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一种抗紫外线和耐高温的高毒力爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6及其应用

阅读：476发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种抗紫外线和耐高温的高毒力爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种抗紫外线和耐高温的高毒力爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6及其应用。本发明首先提供了一种抗紫外线和耐高温的高毒力爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6，该菌株于2019年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019800。该爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6具有对紫外线和高温的耐受力强、菌落生长速率快、产孢量高的特点，对稻飞虱、稻叶蝉具有较强的侵染杀虫效果；另外，该菌株为中国本土爪哇棒束孢菌野生菌株IJNL-N8的诱变株，并非从国外引进，能适应我国南方地区稻田的高温和强紫外线照射等自然环境；因此，该爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6可作为抗药性害虫的替代防治药物，在制备防治稻飞虱和稻叶蝉的生物制剂中具有广泛的应用前景。，下面是一种抗紫外线和耐高温的高毒力爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种抗紫外线和耐高温的高毒力爪哇棒束孢菌(Isaria javanica)诱变株IJUV-6，其特征在于，该菌株于2019年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019800。
2.权利要求1所述爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6在防治稻飞虱或制备防治稻飞虱的生物制剂中的应用。
3.权利要求1所述爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6在防治稻叶蝉或制备防治稻叶蝉的生物制剂中的应用。
4.一种防治稻飞虱的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂中含有权利要求1所述爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6。
5.一种防治稻叶蝉的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂中含有权利要求1所述爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6。

说明书全文

一种抗紫外线和耐高温的高毒力爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6

及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及一种抗紫外线和耐高温的高毒力爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6及其应用。

背景技术

[0002] 白背飞虱和电光叶蝉均是水稻上的重要害虫，在我国水稻种植区广泛分布，严重发生时可导致水稻大面积减产。白背飞虱的成虫产卵在叶鞘中脉两侧及叶片中脉组织内，每卵条粒数2～31粒，平均7.3粒；白背飞虱的若虫群栖于水稻茎杆及叶鞘等部位为害，引起水稻茎杆和叶片变色，严重为害时在水稻田中出现局部或大面积枯死，呈现黄塘为害状。电光叶蝉以成、若虫在水稻叶片和叶鞘等部位刺吸水稻的汁液，影响植株的生长发育，造成叶片变黄或整株枯萎，同时还可传播水稻矮缩病、花叶病等病害。

[0003] 在现有防治白背飞虱和电光叶蝉的手段中，主要使用毒死蜱、杀虫双、吡虫啉、噻虫嗪和吡蚜酮等化学农药来防治白背飞虱和电光叶蝉对水稻的为害，虽然能起到一定的防治效果，但是长期、大量的使用上述化学农药使得白背飞虱和电光叶蝉产生了高水平的抗药性，同时化学农药还杀死了害虫天敌，破坏了稻田的生态环境，削弱了稻田生态环境的自我调节能力，且化学农药残留严重威胁着人类的健康。因此，亟需研究开发高效、安全和可持续防治白背飞虱和电光叶蝉的微生物杀虫剂替代化学农药来控制其对水稻的为害。

[0004] 昆虫病原真菌是一类重要的杀虫微生物，在合适的条件下可在害虫种群中大量发生和流行，引起害虫的大量死亡。根据现有研究报道(如CN201711431519.5)，爪哇棒束孢可有效地防治水稻害虫，但稻田的紫外线、高温等环境条件严重影响爪哇棒束孢的正常生长及其对害虫的侵染，导致爪哇棒束孢对水稻害虫的防治效果不稳定。因此，爪哇棒束孢对水稻害虫防治效果不稳定的问题亟待解决。

发明内容

[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有水稻害虫防治技术的缺陷和不足，提供一种抗紫外线和耐高温的高毒力爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6及其应用。

[0006] 本发明的目的是提供一种抗紫外线和耐高温的高毒力爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6。

