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一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法

阅读:237发布:2020-05-12

专利汇可以提供一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于γ-H2AX的 生物 标志物遗传毒性检测方法。该检测方法包括下述步骤:(1)将与计数微珠混合后的待检测细胞与 抗体 、以及通透液和封闭液混合、孵育后使用流式细胞仪进行 荧光 检测;所述的抗体包括抗γ-H2AX抗体、p53蛋白抗体、磷 酸化 组蛋白H3抗体和抗Cleaved PARP抗体;(2)结果分析:排除死亡细胞,并通过Cleaved-PARP阳性排除凋亡细胞后,根据活细胞的γ-H2AX的表达分析细胞毒性信息。该检测方法检测体外细胞遗传毒性的方法简便、快速、准确并且可以提供多种机制信息的体外遗传毒性检测方法。,下面是一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法专利的具体信息内容。

1.一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法,其特征在于,所述的生物标志物遗传毒性检测方法包括下述步骤:
(1)将与计数微珠混合后的待检测细胞与抗体、以及通透液和封闭液混合、孵育后使用流式细胞仪进行荧光检测;所述的抗体包括抗γ-H2AX抗体和抗Cleaved-PARP抗体;
(2)结果分析:排除死亡细胞,并通过Cleaved-PARP阳性排除凋亡细胞后,根据活细胞的γ-H2AX的表达分析细胞毒性信息。
2.如权利要求1所述的生物标志物遗传毒性检测方法,其特征在于,所述的遗传毒性为化学物质的遗传毒性;和/或,步骤(1)中所述的待检测细胞为人成淋巴TK6细胞。
3.如权利要求1所述的生物标志物遗传毒性检测方法,其特征在于,所述的生物标志物遗传毒性检测方法中还将p53基因作为生物标志物;较佳地,步骤(1)中所述的抗体还包括抗p53蛋白抗体;
和/或,所述的生物标志物遗传毒性检测方法还将组蛋白H3作为生物标志物,将步骤(1)中所述的与计数微珠混合后的待检测细胞的一部分与抗组蛋白H3抗体、通透液和封闭液混合、孵育后使用流式细胞仪进行荧光检测。
4.如权利要求1所述的生物标志物遗传毒性检测方法,其特征在于,步骤(1)中所述的封闭液为1%白蛋白,所述的通透液为1×Perm/Wash buffer。
5.如权利要求1所述的生物标志物遗传毒性检测方法,其特征在于,步骤(1)中所述的待检测细胞经过下述处理后得到:①固定待检测细胞;②使用带有计数微珠的试剂对固定所得的待检测细胞进行洗脱,或者对固定所得的待检测细胞进行洗脱后再加入计数微珠;
较佳地:
步骤①中用于所述固定的试剂为70%乙醇,优选-20℃预冷的70%乙醇,所述固定的时间为14~18小时,优选16小时;
和/或,步骤②中用于所述洗脱的试剂为PBS溶液,优选计数微珠浓度为(0.8~1.2)×
104个/mL的PBS溶液,更优选计数微珠浓度为1×104个/mL的PBS溶液。
6.如权利要求1~5任一项所述的生物标志物遗传毒性检测方法,其特征在于,所述的生物标志物遗传毒性检测方法包括下述步骤:
(1)固定待检测细胞;
(2)使用带有计数微珠的试剂对固定所得的待检测细胞进行洗脱,或者对固定所得的待检测细胞进行洗脱后再加入计数微珠
(3)将步骤(2)处理过的待检测细胞分为两份,一份与抗γ-H2AX抗体、抗Cleaved PARP抗体和抗p53蛋白抗体,以及通透液和封闭液混合并孵育,另一份与组蛋白H3,以及通透液和封闭液混合并孵育;再使用流式细胞仪进行荧光检测;
(4)结果分析:排除死亡细胞,并通过Cleaved-PARP阳性排除凋亡细胞后,根据活细胞的γ-H2AX、p53蛋白、组蛋白H3的表达分析细胞毒性信息,γ-H2AX、p53蛋白表达阳性可提示致遗传毒性机制为断裂剂;组蛋白H3和p53蛋白表达阳性可提示致遗传毒性机制为非整倍体诱导剂;γ-H2AX、组蛋白H3和p53蛋白表达阴性提示没有致遗传毒性作用。
7.一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括抗Cleaved PARP抗体以及抗γ-H2AX抗体。
8.如权利要求7所述的生物标志物遗传毒性检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括抗p53蛋白抗体和/或抗组蛋白H3抗体。
9.如权利要求7或8所述的生物标志物遗传毒性检测试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒还包括PBS、计数微珠、封闭液和/或通透液;所述的封闭液优选1%牛白蛋白,所述的通透液优选1×Perm/Wash buffer。
10.Cleaved-PARP在基于γ-H2AX的生物标志物的遗传毒性检测方法中的应用。

