大。然而，较高的肝素浓度造成神经元脱离培养盘。甚至肝素浓度为1μg/ml，在培养3天后吸附的神经元就开始脱离。甚至当使用超最大浓度（相对于对其他类细胞的生物学作用）时，βNGF、BDNF、pDGF、EGF、TGFa、TFGβ1、IL-1β、IL-3或IL-6或IFNc都没有可察觉的作用。在这些试验中也使用NT-3，一种NGF-BDNF基因族中新的神经营养性分子。由支持培养物中胚胎结节状神经节的神经元的存活的已转染COS-细胞，产生的NT-3蛋白质的浓度似乎对运动神经元没有存活作用。

18.2.3.CNTF、碱性FGF与IGF-Ⅰ结合CNTF与碱性FGF在最佳浓度下结合导致在一星期以上期间运动神经元100%存活（表Ⅶ）。CNTF、碱性FGF和IGF-Ⅰ的结合也得到完全相同结果。IGF-Ⅰ本身的作用是小的（表Ⅵ），但是当它与CNTF和/或碱性FGF之任何一个组合时都变更明显（表Ⅶ）。

表Ⅵ已知分子的运动神经元存活活性分子浓度存活a对照  -bNGF（鼠）  10μg/ml  -BDNF（猪）  10μg/ml  -NT-3  -CNTF（鼠，rec.）  500pg/ml  +++碱性FGF（人，rec.）  10ng/ml  ++酸性FGF（人体，rec）  300ng/ml  ±酸性FGF+肝素  100ng/ml+1μg/ml  ++pDGF（rec.）  5ng/ml  -EGF（鼠）  10ng/ml  -TGFa（人体，rec.）  10ng/ml  -TGFβ1（猪，rec.）  5ng/ml  -IL-1β（人体，rec.）  100单位/ml  -IL-3（鼠，rec.）  100单位/ml  -IL-6（鼠，rec.）  50单位/ml  -

表Ⅵ（续）分子浓度存活aIFNc（鼠，rec.）  1000单位/ml  -IGF-Ⅰ（人体，rec.）  100ng/ml  ±IGF-Ⅱ（人体，rec.）  300ng/ml  ±胰岛素（牛的）  25μg/ml  ±转铁蛋白（人体）  100lg/ml  -a：培养3天后测定的存活活性，并用-～+++估算：-：与对照无显著差别（存活：8.3±3.8%，平均值±SD，n＝18）;±：约15-20%（与每个空白对照有统计学上的显著差异，P＜0.01）;++：约35-55%;+++：约55-75%。由不同试验的结果合并得到这些结果。

rec：为重组体。

表ⅦCNTF、碱性FGF和IGF-Ⅱ的附加作用因子运动神经元存活（%）a对照  4.8±1.0IGF-Ⅰ（1μg/ml） 14.5±0.5＊＊碱性FGF（30ng/ml）  51.9±3.6CNTF（1.5ng/ml）  60.7±5.8碱性FGF+IGF-Ⅰ 76.1±4.1＊＊CNTF+IGF-Ⅰ 87.0±4.5＊碱性FGF+CNTF  98.2±3.0碱性FGF+CNTF+IGF-Ⅰ 102.5±5.3NS

a：在培养3天后。由计算相应于每个井底之23%的面积内细胞数来测定运动神经元的存活。平均值±SEM（n＝4）。＊，P＜0.05;＊＊，P＜0.01;NS，不显著。t-试验结果仅表示有或没有IGF-Ⅰ的值之间的比较，因为IGF-Ⅰ的作用是相当小的。任何其他有意义的比较中的差异都是显著的（P＜0.01）。

19.微生物的寄存下面的重组噬菌体和重组质粒DNA保藏于美国典型培养物收集中心12301Parklawn  Drive，Rockville，Maryland  20852。

ATCC登记号  寄存日期质粒  PCP-r-CNTF-C-1  40655  89.9.12质粒  pCMV-rCNTF-C-1  40656  89.9.12噬菌体  λhCNTF-G-1  40657  89.9.12杂交瘤  RP3-12  90.8.15杂交瘤  RP12-2  90.8.15以下重组体质粒DNA寄存于农业研究培养物收集处（NRRL）Northern  Regional  Research  Center，1815  North  University  Street，Peoria，Illinois  61640。

NRRL登记号  寄存日期质粒  pRPN38  90.8.15质粒  pRPN40  90.8.15本发明的范围并不受到在这里描述的特殊实施方式的限制。的确，除了这里所叙述的以外的本发明的各种改进，本技术领域的技术人员根据前面的叙述和附图，都将变得是显然易见的。计划进行的这种改进都落在所附权利要求的范围之内。

这里引用了各种出版物，所公开的内容，完整地作为本发明的参考文献。