[0007] 本发明另一目的是提供爪哇棒束孢菌诱变株在防治稻飞虱或制备防治稻飞虱的生物制剂中的应用。

[0008] 本发明又一目的是提供爪哇棒束孢菌诱变株在防治稻叶蝉或制备防治稻叶蝉的生物制剂中的应用。

[0009] 本发明又一目的是提供一种防治稻飞虱的生物制剂。

[0010] 本发明再一目的是提供一种防治稻叶蝉的生物制剂。

[0011] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：

[0012] 本发明提供的爪哇棒束孢菌(Isaria javanica)诱变株IJUV-6，是对爪哇棒束孢菌野生菌株IJNL-N8(采集于广州地区被真菌自然侵染的褐飞虱，并从虫尸上分离获得)用紫外线照射诱导其产生突变，然后从诱变菌株中筛选出对紫外线具有很强耐受能力的高毒力诱变菌株，命名为爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6，该菌株于2019年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019800，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

[0013] 所述爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6的形态学特征描述如下：

[0014] 在PDA培养基上菌落呈圆形、产孢后菌落正面逐渐变为淡褐色，菌落背面白色或淡黄白色；菌丝薄、表面有细颗粒结构、白色，菌丝宽0.3～1.2μm、分隔、透明、光滑；分生孢子梗10～31μm，其上着生2～4个瓶梗组成的轮生体，瓶梗基部椭圆形膨大，向上逐渐变细，8～14×2.2～2.8μm；分生孢子近柱形或梭形，透明、光滑，5.0～8×1.4～3μm，分生孢子串生排列成长链。

[0015] 该爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6对紫外线的耐受力强(与野生菌株相比，经紫外线照射后孢子萌发率提高了202.1％～440.8％)，菌落生长速率快、产孢量高，对白背飞虱和电光叶蝉具有很强的致病力，对白背飞虱的毒力提高了67.4％，可侵染电光叶蝉3、4、5龄若虫并导致其死亡，也会导致经真菌处理的3、4、5龄若虫新羽化的电光叶蝉成虫死亡；另外，爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6耐高温。因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

[0016] 爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6在防治稻飞虱或制备防治稻飞虱的生物制剂中的应用。

[0017] 优选地，所述稻飞虱为白背飞虱。

[0018] 爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6在防治稻叶蝉或制备防治稻叶蝉的生物制剂中的应用。

[0019] 优选地，所述稻叶蝉为电光叶蝉。

[0020] 另外，本发明还提供了一种防治稻飞虱的生物制剂，所述生物制剂中含有爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6。

[0021] 本发明还提供了一种防治稻叶蝉的生物制剂，所述生物制剂中含有爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6。

[0022] 本发明具有以下有益效果：

[0023] 本发明提供了一种抗紫外线和耐高温的高毒力爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6及其应用。本发明提供的爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6是经紫外线对爪哇棒束孢菌野生菌株IJNL-N8诱变、筛选获得的，对紫外线的耐受力强(与野生菌株相比，经紫外线照射后孢子萌发率显著提高，提高了202.1％～440.8％)，菌落生长速率快、产孢量高；经侵染生物学研究和室内生物测定，抗紫外线的爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6对稻飞虱、稻叶蝉具有较强的侵染杀虫效果；其中，对白背飞虱的毒力提高了67.4％，可导致电光叶蝉3、4、5龄若虫死亡，也会导致经真菌处理的3、4、5龄若虫新羽化的电光叶蝉成虫死亡；且爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6耐高温性能好，在34.5℃高温下孢子可萌发生长(温度高于32℃时，爪哇棒束孢菌的孢子通常不萌发、不生长)；另外，该菌株为中国本土爪哇棒束孢菌野生菌株IJNL-N8的诱变株，并非从国外引进，能适应我国南方地区稻田的高温和强紫外线照射等自然环境；