说明书全文

一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于遗传毒性检测领域,具体涉及一种基于γ-H2AX的生物标志物的遗传毒性检测方法。

背景技术

[0002] 在不同DNA损伤中,DNA双链断裂是最为严重的一种,而DNA损伤又与化学品的遗传毒性密切相关。具有纺锤体毒性的化学品则可影响细胞纺锤丝的合成或者纺锤体的形成,从而导致细胞周期阻滞、细胞凋亡,严重时可导致细胞染色体组出现非整倍体变化。细胞染色体的非整倍体性可导致多种疾病,例如21三体综合征等,而癌症的形成也于细胞的非整倍体性有密切的相关性。检测化合物诱导细胞的DNA损伤和非整倍体变化成为评价化合物遗传毒性的重要标志物。
[0003] 现阶段遗传毒性检测的常用体外试验主要包括细菌回复突变试验(Ames试验)、哺乳动物细胞染色体畸变试验、哺乳动物细胞微核试验和哺乳动物细胞彗星试验等。这些体外检测方法在药物等的遗传毒性安全评价方面发挥着重要作用,也是目前国内外现阶段主要使用的检测方法。但是,这些体外方法有很多局限性:(1)假阳性结果比例较高;(2)目前常用的用于体外遗传毒性检测的细胞系(如CHL、CHO-K1细胞系等)多为啮齿类动物来源的细胞,试验结果外推至人体试验的符合性较差(黄鹏程,周长慧,常艳.基于γ-H2AX生物标志物DNA遗传毒性检测方法的研究进展[J].中国新药杂志,2016(4):418-424.)(3)目前常用的遗传毒性试验使用的细胞株均缺乏p53基因,DNA损伤修复机制不完整(欧红梅,周长慧,涂宏刚,常艳.p53基因状态对体外微核试验结果影响的研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2015,29(01):170-173.)。现有药物等化学品的遗传毒性性评价常用遗传毒性体外实验和动物模型对评价结果尤其是在将结果外推于人类时造成较大的不确定性,可能造成化学品由于假阳性结果而终止继续研发。同时,常用的体外遗传毒性评价方法,均不能直接提供化合物诱导非整倍体效应的评价指标。针对目前常用体外遗传毒性评价方法的局限性,将人源化体外培养的细胞株应用于遗传毒性评价,并整合多种生物标志物检测DNA双链断裂剂和非整倍体诱导剂,有望建立一种良好体外遗传毒性评价方法。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是针对现有技术中用于检测体外细胞遗传毒性的方法假阳性率高、灵敏度低以及检测指标少等缺陷,提供一种基于γ-H2AX的生物标志物的遗传毒性检测方法。该检测体外细胞遗传毒性的方法简便、快速、准确并且可以提供多种机制信息的体外遗传毒性检测方法。
[0005] 影响γ-H2AX生物标志物DNA遗传毒性检测方法的假阳性率高的主要原因在于正常死亡细胞(即凋亡细胞)的存在(Maria Tsamou,Danyel G.J.Jennen,Sandra M.H.Claessen,ChristinaMagkoufopoulou,Jos C.S.Kleinjans and Joost H.M.van Delft.Performance of in vitroγH2AXassay in HepG2cells to predict in vivo genotoxicity[J].Mutagenesis,2012,27(6),645–652.);而如何提高检测的特异性、降低假阳性率并保证检测的灵敏度一直是本领域内亟待解决的问题。发明人创造性地从PI细胞核单染、细胞膜表面磷脂酰丝酸(Annexin V)以及半胱天冬酶3(Caspase-3)以及DNA修复酶PARP的切割底物Cleaved-PARP等众多细胞凋亡标志物中挑选Cleaved-PARP用于本发明以降低假阳性率,解决了本领域内的技术难题,促进了领域中遗传毒性的检测方法的发展。
