1.引言

本发明涉及神经营养因子-3（neurotrophin-3）（NT-3），一种新发现的神经营养因子，它是BDNF/NGF基因家族的一员。编码NT-3的基因已被克隆和序列分析，而且，重组的NT-3已在哺乳动物细胞中被表达。已发现重组的NT-3具有一系列不同于BDNF和NGF的生物学活性。本发明提供了编码NT-3的核酸序列，并用它来大量生产基本上纯净的NT-3蛋白质、肽片段或衍生物，以及针对NT-3蛋白或肽的抗体。本发明的NT-3基因产物可用于多种神经性疾病的诊断和治疗，特别是外周神经病、阿尔茨海默氏病及帕金森病。

2.本发明的背景

2.1  神经营养因子在神经系统中的作用

神经系统的发育和维持依赖于已知为神经营养因子的蛋白质。伴随着中枢和外周神经系统的正常发育的大量神经元细胞的死亡，显然在调节突入特定靶区的神经元数量方面起着关键作用（Berg，D.K.，1982，Neuronal  Development  297-331;Cowan等，1984，225：1258-65）。发育期间的外周靶组织的切除和移植研究表明，神经元细胞死亡是由于神经元之间竞争由突出区产生的数量有限的存活因子（“神经营养因子”）而导致的。这些观察导致了神经生长因子（NGF）的鉴定，它们是描述 最清楚的神经营养分子（Levi-Montalcini  and  Angeletti，P.U.，1968，Physiol.Rev。48：534-69;Thoenen，H.and  Barde，Y.～A.，1980，Rev.60：1284-335）。雄性小鼠颌下腺中这种蛋白丰富来源的偶然发现，大大帮助了对NGF活性的作用和机理的认识，也使得NGF能被提纯和克隆（Ullrich等，1983，Nature  303∶821-5;Scott等，1983，Nature302∶538-40），并生产出中和抗体。由于NGF只能维持有限几个神经元群落，所以长期以来人们一直认为还有其它的神经营养因子存在（Varon，S.和Adler，R.1981，Adv.Cellular  Neurobiol.2∶115-63;Barde等，1987，Prog  Brain  Res  71∶185-9;Snider，W.D.和Johnson，E.M.，1989，Ann.Neurol.26∶489-506）。然而，现在已经很清楚，这种因子的确存在，但它们的含量极少，妨碍了对其进行分子鉴定。不过，由于提纯了两种少量的此类蛋白质，即：脑衍生的神经营养因子（BDNF）和睫状神经营养因子（CNTF），使得最近完成了它们的部分核酸序列分析（Leibrock等，1989，Nature  341∶149-52;Stockli等，1989，Nature  342∶21-28和Lin等，1989，Science  246∶1023-25）。尽管不同的神经元群落具有特异性，BDNF和NGF（不是CNTF）表现出足够的结构同源性而被认为是同一基因家族的成员（Leibrock等，1989，Nature  341∶149-52）。

2.2其他的神经营养因子

在过去10年中，有许多关于多种组织提取物在很多不同细胞类型的特定培养基中表现神经营养活性的报道。然而，在几乎所有的报道中，提纯和鉴定这些活性方面的进展都受到这种活性是以极微量的形式存在这样一个事实的妨碍，其含量在每克组织微微克-毫微克的范围内。

此外，尽管外周神经元的适当的生物鉴定已经建立起来了，但是在设计可靠的、能重现的和专一的中枢神经系统神经元的鉴定方面却证明是成问题的。虽然已发现单一类型的外周神经元是不连续的、易于解剖的神经节，中枢神经系统（CNS）神经元在分布上却总是高度不均一的。因此，无论特定种类CNS神经元的鉴定还是浓缩都需要专一的标记物。在生产这类标记物例如针对细胞表面或细胞骨架组分的抗体，或组织学染料方面，进展是很有限的。因此，对于下述神经营养因子的特征描述已被证明为异常困难的过程：这些神经营养因子（1）不如NGF丰富，（2）难于鉴定，（3）没有足够的量诱发抗体产生。

2.2.1  脑衍生的生长因子与

神经生长因子的比较

已经证明，在培养过大鼠C-6神经胶质瘤细胞的“调节的培养基”中，神经营养活动能够维持胚状小鸡背根神经节神经元在体外存活（Barde等，1978，Nature  274∶818）。神经营养活性没有被小鼠NGF的抗体中和，这一事实表明，在“调节的培养基”中还存在着另一种神经营养因子。随后又报道了在正常成年大鼠脑星形神经胶质细胞的培养物中（Lindsay，1979，Nature  282∶80-82;Lindsay等，1982， Brain  Res.243∶329-343）和在发育中的及成年的大鼠脑（Barde等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77∶1199-1203）以及发育中的和成熟的小鸡脊髓索（Lindsay和Peters，1984，Neurosci.12∶45-51）的提取物中不能被NGF的抗体阻止的类似活动。然而，在任何情况下都没有分离或鉴定出起作用的因子，而且，关于所观察到的活性是由同一种还是由不同种类的因子引起的也还存在着疑问。

采用猪脑作为原始材料，Barde等人（1982，EMBOJ.1∶549-553）报道了一种因子，现在被定名为脑衍生的神经营养因子（BDNF），它表现出促进由E10/E11小鸡胚胎取得的背根神经节神经元生存的功能。已经发现，该神经营养行为归于一种强碱性蛋白质（等电点PI＞10.1），这种蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶电泳中，呈分子量为12.3KD的单一谱带移动。纯化的因子估计为1.4×106，但产率很低，从1.5公斤猪脑中大概只能提纯大约1μg BDNF。而且，因为提纯过程的最后一步是制备凝胶电泳，BDNF的活性由于残余SDS的存在不能够完全恢复次级结构（Barde和Thoenen，1985，“Hormones and Cell Regulation”，第9卷，Dumont等，eds.Elsevier Science Publishers，pp.385-390）。人们发现，BDNF的强碱性和分子大小与NGF单体非常相似。不过，BDNF在以下方面表现出与已知的NGF的特性不同的特性：（a）在小鸡后根神经节的生物学试验中，NGF的抗体对于BDNF的生物学活性无明显影响;（b）在同一 实验中，BDNF和NGF的作用是加性的;（c）与NGF不同，我们发现BDNF对E12小鸡交感神经元的存活没有作用。另外，在早期对脑提取物的研究中，观察到在这些来源中的神经营养活性表现出在发育的后期作用于感觉神经元，而不是与NGF相关。利用在聚阳离子基质如聚赖氨酸和聚鸟氨酸上培养的小鸡胚神经元的解离培养物，我们发现BDNF能维持30%以上E10-11（胚胎期10或11天）后根神经节神经元的存活，但是，对E6的同一种神经元的存活似乎只有很小的作用（Barde等，1980，Proc、Natl、Acad、U.S.A.77∶1199-1203，见上文）。在类似条件下，NGF能维持30-40%的E6DRG神经元存活。有趣的是，后来又发现当在由胞外基质糖蛋白昆布氨酸覆盖的基质上培养时，无论NGF还是BDNF均能维持大约50%的来自胚龄为E6-E12的小鸡胚的DRG神经元存活（Lindsay等，1985，Develop.Biol.112∶319-328）。在后来的研究中发现，NGF和BDNF的作用在二者的浓度为饱和时是加性的。

Levi-Montalcini所作关于NGF神经元的特性的早期研究（1966，The  Harvey  Lectures  60∶217-259）表明，NGF并不是一种普遍存在的神经营养因子，甚至对感觉神经元来说也是如此。因为NGF似乎对小鸡的某些颅侧感觉神经节的神经元没有作用，尤其是第10颅侧神经的结状神经节。后来的体内研究（Johnson等，1980，Science  210：916-918，Pearson等，1983，Develop.Biol.96：32-36）表明，在胚胎发生过程中NGF丧失对于大鼠的大多数 颅侧感觉神经节的神经元的存活没有作用，而类似的处理却能大大减少由神经脊产生的感觉神经节中的神经元数。更详细的体外研究（Lindsay和Rohrer，1985，Develop.Biol.112：30-48，Davies和Lindsay，1985，Develop.Biol.111：62-72;Lindsay等，1985，J.Cell.Sci  Suppl.3：115-129）清楚地表明，NGF能维持多数由神经脊产生的感觉神经元存活，但对由神经基板产生的颅侧感觉神经元的存活无明显作用。

BDNF的神经元特性不同于NGF的第一个证明是提纯的BDNF能够维持40-50%的由E6、E9或E12的小鸡胚的神经基板产生的结状神经节解离的感觉神经元的存活的体外实验（Lindsay等，1985，J.Cell.Sci.Supp.3：115-129）。NGF无论是独自还是与BDNF同时使用都对这些神经元无显著作用。随后的外植体培养研究又表明，BDNF似乎能维持来自其它由神经基板产生的感觉神经节的存活和轴突赘疣，包括岩部神经节、膝状神经节和腹外侧的三叉神经节（Davies等，1986，J.Neurosci.6：1897-1904），其中没有发现对NGF敏感的。在所有上述研究中，NGF的中和抗体对所观察到的BDNF的活性没有影响。除了其对来自外周神经节的培养的神经元的作用以外，还发现BDNF能促进由鹌鹑神经脊培养的细胞的存活和神经元分化（Kalcheim和Gendreau，1988，Develop.Brain  Res.41：79-86）。

在本发明之前，由于不能生产足够数量的用于免疫接种的BDNF，妨碍了制备用于与抗NGF抗体比较它们对神经元群体的 影响的抗BDNF抗体并排除了BDNF/NGF交叉中和实验的可能性。不过，有关BDNF的两个近期研究（Kalcheim等，1987，EMBO  J.6：2871-2873;Hofer和Barde，1988，Nature  331：261-262）已经证明了BDNF在鸟类PNS发育中的生理作用。如果把一个机械屏障放在E3/E4DRG（胚胎期为3天或4天的后根神经节）与它们在神经管中的中枢神经系统（CNS）靶之间，可以观察到许多DRG神经元死亡（Kalcheim和Le  Douarin，1986，Develop.Biol：116：451-466）。有人假设，这些神经元的死亡可能是由于一个CNS（神经管）产生的神经营养因子的丧失引起的。随后就观察到，附着在一种由昆布氨酸覆盖的Sialastic膜上的BDNF能够防止这些细胞死亡（Kalcheim等，1987，EMBO  J.6：2871-2873）。已经发现，将BDNF注射到发育中的鹌鹑蛋中，能够减少结状神经节中自然发生的细胞死亡，采用NGF时未能观察到类似效果（Hofer和Barde，1988，Nature  331：261-262）。除了BDNF对起源于神经脊和神经基板的外周感觉神经元的作用以外，还发现它能维持发育中的CNS神经元存活。Johnson等（1986，J.Neurosci.6：3031-3938）提供的资料表明，BDNF能够维持由E17大鼠胚胎培养的视网膜神经节细胞的存活。它扩展了以前的关于经过调节的培养基和从视网膜神经节细胞的靶区制备了脑提取物似乎能够维持这些神经元存活的研究（McCaffery等，1982，Ex.Brain  Res.48：37-386;Sarthy等，1983，J.Neurosci.3：

2532-2544;Turner等，1983，Dev.Brain  Res.6：77-83）。

除了BDNF对培养中的正在发育的神经元的作用之外，还已证明，它对培养的成熟的外周神经及中枢神经系统神经元有作用。尽管成熟的感觉神经元似乎不需要神经营养因子就能在体外存活3周或4周，但已经证明，BDNF以及NGF能够促进培养中的成熟的大鼠DRG神经元的轴突再生（Lindsay，1988，J.Neurosci.8：2394-2405）。此外，在成熟的大鼠视网膜培养物中，还观察到BDNF能促进来自视网膜神经节细胞的存活和轴突伸长（Thanos等，1989，Eur.J.Neurosci.1：19-26）。NGF和BDNF的生物学作用比较见表1。

表1

BDNF和NGF的生物学活性比较＊

外周神经系统 存活＊＊

BDNF  NGF

（ⅰ）E6小鸡DRG  -  ++

E10小鸡DRG  +  ++

E12小鸡交感神经  -  ++

（Barde等，1980，

见上文）

（ⅱ）E6-E12小鸡DRG  ++  ++

E6-E12小鸡节状神经  ++  -

E12小鸡交感神经  -  ++

E12小鸡睫状神经  -  -

（Lindsay等，

1985，见上文）

（ⅲ）E3-E14小鸡：

颈神经  +/++  ++

DM-三叉神经  +/++  ++

岩部神经  +/++  -

膝形神经  +/++  -

VL-三叉神经  ++  -

前庭神经  -  -

中脑神经  ++  -

（Davies等，1986，

见上文）（Barde等，

1987，Prog，

Brain  Res.7.1：

185-189）

中枢神经系统

（ⅰ）E17大鼠视网膜  ++  -

神经节细胞

（Johnson等，1986，

J.Neurosci.6：

3031-3038）

＊按照出版日期的年代顺序;体外测试的效果

＊＊不存活：（-）;中度存活：（+）;存活良好：（++）

2.2.2  脑衍生的神经营养

因子的神经元靶

已经发现;外周神经节的感觉神经元是由两个不同的、非稳态的胚胎学结构即神经脊和神经基板中的任一个产生的。神经脊似乎能够产生自主神经节和脊髓神经的感觉即DRG神经元和随体细胞。采用由Le  Douarin发明的鹌鹑/小鸡嵌合移植系统，研究了神经脊和神经基板对颅侧神经感觉神经节形成的供献（Le  Douarin，1973，Develop.Biol.20：217-222;Noden，1978，Develop.Biol.67：313-329;Narayanan和Narayanan，1980，Anat.Rec.196：71-82;Ayer-Le  Lievre和Le  Douarin，1982，Develop.Biol.94：291-310;D′Amico-Martel和Noden，1983，Am.J.Anat.166：445-468）。正如Lindsay等人所述（1985，J.Cell.Sci.Supp.3：115-129），目前，确信至少对鸟类来说，第7、9和10颅神经的远基神经节（分别为膝状神经节、岩部神经节和结状神经节）的神经元和第8颅神经的前庭听觉复合体的神经元是绝对起源于神经基板的。第5颅神经的三叉神经节含有起源于神经脊和神经基板的神经元（由基板产生的神经元在上下颌叶的腹侧极点中占有优势），而所有颅神经节的随体细胞都是起源于神经脊的。

通过采用外植体和脊髓和颅神经感觉神经元的解离的、富含神经元的培养物进行体外实验，已经发现起源于神经脊的感觉神经元对NGF有反应。相反，又观察到起源于神经基板（包括三叉神经节腹 侧部分的神经元和前庭、膝状、岩部及结状神经节的全部神经元群落）的神经元在胚胎发育的整个过程中基本上对NGF没有反应。已发现，与它们在对NGF的需要和反应上的差别相反，无论是起源于基板还是起源于神经脊的感觉神经元，（表1）对BDNF的促进存活和神经突的活性有反应（Lindsay等，1985，J.Cell.Sci.Supp。3：115-129;Lindsay等，1985，Develop.Biol.112：319-328;Kalcheim和Gendreau，1988，Develop.Brain  Res.41：79-86）。Tebar和Barde（1988，J.Neurosci.8：3337-3342）研究了用放射性标记的BDNF与小鸡胚胎背根神经节神经元的结合参数，他们的结果与存在着两类BDNF的受体的观点相符合，一类对BDNF有较高亲合力，另一类亲合力较低。在交感神经节神经元上没有观察到高亲合力受体。

Barde等人又进一步观察了BDNF的已知的神经元靶（1987，Prog.Brain  Res.71：185-189）。在本发明之前，由于缺少BDNF的专用的核酸或抗体探针，合成BDNF的细胞一直难于鉴定。制备BDNF的多克隆或单克隆抗体的努力一直没有成功。由于未能生产出抗体，BDNF的分子克隆也受到阻碍，还阻碍了确定除去BDNF后对发育中的体内神经元的生理影响、用免疫试验测定组织中的BDNF含量以及用免疫细胞化学方法定位BDNF。