[0024] 因此，该爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的作用机理、对害虫的防治效果好、对环境无污染、无残留的特点，且不会导致水稻害虫产生抗药性，适应了有机食品生产的要求，可作为抗药性害虫的替代防治药物，对南方地区的稻飞虱、稻叶蝉等水稻害虫有显著的防治效果，在高效、安全和可持续防治白背飞虱和电光叶蝉方面具有广泛的应用前景。附图说明

[0025] 图1是爪哇棒束孢菌诱变菌株在PDA培养基上的菌落形态图。

[0026] 图2是野生菌株和爪哇棒束孢菌诱变菌株经紫外线照射后的孢子萌发率比较图。

[0027] 图3是白背飞虱被爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6侵染后的死亡症状图。

[0028] 图4是电光叶蝉被爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6侵染后的死亡症状图。

具体实施方式

[0029] 以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0030] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0031] 实施例1爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6的分离、鉴定

[0032] 1、材料来源

[0033] 爪哇棒束孢菌诱变株是在爪哇棒束孢菌野生菌株IJNL-N8的基础上诱变而来，爪哇棒束孢菌野生菌株IJNL-N8采集于广州地区被自然侵染的褐飞虱[Nilaparvata lugens(Stal)]虫尸；

[0034] 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar,PDA培养基)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，加入水煮沸后使总体积为1000mL，经高压灭锅灭菌(121℃，30min)；

[0035] 查氏培养液(Czapek)：蔗糖30.0g、硝酸铵(NH4NO3)3.0g、磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g、硫酸镁(MgSO4.7H2O)0.5g、氯化钾(KCl)0.5g、硫酸亚铁(FeSO4)0.01g，倒入烧杯中并加入水加热溶解后使总体积为1000mL，再经高压灭菌锅灭菌(121℃，20min)；

[0036] 培养条件：置于26±1℃(光照14L：10D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4℃冰箱贮存。

[0037] 2、爪哇棒束孢菌野生菌株IJNL-N8的诱变和诱变菌株的筛选

[0038] (一)爪哇棒束孢菌野生菌株IJNL-N8的诱变、分离及诱变菌株的初步筛选[0039] 1)野生菌株的诱变、分离

[0040] 取一定浓度的爪哇棒束孢菌野生菌株IJNL-N8的分生孢子悬浮液，置于紫外线下照射30分钟诱导野生菌株产生突变，将照射后的孢子悬浮液涂布在PDA培养基，于26±1℃倒置培养，挑取新产生的单菌落、转移到新的PDA培养基中继续培养，获得共100株左右的诱变菌株，连续传代培养10代以上；

[0041] 2)诱变菌株的初步筛选

[0042] (1)实验方法

[0043] 观察100株诱变菌株的培养特性，从中挑选培养性状稳定、菌丝生长快、菌落直径比野生菌株大的诱变菌株30株，置于PDA培养基继续培养，待产生分生孢子后，检测诱变菌株对紫外线的耐受力，筛选出抗紫外线能力提高200％以上的诱变菌株10株，放入4℃冰箱保存备用；将获得的10株诱变菌株接种到PDA培养基上，于26±1℃条件下培养对诱变菌株的培养性状、菌丝、分生孢子和产孢器的形态进行描述。

[0044] (2)实验结果

[0045] 爪哇棒束孢菌诱变菌株在PDA培养基上的菌落形态图如图1所示，诱变菌株的形态描述结果为：2～4天可观察到PDA培养基上有白色的菌丝长出，随后生长形成的菌落呈绒毛状，菌落开始时为白色，产孢后菌落正面逐渐变为淡褐色，菌落背面白色或淡黄白色；菌丝薄、表面有细颗粒结构、白色，菌丝宽0.3～1.2μm、分隔、透明、光滑。分生孢子梗10～31μm，其上着生2～4个瓶梗组成的轮生体，瓶梗基部椭圆形膨大，向上逐渐变细，8～14×2.2～2.8μm；分生孢子近柱形或梭形，透明、光滑，5.0～8×1.4～3μm，分生孢子串生排列成长链。