表2

对BDNF有反应和无反应的神经元小结＊

A.有反应的神经元

Ⅰ.起源于神经脊的小鸡感觉神经元：

（a）脊根神经节

（b）颈神经节

（c）背中脉三叉神经节

（d）中脑三叉神经节＊＊

Ⅱ.起源于外胚基板的小鸡感觉神经元：

（a）结状神经节

（b）前庭神经节

（c）岩部神经节

（d）膝状神经节

（e）腹侧三叉神经节

Ⅲ.大鼠视网膜神经节细胞

Ⅳ.小鸡视网膜神经节细胞＊＊＊

B.无反应的神经元

Ⅰ.小鸡和大鼠交感神经元

Ⅱ.小鸡副交感神经睫状神经元

＊引自Barde等，1987，Prog.Brain Res。71：185-189

＊＊参见Davies等，1986，Nature 319：497-499

＊＊＊Rodriguez-Tebar等，1989，Dev.Biol.136：296-303

2.2.3.脑衍生的神经营养因子基因的克隆

第一次完成BDNF基因的克隆记载于1989年8月30日申 请的、申请号为07/400，591的美国专利申请中，这里引证该文献是为了从整体上作为参考。简言之，从猪脑中提取了极少量的BDNF蛋白质，使得能够确定随后可用于设计相应的低核苷酸的氨基酸序列的断片。这些合成的低核苷酸又被用作由产生BDNF的细胞制备的cDNA模板的聚合酶链式反应（PCR）的引物。PCR的产物被用作探针，使得来自很多物种（包括人、猪、大鼠和小鼠）的完整的cDNA和/或基因组的BDNF基因能实现克隆，而且这些基因的序列也得以确定。重组的BDNF基因在COS细胞中获得表达。

3.本发明的概述

本发明涉及神经营养因子-3（NT-3），BDNF基因家族的一个新发现的成员。它部分地基于BDNF和NGF同源区域的核酸序列的鉴定（美国专利申请NO.07/400，591，1989年8月30日申请，在此作为参考文献）。根据本发明，这些同源区域可被用来鉴定BDNF/NGF基因家族的新成员。这一套方法被用于鉴定NT-3。本发明提供了用这些方法鉴定的、与BDNF/NGF有关的新的神经营养因子的基因和基因产物。

本发明还部分涉及编码NT-3的重组DNA分子。在本发明的具体实施例中，编码NT-3的DNA来自人的DNA、小鼠DNA或大鼠DNA。本发明还提供了包括至少一部分基本上如图2（小鼠NT-3）、图7（大鼠NT-3）、或图11（人类NT-3）所述的核酸序列的重组DNA分子。本发明还提供了可用于生产重组NT-3蛋白质和有关的肽的重组DNA表达载体。

在另一个实施例中，本发明提供了NT-3蛋白质和有关的肽以 及用于生产和制备这些肽和蛋白质的方法。本发明还涉及针对NT-3蛋白质和肽的抗体。

根据本发明，NT-3可用于神经疾病的诊断和/或治疗，所述疾病包括（但不局限于）外周神经病如糖尿病神经病、毒性和营养性神经病、遗传性神经病和与爱滋病有关的神经病，以及变性疾病如阿尔茨海默氏病。已经证明，NT-3能维持多巴胺能神经元的存活，因此，在本发明的优选实施例中，NT-3可被用于帕金森病的治疗。因为已观察到NT-3表现出一系列与BDNF或NGF特性不同的活性，所以，NT-3提供了新的、有价值的用于诱发中枢神经系统的再生和修复的选择方案。

4.附图说明

图1是各种来源的BDNF和NGF的序列的比较。编码BDNF的基因的序列分析及其氨基酸顺序的推测表明，该蛋白质与NGF有许多结构上的相似之处。成熟的BDNF的初级序列、一般结构、以及起源于一种原始蛋白质的可能的发展模式充分表明，NGF和BDNF基因可能是由一个共同的原始基因演化来的。在成熟的多肽范围内，如果在NGF序列中只引入三个间隙以便使匹配达到最优化，就有总计51个氨基酸成员对于以前已知的来源于很多物种的NGF以及对于猪和人的BDNF是共同的。这些氨基酸成员包括全部六种半胱氨酸残基，这意味着，NGF和BDNF具有非常类似的次级结构。而且，还可以看出六个或更多氨基酸的四个片段，其中来自上面所列全部物种的NGF和猪的BDNF或者是相同的或者是只有不超过1个的保存的氨基酸被取代而不同。因此，有理由认为NGF和BDNF是同一个基因家族中关系密切的成员。

图2是老鼠NT-3的基因序列和推测的氨基酸序列。该氨基酸序列从出现在3个框架终止密码后面的第一个ATG密码处开始。下面划线的序列表示在第一轮PCR中所用引物的位置。仅有的N-糖基化交感序列下面划有双线，而箭头所指表示生产的、成熟NT-3的假定的起点。

图3是成熟的小鼠NT-3、NGF（Scott等，1983，Nature  302：538-540）和BDNF（Leibrock等，1989，Nature  341：149-152）之间的氨基酸序列比较。这里所示成熟的小鼠BDNF序列与猪的BDNF序列是100%一致的。粗体字母和阴影表示在所有3种蛋白质中同一位置上发现的氨基酸，而箭头是指向所有的半胱氨酸残基。星号是表示为了便于比较而引入的间隙。V1-V4表示由3个以上邻接的氨基酸组成的4个可变区域。

图4是小鼠NT-3mRNA的组织分布。将20μg总RNA施加于每一个带中，并同由32P标记的双链DNA探针杂交。（A）在所有组织中都能看到相当于大约1.4Kb的单一的谱带。最弱的信号出现在肺组织中，而最强的信号出现在心脏。骨骼肌是从大腿上获得的。（B）在脑中，最强的信号出现在海马和小脑中。

图5表示由胚胎期为8天的小鸡获取的结状神经节中分离出的感觉神经元的存活情况。5000个细胞被放在聚鸟氨酸-昆布氨酸基质上，24小时以后计数存活下来的神经元。这里所用BDNF的浓度是获得最大存活率所需最低浓度的3倍。在无添加剂或以1∶50比例稀释的带有非转染性COS细胞或用对照的DNA转染的细胞的调节培养基中没有发现神经元存活。

图6：（A）利用变性的1B和2C引物（称为R1B/2C）产生的PCR产物探测大鼠的基因组DNA中的新的基因-NT-3以及NGF和BDNF基因。（B）大鼠NT-3基因组克隆的限制性图谱。从大鼠的基因组库中分离出了两个专一与R1B/2C探针杂交的独立的噬菌体克隆。绘出了表示含有19.5Kb插入片段的这些克隆之一的限制性图谱。粗线条表示NT-3的开放阅读框架（ORF）（参见图7A）R1B/2C的位置也被标出来了。

图7表示大鼠NT-3的序列及其与大鼠NGF和大鼠BDNF的同源性。（A）NT-3的核苷酸序列和氨基酸序列。由NT-3基因编码的跨越ORF的DNA序列，翻译的氨基酸表示在DNA序列上面;星号标志着开放阅读框架的开始和结束。将氨基酸编号，+1位置被指定给成熟NT-3的第一个残基（119个氨基酸）。用于释放成熟NT-3的断裂位点就像正在该点上游的保留的糖基化位点一样被框起来。另一个潜在的断裂位点同样位于NGF中的假设的中间处理点（Darling等，1987，Cold  Spring  Harb  Symp  Quant，Biol.1：427-34）（但它在BDNF中没被保留）上，它被框起来并标有“？断裂”。成熟的NT-3中的6个半胱氨酸下画有线。NT-3的短的前体形式的甲硫氨酸起始密码（在-139处）正如文中所讨论的标有起始位点“B”起始位点上游内含子边缘在图中也被标出。（B）大鼠NGF和大鼠BDNF的大鼠NT-3序列。MacVector序列分析软件（从lnternational  Biotechnologies，lnc.购买）被用来产生带有NGF和BDNF基因的大鼠NT-30RF的矩阵排列（采用窗口大小为20以及20%的最小匹配）。沿着该矩阵对 角线所看到的明显的配对在NT-3蛋白质产物的图示下面被表示出来;与NGF和BDNF相比，在成熟的NT-3蛋白质上游可以看到两个同源区域，被称为Ⅰ和Ⅱ。如图中所示，区域Ⅰ延伸到用于形成较短的NT-3前体形式的“B”起始位点，它支持了存在一个较长的前体的论点。（C）NT-3、NGF和BDNF在同源区域Ⅰ和Ⅱ的序列比较。这些区域里的序列被排列成达到最大的同源性，为排列而插入的间隙用“-”表示。NGF或BDNF上与NT-3序列一致的部分均用“★”表示，而NGF与BDNF一致的部分在NGF序列中用“·”表示。序列上方的“+”号表示在大鼠NT-3和所有被检查的物种的NGF和BDNF序列之间被完全保留下来的残基。定义NGF的下列位点，以前是序测BDNF的，这里被推荐用于NT-3，表示如下：“B”起始位点甲硫氨酸起始密码子;断裂位点信号序列（Edwards.et  al.，1988，Mol.Cell.Biol.8：2456-64）;在BDNF中缺乏而在NT-3中存在的建议的NGF中间断裂位点;糖基化受体位点;释放成熟因子的分解蛋白的断裂位点。（D）成熟形式NT-3、BDNF和NGF的序列比较。保守的半胱氨酸在下面用黑体菱形加以强调。“★”、“·”和“-”的用法与C栏中一样。只在NGF序列中出现的C-末端断裂位点也被标出。

图8是用外植的小鸡胚胎（8天）神经节作试验时NGF、BDNF和NT-3活性的比较。在缺乏任何神经营养因子（对照物;A、E、I）或存在含有NGF（B、F、J）、BDNF（C、G、K）或NT-3（D、H、L）的COS细胞上清液的条件下培养了24小时（DRG和NG）或48小时（SG）的脊神经节（DRG） （图片A-D）、结状神经节（NG）（图片E-H）和交感链神经节（SG）（图I-L）的显微照片。在对照的培养物中（从假转染细胞中提取的500μl  COS细胞上清液）几乎没有轴突赘疣。NGF（10μl  COS细胞上清液）在DRG和SG上产生了大量的纤维状赘疣，但在NG上没有。将NGF  COS细胞上清液从20μl增加到500μl对NG没有产生影响。BDNF（10μl  COS细胞上清液）能在DRG和NG上产生纤维状赘疣，但在SG上不行;较大的用量（20-500μl）对SG也没有作用。NT-3（20μl  COS细胞上清液用于DRG和NG，200μl用于SG）能在所有三种类型的神经节上产生纤维状赘疣，尽管从SG上起初的生长比较缓慢、数量也较少。正如以前所描述的（Lindsay  et  al.，1985，Dev.Biol.112：319-28），神经节被作为外植体在添加有5%的马血清的F14培养基的胶原凝胶中培养（Lindsay  R.M.and  Rohrer，H.，1985，Dev.Biol.112：30-48）。比例尺（scale  bar）＝200μm。

图9是表示NT-3在高度浓缩的DRG神经元培养物中促进其存活和轴突赘疣。解离的小鸡胚胎（8天）。DRG用下述方式处理48小时的神经元浓缩（＞95%的神经元）培养物的显微照片：（A）来自假转染的COS细胞的上清液（500μl）或（B、C）来自被NT-3转染的细胞的上清液（50μl）。A和B是暗场显微照片。在A中（对照培养），培养的神经元存活率少于5%;在B中，经受住处理的神经元约为所培养的神经元的60%。从剂量反应曲线上来看，发现这是NT-3对小鸡E8DRG神经元的最大限度 的作用。（C）是如图B所示同一种培养物的较高放大倍数的相差显微照片。应当注意到有大量相明亮的神经元细胞体，并且实际上根本就没有任何非神经元细胞。培养物是按先前所述方法制备的（Lindsay  et  al.，1985，Dev.Biol.112：319-28）。比例尺（scale  bar）＝150μl（C）。

图10是在啮齿动物组织中表达的NT-3、NGF和BDNF的Northern吸引杂交结果比较。RNA（Auffray，C.and Rougeon，F.，1980，Eur J.Biochem.107：303-14）是从标出的大鼠组织（左图）或小鼠组织（右图）中制备的。从上述来源中获取的10微克RNA在1%的甲醛-琼脂糖凝胶上分离，并在10×SSC中被转移到尼龙膜上，三次Northern吸印的尼龙膜在68℃条件下分别与由32P标记的（Feinberg，A.P.and Vogelstein，B.，1984，Anal.Biochem.137：266-7）大鼠NT-3、大鼠BDNF和大鼠NGF DNA片段杂交（Mahmoudi，M.and Lin，V.K.1989，Biotechniques 7：331-3），然后在68℃条件下于2×SSC，0.1%SDS液中漂洗。NT-3、NGF和BDNF的DNA片段是由PCDM8中含有这些基因的表达结构上得到的，这些结构中的、大约775bp的Xhol插入片段在放射性标记之前是经过了凝胶纯化的。还包括一张用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色的凝胶的照片，以便比较每个样品的RNA总量。

图11是大鼠和人的NT-3基因的线性DNA序列。予计的翻译起始位点是用“PREPRO-11”表示，而予计的成熟的NT -3的起点用“MATURE-11”表示。成熟的大鼠和人的NT-3蛋白质具有相同的氨基酸序列，而它们的prepro区在11个位置上有差异，这些位置的下面划有线。

图12是通过代谢标记测定的人的NT-3多肽的表达。在60mm的培养皿中，每个培养皿接种COS-M5细胞5×105个，并在含有10%全牛血清（FBS）的完整DMEM培养基上于37℃条件下生长过夜。这些细胞用20μg含有由细胞巨化病毒启动子调节的人的NT-3基因的pC8-hN3（P1）质粒转染（采用Chen和Okayama所述的CaPO4方法，1987，Mol.Cell.Biol.7：2745-52），或进行假转染（无质粒DNA）。48小时以后冲洗细胞，并在1ml含有1%FBS、不含甲硫氨酸和半胱氨酸的DMEM中培育1小时。一种〔35S〕甲硫氨酸和〔35S〕半胱氨酸（各100μCi，购自New England Nuclear）的混合物被加进每个培养物中，细胞在37℃条件下再培养4小时，收集培养基。将50μl样品与25μl含有十二烷基硫酸钠（SDS）的强化样品缓冲液混合，煮沸5分钟，在有SDS的条件下于15%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳（Laemmli，1970，Nature 227：680-685）。这些蛋白质通过电泳（3小时，100mA）转移到尼龙膜（immobilon，购自Millipore）上，采用Towbin等人所述的缓冲液，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76：4350-4354。将该滤膜风干，并通过射线自显影术检测标记的蛋白质（在室温下16小时，采用Kodak X-AR胶片和Dupont公司生产的Cronex加强屏）。

图13是表示不含NT-3上清液（O）或含有稀释为1∶300、1∶100、1∶50或1∶25的NT-3上清液的各个培养物中存活的酪氨酸羟化酶细胞数量的柱状图。

图14除了浓度为900000细胞/皿外，是与上述图13符号用法一样的柱状图。

图15：A.NT-3、BDNF和NGF合成的转录本的比较。利用一种与所有三种转录本的5′端的共有序列同源的放射性标记的低核苷酸进行斑点杂交，结果证明，最初用分光光度方法测量，同等数量（2ng）的合成的NT-3、BDNF和NGF转录本被用作规定的标准。B.通过与规定的合成RNA标准比较确定从成年大鼠脑中制备的总RNA中NT-3、BDNF和NGF  mRNA的含量水平。从成年大鼠脑中提取出的10μg总RNA与4、10和20pg的与上述各种神经营养因子相应的合成转录本进行Northern吸印并同专用于每种神经营养因子的放射性标记的探针杂交。

图16是NT-3、BDNF、NGF和NGFR基因在从大鼠胚胎（A）、发育中的大鼠脑（B）和选择的产期和成体组织（C）中制备的总RNA（10μg/道）中的表达。组织：A.BR-在图1B中标准化的成体脑样品：PLAC-胎盘;EMB-整胚胎;SP.C-脊髓;THY-胸腺;LIV-肝脏;HRT-心脏;BR-脑。转录本的大小（以千碱基对（Kb）表示）表示在右侧。

图17是NT-3、BDNF、NGF和NGFR基因在从新生的（A）和成熟的（B）神经系统的不连接的区域中制备的总RNA（10μg/道）中的表达。区域：A.BR-在图1B中标准化的 成体脑样品;CBL-小脑;HBR-菱脑;MBR-中脑;DIEN-间脑;STR-纹状体;HIP-海马;CTX-新大脑皮质;OLF-嗅球;BR-没有小脑的整脑;ADR-肾上腺;RET-视网膜;SC.N.-坐骨神经;SP.C.-脊髓。

图18是对新生的和成熟的中枢神经系统（CNS）部位和外周组织中的NT-3、BDNF和NGF转录本含量的定量分析。对多个Northern吸印底片包括出现在图16、17和19中的底片进行光密度扫描分析（Maisonpierre  et  al.，1990，Science  247：1446～1451）以获得数据。所有含量水平都是相对于成体脑中神经营养因子含量标准化的;在成体脑中三种神经营养因子的含量相似（参见上下文），均被定为1。超过标度的值包括在断开的垂直柱的顶部。神经的和非神经的样品都表示在图中。样品：BRN-不包括小脑的脑;CBL-小脑;HBR-菱脑;MBR-中脑;DIE-间脑;STR-纹状体;HIP-海马;CTX-新大脑皮质;OLF-嗅球;SP.C.-脊髓;SC.N.-坐骨神经;RET-视网膜;ADR-肾上腺;HRT-心脏;LIV-肝脏;THY-胸腺;SKN-皮肤;MUS-骨骼肌;LNG-肺;INT-肠;KID-肾;SPL-脾。

图19表示NT-3、BDNF、NGF和NGFR基因在脊髓（A、E）、小脑（B、F）和海马（C、G）的发育过程中的表达。对从所示的发育时期制备的10μg总RNA中各种转录本的表达进行比较。神经营养因子转录水平的密度计定量分析表示在图E、F、G中。

5.本发明的详细描述

本发明涉及神经营养因子-3-BDNF/NGF神经营养分子家族的一个新成员，以及采用类似方法能被鉴定的BDNF/NGF家族的其它成员。为了使公开更清楚（而不是局限于此），本发明的详细说明将分成下列几个小部分：

（1）BDNF/NGF家族的附加成员的鉴定;

（2）NT-3的克隆;

（3）NT-3的表述;

（4）NT-3的生物学活性试验;

（5）NT-3基因和蛋白质;

（6）抗NT-3抗体的产生，以及

（7）本发明的利用。

5.1  BDNF/NGF家族中附加成员的鉴定：

NGF和BDNF是由大约120个氨基酸组成的、拥有约50%相同的氨基酸序列的碱性蛋白质，包括绝对保守的6个半胱胺酸残基，发现它在有活性的NGF中形成3个二硫桥（Bradshaw，A.，1978，Ann.Reu.Biochem.47：191-216;Leibrock等，1989，Nature  341：149-527。由进化上分枝的物种得到的NGF的序列的比较已经揭示出在这些半胱氨酸残基两侧的氨基酸构成分子中最保守的区域（Meier等，1986，EMBO  J.5：1489-93;Selby等，1987，J.Neurosci.Res.18：293-8）。很明显，它们也是BDNF与NGF之间最为相似的区域（Leibrock等，1989，Nature  341：149-52）。

寻找BDNF/NGF基因家族的其它成员的合适方法，可以通 过利用NGF和BDNF之间存在着高度同源的保守片段的途径来实现。例如，BDNF基因家族的其它成员可按下述方法鉴定：从各种各样的核酸序列中选择与BDNF和NGF同源的序列;并进一步从所选定的序列中鉴定出那些含有与NGF和BDNF不同源的核酸序列的序列。“不同源”一词可以解释为一个至少含有6个核苷酸的区域，其中至少约2个核苷酸不同于NGF和BDNF序列。

本发明还涉及与BDNF和NT-3同源或者与NGF和NT-3同源、但也含有与BDNF和NT-3或与NGF和NT-3分别不同源的区域的DNA分子。BDNF/NGF/NT-3基因家族的这些附加成员可以用与同源区域相一致的分子探针来鉴定。通过进一步分析，发现BDNF/NGF/NT-3基因家族的这些成员具有与BDNF/NGF/NT-3基因家族的已知成员的序列不同的序列。

例如，本发明的一个优选的特别实施例提供了如下方法。与下面表Ⅲ中所列的四个保守片段（“框架”）的每一个的序列相应，大约10-20个核苷酸的几组变性的低核苷酸探针可以被合成，表示出现在NGF或BDNF中的氨基酸的、约3-7个连续密码子的所有可能的编码序列。相对于成熟多肽的氨基末端进行编号（以使前体BDNF中的His  134在成熟的蛋白质中被当作Hisl看待），四个框架可以表示如下（相对于人的成熟蛋白质编号）：

表3

框架1：  NGF  Gly10  -Ser19

BDNF  Gly8  -Ser17

框架2：  NGF  LyS50  -CyS58

BDNF  LyS50  -CyS58

框架3：  NGF  Gly67  -Asp72

BDNF  Gly67  -Asp72

框架4：  NGF  Trp99  -CyS110

BDNF  Trp100  -CyS111

由表3中所列框架的序列对产生的合成低聚核苷酸可被用作引物，通过来源于有潜在用途的PCR序列（RNA或DNA）来进行扩增。这可能包括来源于能够表达一种与BDNF或NGF密切相关的多肽的任何真核生物的mRNA.cDNA或基因组DNA。通过进行6个PCR反应（即：来源于框架1的引物与来源于框架2的引物;框架1与框架3的引物;框架1与4的引物;框架2与3的引物;框架2与4的引物;框架3与4的引物），有可能检测出共有上述NGF和BDNF之间的保守序列的四个片段中任何二个的基因或基因产物。如果有人想要为每一个框架合成几个不同的变性引物，还有可能用较少数量的PCR反应来完成全部检查。还有可能通过改变用于启动PCR反应的杂交条件强度以使得能够在未知基因和NGF或BDNF 之间产生较高或较低程度的核苷酸序列的相似性。如果BDNF/NGF基因家族的以前未知的成员的一个片段被成功地扩增了，该片段就可能被分子克隆和序列分析，并被用作探针来分离完整的cDNA或基因组克隆。反过来，它又为未知基因的完整核苷酸序列的鉴定、对其表达的分析和用于功能分析的其蛋白质的产生做好准备。

另外，本发明提供了将BDNF/NGF序列同源性用于设计是BDNF/NGF基因家族成员、但在自然界中不会存在的新的重组分子的方法。例如（但不是限制），按照本发明可以构建一个包括NGF和BDNF基因的部分的重组分子。这样一种分子能表现出与BDNF和NGF相关的特性，并出现了一些新的生物学活性，包括兴奋剂和拮抗物。BDNF和NGF的一级序列还可被用于在计算机上摸拟该分子的三级结构（Hopp  and  Woods，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828）;BDNF/NGF嵌合重组基因可以根据三级结构与生物学功能的关系设计。同样，可以构建出包括BDNF/NGF基因家族中任何一个或多个成员的一部分的嵌合基因。

5.2  NT-3的克隆

利用BDNF与NGF共有的同源区、采用前文所述方法可以鉴定来自任何生物体的NT-3基因。在本发明的二个优选的、具体的实施例中，该基因可用如下方法鉴定和克隆。

在一个优选的实施例中，核苷酸序列（采用IUPAC命名法）为GGGGATCCGC  CGI  TGY  MGI  GGI  ATH  GA的有义（或5′）引物（引物1，它包括Bam  H  I和Sac  Ⅱ核酸内切酶分裂位点）和核苷酸序列为TCGAATTCTAG  AT  ICK IAT RAA ICK CCA的反义（或3′）引物（引物2，它包括Eco RI和XbaⅠ位点），可用于聚合酶连锁反应（Saiki et al.，1985，Science 230：1350-1354）

该反应使用一种工业用热循环装置（例如，Perkin-Elmer Cetus热循环装置）和从耐热水生生物聚合酶（Taq聚合酶）中提取的热稳定DNA聚合酶。在以45℃的退火温度循环四次以后，剩下36次循环以49℃的退火温度进行。然后，扩增所产生的DNA产物可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并将与予期大小（约137bp）相当的产物可以被洗脱下来、再扩增、随后用二种限制性核酸内切酶消化。其中一种限制性核酸内切酶能在被扩增的片段内切开该生物体的NGF基因序列，另一种能在被扩增的片段内切开该生物体的BDNF基因序列。未被切开的DNA（被假定为没有编码NGF或BDNF，免受限制性核酸内切酶分裂）随后又可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳与被分裂的DNA分离、洗脱、不对称扩增（Innis et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：9436-9440），并利用引物1和引物2进行序列分析（Sanger et al.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3918-3921）。根据由此获得的序列，可以设计出能更精确地反映新基因的序列的其它有义引物和反义引物。例如，其它有义引物如GGGATTGATGACAAA（引物3）和ACTCTCAGTGCAAAACTTCGC（引物4）及反义（5′）引物CGGATCCGAATTCTGCAG（T）12V（引物5）也可被采用。从有可能产生神经营养活性的组织如脑中制备出的RNA（可采用任何常规方法，如Okayama等提出的方法，1987， Meth.Enzymol.154：3-28），可采用被设计成与3′端Poly（A）尾巴配对并含有Bam HI、EcoRI和PstI限制性核酸内切酶切点的引物5进行反转录（Leibrock et al.，1989，Nature 341：149-152）。然后，所产生的cDNA可采用引物3和5进行PCR扩增，随后再用引物4和5进行再扩增。用最后一次反应的产物进行Southern吸印，并将其与同引物3和4序列下游的序列相应的、由32P末端标记的低聚核苷酸探针杂交。如此鉴定的DNA片段然后可以被克隆到适当的载体里，所获得的最长的插入片段可用于从所感兴趣的生物体筛选基因组库。以这种方式鉴定的阳性克隆然后再通过标准的限制性酶切图谱和核苷酸序列分析技术进行分析。

在本发明的另一个优选的实施例中，与在NGF和BDNF之间高度保守的四个蛋白质序列的片段相当的变性低聚核苷酸可以被合成。例如，这些氨基酸顺序（出现在图7D中）可以是：（1）Gly-Glu-（Tyr/Phe）-Ser-Val-Cys-Asp-Ser;（2）Lys-Gen-Tyr-Phe-（Tyr/Phe）-Glu-Thr-Lys-Cys;（3）Gly-Cys-Arg-Ile-Asp;（4）Trp-Arg-Phe-Ile-Arg-Ile-Asp-Thr-（Ser/Ala）-Cys-Val-Cys。在PCR反应中可以使用一系列变性的、有义和反义低聚核苷酸（含有一个15-26个核苷酸长的变性部分，相当于上述在有义或反义方向上的蛋白质序列的5-9个氨基酸，以及一个编码限制性酶识别位点的非变性的“尾巴”）。上游有义引物和下游反义引物对之间的放大反应，可以在标准条件下进行，或者最好通过实验确定最佳反应条件。例如，有义引物（与上述氨基酸序列（1）相关）

5′GACTCGAGTCGACATCG-GTN-TGY-GAY-WSN-RTN-WS-3′和反义引物（相当于上述氨基酸序列（2））5′-CCAAGCTTCTAGAATTC-CA-YTT-NGT-YTC-RWA-RAA-RTA-YTG-3′可被用于放大反应，使用衍生于适宜源的基因组DAN或cDNA作为模板，采用上游有义和下游反义引对的放大反应产物可被用作在基因组DNA的Southern吸印的杂交探针，以证实PCR产物与基因组DAN序列进行杂交，此产物包括与该探针同源区以及与该探针不同源区（例如，非NGF、非BDNF序列）。证实有一种新基因组DAN序列的PCR产物可用来筛选基因组或cDNA库和由此选择克隆，编码BDNF/NGF基因家族的新成员。

5.3.神经营养因子-3的表达

对NT-3蛋白质编码的核苷酸序列，或其一部份，可插入到合适的表达载体中，即含有对转录和翻译所插入的有蛋白编码序列所必需成分的载体。这种必需的转录和翻译信号也可由自然NT-3基因和/或其侧区提供。各种宿主载体系可用于表达蛋白编码序列。这些包括（并不限于此）用病毒感染的（如牛痘病毒、腺病毒）哺乳动物细胞系;用病毒（如杆状病毒）感染的昆虫细胞系;微生物如含有酵母载体的酵母，或用噬菌体DNA、质粒DNA、或装配形质粒DNA转形变异的细菌。在本发明优选的实施例中，表达载体含有CMV启动子（Stephens  and  Cockett，1989，Nucl，Acids  Res.17：7110）和SV40复制源。这些载体的表达元素其强度和特性是变化的。取决于所用宿主载体系，一些适合的转录和翻译成分中的任一种都可使用。

前述的将DNA片段插入到载体中的任一方法都可用于构成含有嵌合基因的表达载体，该嵌合基因由合适的转录/翻译控制信号和蛋白编码序列组成。这些方法包括在体外重组的DNA和合成技术以及在体内重组（遗传学的重组）。对NT-3蛋白或肽片段编码的核酸序列的表达可通过第二核酸序列调整，以便NT-3蛋白或肽表达在用重组的DNA分子转形变异的宿主中。例如，NT-3的表达可由现有技术中所知的任一启动子/强化因子元素来控制。可用于控制NT-3表达的启动子包括，并不限于此，SV40早期启动子区（Bernoist  and  Chambon，1981，Nature  290：304-310），含在3′长的末端重复劳氏（Rous）肉瘤病毒中的启动子（Yamamato，et  al.，1980，Cell  22：787-797），疱疹胸苷激酶启动子（Wagner  et  al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sei.U.S.A.78：144-1445），金属硫堇（metallothionin）基因的调节序列（Brinster，et  al.，1982，Nature  296：39-42），原核生物的表达载体如β-内酰胺酶启动子（Villa-Kamaroff，et  al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731），或tac启动子（DeBoer，et  al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25），也见Scientific  American中的“由重组细菌得到的有用蛋白质”（Useful  Proteins  from  recombinant  bacteria）”，1980，242：74-94;植物表达载体，它含有nopaline合成酶启动子区（Herrera-Estrella， et  al.，Nature  303：209-213）或花椰菜斑纹病毒35S  RNA启动子（Gardner，et  al.，1981，Nucl.Acids  Res.9：2871），以及用于光合成酶核酮糖二磷酸酯羧化酶的启动子（Herrera-Estralla  et  al.，1984，Nature  310：115-120）;由酶母或其它酶菌获得的启动子，其他酶菌如Gal4启动子、ADC（醇脱氢酶）启动子、PGK（磷酸甘油激酶）启动子、碱性磷酸酶启动子、和下述动物转录控制区，其表现了组织特征并已用于基因突变动物：在胰腺泡细胞（Pancreatic  acinar  cells）中为活性的弹性蛋白酶I基因控制区（Swift  et  al.，1984，Cell  38：639-646;Ornitz  et  al.，1986，Cold  Spring  Harbor  Symp.Quant.Biol.50：399-409;Mac  Donald，1987，Hepatology  7：425-515）;在胰β细胞中为活性的胰岛素基因控制区（Hanahan，1985，Nature  315：115-122）;在淋巴样细胞中为活性的免疫球蛋白基因控制区（Grosschedl  et  al.，1984，Cell  38：647-658;Adames  et.al.，1985，Nature  318：533-538;Alexander  et  al.，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444），在睾丸、胸、淋巴样和柱状细胞中为活性的小鼠乳房（肿）瘤病毒控制区（Leder  et  al，1986，Cell  45：485-495），在肝中为活性的清蛋白基因控制区（Pinkert  et  al.，1987，Genes  and  Devel.1：268-276），在肝中为活性的甲胎蛋 白基因控制区（Krumlauf  et  al.，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648;Hammer  et  al.，1987，Science  235：53-58）;在肝中为活性的α-1-抗胰蛋白酶基因控制区（Kelsey  et  al.，1987，Genes  and  Devel.1：161-171），在骨髓样细胞中为活性的β-珠蛋白基因控制区（Mogram  et  al.，1985，Nature  315：338-340;Kollias  et  al.，1986，Cell  46：89-94）;在脑内的少突神经胶质细胞中为活性的髓磷酯碱性蛋白基因控制区（Readhead  et  al.，1987，Cell  48：703-712）;在骨骼肌中为活性的肌浆球蛋白轻链-2基因控制区（Sani，1985，Nature  314：283-286），和在下丘脑中为活性的促性腺释放激素基因控制区（Mason  et  al.，1986，Science  234：1372-1378）。

用下述三种普通方法来鉴定含有NT-3基因插入物的表达载体：（a）DNA-DNA杂交，（b）“标记”基因机能的存在和消失，和（c）插入序列的表达。在第一种方法中，插入在表达载体中的外源基因的存在可通过使用含有与插入的NT-3基因同源的序列的探针通过DNA-DNA杂交手段来探测到的。在第二种方法中，重组载体/宿主体系的可以基于由外源基因插入该载体而引起的特定的“标记”基因机能的存在和消失而鉴定和选择（特定的“标记”基因功能例如胸苷激酶活性，对抗菌素的抵抗力，表达型的转变，在杆状病毒中咬合体的形成，等等）。例如，如果NT-3基因插入到载体的标记基因序列中，含有NT-3插入物的重组体则可通过标记基因 功能的消失来鉴定。在第三种方法中，重组体表达载体可通过测定由该重组体表达出的外源基因产物而得到鉴定。例如，这种测定可基于生物测定体系中的NT-3基因产物的物理或功能特性。

一旦某一特定的重组的DNA分子被鉴定和分离出，可用现有技术中已知的几种方法将其繁殖。一旦建立合适的宿主体系和生长条件，重组表达载体则可大量繁殖和制备。如前指出，可用的表达载体包括（并不限于此）下列载体或其衍生物，人或动物病毒如牛痘病毒或腺病毒;昆虫病毒如杆状病毒;酵母载体;噬菌体载体（如人字形缝尖（λambda），和质粒和装配型质粒DNA载体，等等。