[0046] (二)抗紫外线的爪哇棒束孢菌诱变菌株的进一步筛选

[0047] 虫生真菌在生长、繁殖过程中出现的变异是不定向的，变异可引起菌株的毒力显著提高或剧烈下降，紫外线诱变可提高真菌的变异频率，增加获得抗紫外线高毒力菌株的机率。菌株筛选常用的指标分别为致病力、产孢量、孢子萌发率、菌落生长速率；以上述指标为依据，从爪哇棒束孢菌诱变菌株中进一步筛选出抗紫外线的高毒力诱变菌株，具体的实验方法和实验结果如下：

[0048] 供试菌株的处理：将上述筛选出的培养性状稳定、菌丝生长快、菌落直径比野生菌株大、抗紫外线能力提高200％以上的爪哇棒束孢菌诱变菌株10株的孢子分别接种到PDA培养基，并于26±1℃的培养箱(14L：10D)中培养。

[0049] 供试昆虫与寄主植物：将网室中饲养在水稻上的白背飞虱成虫接种到无虫的水稻植株上，置于26±1℃的养虫笼(60×60×80cm)中，待水稻植株上的白背飞虱发育到4龄若虫时备用。

[0050] 水稻为常规栽培品种，实验所用水稻均采用分蘖后高于30cm的盆栽苗。

[0051] 1)野生菌株和爪哇棒束孢菌诱变菌株经紫外线下照射后的孢子萌发率测定[0052] (1)实验方法

[0053] 将野生菌株(WT)和10株爪哇棒束孢菌诱变菌株(MT-3、MT-5、MT-6、MT-11、MT-15、MT-19、MT-23、MT-24、MT-28、MT-29)配制成1.0×106孢子/mL的孢子悬浮液，并放置于紫外线下照射40min，然后从孢子悬浮液中取5mL置于装有200mL的查氏培养液的三角瓶中，在26±1℃摇床内200rpm振荡培养，分别在第11h、13h、15h时观察并记录孢子萌发情况，以芽管长度超过孢子直径一半作为孢子萌发标准，所有处理3次重复；选取经紫外线照射40分钟后，选取抗紫外线能力提高200％以上的诱变菌株进行后续实验；抗紫外线能力的计算公式为：

[0054] 抗紫外线能力(％)＝(诱变株的孢子萌发率－野生菌株的孢子萌发率)/野生菌株的孢子萌发率*100。

[0055] (2)实验结果

[0056] 野生菌株和爪哇棒束孢菌诱变菌株经紫外线照射后的孢子萌发率比较图如图2所示，从图中可以看出，与野生菌株相比，10株爪哇棒束孢菌诱变菌株在第11h、13h、15h时的孢子萌发率均有所提高；第15h时诱变菌株的孢子萌发率提高了202.1％～440.8％；其中，诱变菌株MT-6的孢子萌发率提高了440.8％。

[0057] 2)野生菌株和爪哇棒束孢菌诱变菌株菌落生长直径和产孢量测定

[0058] (1)实验方法

[0059] 将野生菌株(WT)和10株爪哇棒束孢菌诱变菌株的分生孢子分别配制成1×107孢子/mL的孢子悬液，分别取1.0mL悬液滴入PDA培养基上，用三角玻璃棒涂布均匀，待2～4d长出菌丝后，用直径为5mm的打孔器取新鲜菌落，接种于新的PDA培养基上，然后置于培养箱中培养(26±1℃，14L：10D)；每株菌株5次重复；

[0060] 第10d测定菌落直径并收集分生孢子，用血球计数板记数测定产孢量；具体操作为：采用十字交叉法测量菌落生长直径，用灭菌后的直径为13mm打孔器在菌落上取生长均匀的菌块，然后放入加有20mL 0.20％吐温-80无菌水中，用磁力搅拌器使孢子分散，制成孢子悬浮液，用血球记数板记数、测定孢子的数量，计算产孢量(孢子总数/菌落面积)。