另外，可选择宿主细胞株，以调整插入序列的表达，或以所需特定的方式改变和处理该基因产物。在存有特定诱导物时，可提高由特定启动子的表达;所以遗传学设计的NT-3蛋白的表达是可控制的。还有，不同的宿主细胞，对蛋白的翻译和后翻译处理以及改性（如糖基化、分裂）具有特性的和专门的机理。可选择合适的细胞系或宿主体系以保证需要的对所表达出的外源蛋白的改性和处理。例如，在细菌体系中的表达可用以产生一种未糖基化的核心蛋白产物。在酵母中的表达将产生糖基化产物。在哺乳动物（mammalian）细胞中的表达可用以保证外源的NT-3蛋白的“自然”糖基化。还有，不同的载体/宿主表达体系可影响处理反应（蛋白分裂）到不同的程度。

在本发明的一个特定实施例中，DNA编码Prepro  NT-3可克隆化到PCMV质粒中，被扩增，并且然后通过磷酸钙方法用于转变感染（transfect）COS的细胞（Chen  and  Okayama，1987，Mol.Cell，Biol.7：2745-2752）;从细胞培养基中可收集出NT-3活性（见下文的例 第6和7节）。

已经可理解到，NGF以两种不同的前体形式合成：一种长的形式和一种短的形式（Darinq  et  al.，1983，Cold  Spring  Harbor  Symp.Quant.Biol.48：427-483）。较短的形式基本上类似于BDNF和NT-3的prepro形式。根据本发明，理想的是使用含有类似于BDNF或NT-3的长形式的DNA编码的表达体系。DNA编码这些长前体形式可通过对成熟的BDNF或NT-3肽编码区上游的CDNA或基因组DNA区进行定序和定位开放翻译解读密码来鉴定。将NT-3基因序列同NGF和BDNF的序列排列到已用于预测NT-3蛋白的长和短的前体（图7B）。来源于长或短前体形式的成熟BDNF或NT-3表达的效果取决于所用的表达体系，并且可以从一种细胞系变为另一种细胞系。

5.3.1  被表达基因产物的鉴定和纯化

一旦鉴定出表达NT-3基因的重组体，则可分析该基因产物。这可通过基于产物（包括放射性示踪的产物）的物理或功能特性的测定和随后通过凝胶电泳分析而获得。

一旦该NT-3蛋白被鉴定出，可用一般方法将其分离和纯化，这些方法包括色谱分析（如：离子转换、亲合力，和粒度柱状色谱分析（Sizing  Column  Chromatography）），离心法，溶解性差示（differential  Solubility），或通过蛋白纯化的任一其他一般技术。功能特性可用任一合适测定方法而评定，包括（并仅限于此）小鸡胚背根神经节，衍生于神经的或交感神经节 神经元。

5.4.神经营养因子-3的生物活性的测定

根据本发明，定性和定量地示出NT-3活性的任一体系都可使用。与BNDF和NGF形成对照，NT-3促进轴突从衍生于神经基板的结状神经节和交感神经节两者派生，因而任一这种体系，还有背根神经节（DRG）培养体系，都可用于NT-3生物测定。可按Barde等人所述的方法来进行DRG的测定（1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：1199-1203）可按Lindsay等人所述的方法来进行结状神经节的测定体系（1985，Dev.Biol.112：319-328）。可按Barde等人所述的方法进行交感神经节的测定体系（1982，EMBO  J.，1：549-553）。

5.5  神经营养因子-3基因和蛋白

用上文所述和下文例6和7节中的方法，可确定下列核酸序列，并导出其相应氨基酸序列。确定了小鼠基因组NT-3序列，并描绘于图2中。大鼠NT-3序列示于图7中，确定了人类的基因组DNA  NT-3序列，并描绘于图11中，其也表明了大鼠的DNA序列。根据本发明，每一个这种序列，或其机能等同物都可使用。另外，本发明也涉及从猪、牛、猫、鸟、马或犬的，以及灵长类和任一其它物种中分离出的NT-3基因和蛋白，在这些物种中有NT-3活性存在。本发明还涉及含有至少十个核苷酸的NT-3核酸的亚序列，诸如含有此NT-3序列的杂交部分的亚序列，应用在 核苷酸杂交测定，Southern和Northern吸印分析等中的NT-3核酸序列的杂交部分。本发明也提供NT-3蛋白和片段，及其衍生物，示于图2，7和11中的氨基酸序列或其机能等同物。本发明也提供含有抗原决定簇或其为机能活性的NT-3蛋白的片段或其衍生物。在此所用的“机能活性”的含义为对已知的NT-3机能测定（如小鸡胚胎DRG、节状神经节和交感神经节测定）中具有正活性。

例如：绘于图2，7和11中的核酸序列可通过取代、加入或缺失其提供的机能等同物分子而得以改变。由于核苷酸编码序列的变性，其他的其编码基本上与绘于图2、7和11中的氨基酸序列相同的DNA序列可用于本发明的实施中。这些包括（并不限于此）含有部分或全部的由不同密码子取代而改变的绘于图2，7和11中的NT-3基因的核苷酸序列，这些密码子将此序列中的机能等同物氨基酸残基编码，结果产生沉默变化。另外，本发明的NT-3蛋白、或片段或其衍生物包括（但不限于此）这些含有（作为初级氨基酸序列）基本上如绘于图2，7和11中的全部或部分氨基酸序列，而这种改变序列的机能等同物的氨基酸残基对于其中的可产生沉默变化序列中的残基进行取代。例如，在此序列之中的一个或多个氨基酸残基可被作为机能等同物的具有相似极性的其他氨基酸取代，结果产生沉默变化。序列中氨基酸取代物可从氨基酸所属类的其他组员中选择。例如，无极性（疏水的）氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸。极性中和的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。荷正电的（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。荷负电的（酸 性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在翻译中或之后的各种修饰的NT-3蛋白或片段或其衍生物也包括在本发明的范围之内，这些修饰如糖基化，蛋白解离，连接到抗体分子或其他细胞配位体上等等。

另外，所给的NT-3可在体内或体外变异，以产生和/或破坏翻译、起始和/或终止序列，或着在编码区中产生变异和/或形成新的限制性核酸内切酶部位或破坏先在存在的这种位置，以进一步促进在体外的修饰。现有技术中所知的任何诱变技术都可使用，包括（并不限于此）在体外对位诱变（Hutchinson.et al.，1978，J.Biol.Chem.253：6551），使用TAB 衔接物（Pharmacia），等等。

5.6.神经营养因子-3抗体的生殖

根据本发明，NT-3蛋白、或片段或其衍生物可用作免疫原以产生抗NT-3抗体。

为进一步改善产生抗NT-3免疫应答的可能性，分析NT-3的氨基酸序列以鉴定与增加的免疫原性有关的分子部分。例如，此氨基酸序列可经过计算机分析以鉴定表面抗原决定部位，根据Hopp和Woods方法（1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：3824-3828），该方法已成功地用于鉴定乙型肝炎表面抗原的抗原肽。另外，从不同物种中得到的氨基酸序列可进行比较，并鉴定相对非同源区;这些非同源区更可能成为对各种物种是致免疫的。

为制备直接针对NT-3的单克隆抗体，在培养液中通过传代细胞系能提供抗体分子产物的任何技术均可使用。例如，由kohler 和Milstein最早发明的杂交瘤（hybridoma）技术（1975，Nature  256：495-497），以及三瘤（trioma）技术，人类的B细胞杂交瘤技术（Kozbor  et  al.，1983，Immunology  Today  4：72），和产生人类单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术（cole  et  al.，1985，“单克隆抗体和癌症的治疗”（Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy），Alan  R.Liss，Inc.pp.77-96），以及类似的技术也在本发明的范围之内。

用于治疗的单克隆抗体可以是人类的单克隆抗体或或嵌合的人-鼠（或其他物种）单克隆抗体。人单克隆抗体可由现有技术中所知的许多技术中的任一种来制备（如，Teng  et  al.，1983，Immunology  Today  4：72-79;Olsson  et  al.，1982，Meth.Enzymol.92：3～16）。嵌合的抗体分子可制成含有同人恒定区在一起的小鼠抗原结合区域（Morrison  et  al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851，Takeda.et  al.，1985，Nature  314：452）。

现有技术中所知的各种方法均可用来制备对NT-3的抗原决定部位的多克隆抗体。为制备抗体，各种宿主动物可通过注射NT-3蛋白，或片段或其衍生物而免疫，包括（并不限于此）兔、小鼠、大鼠等等。各种佐剂可用于增加免疫应答，这取决于宿主物种，包括（并不限于此）弗氏佐剂（Freund）（完整的和不完整的），矿物胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、普卢兰尼克（pluronic）多元醇、多聚阴离子、肽、油乳胶、钥孔 血蓝素， 二硝基苯酚，和可能有用的人类佐剂如BCG（卡介菌）和杆状杆菌parvum。

对NT-3抗原决定部位的单抗体的单分子克隆可用已知技术制备。重组DAN方法学也用来构成核酸序列，其编码单克隆抗体分子，或其抗原结合区（重组DAN方法学见例如：Maniatis  et  al.，1982，Molecular  Cloning，A  Laboratory  Manual，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  Spring  Harbor，New  York）。

可用已知技术来纯化抗体分子，例如：免疫吸附或免疫亲和色谱法，色谱法如HPLC（高性能液相色谱法），或其相结合的方法，等等。

含有分子的个体基因型的抗体片段可用现有技术制备。例如：这种片段包括（并不限于此）：通过胃蛋白酶消化抗体分子制备的F（ab′）2片段，Fab′片段可以通过还原F（ab′）2片段的二硫桥产生以及可由用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而得到的2Fab或Fab片段。

5.7.本发明的用途

本发明涉及核酸序列和涉及由此产生的基本纯的蛋白、肽片段或由其产生的衍生物。可大量制备NT-3，足以够诊断和治疗应用。另外，抗NT-3抗体和NT-3核酸探针可用于诊断和治疗应用。对多数用途来说，最好是从相同物种得到的NT-3基因或基因产物用于诊断或治疗目的，尽管NT-3的杂交物种在本发明的特殊实施例中也是有用的。

5.7.1.诊断应用

本发明涉及的编码NT-3的核酸和由其产生的蛋白、肽片段或其衍生物，以及对NT-3蛋白、肽、或其衍生物的抗体，可用来诊断与NT-3表达模式的交错有关的疾病和神经系统的紊乱。

在本发明的各种实施例中，NT-3基因和相关的核酸序列和亚序列（包括互补序列），可用于诊断杂交测定。含有15个核苷酸的NT-3核酸序列，或其亚序列，可用作杂交探针。杂交鉴定可用于探测、预测、诊断、或监控与NT-3表达的变化有关的情况、紊乱或疾病状态，包括，尤其是由感觉神经元损伤造成的疾病状态。这种疾病和病理包括（并不限于此）中枢神经系统（CNS）创伤、梗塞、感染、变性神经病，恶性肿瘤，或手术变化包括（并不限于此）阿尔茨海默病，帕金森病和亨廷顿午蹈病。例如，从病人身上取得的组织样品中的全部RNA，可用来分析NT-3mRNA的存在，其中NT-3mRNA量的变化表明神经元的变性。

在本发明另外的实施例中，对抗NT-3蛋白、肽片段、或衍生物的抗体可用于诊断神经系统的疾病和紊乱，包括，特别是，感觉紊乱和视网膜退化疾病，以及上文所列的那些紊乱和疾病。本发明的抗体例如可用于原位杂交技术，这种原位杂交技术使用从需做这种鉴定的病人身上得到的组织样品。在另外的实例中，本发明的抗体用于ELISA方法以检出和/或测量存于组织或流体样品中的NT-3的量。类似地，本发明的抗体用于Western吸印分析以检出和/或测量存于组织或流体样品中的NT-3。

在本发明的另外实施例中，NT-3蛋白、肽片段或衍生物可用于诊断神经系统的疾病和紊乱。在特别实施例中（并不局限于此）， 标记的NT-3蛋白或肽片段可用于鉴定表达NT-3受体的组织或细胞以鉴定NT-3受体表达的畸变，并因此鉴定在此组织中的可能的异常或对NT-3的细胞应答。

5.7.2.治疗应用

本发明涉及的编码NT-3的核酸，和涉及由其产生的蛋白、肽片段，或其衍生物，以及对NT-3蛋白、肽、或衍生物的抗体，可用于治疗神经系统的疾病和紊乱，这些疾病和紊乱与NT-3表达模式的交错有关，或将其暴露于NT-3或抗NT-3抗体中可获得益处。

在本发明的各种实施例中，NT-3蛋白、肽片段或衍生物可投药于由创伤、外科、局部缺血、感染、代谢疾病、营养缺乏、恶性肿瘤、或毒剂造成的神经系统损伤的病人。在本发明的各种特定实施例中，NT-3可局部投药于已切断的感觉神经元，包括，并不限于此，背根神经节中的神经元或任一下列组织中的神经元：膝状、岩部和结状神经节;第8脑神经听觉前庭复合体;三叉神经节的颚-下颔裂片的腹外侧叶，中脑的三叉核和交感神经节。所希望的是通过吸附到薄膜（如硅橡胶膜）上来给予与NT-3相关的肽或NT-3蛋白，其可被插入到切断的神经附近。本发明例如也可用于促进患有糖尿神经病（单神经病复合的和糖尿外周神经病）的病人的康复。

除糖尿神经病外，NT-3或与NT-3相关的肽也可用于治疗其他的外周神经病，包括（并不限于此）下列：与病毒有关的神经病，包括与神经病有关的得有免疫缺陷综合症（AIDS），由多发性神经炎感染的单核细胞增多症，带有多发性神经炎的病毒性肝炎;Guillian-Barre综合症;与肉瘤中毒有关的神经病;中毒的多 发神经病包括有关于铅和醇的神经病;营养神经病包括亚急性合并性变性;血管病的神经病包括与全身狼疮红斑病有关的神经病;与肉样有关的神经病;癌神经病;压迫神经病（如腕通道综合症）和遗传神经病。遗传神经病可用NT-3或NT-3有关的蛋白治疗，这种病包括腓骨肌肉萎缩，家族性自主神经机能异常和渐进增殖性神经病。

在本发明另外的实施例中，NT-3蛋白或肽片段或由其衍生的衍生物，可用于治疗先天性疾病或神经变性紊乱，包括（并不限于此）阿尔茨海默病，帕金森病，多发性硬化，肌萎缩性侧索硬化和亨廷顿舞蹈病。

在本发明的特殊实施例中，可与外科的植入组织一起给药NT-3蛋白、或肽片段或由其衍生的衍生物，用于治疗阿尔茨海默病和/或帕金森病。如下文第11节中指出的NT-3促进多巴胺能的神经元存活;当多巴胺能的神经元在帕金森病中被破坏，NT-3可用于治疗帕金森病，包括给需要这种治疗的病人给予有效剂量的NT-3。已经表明约35%的患有帕金森病的病人有阿尔茨海默类型痴呆;本发明制备的NT-3证实是一种对治疗这种复合疾病有效的专门药剂。类似地，根据本发明制备的NT-3可用于治疗与Down′s综合症一起的阿尔茨海默疾病。另外，如下文第12节所指出的，NT-3在神经系统的发育和分化过程中以高含量表达;依此，NT-3可用于治疗发育神经系统的紊乱，如唐氏综合症，也用于治疗与细胞反分化有关的紊乱，如恶性肿瘤，或用于治疗从在神经系统中的再生可得到益处的紊乱。根据本发明制备的NT-3可用于治疗各种痴呆和先天性学习紊乱症。

在本发明的另外实施例中，NT-3蛋白、片段或衍生物可与其 他细胞激动素一起使用以获得所需的神经营养效用。例如，（并不限于此），根据本发明的NT-3可与第二药剂一起使用以获得对神经元的生长和/或保持其存活和/或恢复或增强机能有协同刺激效应，第二药剂例如NGF或BDNF，其中所说的协同解释为NT-3蛋白、肽片段或衍生物与第二药剂的组合的效果可得到比相同用量的任一单独使用的物质更大的效果。可以预想到，在中枢神经系统中很宽的一系列神经亚群落的生长、发育、保持其分化机能和存活中，NT-3同其他中枢神经系统衍生的肽因子一起起到协同效应也将全部表征出来。换而言之，NT-3和第二种神经营养剂是可加合性的。

进一步可预见，基于NT-3分子的全部特征，可以研究新的NT-3的肽片段、衍生物或突变体，其可起到NT-3的生物功能的部分或全部的拮抗物的作用。这种NT-3拮抗物可用于选择感觉神经元部分切除术中，例如用于治疗慢性疼痛综合症。

在本发明的另一个实施例中，将针对NT-3蛋白、肽片段或其衍生物给药于患有各种精神性紊乱和疾病的并需要治疗的病人。例如，由于NT-3过量产生而致病的患者需要这种治疗，抗NT-3抗体可用于抑止感觉神经元畸变再生（如手术后），或者如上文所述，可用于治疗慢性疼痛综合症。

如下文第6和7节所述，NT-3的组织分布表明NT-3  mRNA以较高含量表达在脑、肾、心脏和脾，及其他的组织中。在非神经组织中制备的NT-3可以或不可以与表达于脑中的NT-3相同。NT-3的单一物种可在神经和非神经组织中都起作用;在NT-3表达中的紊乱可导致影响神经系统以及其他器官系统的疾病。另外，NT-3分子紧密相关的家族可在神经和非神经组织中促进不 同的机能。因此，本发明的NT-3分子可用于治疗影响神经的以及神经调节的非神经组织的疾病，尤其包括心脏、造血的、肾的和网状内皮系统。

进而，如下文第6节中的例子，在未成熟动物中的NT-3表达较在成年动物中有提高。根据本发明，NT-3实际上可用于治疗发育失调或，另一方面，用于引导中枢神经系统损伤后的神经系统的修复。

5.8  药用组合物

本发明的活性组合物，可包括全部或部份的NT-3基因产物，包括蛋白、肽片段或由其产生的衍生物，或抗NT-3蛋白、肽片段、或衍生物的抗体（或抗体片段），或NT-3和至少一个其他药剂（如NGF或BDNF）的化合体，此组合物可用任何无菌生物适宜的药用载体进行给药，这些载体包括（并不限于此）盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。

NT-3蛋白、肽片段或衍生物可含有基本上如绘于图2，7或11中的氨基酸序列或其亚序列;最好使用NT-3蛋白含有（实际上）全部的或部份的氨基酸序列，从约氨基酸140至约氨基酸258（如绘于图2中），从约氨基酸1至约氨基酸119（如图7中），或从图11中的第一个标有“成熟的”氨基酸至绘于其中的序列的末端，或一个机能等同物序列，因为这种亚序列应认为含有NT-3分子的功能部份。NT-3可从相应于任何适合物种的NT-3基因的序列中衍生，这些物种包括（并不限于此）人、猪、大鼠、鸡、牛、狗、绵羊、山羊、猫、兔等等。

在治疗特殊紊乱或疾病时有效用的NT-3蛋白、肽片段、衍生 物、或抗体的用量取决于紊乱或病理状态的性质，并可通过标准的临床技术而确定。只要有可能，最好是测定剂量-应答曲线，首先在体外使用本发明药用组合物，例如上文所述的在NT-3生物测定体系，然后在先于人试验之前用于动物模拟体系。基于体外试验数据，在本发明的特殊实施例中，对促进感觉神经元存活有效用的药用组合物是提供局部浓度为约0.1～10μg/ml之间的NT-3蛋白。

引入体内的方法包括（并不限于此）皮下的、肌肉的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、口服的和鼻内的引入。另外，可以通过任何合适的途径将本发明的药用组合物引入到中枢神经系统，这包括心室内和内膜注射;心室内注射通过心室内导管是便利的，例如此导管附属于储存宿主，如Ommaya储存宿主。

另外，可以将本发明的药用组合物局部地给药于需治疗的部位;例如（并不限于此）这可在外科手术时局部注入，通过注射、利用导管、或利用植入物手段，所说的植入物可以是有孔的、无孔的、或胶质材料，包括膜（如硅橡胶膜）、或纤维。

本发明也提供借以脂质体、微颗粒、或微囊体形式给予含有NT-3蛋白、肽片段、或衍生物的药用组合物。在本发明的各种实施例中，使用这种组合物是有效的，可获得NT-3和与NT-3有关产物的持久释放。

可以预想到将能有效地产生NT-3、与NT-3相关的物质、NT-3拮抗物、或抗NT-3抗体的细胞引入到需要增加或减少NT-3浓度的部位是可行的。

6.实例：小鼠的神经营养因子-3基因

的克隆繁殖和特征化

6.1  材料和方法

6.1.1聚合酶链反应

基于保存于BDNF和公知的NGFS中的2氨基酸序列的基础上合成了两种低聚核苷酸引物（Leibrock et al.，1989，Nature.341：149-152）。有义引物（或5′）的序列是GGGGATCCGC GGI TGY MGI GGI ATH GA（引物1，IUPAC命名法 I＝次黄苷），并包括BamHⅠ和SacⅡ位点，反义引物（或3′）序列为TCGAATTCTAG AT ICK IAT RAA ICK CCA，并包括EcoRI和xbaⅠ位点（引物2）。使用Perkin-Elmer Cetus热循环控制器和Taq聚合酶（基因AmpTM）用1μg的小鼠基因DNA完成PCR（saiki et al.，1985，Science 230：1350-1354）。退火温度为45℃时循环4次之后，剩余的36次循环在退火温度为49℃下进行。结果产生的相当于所期望尺寸（137碱基对）的扩增的DNA产物从丙烯酰胺凝胶中洗脱下来，再扩增并用HindⅡ和ApaⅠ消化，前者分裂小鼠NGF，后者分裂小鼠BDNF。未分裂的DNA经洗脱并不对称地放大（Innis et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：9436-9440）并用引物1和2定序（Sanger et al.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3918-3921）。基于如此获得的序列，合成2个附加的有义引物，其对应于核苷酸808-822（引物3）和 824-844（引物4），SaIl和PstI位点可加入其中。从成年的小鼠脑、肝和肌肉中可提出RNA（Okayama et al.，1987，Meth.Enzymology 154：3-28）并用反义（5′）引物CGGATCCGAATTCTGCAG（T）12V（引物5）逆转录，设计成与3′聚（A）尾端相匹配，并含有对BamHI，EcoRI和PstI克隆繁殖位点（Leibrock et al.，1989，Nature 341：149-152）。这些cDNAs首先用引物3和5进行PCR扩增，并用引物4和5再扩增。用由这种最后反应得到的产物，并用对应于核苷酸879-893的32P-末端标记的低聚核苷酸对其进行杂交化进行Southern吸印分析。如此鉴定的DNA片段克隆繁殖到Blueseript sk+载体中（Stratagene），并且获得的最长的插入物（460碱基对）用于筛选EMBL3小鼠基因组文库（Clontech）。发现了两种正克隆，其中一个克隆的DNA用各种限制性内切酶消化。用460碱基对插入物探测此限制片段：在Bluescript SK+中将一个770碱基对HindⅢ和4000碱基对PstI片段进行亚无性繁殖。全部HindⅢ序列、使用PstI片段伸展的3′和5′被表示出来。

6.1.2.Northern吸印

从成熟的雌性组织中提取的全部RNA（Okayama  et  al.，1987，Meth.Enzym.154：3-28），并在含有1.3%甲醛的琼脂糖凝胶上作电泳（Hehrach  et  al.，1977，Biochem.16：4723-4751）。将RNA转移到尼龙膜（Hybond-N，Amersham）上并在42℃下于含 有40%甲酰胺，5x Denhardt′s溶液和200μg·ml-1变质的鲑精子DNA的1ml 200mM磷酸钠中（PH7.2）杂交一整夜。使用的探针是32P-标记的已随机接触抗原的双链探针（Feinberg et al.，1979，Anal.Biochem.137：266-267），其对应于核苷酸319-1093（图2）。其特殊活性是1.3×108cpm×μg-1，并且107加入到杂交缓冲剂中。在60℃下于含有0.5%SDS的0.1xSSC中冲洗60分钟，用强化滤网在-70℃下过滤5天。

6.1.3  神经营养因子-3的表达

合成低聚核苷酸引物，其相应于绘于图2中的开放解读密码的起始19个核苷酸（加上EcoRI位点）和最后的19个核苷酸（加上BamHI位点）。用所述的PstI基因组片段作为模板进行PCR扩增后，将所得到产物克隆繁殖到表达载体PCMV的EcoRI-BamHI位点上，（Anderson  et  al.，1989，J.Biol.Chem.264：8222-8229）。测定在PCMV中的NT-3的核苷酸序列插入物。用磷酸钙方法（Chen  and  Okayawa，1987，Mol.Cell  Biol.7：2745-2752）和前述收集的培养基（Leibrock  et  al.，1989，Nature  341：149-152）来转染COS-1细胞。用磷酸钙，或用PCMV/NT-3结构（其中NT-3的终止密码子已被去除）处理COS-1细胞后可获得所用的控制培养基。当稀释为1∶50时两种培养基的生物活性都消失了。将结状神经节解离出，并在24-井型平皿中培养该神经元（Lindsay  et  al， 1985.Dev.Biol.112：319-328），纯化从猪脑中得到的BDNF（Hofer  and  Barde，1988，Nature  331：261-262）。

6.2  结果和讨论

在鉴定神经营养因子中主要的问题是其极为低的丰度。用基于探测其活动性的生物测定的蛋白纯化技术来表示NGF和BDNF两者的特征（Cohen，et  al。1960  Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.46：302-311;Barde  et  al.，1982，EMBO  J.1：549-553）。对NGF这种方法是可行的，因为在成年雄鼠下颌腺中的这种蛋白有非常高的丰度，对BDNF这种方法也是完全可行的，因为猪脑组织实际上是无限量可得的。基于在NGF和BDNF中鉴定出的此序列同一性，建议用不同的方法（Strategy）来鉴定已确定为基因家族的其他组员们。（Leibrock  et  al.，1989，Nature  341：149-152）。将小鼠的NGF和BDNF氨基酸（a.a.）序列的详细地比较揭示出有2个6a.a.的伸展部分（在图2中的划线处），这看来特别适于在聚合酶链反应（PCR）中用低聚核苷酸引物的方法（Saiki  et  al.，1985，Science  230：1350-1354）。因为在NGF和BDNF基因中没有内含子间断对活性生物蛋白的外显子编码，所以可以使用小鼠基因。用这种方法可得到所期望的NGF和BDNF序列的扩增，这些随后用合适的限性酶消化。剩下的完整的DNA片段被定序，并且发现该序列既不相应于BDNF也不相应于 NGF。合成两种特定有义（或5′）引物为进一步的PCRS，用作模拟是互补DNA，该DNA是通过从鼠脑、肌肉和肝中提取的RNA的逆转录而制备的，并指定一种3′引物以匹配聚A序列（图2）。这三种组织已给出放大到相似尺寸的产物，共被克隆繁殖并用于筛选小鼠基因组文库。将如此发现的基因组克隆中的一个定序（图2）。开放解读密码预测我们命名为NT-3的一种258a.a.蛋白（在框架起始终止密码子中的3之后用伯级甲硫氨酸）。在每一方面，预测的蛋白的所有结构类似于为NGF和BDNF所建立的：18a.a的推动信号序列（表现为5和9a.a.，分别与BDNF和NGF具有同一性），接着是121a.a.的原序列。这种原序列，假定包括在折叠和正确的这些蛋白的二硫桥的结构中（Edwards  et  al.，J.Biol.Chem.263：6810-6815），已经在小鼠NGF（103a.a.）和鼠BDNF（112a.a.）中发现。单一的可能的N-糖基化位点于9a.a.（与BDNF和NGF中的8相比），位于我们认为是成为分裂位点之前（用一组碱性残基来特征化），并产生成熟的NT-3（图2箭头所标）。成熟的NT-3预测为由119a.a.组成（相对分子质量13，625和PI9.3）。对成熟小鼠的NGF、BDNF和NT-3之间的比较表明54a.a同一性（图2）。所有的6个半胱氨酸残都在保守残基之中（图3箭头所标），在NGF和BDNF中所知的半胱氨酸残基物包括在：硫桥链形成中（Leibrock  et  al.，1989，Nature  341：149-152;Angeletti，1973，Biochemistry  12：100～115）。很明显，将NT-3序列加入到NGF和 BDNF的序列中表明反7a.a.同一性是没有的（当将小鼠NGF和BDNF比较时发现61a.a.同一性）。所以，几乎50%的其初级结构是保守的，并且很可能对所有3种蛋白共有的碱性3维形状的形成都需要，另外，3个序列的比较表明了4不同的区域，每个长度上的7到11a.a.（在图3中编号为V1至V4），并假定包括在由这些蛋白产生出的神经特性中。

为研究NT-3基因的表达，从各种鼠组织中提取RNA并用NT-3专用探针进行分析（图4）。在所有检测的组织中发现了约1.4千基（Kilobases）的单一谱带（图4A）。但是，这种mRNA的表达程序是明显不同的。在脑中（图4B），已经发现标记区域的不同，在小脑和海马中获得了最高量的mRNA（图4B）。这些结果表明在成体鼠组织中NT-3mRNA的分布是很不同于BDNF和NGF  mRNA的分布的。的确，BDNF  mRNA主要发现在脑中，而在例如肝或骨骼肌这些组织很难检测到NGF  mRNA（Heumann  et  al.，1984，EMBO  J.3：3183-3189）。然而，引起好奇的是注意到已知表达NGFmRNA的海马（Korsching  et  al.，1985  EMBO  J，4：1389-1393）也表达BDNF和NT-3mRNA，并且比在多数其他脑区域中更为大的量（图4B）。

为了试验NT-3是否为生物活性和分泌蛋白，将整个蛋白编码序列克隆繁殖到用于转染（猴肾）COS细胞的表达载体中（图5）。得到的事实为在外周组织中发现了NT-3mRNA，我们培养了许多已知的胚鸡神经元，这些神经元已知突入到这些组织中且获得存活营养因子。运动神经元（从6天的胚胎期（E6）的骨髓中纯化的） （Dohrmann  et  al.，1986，Dev.Biol.118：209-221）），睫状神经元（E8）和解离的交感神经元（E11）在存有NT-3时发现没有存活。但是，从E8初级觉神经节中分离出的感觉神经元发现有应答。在此表明（图5），NT-3维持约30%的从节状神经节中分离的神经元的存活。另外，这种效果对BDNF的效果有加合性，并且两种组合的因子可挽救大多数的神经元（90%）（图5），这种BDN中在中心突出区中合成并已知对此状神经元的亚群产生作用（Lindsay  et  al.，1985，Dev.Biol.112：319-328）。注意到这点是很重要的：找到NT-3mRNA在这种神经节的内脏靶中，包括心脏、肠、肝和肺（图4A）。在E8解离的背根和三叉神经节和在E8交感神经节的外植体中发现了NT-3应答感觉神经元的群落。所以这表明NT-3是存在于一些外围组织中至今末特征化的生物活性，外围组织包括肝（Lindsay  and  Tarbit，1979，Neuro  Sci.Lett.12：195-200）和骨骼肌（Davies，1986，Dev.Biol。115：56-67），并且已知维持着不应答NGF的内脏和本体的感觉神经元的存活（为综述，见Davies，1987，Development  101：185-208）。

综合在一起，这些发现表明，NT-3是一个在结构和功能上都相关于NGF和BDNF（前2个神经营养因子）的神经营养因子。我们建议命名神经营养因子（NT）是参照这类蛋白质，其与内白细胞素相似，并按其发现的顺序给其编号。

7.实例：神经营养因子-3基因的

克隆繁殖和鉴定

在设计克隆繁殖策略时利用NGF和BDNF间的同源性以研究此基因家族的其他成员。我们报道了对编码为BDNF/NGF家族中第三成员的基因克隆繁殖，该第三成员我们已命名为神经营养因子-3（NT-3）。当与NGF和BDNF相比较时，这种新的因子表现为特殊的生物活性和时空表达。

7.1  材料和方法

7.1.1聚合酶链反应

合成相应于很好保存于NGF和BDNF之间的四种蛋白序列（这已在图7D所示的NGF/BDNF中发现）为：（1）甘-谷-（酪/苯丙）-丝-缬-半胱-天冬-丝，（2）赖-谷氨酰胺-酪-苯丙-（酪/苯丙）-谷-苏-赖-半胱，（3）甘-半胱-精-异亮-天冬，和（4）色-精-苯丙-异亮-精-异亮-天冬-苏-（丝/丙）-半胱-缬-半胱。一系列的简并有义的和反义低聚核苷酸用于PCR反应中（该低聚核苷酸含有15～26个核苷酸长度的简并部分，相应于或着在有义的反义方向上指示的蛋白序列的5～9个氨基酸未变性的“尾巴”编码限制性内切酶识别部位）。上游有义和下游反义引物对之间的扩增反义的进行是依照由Perkin-Elmer/cetus推荐的条件进行，除了对每一个引物对的退火温度、Mg++浓度和延长时间要调整到最适合条件外。1B有义引物的确切序列（上面的“1”蛋白序列的编码部分）为