[0061] (2)实验结果

[0062] 野生菌株和爪哇棒束孢菌诱变菌株的菌落生长直径和产孢量测定结果如表1所示，从表中可以看出，与野生菌株的菌落生长直径相比，除了诱变菌株MT-5、MT-15之外，其余的8株诱变菌株的菌落生长直径均显著增大；其中，诱变菌株MT-19的菌落生长直径最大，诱变菌株MT-15的菌落生长直径最小。另外，与野生菌株的产孢量相比，诱变菌株MT-5、MT-6、MT-11、MT-23、MT-24的产孢量显著提高；其中，诱变菌株MT-6的产孢量最高。

[0063] 表1野生菌株和爪哇棒束孢菌诱变菌株的菌落生长直径和产孢量测定结果[0064]

[0065] 注：表中同列数字后字母相同表示差异不显著(DMRT法)。

[0066] 3)野生菌株和爪哇棒束孢菌诱变菌株孢子萌发率测定

[0067] (1)实验方法

[0068] 将野生菌株(WT)和10株诱变菌株分别培养10d后，用无菌水收集孢子并配制成1.0×106孢子/mL的孢子悬浮液，然后取5mL孢子悬浮液加入装有200mL查氏培养液的三角瓶中，在26±1℃、200rpm条件下培养，在第12h时观察并记录孢子萌发情况，以芽管长度超过孢子直径一半作为萌发标准；所有处理3次重复。

[0069] (2)实验结果

[0070] 野生菌株和爪哇棒束孢菌诱变菌株的孢子萌发率测定结果如表2所示，可以看出，与野生菌株的孢子萌发率相比，诱变菌株MT-3、MT-6、MT-11、MT-19、MT-23、MT-28的孢子萌发率显著提高，而诱变菌株MT-5、MT-15的孢子萌发率显著降低；其中，诱变菌株MT-6的孢子萌发率最高，诱变菌株MT-15的孢子萌发率最低。

[0071] 表2野生菌株和爪哇棒束孢菌诱变菌株的孢子萌发率测定结果

[0072]

[0073] 注：表中同列数字后字母相同表示差异不显著(DMRT法)。

[0074] 4)野生菌株和爪哇棒束孢菌诱变菌株对白背飞虱4龄若虫的致病力测定[0075] (1)实验方法

[0076] 将野生菌株(WT)和10株诱变菌株(MT)的分生孢子分别配制成1×107孢子/mL的孢子悬液；向带有白背飞虱4龄若虫的水稻茎杆(去掉上部叶片后带根系的水稻苗)喷施孢子悬浮液中，对照喷施0.1％的吐温-80无菌水，自然晾干；每处理为12～16根水稻茎杆，每2根茎杆5头若虫，3次重复；处理过的水稻茎杆和若虫一起置于透明的保鲜盒内(2根茎杆/盒)，底部放有保温的滤纸，再置于26±1℃的光照培养箱中(14L：10D)；每日观察并记录若虫死亡情况，连续观察8d；上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统中处理完成。

[0077] (2)实验结果

[0078] 野生菌株和爪哇棒束孢菌诱变菌株对白背飞虱4龄若虫的致病力测定结果如表3所示，在诱变菌株的处理组，白背飞虱在第2d开始表现出侵染症状；从表中可以看出，与野生菌株相比，在第4d时，诱变菌株MT-6、MT-15、MT-19、MT-23对白背飞虱4龄若虫的侵染率均显著提高，诱变菌株MT-6、MT-11、MT-15、MT-19、MT-23、MT-28在第8d时对白背飞虱4龄若虫的侵染率均显著提高；其中，诱变菌株MT-5对白背飞虱4龄若虫的侵染率最低(49.0％)，诱变菌株MT-6对白背飞虱4龄若虫的侵染率最高(68.5％)，诱变菌株MT-6对白背飞虱4龄若虫的毒力提高了31.5％。