5′-GACTCGAGTCGACATCGGTN-TGY-GAY-WSN-RTN -WS-3′和2c反义引物的确切序列（相应于上述“2”的蛋白序列部分的反义密码子）是5′-CCAAGCTTCTAGAATTC-CA-YTT-NGT-YTC-RWA-RAA-RTA-YTG-3′（如IUPAC编码的核苷酸的缩写）。随后的序列分析表明1B低聚核苷酸具有2个失配于NT-3序列的核苷酸，而2C低聚核苷酸具有一个失配于NT-3序列的核苷酸。根据由Rerkin-Elmer/cetus推荐的基因扩增反应通过PCR进行了放射标记，用如下改进：将在低熔点琼脂糖中的1～10ng的DNA模板加入到含有未标记的dATP，dGTP和DTTP（最终浓度为50μm）的反应混合物中;对每50μl的反应加入50μciα32P-dCTP（3000Ci/mmole），并且该反应进行7次扩增循环过程。扩增反应的引物完全等同于用于原来的PCR反应的简并引物。

7.1.2.用NT-3探针作大鼠基因组DNA

的Southern吸印分析

用简并的1B和2C引物通过由大鼠基因组DAN模板放大得到R1B/2C PCR产物如上面第7.1.1节所述。用简并的1B和2C引物衍生的PCD（表示为R1B/2C）产物检测大鼠基因组DAN中的新的基因NT-3，以及NGF和BDNF基因。从费希尔（Fischer）大鼠的肝中制备的DNA（Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor）），用EcoR1消化，在1%琼脂糖凝胶上分馏10μg。用10X SSC将 DNA转移到硝化纤维素上（Maniatis et al.，1982，Molecular Cloning：A Laboratory Manual（Colding Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor）），在60℃下杂交（Mahmoudi and Lin，1989，Biotechniques：7：331-3）到32P-标记的R1B/2C PCR产物中，在65℃下于2x SSC/0.1%SDS中冲洗。NT-3、NGF和BDNF谱带如图表示出;NGF和BDNF谱带的位置事先用专用探针确定。尺寸大小示出在左侧为千基（Kb）级。

7.1.3  神经营养因子-3的表达

大鼠NT-3表达结构是通过用PCR放大假定的短的NT-3的前体的编码区而构成的，该NT-3是取自含有夸越NT-3基因的3.2Kb  Sstl的大鼠基因组片段（图6B）的质粒;用于PCR反应的低聚核苷酸在其末端含有合成的Xhol识别部位，以允许将放大的编码区域插入到该Xhol部位，该部位在PCDM8表达载体的多衔接物中（Seed，1987，Nature，329：840-42）。用于扩增大鼠NT-3基因编码区的确切的低聚核苷酸是上游有义引物5′-CGGTACCCT  CGA  GCC  ACC  ATG  TCC  ATC  TTG  TTT  TAT  GTG-3′（下面标线的ATG与“B”开始位点起始密码子相对应，具有与ATG序列下游正好与NT-3序列相匹配的序列;ATG的上游引物含有合成的Xhol位点），和下游反义引物5′  CGG  TAC  CCT  CGA  GAT  GCC  AAT  TCA   TGT TCT TCC G-3′（下面标线的三联体是互补到NT-3基因的终止密码子;这三联体位于确切的反义NT-3序列的侧面，并有Xhol位点位于这种引物的5′末端）。所得到的大鼠NT-3的表达质粒表示为PC8-rN3（P1）。类似的策略是先前用过的将大鼠NGF和BDNF编码区插入到与PCDM8载体相同的Xhol位点上。如Okayama和Berg（1982，Mol.Cell Biol.5：1136-42）所述的，将NT-3、NGF和BDNF表达结构转染到COS-M5细胞中（每60mm平皿上接种5×105个细胞）并在2.5ml的含有高葡萄糖（4500mg/ml）和10%胎牛血清的Dulbecco′s修饰的Eagle培养基中培养;在转染72小时后收集上层清液。

7.2.结果

7.2.1.神经营养因子-3基因的克隆化

使用不同的简并低核苷酸对，可获得期望大小（由NGF和BDNF序列预定）的扩增产物。首先将这些产物进行限制性内切酶分析以确定NGF、BDNF或新序列的相对含量。在所有情况下，用溴化乙锭染色可测定仅与NGF和BDNF序列相应的限制性片段。但是，使用同样的PCR产物作为大鼠基因组DNA的Southern吸印的杂交探针可显示出一个产物（表示为R1B/2C，图6A），该产物可鉴定除NGF和BDNF（图6A）外的新基因组DNA序列，因此，用Southern吸印筛选的PCR产物可用于鉴定用其他方法不能测定的稀有的扩增序列。R1B/2C探针也可测定趋异进化物种（包括人、小鼠、小鸡和爪蟾属）的基因组DNA中的新序列， 建议用该探针鉴定功能基因。

为分离这种基因，使用R1B/2C探针，以及特别为NGF和BDNF的探针，以筛选（Maniatis  et  al.，1982，Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual（Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  Spring  Harbor））大鼠基因组DNA文库（从Clontech  Laboratories，Inc.购买，Palo  Alto，CA），该大鼠基因组DNA文库由Sprague-Dawley大鼠基因（用Sau3A限制性核酸内切酶部分消化并在EMBL3/SP6/T7噬菌体载体中克隆化）制备。发现二个独立的噬菌体克隆杂交到R1B/2C探针上，但没有杂交到另外两个探针上。这些克隆中的大鼠基因组插入物的限制性图分析表明它们相当于同样的基因（图6B）。带有最长插入物的噬菌体克隆表示为φrN3（G1）。序列分析证明由R1B/2C鉴定的基因编码成NGF/BDNF家族中的一个新成员（见图7），我们将其命名为神经营养因子-3。

7.2.2.成熟的神经营养因子-3的序列分析

使用United  States  Biochemical  Corporation提供的SEQUENASE  Version  2.0型仪器并使用厂家推荐的议定书，通过二脱氧核苷酸链终止法（Sanger  et  al.，1977，Proc.Natl.Acad  Sci.U.S.A.74：5463-7）进行DNA定序。

NGF有两个不同的前体形式，术语称“长”前体（在开始位点“A”起始）和“短”前体（在开始位点“B”起始），按其N-末端序列的长度来区分（Darling  et  al.，1987， Cold  Spring  Harb.Symp.Quant.Biol.1：427-34;Selby  et  al.，1987，Mol.Cell  Biol.7：3057-64;Edwards  et  al.，1988，Mol.Cell  Biol.8：2456-64）。长和短前体都可蛋白水解地解离以产生NGF的成熟形式，它基本上构成每个前体的羧基末端的120个氨基酸。BDNF也有类似的长和短前体形式。

由几个物种的NGF基因序列显示出大多数这种附加的N-末端序列已在分离的外显子上发现，除了包括在轴突5′末端的四个密码子（Val-His-Ser-Val），这些密码子给完全短（起始位点“B”）前体编码。我们预先已经证明这四个密码子（Val-X-X-Val）中的二个，以及领先于它们的RNA拼接受体位点，仅存在于上游至由几个物种分离的BDNF基因中的保存的“B”起始位点;这个发现使我们提出BDNF的长前体和短前体的存在。Val-X-X-Val密码子以及拼接受体位点保存在大鼠NT-3基因中;这种拼接受体位点和提出的基因的内界面示于图7A。这些序列的研究使我们假定存在NT-3基因的上游编码外显子，它编码长前体形式。公认的NT-3“A”起始位点的保存序列上游的发现进一步加强了我们关于长BDNF前体存在的假定，并认为对所有NGF家族成员都起到重要的、进化的保存作用。假定的成熟NT-3的N-终点接着一个标准的蛋白酶卵裂序列（Arg-Arg-Lys-Arg），同NGF和BDNF（图7A，C）中见到的很相似。在一些物种中，NGF的两个C-末端氨基酸也被蛋白水解去除。不同于NGF，大鼠NT-3在其C-终点（图7A，C）没有明显的潜 在卵裂位点，我们可以推断，正如观察期的所有物种BDNF一样，在NT-3的C末端没有蛋白水解修饰。

基于这些观点，成熟的NT-3多肽的假定大小是119个氨基酸，具有计算的PI约为9.5。这样，在大小和电荷方面，NT-3非常相似NGF和BDNF。七个成熟NT-3的N-末端氨基酸完全不同于NGF和BDNF。从八个成熟NT-3的氨基酸开始，最佳顺序需要相对于BDNF的两个氨基酸的单裂和相对于NGF的一个氨基酸的单插入（图7D）。成熟大鼠NT-3显示出57%氨基酸与大鼠NGF同源，58%氨基酸与大鼠BDNF同源;120个残基的57个（48%）被全部三个蛋白质所共用（图2D）。六个在NGF和BDNF中发现的半胱氨酸残基全保存在NT-3中，在三个蛋白质中的最大同源区域主要集聚在这些半胱氨酸残基周围。

7.2.3.神经营养因子-3前体的分析

仅从上游到假定卵裂位点释放出成熟的NT-3，有一个通用的糖基化受体位点（Asn-X-Thr/Ser，见图7A，C），它也在NGF和BDNF中同样位置发现（Ullrich  et  al.，1983，Nature  303：821-5;Leibrock  et  al.，1989，Nature  341：149-52）。这个糖基化位点是否在NT-3、NGF或BDNF前体的制备中起作用仍是未知的。

将NT-3序列同NGF和BDNF前体进一步比较显示出两个成熟NT-3序列的氨基酸同源上游的区域（图7B、C中区域Ⅰ和Ⅱ）。区域Ⅰ同源使我们假定存在“B”开始位点（上述给NGF定义的）的大鼠NT-3、它将产生258个氨基酸的短前体，大小类 似于NGF的短前体（241个氨基酸）和BDNF的短前体（249个氨基酸）;表现甲硫氨酸起始密码子、分泌信号序列和信号序列卵裂位点，这些短前体全部三个因子都存在（图7C）。因为区域Ⅰ同源扩展“B”起始位点的上游，我们也可假定存在NT-3的长前体，它起始于“A”起始位点（见图7A、B、C）。正如用NGF所看到的（Ullrich  et  al.，1983，Nature  303：821-5;Selby  et  al.，1987，Mol.Cell  Biol.7：3057-64）和为BDNF所提出的，这样一个起始端大概会被编码在另一外显子上游到单个外显子，它编码完整短前体。

除了区域Ⅰ和Ⅱ氨基酸同源外，比较NT-3、NGF和BDNF亲水性区，显示出在前体、成熟产物的上游具有相似的结构。

7.2.4.神经营养因子-3具有神经营养活性

NT-3、NGF和BDNF之间的明显同源有力地指出了NT-3可能具有神经营养活性。NGF和BDNF都可促进体内和体外的外周和中枢神经系统神经元的选择种群的存活（reviewed  in  Whittemore  and  Seiger，1987，Brain  Res.Rev.12：439-64;Lindsay，1988，in“The  Making  of  the  Nervous  System，”PP.149-65;Davies，1988，Trends  Genet.4：139-43）。例如，给发育鸟胚胎引入任一个因子可防止在特定的外周神经节中自然发生神经元死亡（如Hoffer  and  Barde，1988，Nature  331：261-2）。当加到移出的神经节时，NGF和BDNF引起轴突赘疣（Davies  et  al.， 1986，J.Neuro  Sci.6：1897-904），当加到离异神经节神经元的培养物中时，这些因子促进神经元的存活和分化（Lindsay  et  al.，1985，Dev.Biol.112：319-28）。这种在体外的试验，采用几种类型的小鸡外周神经节，可用于区别NGF和BDNF的神经营养活性。而将两种因子都作用于在神经脊衍生的背根神经节（DRG）中发现的感觉神经元种群上，只有BDNF维持神经基板衍生的节状神经节（NG）的感觉神经元（Lindsay  et  al.，1985，Dev.Biol.112：319-28）。相反，NGF，而不是BDNF，可以维持侧椎骨干交感神经节（SG）的神经元的生存和生长（Barde  et  al.，1982，EMBO  J.1：549-53）。

为了测定NT-3的潜在生物活性，我们将大鼠NT-3基因插到一个载体PCDM8中（Seed，1987，Nature  329：840-42），它预先被用来暂时表达哺乳动物细胞中的BDNF和NGF。设计这种结构用来表达NT-3的短前体形式;NGF和BDNF的短前体形式的表达已产生生物活性物质（Edwards  et  al.，1988，Mol.Cell  Biol.8：2456-64;Leibrock  et  al.，1989，Nature  341：149-52）。NT-3、NGF和BDNF结构被转染成COS细胞;收集培养物的上清液，并首先在不同浓度下测定其由DRG外植体引起轴突赘疣的能力。正如所预期的，NGF和BDNF在这个测定中促进轴突赘疣（图8）。首次表明NT-3基因实际上编码神经营养活性，该基因产物由DRG外植体引起大量的轴突赘疣（图8）。

为确定NT-3直接作用于神经元，我们测定在解离的DRG神 经元的高富集培养液中的这个因子（图9）。在实际上没有Schwann细胞和成纤维细胞时，NT-3促进大约60%DRG神经元的生存和轴突赘疣。如果NGF和BDNF一起维持在培养液中的实际上100%的DRG神经元（Lindsay  et  al.，1985，Dev.Biol.112：319-28），则必须假定NT-3促进细胞的生存，它也应答于其它两个因子中的至少一个。

7.2.5.NT-3的神经营养活性是从NGF

和BDNF中分离的

为进一步研究NT-3的神经元特性，我们测定NG和SG外植体上的因子。正如所预期的，对比实验证明NGF引起由E8鸡胚SG（而不是NG）外植体的轴突赘疣，而BDNF引起由NG（而不是SG）外植体的轴突赘疣。有趣的是NT-3促进由NG和SG外植体两者的轴突赘疣（图8），提供比NGF或BDNF更广的特性。但是，象NGF和BDNF一样，NT-3不能促进生存或促进由鸡睫状神经节的外植体或解离的富集神经元培养液的轴突赘疣。如前所述，副交感神经元（包括神经节）应答于大鼠CNTF（与NGF/BDNF/NT-3家族没联系的神经营养因子（（Manthorpe  et  al.，1986，Brain  Res  367：282-6）;Stockli  et  al.，1989，Nature  342：21-28）。在使用用对比载体转染的COS细胞的上清液的任何这些测定中都没有发现应答（图8）。

移出的胚胎8天的（E8）鸡背根神经节（DRG）、节状神经节（NG）和侧椎骨交感神经节（SG）对增加NT-3剂量的应答的典型实验测量结果示于表Ⅳ。在1ml胶原凝胶中按外植体的倍数 培养神经节，如Lindsay和Rohrer所述（1985，Dev.Biol.112：30-48）。在0～5范围内计算纤维赘疣，这里的5是应答于饱和剂量（1-10ng/ml）的神经生长因子（NGF）时的背根神经节上观察到的最大纤维赘疣。如上所述，提供大鼠NT-3作为用质粒PC8-rN3（P1）转染的COS-M5细胞的条件培养基。使用假转染的COS-M5细胞的条件培养基作为对照。所有的实验剂量，超过50倍范围，NT-3促进外植体神经节的所有三种类型的可见的纤维赘疣，虽然在低剂量时交感神经节对NT-3的最大应答大于对BDNT的最大应答。节状神经节没有显示出应答于NGF的纤维赘疣。交感神经节对NT-3的最大应答小于这些神经节对NGF的最大应答，较在背根或节状神经节培养液中最大应答于NT-3所需的浓度更高时可以观察到。

表Ⅳ

重组大鼠NT-3促进下列外植体的纤维赘疣：

DRG＝E8小鸡胚胎背根神经节

NG＝E8小鸡胚胎节状神经节

SC＝E8小鸡胚胎侧椎骨交感神经干神经节

纤维赘疣数

DRG  NG  SC

（24小时）  （24小时）  （24小时）

对照  500μl伪转染的  0～0.5  0  0

COS细胞上清液

NT-3  10μl  COS  2-3  2-3  0-0.5

细胞上清液

NT-3  50μl  COS  3-4  4-5  0-0.5

细胞上清液

NT-3 200μl COS 5＊2-3＊0-1

细胞上清液

NT-3 500μl COS 5＊0-2＊1-2

细胞上清液

在每种情况下的结果都是4到6个神经节的纤维赘疣数目范围。

＊在NT-3的过饱和含量时，纤维赘疣减少，由DRG外植体上纤维长度和NG外植体上纤维数确定。

7.2.6.大鼠神经营养因子-3对哺乳动物

神经元是活性的

为了确定大鼠NT-3是否对哺乳动物神经元呈现活性，使用14天大鼠胚胎解剖的背根神经节重复外植体测定（表V）。使用纯化的NGF作对照。将E14大鼠背根神经节外植体（每1ml培养液4个神经节）培养24小时，基本上如所述的对鸡神经节那样（图8，表Ⅳ），其分别为：不加入神经营养因子（对照），加有小鼠下颌腺神经生长因子（NGF），或加有重组大鼠NT-3（如上所述， 用质粒pC8-rN3（P1）转染的COS-M5细胞的条件培养基）。如上所述（见表Ⅳ），记录每个神经节的纤维赘疣。结果表明，象NGF一样，NT-3在促进大鼠背根神经节外植体纤维赘疣中是高活性的。