[0079] 表3野生菌株和爪哇棒束孢菌诱变菌株对白背飞虱4龄若虫的致病力测定结果[0080]

[0081] 注：表中同列数字后字母相同表示差异不显著(DMRT法)。

[0082] 5)爪哇棒束孢菌诱变菌株的筛选评估

[0083] 诱变菌株对紫外线的耐受力、孢子萌发率、菌落生长速率和产孢量、致病力是筛选与评估优良菌株的重要指标。从上述实验结果中可以看出，本发明筛选出的诱变菌株MT-6具有对紫外线的耐受力强、孢子萌发率高、菌落生长速率快、产孢量大、对白背飞虱4龄若虫的致病力强等特点；因此，综合各方面的因素，筛选出MT-6为最佳的诱变菌株，将其命名为爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6，并于2019年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2019800，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

[0084] 爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6属丝孢目、棒束孢属，在PDA培养基上菌落呈圆形、产孢后菌落正面逐渐变为淡褐色，菌落背面白色或淡黄白色；菌丝薄、表面有细颗粒结构、白色，菌丝宽0.3～1.2μm、分隔、透明、光滑；分生孢子梗10～31μm，其上着生2～4个瓶梗组成的轮生体，瓶梗基部椭圆形膨大，向上逐渐变细，8～14×2.2～2.8μm；分生孢子近柱形或梭形，透明、光滑，5.0～8×1.4～3μm，分生孢子串生排列成长链。

[0085] 6)爪哇棒束孢菌诱变菌株IJUV-6的抗紫外线遗传稳定性评估

[0086] (1)实验方法

[0087] 将野生菌株(WT)和诱变菌株(IJUV-6)的分生孢子分别接种到PDA培养基中，通过比较继代培养第10、12、14代诱变菌株IJUV-6的培养特征等方面的差异，明确诱变菌株IJUV-6在遗传上的稳定性；

[0088] 用0.1％吐温-80无菌水收集诱变菌株(IJUV-6)的孢子并配制成1.0×106孢子/mL的孢子悬浮液，并放置于紫外线下照射40min，然后取5mL孢子悬浮液加入装有200mL查氏培养液的三角瓶中，在26±1℃、200rpm条件下培养，在第11h、13h、15h时观察并记录孢子萌发情况，以芽管长度超过孢子直径一半作为萌发标准，所有处理3次重复；通过比较第10、12、14代诱变菌株IJUV-6在抗紫外线方面的差异，明确诱变菌株IJUV-6抗紫外线遗传稳定性。

[0089] (2)实验结果

[0090] 第10、12、14代诱变菌株IJUV-6在PDA培养基上的菌落形态、颜色、菌丝生长状态与分生孢子的颜色、菌苔颜色等方面完全相同，在菌落生长速率、孢子萌发率、产孢量等方面也完全相同，表明诱变菌株IJUV-6在遗传上已经稳定。

[0091] 诱变菌株IJUV-6不同繁殖世代的孢子经紫外线照射后的孢子萌发率如表4所示，从表中可以看出，经过紫外线下照射40min后，第10、12、14代诱变菌株IJUV-6在11h、13h和15h的孢子萌发率差异不显著，表明所筛选出的诱变菌株IJUV-6对紫外线的耐受力能够稳定遗传。

[0092] 表4诱变菌株IJUV-6不同繁殖世代的孢子经紫外线照射后的孢子萌发率[0093]

[0094] 注：表中同列数字后字母相同表示差异不显著(DMRT法)。

[0095] 7)爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6的耐高温性能评估

[0096] (1)实验方法

[0097] 将野生菌株(WT)和诱变菌株(IJUV-6)、爪哇棒束孢菌IJN-30(分离自稻叶蝉)、爪哇棒束孢菌IJW-25(分离自烟粉虱)的分生孢子分别接种到PDA培养基中，培养7～10d产孢后，备用。