表Ⅴ

NT-3促进大鼠胚胎背根神经节外植体纤维赘疣。

纤维赘疣数

E14大鼠DRG

对照  0，0，0，0

NGF（小鼠，5ng/ml）  4，4，4，3

NT-3：20μl大鼠NT-3  3，3，3，4

COS细胞上清液

对于每种培养液的4个单独神经节的每一个都给出纤维赘疣数（0-5范围内）。

当DRG、NG和SG外植体的每一个对三个有关的神经营养因子的至少二个应答时，由给定的神经节显示出的最大应答取决于所用的因子。在DRG情况下，对饱和含量的NGF、BDNF和NT-3的应答是比较相当的。但是，用NG时，对NT-3的最大应答比对BDNF的大，当用SG时，与NGF相比，对NT-3的最大应答基本上较低和稍微延迟。

7.2.7.研究神经营养因子-3合成的位点

已经证实在发育期神经元存活依赖于靶衍生神经营养分子。连续存活，甚至在成体中，可能需要持久的神经营养作用（Thoenen  et  al.，1987，Ciba  Found.Symp.126： 82-95）。在其他情况下，成熟神经元的存活可不再依赖神经营养因子;不过已表明这些因子深深地影响神经元的分化表现型（Lindsay  and  Harmar，1989，Nature  337：362-4）。确定神经营养分子合成的位点可以由此帮助解释它的生理作用。

研究NT-3合成的位点并将NT-3表达与NGF和BDNF的表达比较，将由各种成体大鼠组织制备的RNA试样的三重的Northern吸印杂交成特殊探针，用于这些基因的每一个（图10）。正如以前所表明的（Heumann  et  al.，1984，EMBO  J.3：3183-9;Shelton  and  Reichardt，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：7951-5）NGF  mRNA的表达在脑、心和脾中是最高的;在所有其他检测的组织中至少可检测出痕量。BDNF呈现一个更为限制的表达模式;在脑中发现最高的含量（Leibrock  et  al.，1989，Nature，341：149-52）在心、肺和肌肉中见到显著的含量。如同NGF，在所有研究的成体组织中都测定出NT-3转录本（1.4Kb）。但是，在所有研究的外周组织中，NT-3mRNA表达的含量至少同在成体脑中见到的是可相比的，而在某些情况下（例如肾、脾）是显著高的。

我们也可比较在新生和成年小鼠的脑中的NGF、BDNF和NT-3转录本的相对丰度。同NGF和BDNF两者相比，在新生脑中NT-3mRNA的含量比在成体脑中高（图8）。更详细的分析表明在中枢神经系统中NT-3mRNA的含量比在胎儿发育期显著高，然后降低到成体含量。

7.3.讨论

NGF、BDNF和这个基因家族的最新成员NT-3之间进行结构比较，集中在几个保存区域，并提出建议通过位于这些保存区域外侧的序列来确定这些蛋白间的功能差别。存在所有这三种蛋白的长和短前体形式的假定产生了关于在体内两种前体形式相关的这一有兴趣的问题。长形式比短形式可更有效地制备。尽管如此，表达这些因子的短前体形式的载体在COS细胞中产生生物活性物质。

我们发现这三种神经营养因子显示出独特的特殊阶段和特殊组织的表达模式，这支持了神经发育依赖于分离的神经营养活性的时间和空间的独特表达的观点。NT-3表达的发育轮廓提示这个因子可在神经系统的发育早期中起特别重要的作用。我们的NT-3在体外的神经营养活性的原始鉴定，联同于在成体脑和成体外周组织中NT-3mRNA的普遍流行，这进一步提示NT-3可能具有对神经元功能和/或在成体中存活具有普遍的影响。更全面的NT-3表达也增加了这个因子作用于神经系统的细胞表面的可能性，正如已对NGF所提出的（Otten  et  al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10059-10063）。

虽然还不能清楚地证明神经元可对多于一个神经营养因子同时应答，有资料提出NGF和BDNF可作用到重迭神经元种群上。例如，或者NGF或BDNF的引入可挽救绝大多数DRG神经元，否则这些DRG神经元在鸟类正常发育中会死亡（Hofer  and  Barde，1988，Nature  331：261-2）。通过NT-3对小鸡外周神经节的作用的观察有力地支持了单个神经元可应答于多个相关的帮助这一有趣的可能性。如果是这样，同时应答的调解 和生理关联两者则成为极有趣的问题。例如，受体的组份和/或三个结构相关的神经营养因子的信号传导机制可以是共同的。原则上，同时应答的神经可有多个受体（每个特为所给的神经营养因子）或单个受体，它们可以调整对多个神经营养因子的应答。在体内，这些不同的因子可以同时提供给所有应答神经元。很可能，在单个因子的相对存在中有时间-空间差别（如Davies  et  al.，1987，Nature  326：353-8）。甚至有可能这些不同的因子存在于同样神经元的不同部位（例如，感觉神经元可从其外周和中心端接受分离因子）（Kalcheim  et  al.，1987，Le  Douarin，EMBO  J.6：2871-3）。如果多个因子同时存在于某些神经元中，这些因子或是重复的或是互补的。

解释NGF、BDNF和NT-3的单独的或潜在的互补作用，关键的是为了解神经系统的正常发育和维持提供信息。动物研究已经提出NGF在变性神经条件的处理中是有价值的（Snider  and  Johnson，1989，Ann.Neurol.26：489-506;Fischer  et  al.，1987，Nature  329：65-8;Phelps  et  al.，1989，Neurobiol。Aging  10：205-7）。NGF/BDNF基因家族中的新成员的克隆化和与该家族其他成员的潜在的相互作用，增加了在神经变性疾病中这些蛋白的潜在治疗运用的新的考虑。

8、实例：人神经营养因子-3基因的

克隆化和特性鉴定

8.1.结果

按上文例7所述，来制备用于鉴定大鼠NT-3基因的探针 （R1B/2C）。如其中所述，由大鼠基因组DNA通过聚合酶链式反应（PCR）制备该探针，制备中使用与NGF和BDNF共用的氨基酸序列同源的两个“盒”相应的简并低核苷酸引物。在R1B/2C探针中表示新基因的DNA分子种群的存在通过用EcoR1限制性核酸内切酶消化的大鼠基因组DNA上Southern吸印杂交来起始显示;除了已知的同NGF和BDNF基因相应的预计的片段外，探针测定出一个新的DNA片段。

当用32P-标记的R1B/2C作为探针来分析用各种限制性核酸内切酶消化的人基因组DNA的Southern吸印时，在大鼠DNA情况下，观察到杂交成与NGF和BDNF基因相应的带，并且也有杂交成新的带。例如，用HindⅢ限制性核酸内切酶，观察到约1.8Kb的新（即无NGF，无BDNF）带;用BamHI观察到约15Kb的新带;用EcoRI观察到8和12Kb的新带（从人基因组DNA中的EcoRI限制性位点的多形性可得出二种带的存在）。这些资料表明人DNA含有一个给NT-3的基因，它可在大鼠和人之间很好地保存。

按分离大鼠NT-3基因（见例7）所述，通过筛选基因组文库可分离人NT-3基因。简单地说，用R1B/2C探针，并用大鼠NGF和大鼠BDNF探针筛选由人胎盘基因组DNA的Sau3A部分消化产物组成的，用噬菌体载体λEMBL3/SP6/T7（从Clontech Laboratories，Inc.购买）克隆化的文库。人NT-3克隆希望同R1B/2C杂交，而不同NGF或BDNF杂交。在筛选的约8×105噬菌斑中可鉴定一种这样的噬菌体克隆。这种克隆，用φhN3（G1）表示，发现含有约16 Kb的人DNA插入物。该克隆是按一般方法可限制性地绘出，将选择的限制性片段亚克隆化成DNA序列分析的质粒pBluescripⅡ（层聚基因（Stralagene））。人NT-3基因的序列和导出的氨基酸序列，用大鼠NT-3序列排列，示于图11。

8.2.讨论

序列分析结果表明于大鼠和人NT-3之间在核酸和氨基酸序列中具有非常高的保存度。在给成熟多肽（119个氨基酸）编码的区域中，在DNA序列中人和大鼠基因约92%同源。但是，在这个区域中人和大鼠之间核苷酸序列的无差别则导致氨基酸的取代;导出的成熟大鼠和人NT-3（和成熟小鼠NT-3，见上文第6节）的氨基酸序列是完全相同的。这使人想起BDNF的高保存度，它表明大鼠、小鼠、人和猪中的成熟多肽的氨基酸序列完全相同。相反，成熟人NGF和啮齿动物NGF（小鼠或大鼠）的氨基酸序列有大约10%的差别。所以，推定的人和大鼠NT-3前体的氨基酸序列也明显地显示出几个差别（在图11中划线的）。预定的蛋白酶卵裂位点的上游直接产生成熟NT-3多肽（Arg-Arg-Lys-Arg），人的序列缺少一个密码子（Pro），它存在于大鼠序列中。在人和大鼠prepro  NT-3之间的四个氨基酸的一个区段是不同的，在该区段和预定的蛋白酶卵裂位点之间分散着六个附加的单个氨基酸取代物。

9.人的NT-3的生物活性

因为成熟人NT-3的导出的氨基酸序列和成熟大鼠NT-3的相同，这有力地假定人和大鼠NT-3蛋白会显示难于区分的生物活性。通过将克隆化的人基因插入到质粒表达载体PCDM8中可确定人NT-3的神经营养活性，将得到的质粒pC8-hN3（P1） 转染到COS-M5细胞（如Chem  and  Okayama所述，1987，Mol.Cell  Biol.7：2745-52），并在转染细胞条件培养基中测定神经营养活性。人NT-3基因可由噬菌体φhN3（G1）的PCR扩增，并插入到质粒表达载体pCDM8中，如对大鼠NT-3基因所述（例7）;将得到的质粒表示为pC8-hN3（P1）。确定完全NT-3插入物的核苷酸序列并同如上所述确定的基因组序列比较，以确定在PCR扩增和克隆化过程期间没有引入突变。转染和测定方法基本与测定大鼠NT-3的生物活性所用的方法相同。

正如所假定的，当在9天（E9）小鸡胚胎背根神经节和节状神经节的外植体上测定时发现人NT-3具有神经营养活性（表Ⅵ）。在条件培养基（上清液）存在下将该神经节培养（见图8，表Ⅳ）24小时，该条件培养基来自假转染的COS-M5细胞，或来自用质粒（全部由pCDM8表达载体衍生的）转染的COS-M5细胞，该质粒编码重组人BDNF，或重组大鼠NT-3〔rNT-3;质粒pC8-rN3（P1）〕或重组人NT-3〔hNT-3;质粒pC8-hN3（P1）〕。选择BDNF质粒作为阳性对照物，因为已知BDNF具有对背根和节状神经节的神经营养活性。如表Ⅵ所示，大鼠和人重组NT-3，在合适的剂量下（比较表Ⅳ）大致显示出同BDNF对背根神经节同样水平的活性，显示出比BDNF对节状神经节显著大的活性。在人与大鼠NT-3活性的比较中没有观察到差别。

表Ⅵ

当在外植体培养液中对小鸡胚胎背根神经节或节状神经节的测定 时，COS细胞生产的重组人NT-3的活性与重组大鼠NT-3的一样。

纤维赘疣数

DRG  NG

对照  0，0，0，0，0.5  0，0

BDNF：20μl  COS  3，3，3，3，3  1，3

上清液

假：20μl  COS上清液  0，0.5，0，0，0  0

人NT-3：20μl  COS  3，2，4，3  3，3

上清液

大鼠NT-3：20μl  COS  3，4，4，3，4  3，4

上清液

数目表示在培养液中24小时内，1至5个单独的神经节上观察到的纤维赘疣（范围为0到5）的测量结果。对每个单独神经节上的数目都有表示。

10.用代谢标记鉴定人NT-3基因产物

成熟NT-3多肽（大鼠或人）的假定的大小是119个氨基酸，分子量是13.6道尔顿。为了用实验方法确定成熟人NT-3多肽的近似大小，将用人NT-3表达质粒转染的细胞进行代谢标记，并分析条件培养基以确定新多肽的存在。在图12所示的实验中，用质粒pC8-hN3（P1）（如上所述）转染COS-M5细胞，用[35S]半胱氨酸和[35S]蛋氨酸的混合物标记该细胞，收集生长培养基并在15%聚丙烯酰胺凝胶的变性条件下由电泳来分离将蛋白转移到膜滤器上（基本上如Towbin等人所述，1979，Proc.Natl.

Acad.Sci.U.S.A.76：4350-4354），并用自动射线照相术测定标记的多肽。用假转染细胞作对照物（通道标记的“MOCK”）。如图12所示，表达质粒pC8-hN3（P1）支配约14KDa的单个多肽（在图中标记NT-3的）的合成，这在对照物中没有发现。在现有技术分辨率的限制内，这与假定的成熟NT-3的大小非常一致。

11.实例：神经营养因子-3维持胚胎大鼠下中

脑的培养多巴胺能神经元的存活

建立E14大鼠胚胎下中脑培养液，如美国专利申请（序号No.07/400，591，1989，8.30日申请）中所述，在此通过参照将该专利全部引入。培养液的接种密度为50，000细胞/cm2（图13）或100，000细胞/cm2（图14），在无神经营养因子的对照物中生长，或在高含量的含有重组人神经营养因子-3（NT-3）的COS细胞上清液中生长。培养8天后，将细胞固定并用单克隆抗体染色成酪氨酸羟化酶（TH），一种多巴胺能神经元的标记。如图13和14所示，发现高含量的NT-3增加8天后存活的TH阳性细胞数，用1∶25稀释NT-3COS细胞上清液最大增加到2、5倍地超出控制值。纯化神经生长因子看来没有作用，但是，NT-3的作用类似于由BDNF观察到的。

12.实例：在发育的大鼠神经系统中的NT-3、

BDNF和NGF：相同和相反的表达模式

12.1.方法

12.1.1  材料和解剖

在整个解剖中使用Sprague-Dawley大鼠（由Harlan   Sprague  Dawley  Inc.购得）。由一般大体解剖界标指导成体脑的解剖。脑皮层样品包括新大脑皮质和嗅皮层的背部位置。制取间脑样品用髓纹和视交叉分别作背部和下部界标。制取中脑样品在上丘或下丘的平面、背面，并伸展到脑的下表面直到脑桥的最大吻边界。后脑样品没有小脑，但是包括脑桥和髓。应注意到只有纹状体的吻部分制成样品，避免被丘脑组织污染。从伞/穹窿到约尾极的平面内收集海马样品。解剖新生脑采用类似的界标，除髓纹之外。使用同步妊娠的大鼠以获得胚胎组织，精子的日期确定地表示为寿命E1，分娩的日期表示为PO。成年大鼠平均重150～275克（年龄为6～8周）。

12.1.2.RNA的制备和Northern吸印

解剖选择的Sprague-Dawley大鼠组织并立即冷冻在液氮中。通过在3M LiCl/6M尿素中组织的均化来分离RNAS（如Bothwell et al.，1990，in Methods of Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes，Jones and Bartlett，Boston，MA所述）。分离RNAS（10μg）用电泳法，通过四倍的1%琼脂糖/甲醛凝胶（Bothwell等人，见上文），接着用10X标准盐水柠檬酸（SSC），PH7，毛细转移到尼龙膜上（MagnaGraph，Micron Separations Inc.）。用紫外线（STRATALINKER ，Stratagene，Inc.）照射将RNAs UV-交联到膜上并在68℃在0.5M NaPO4（PH7）、1%牛血清清蛋白（馏分V，Sigma Inc.）、7%SDS、1mM EDTA（Mahmoudi and Lin， 1989，Biotechniques 7：31-33）和100μg/ml声处理的、变性的鲑精子rDNA存在下用放射性标记探针杂交。在68℃用2X SSC、0.1%SDS冲洗过滤物，并用1或2个增光屏（CRONEX ，Dupont）和X-射线胶片（XAR-5，Kodak）在-70℃自动射线照相一天到二周。四倍的凝胶的溴化乙锭染色表明测定的不同样品的总的RNA的含量是相当的（as in Maisonpierre et al.，1990，Science 247：1446-1451）;这是通过用特别适于28S rRNA的探针来探测几个吸印而测定的。

12.1.3.NT-3、BDNF、NGF和

NGFR探针的制备

大鼠NT-3、BDNF和NGF编码区域分子克隆化到pCDM8表达载体中（Aruffo and Seed，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：8573-8577）已在前面叙述（Maisonpierre et al.，见上文）。将这些质粒的800碱基对（bp）XhoI插入物在丙烯酰胺凝胶上分离并用电洗脱回收（Bothwell et al.，1990），接着用无规则的六聚物标记进行32P-标记（Bothwell et al.，见上文）;将每个探针杂交到合成的NT-3、BDNF和NGF转录本上（见下文），这证明一个专门的神经营养因子探针不由相关神经营养因子杂交到转录本上。大鼠NGFR探针是1.6Kb NcoI cDNA片段，它跨过大鼠NGFR蛋白编码区域（Radeke et al.，1987，Nature 325：593-597）。

12.1.4.合成转录本的生产和测定

如上所述，使用在pCDM8/神经营养因子表达结构物中存在的T7噬菌体启动子制造同NT-3、BDNF和NGF编码区域指向对应的合成RNA转录本。这些合成转录本的量首先用分光光度测定法测量。转录本的进一步测定使用末端标记（Bothwell等人，见上文）的30-mer低核苷酸探针，该探针杂交到三个转录本的共用的5′末端（T7启动子的下游）。点一和杂交到低核苷酸探针（杂交和冲洗在55℃，其他如上所述）的Northern吸印的合成转录本的光密度扫描（Series  300  Computing  Densitometer，Molecular  Dynamics  Inc.）证实使用相当含量的合成转录本可作为规定的标准（图15A绘出的典型数据）。

12.1.5.神经营养因子转录本含量的光密度测量

如下为各种样品中转录本含量规范化到标准化的成体大鼠脑样品上（见上文）。成体脑RNA样品的相当的等分试样包括在每个Northern吸印上。对每个Northern吸印的各种自动射线照相底片的光密度扫描用来确定每个测定样品的信号强度。对每个扫描底片，测定每个样品的信号强度。对每个扫描底片，每个样品的信号强度都用在底片上获得的成体脑样品的信号强度值除，这使所有数据相对于标准的成体脑样品而规范化。在图18中，表示出了相对于成体脑样品中的含量的不同样品中转录本的含量，成体脑中的含量人为地定为1.0。已经确定在成体脑样品中每微克的总的RNA毫微微克的神经营养因子转录本，我们可确定在样品中相对于成体脑样品规范化的转录本的实际含量（以fg/μg计）。

12.2.结果

12.2.1.在成体大鼠脑中NT-3、BDNF

和NGF  mRNA含量的测定和比较

我们采用Northern吸印测定系统来测定和比较在各种组织衍生样品中NT-3、BDNF和NGF转录本的表达。测量相对于定义的合成标准的不同样品中每种神经营养因子转录本的含量。被精确确定数量的合成NT-3、BDNF和NGF  RNA转录本（见图15A及其说明）包含在还含有10ug从成体大鼠脑分离出的总RNA的Northern吸印中。将该吸印杂交到放射标记的专用于每种神经营养因子的探针上，然后自动射线照相（图15B）。然后使用扫描光密度测定法用于比较从成体脑样品和合成标准样品获得的杂交信号强度。测定表明在成体大鼠脑中全部三种神经营养因子有大约相等的mRNA含量（估计为每ug总RNA40fg  NT-3转录本、45fg  BDNF转录本和30fg  NGF转录本）。标准的成体脑样品的等分试样包括在所有后续的Northern吸印上，这样，可通过比较来测定新RNA样品中神经营养因子表达的含量（见下文）。为助于视觉比较不同样品中三种神经营养因子转录本，选择绘有连续图形的底片，以便对所有三种神经营养因子在标准化成体脑样品中的信号强度是类似的，所以将在其他组织样品中的信号规范为定义的标准。

12.2.2.NT-3、BDNF和NGF基因表达

显示出共同和独特的发育特征

大鼠胚胎中神经营养因子表达的检测表明所有三种神经营养因子，在十一和十二天（E11-E12）胚胎之间表达水平都有惊人的增 加（图16A）;所有三种神经营养因子转录本都广泛分布在整个E12和E13胚胎中。在神经营养因子基因表达中预定增加的时间与神经发生（在周围和中心）真正开始的时间相同，同由这些新形成的神经元开始制成轴突的时间相同（例如，Altman  and  Bayer，1982，Adv.Anat.Embryol.Cell  Biol.Vol.74;Altman  and  Bayer，1984，ibid，Vol.85）。

尽管在胚胎发生期间神经营养因子基因表达的开始相同，同标准化成体脑样品比较表明在早期胚胎中NT-3mRNA具有最大的丰度（180fg/μg总RNA），而BDNF  mRNA丰度最小（5-10fg/μg总RNA），NGF  mRNA以中间含量存在（30fg/μg总RNA）（图16A）。当表达含量随后在发育脑中（图16B）或在致密的神经支配的心脏中时，NT-3和BDNF连续地显示为反比关系，最初高的NT-3表达开始降低，而最初低的BDNF表达开始增加，直到在成体中最终达到相似含量;相反，NGF表达保持相当恒定的含量。有趣的是，在肝和胸腺发育期间NT-3表达增加，这些器官不是致密的神经支配的，它不表达可测定的BDNF  mRNA（图16C）。

NGFR转录本的胚胎表达显然先于在神经营养因子基因表达中的增加，在早期脊髓中显著地高，而在出生前脑发育中和出生后心脏发育中降低（图16A、B、C）。

12.2.3.比较NT-3、BDNF、NGF和

NGFR在新生和成体神经系统中的表达

为确定在大鼠神经系统中神经营养因子基因表达的空间分布和了 解在各分离的脑区域中整个脑相关的发育变化中的不同的发育轮廓，我们检测在新生和成体脑之间神经营养因子基因表达。所有三种因子在其表达模式中都显示分离的时空差别（图17）。测定转录本含量（包括在外周组织中的），以图的形式表示于图4中。所有三种因子共有的主要相似处是其在成体海马中的表达为一样的高含量。同在成体外周组织中的情况相比，其中在其广泛的分布中NT-3和NGF表达更为相似（Maisonpierre等人，见上文），在成体脑中其全部表达模式中NT-3和BDNF显示出明显的相同（图17B、18B）;有趣的是，两个因子显著地缺少纹状物。但是，当表达在新生和成体脑之间比较时，NT-3和BDNF也显示出最有趣的和明显的不同（图17A、B和图18A、B）。在新生脑中NT-3表达是最高的，比在成体脑中、在脑的更不成熟区域（即小脑、海马和新皮质）中高得多。在这些区域BDNF表达是最低的，而在较早成熟的更为尾部脑区域（即后脑、中脑和间脑）中最高并类似于成体水平。如在成体脑中，NT-3和BDNF转录本在新生纹状体中是测不出的。

同NT-3和BDNF相比，NGF  mRNA含量在新生脑与成体脑相比中显示出不太惊人的差异（图17、18）;在新生脑中嗅球NGF含量较高，而海马和新皮质NGF含量在成体中较高。与在成体脑中相反，NGFR  mRNA含量在新生脑中通常较高，在新生小脑和后脑中具有特别高的含量（图17A、B）。

12.2.4.在分离的CNS区域的发育期间NT-3、

NGF和BDNF表达的检测

为进一步证实这一观点，即NT-3在特殊CNS区域的早期发 育中表现最显著，而BDNF在同样区域的晚期发育中表达突出，我们分析了在三种CNS区域发育期间的（其按照非常不同的时间过程而成熟）神经营养因子基因表达。神经发生，迅速接着一个细胞自然发生死亡的时期，在脊髓（E12-E13）中很早开始并在分娩前几天完成（Altman  and  Bayer，1984，见上文）。相反，在小脑和海马中大多数神经元（按颗粒细胞种群计数）在分娩后出生（eg.Altman，1966，J.Comp.Neur.128：431-474;Schlessinger  et  al.，1975，J.Comp.Neurol.159：149-176）。在后发育的小脑中，在生命的前三周内有大范围的神经发生、或神经细胞移行和神经元分化（例如Altman，1966，见上文）。已经报道，直到分娩后约两周，在海马中NGF  mRNA含量是不易测定的。（Large  et  al.，1986，Science  234：352-355）;在大批颗粒细胞再育的邻近出生开始后很久这种增加出现（例如Altman，1966，见上文）和来自基前脑胆碱能神经元的纤维的侵入（Koh  and  Loy，1989，J.Neuro  Sci.9：2999-3018），但同这些神经元的进一步胆碱能的分化相一致（Large等人，见上文）。

我们对发育的脊髓的检测（图5A、E）表明高含量的在E12-E13中NT-3表达（150-280fg/μg总RNA），它在分娩时降低，而在成体中几乎是不可发现的。BDNF  mRNA（它在E12-E13中可勉强测定出）在分娩时达到峰值（10-20fg/μg总RNA），然后在成体中降低。NGF  mRNA在E12-E13脊髓中表达为最高含量（15-25fg/μg总 RNA），但是在相同阶段比NT-3  mRNA含量低10倍。有趣的是，NGFR在早期脊髓中表达为最高含量;这样的表达与在早期脊髓中新形成的运动神经元的自然发生的细胞死亡的时期相关（Ernfors  et  al.，1989，Neuron  2：1605-1613）。

在晚发育的小脑（图19B、F）中，在分娩后的整个前三周内持续存在惊人的高含量的NT-3  mRNA（500-820fg/μg总RNA），而BDNF表达仅在这个时期的后期开始增加;仅在小脑发育的早期阶段可测定出含量很低的NGF表达。在小脑发育早期NGFR表达为高含量，然后在观察到NT-3表达降低之前降低。

在海马中（图19C、G），BDNF和NGF  mRNA两者的含量从在E17时的低含量增加到分娩时的中等含量，而在成体时达到最高含量。虽然在成体海马中所有三种神经营养因子转录本表达出相似的含量，但在E17和新生海马中NT-3表达比BDNF和NGF高得多;在新生海马中NT-3表达含量象在邻近出生的小脑中见到的一样高（820fg/μg总RNA）。同神经营养因子比较，在海马发育期间NGFR表达降低。

在上述检测的所有三种CNS区域中，在其发育期NT-3表达惊人的高，然后降低到成体含量，而开始低的BDNF  mRNA含量增加达到类似于NT-3的成体含量。与NT-3和BDNF的相反轮廓相比，NGF表达不呈现恒定的模式，它在脊髓和小脑发育早期，但在海马发育后期优先表达（尽管含量低）。

12.3  讨论

我们的分析揭示了这三种神经营养因子转录本的时空分布的相似点和差别。在大鼠胚胎发生的第十一天和第十二天之间，NT-3、BDNF和NGF转录本在它们的表达中都表现出同时增加，并广泛地分布在十二和十三天的胚胎中。表达这种共同突然发生的时间大体上与神经发生的发育开始相吻合（例如，Altman和Bayer，1982，上文;Altman和Bayer，1984，上文）。这种联系支持了下述看法，这三种神经营养因子对于神经系统起到特别重要的发育作用，并可标志一般首先需要所有的神经营养因子以维持有丝分裂期后的神经元生存的阶段。不过，它们的表达时间选择也可能表明神经营养因子在发育的神经系统中的其它作用（见下文）。

虽然对于这三种神经营养因子来说基因表达的开始同时出现，但它们在早期胚胎中所达到的水平非常不同。NT-3  mRNA在胚胎中最为丰富，而BDNF  mRNA则以最低的水平表达。NT-3表与BDNF表达之间的这种差别在检验的几乎每个例中都是如此。在发育过程中，NT-3表达在神经元及其前体的增殖、迁移和分化正在进行的CNS区中极为显著，通常，随着它们的成熟，这种表达在CNS区中显著地降低。相反，在新生体中BDNF表达在神经发生已经进行的CNS区中最为显著，通常随着它们的成熟，这种表达在CNS区中增加。有意思的是，在各种成体CNS区中NT-3和BDNF转录本最终达到的水平非常相近。在发育过程中NT-3和BDNF表达之间的这种互逆关系（与它们在成体CNS中十分相似的轮廓耦合）表明，在某些情况下NT-3和BDNF可能对CNS中相同的神经元群体起作用。如果是这样的话，我们的数据将意味着， NT-3在这些神经元的发育中（或许在靶神经支配的建立期间）起重要的作用，而BDNF可能主要是在上述神经元的生存后期起作用（即作为成熟因子或维持因子）。在发育中NGF表达局部发生变异，但这些变异与NT-3和BDNF的变异不同，不遵循始终如一的模式。NGFR  mRNA水平并不具体地反映这三种神经营养因子基因中任何一种的表达，这与下述可能性相符合，即它可能作为各个神经营养因子受体的共同组分（Rodriguez-Tebar等人，1990，Neuron，4：487-492）。NGFR表达往往在CNS区的发育初期是最高的，我们的研究揭示了在NGFR表达中的有意思的发育调节的变化，它是进一步研究的课题。

与NT-3和BDNF在成体CNS中相似的分布情况相反，它们在成体外周组织中具有显著不同的表达模式;NT-3转录本的较宽的外周分布可能反映了对于比BDNF更宽（且不同）范围的外周中的（神经的及非神经的）细胞的活性（Maisonpierre等人，上文）。

虽然有重要的证据表明NGF和BDNF在神经系统的发育中起重要的早期作用，但我们的分析揭示了在非常高的NT-3表达和早期神经系统发育之间的更为一致并且给人印象深刻的相关关系。在发育的小脑和新生的海马中NT-3mRNA的水平比在任何其它组织或脑区中的任何神经营养因子的水平要高几倍，并且比成体脑中任何神经营养因子的水平高20多倍。发现了NT-3是一种新的与NGF有关的蛋白质，该蛋白质至少可以支持某些依赖BDNF和NGF的神经元（Maisonpierre等人，上文），其时间上的表达非常明显地相应于神经发育的关键时期，这提出了一种可能性，即 NT-3是通常对于某些以往曾归因于BDNF和NGF的发育上重要功能负责的生理试剂。进一步强调了应重新确定这个家族的所有成员的真正的发育作用，这是由于存在着对于这些相关因子的抗体可能交叉反应的可能性（Whittemore和Seiger，1987，Brain  Res.Rev.12：439-464）。

虽然我们前面已经指出，NT-3可以起典型的神经元生存分子的作用（Maisonpierre等人，上文），这为NT-3作为靶衍生的因子（其受限制的表达导致神经元的选择和删除）创造了条件，但这并不排除NT-3（及其它神经营养因子）的其它发育上的重要作用。在发育的神经系统中NT-3表达的模式与nestin（一种新的中间丝状体蛋白质，其表达是正在进行神经发生的CNS区的特征-Lendahl等人，1990）和SNAP（早期轴突赘疣的抗原标记-Yamamoto等人，1986，J.Neurosci.6：3576-3594）的模式惊人的相似。与NGF的情况（Clegg等人，1989，Devel.Biol.134：30-37）不同，高水平的NT-3表达先于交感神经纤维到达心脏。因此，NT-3可能特别与发育过程而不是与神经元生存联系到一起，包括神经元前体增殖/分化和/或迁移细胞或它们的轴突的控制;NT-3的这种潜在生理作用的进一步的提示来自最近的发现，即神经营养因子中的一种（即NGF）可以在体外的神经元前体增殖中起作用。相反地，BDNF虽然在发育的初期就已存在，但它可能在神经元死亡和选择的初期之后很久才有更重要的作用。

在成体中所有的三种神经营养因子的表达模式都具有惊人的相似点-在成体海马中所有三种神经营养因子都以比较高的水平表达。 中断基前脑胆碱能神经元向海马的投射导致失去或减少由这些神经元的传递质合成（Snider和Johnson评述，1989，Ann.Neurol.26：489-506）。类似的退化与老年大鼠及患有阿尔茨海默氏病的人中的记忆特异性功能表现较差有联系。在大鼠模型中通过NGF的引入可使基前脑胆碱能神经元的退化向反方向转变。这里所提出的资料与下述可能性是一致的，即成体海马通常可以向基前脑提供所有三种神经营养因子，这意味着，NGF和BDNF对培养的胆碱能神经元的辅助作用的最近证据反映了这些分子的真正生理作用。但是，在海马发育的最初阶段NT-3表达是非常高的，随后降低到与NGF和BDNF相似的成体水平上。这些高的早期表达再一次提示，NT-3在来自基前脑或其它海马传入的早期联系的指导或建立中，或者在齿状颗粒细胞前体的增生中起到独特的作用;海马早期发育期间较低水平的NGF表明是阻止NGF的这种作用的（Large等人，上文）。

13.微生物的寄存

下列微生物于1990年2月28日寄存在美国典型培养物寄存中心（ATCC），12301  Parklawn  Drive，Rockville，Maryland  20852：

菌株  ATCC登记号

噬菌体DNA  φhN3（G1）  40763

噬菌体DNA  φrN3（G1）  40764

质粒  PC8-rN3（P1）  40766

质粒  PC8-hN3（P1）  40765

本发明不限于本文所述具体实施方案确定的范围。由以上所述及附图，除了所述实施方案外本发明的各种改进对本专业技术人员都是显而易见的。这些改进将落入权利要求的范围之内。本文中引证了多种出版物，这些出版物公开的内容是为了全面地提供参考。