[0098] 分别用0.1％吐温-80无菌水收集所有菌株的孢子并配制成1.0×106孢子/mL的孢子悬浮液，然后取5mL孢子悬浮液加入装有200mL查氏培养液的三角瓶中，分别在30±1℃、31±1℃、31.5±1℃、33.5±1℃、34.5±1℃、35±1℃、200rpm条件下培养，在第12h、24h时观察并记录孢子萌发情况，以芽管长度超过孢子直径一半作为萌发标准，所有处理3次重复；通过比较第12h、24h各菌株在不同温度下孢子萌发率方面的差异，明确诱变菌株IJUV-6的耐高温性。

[0099] (2)实验结果

[0100] 诱变菌株IJUV-6在不同温度下的孢子萌发率结果如表5所示，可以看出，温度为30±1℃至33.5±1℃条件下，野生菌株和诱变菌株IJUV-6的孢子均可正常萌发；其中，诱变菌株IJUV-6在33.5±1℃条件下的孢子萌发率显著高于野生菌株；温度为34.5±1℃条件下，诱变菌株IJUV-6在第24h的孢子萌发率为20.5％，而野生菌株不萌发；且温度高于33.5±1℃条件下，爪哇棒束孢菌IJN-30和爪哇棒束孢菌IJW-25的孢子均不萌发；以上结果表明：本发明筛选得到的诱变菌株IJUV-6具有很好的耐高温性能。

[0101] 表5诱变菌株IJUV-6在不同温度下的孢子萌发率(％)结果

[0102]

[0103]

[0104] 注：表中同列数字后字母相同表示差异不显著(DMRT法)。

[0105] 生物测定是检测虫生真菌对目标害虫的致死程度和致死速率的有效手段之一，可为综合评价爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6的生物防治潜力提供重要的参考依据；本发明以下实施例2和3分别测定爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6对白背飞虱和电光叶蝉的致病力，筛选出用于防治白背飞虱和电光叶蝉的最佳浓度，具体的实验方法和实验结果如下：

[0106] 实施例2爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6对白背飞虱的致病力测定

[0107] 1、实验方法

[0108] 供试昆虫与寄主植物：将网室中饲养在水稻上的白背飞虱成虫接种到无虫的水稻植株上，置于养虫笼(60×60×80cm)中，待水稻植株上的白背飞虱发育到4龄若虫时备用。

[0109] 水稻为常规栽培品种，实验用水稻均采用分蘖后高于30cm的盆栽苗。

[0110] 供试菌株的处理：将野生菌株(WT)和爪哇棒束孢诱变菌株IJUV-6接种于PDA培养基，于26±1℃的恒温箱(14L：10D)中培养10天，待产孢后加入0.1％吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上打散后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板将孢子浓度调整为0、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108孢子/mL共6个浓度，备用。

[0111] 向分别带有白背飞虱4龄若虫的水稻茎和叶片上喷施孢子液，对照区的水稻上喷施0.1％吐温-80水溶液，自然晾干后放入养虫笼中；每个实验组为3～4钵苗，3丛(3×6颗苗)/钵，每丛10～20头若虫，重复3次；养虫笼置于26±1℃的空调养虫室内、光照(14L：10D)；每日检查并统计若虫感染死亡率，连续观察8d；同时，观察与统计上述经爪哇棒束孢诱变菌株IJUV-6处理后的白背飞虱4龄若虫的死亡率；上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。

[0112] 2、实验结果

[0113] 白背飞虱被爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6侵染后的死亡症状如图3所示，接种爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6后的第2～3d，白背飞虱4龄若虫开始出现发病症状，虫体上有少量白色的菌丝长出，随后白背飞虱4龄若虫死亡，几天后虫体表面出现大量的白色菌丝与淡褐色的孢子。

[0114] 爪哇棒束孢诱变株IJUV-6侵染后白背飞虱若虫的累计校正死亡率如表6所示，从表中可以看出，随着爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6孢子浓度的增加，白背飞虱4龄若虫的死亡率也增加；相同的爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6孢子浓度下，随着时间的延长，白背飞虱4龄若虫的死亡率也增加；相同的爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6孢子浓度和时间下，爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6对白背飞虱的致病力显著高于野生菌株；其中，在第8d时，爪哇棒束孢菌诱6 5
变株IJUV-6对白背飞虱的LC50为1.75×10孢子/mL，野生菌株对白背飞虱的LC50为5.7×10孢子/mL，与野生菌株相比爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6对白背飞虱的毒力提高了67.4％。

[0115] 表6爪哇棒束孢诱变株IJUV-6侵染后白背飞虱若虫的累计校正死亡率

[0116]

[0117] 注：表中同列数字后字母相同表示差异不显著(DMRT法)。

[0118] 实施例3爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6对电光叶蝉的致病力测定

[0119] 1、实验方法

[0120] 供试昆虫与寄主植物：将网室中饲养在水稻上的电光叶蝉成虫接种到无虫的水稻植株上，置于养虫笼(60×60×80cm)中，待水稻植株上的电光叶蝉发育到3、4、5龄若虫时备用。

[0121] 水稻为常规栽培品种，实验用水稻均采用分蘖后高于30cm的盆栽苗。

[0122] 供试菌株的处理：将爪哇棒束孢诱变株(IJUV-6)接种于PDA培养基，于26±1℃的恒温箱(14L：10D)中培养10天，待产孢后加入0.1％吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上打散后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板将孢子浓度调整为1×107孢子/mL备用。

[0123] 向分别带有电光叶蝉3、4、5龄若虫的水稻茎和叶片喷施孢子液，对照区的水稻喷施0.1％吐温-80水溶液，自然晾干后放入养虫笼中；每个实验组为3～4钵苗，3丛(6颗苗/丛)/钵，每丛10～20头若虫，重复3次；养虫笼置于26±1℃的空调养虫室内、光照(14L：10D)；每日检查并统计若虫感染死亡率，连续观察5～11d；同时，观察与统计上述经爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6处理后的电光叶蝉3、4、5龄若虫的死亡率及新羽化成虫的死亡率；上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。

[0124] 2、实验结果

[0125] 电光叶蝉被爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6侵染后的侵染症状图如图4所示，接种爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6后的第2～3d，电光叶蝉3、4、5龄若虫开始出现发病症状，虫体停止长大、或蜕皮不正常、或不能蜕皮而死亡，死亡后的虫体开始变小，虫体的体表可观察到有少量白色的菌丝长出，几天后虫体表面出现大量的白色菌丝和淡褐色的孢子。

[0126] 爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6侵染后电光叶蝉若虫的累计校正死亡率如表7所示，从表中可以看出，经过爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6处理后，不同龄期的电光叶蝉若虫的死亡率差异显著，电光叶蝉3龄若虫的死亡率最高，电光叶蝉5龄若虫的死亡率最低；另外，除导致电光叶蝉3、4、5龄若虫死亡外，新羽化的成虫也会大量死亡；其中，爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6处理后的4龄若虫新羽化的成虫的死亡率高达62.5％。这说明爪哇棒束孢菌不仅可侵染叶蝉的若虫，还可导致经真菌处理后的3、4、5龄若虫新羽化的成虫死亡。

[0127] 表7爪哇棒束孢菌诱变株IJUV-6侵染后电光叶蝉若虫的累计校正死亡率[0128]

[0129] 注：表中同列数字后字母相同表示差异不显著(DMRT法)；

[0130] “/”表示在第8天、12天不存在此龄期的若虫，或变成其它龄期的虫态。

[0131] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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