[0006] 本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题:
[0007] 本发明提供一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法,所述的生物标志物遗传毒性检测方法包括下述步骤:
[0008] (1)将与计数微珠混合后的待检测细胞与抗体、以及通透液和封闭液混合、孵育后使用流式细胞仪进行荧光检测;所述的抗体包括抗γ-H2AX抗体和抗Cleaved PARP抗体;
[0009] (2)结果分析:排除死亡细胞,并通过Cleaved-PARP阳性排除凋亡细胞后,根据活细胞的γ-H2AX的表达分析细胞毒性信息。
[0010] 所述的遗传毒性可为本领域常规,是指环境中的理化因素作用于有机体,使其遗传物质在染色体平、分子水平和基水平上受到各种损伤,从而造成的毒性作用,本发明中的遗传毒性优选化学物质的遗传毒性。
[0011] 为降低种属间差异导致的体外哺乳动物细胞试验系统的假阳性率,上述步骤(1)~(2)中所述的待检测细胞优选人成淋巴TK6细胞。
[0012] 上述步骤(1)中所述的封闭液可为本领域常规,例如:所述的封闭液可以为脱脂奶、胎牛血清等,所述的通透液可以为Triton X-100、Tween-20以及1×Perm/Wash buffer等。本发明中,所述的封闭液优选1%牛白蛋白,所述的通透液优选1×Perm/Wash buffer。其中,本领域技术人员通常根据封闭液的使用说明,将封闭液和通透液先后添加,然而本发明人尝试将两者进行混合后同时与所述的待检测细胞以及所述的抗体混合,意外发现实验效果并不受影响,且能够大幅缩短操作的时长并节约时间成本。故本发明中较佳地将所述通透液和所述封闭液以混合或者不混合的状态同时与待检测细胞以及抗体混合。
[0013] 较佳地,所述的生物标志物遗传毒性检测方法中还将p53基因作为生物标志物,具体地:在上述步骤(1)中,所述的抗体还包括抗p53蛋白抗体。
[0014] 所述的生物标志物遗传毒性检测方法还可以将组蛋白H3作为生物标志物,具体为将步骤(1)中所述的与计数微珠混合后的待检测细胞的一部分与抗组蛋白H3抗体、通透液和封闭液混合、孵育后使用流式细胞仪进行荧光检测;与含有抗γ-H2AX抗体以及抗Cleaved PARP抗体(或者还包括抗p53蛋白抗体)的通透液和封闭液对细胞的处理分别进行。
[0015] 较佳地,为了增强抗体的结合效率,步骤(1)中所述的待检测细胞经过下述处理后得到:①固定待检测细胞;②使用带有计数微珠的试剂对固定所得的待检测细胞进行洗脱,或者对固定所得的待检测细胞进行洗脱后再加入计数微珠;上述步骤①~②可为本领域常规,例如步骤①中所述固定的试剂可以为4%福尔林溶液、70%乙醇等本领域常用试剂。本发明中,用于所述固定的试剂优选70%乙醇,更优选-20℃预冷的70%乙醇,所述固定的时间优选14~18小时,更优选16小时;步骤②中用于所述洗脱的试剂优选PBS溶液,更优选计数微珠浓度为(0.8~1.2)×104个/mL的PBS溶液,进一步优选计数微珠浓度为1×104个/mL的PBS溶液。
[0016] 在本发明一较佳实施例中,所述的生物标志物遗传毒性检测方法包括下述步骤:
[0017] (1)固定待检测细胞;
[0018] (2)洗脱后加入计数微珠或者使用带有计数微珠的试剂进行洗脱;
[0019] (3)将步骤(2)处理过的待检测细胞分为两份,一份与抗γ-H2AX抗体、抗Cleaved PARP抗体和抗p53蛋白抗体,以及通透液和封闭液混合并孵育,另一份与组蛋白H3,以及通透液和封闭液混合并孵育;再使用流式细胞仪进行荧光检测;
[0020] (4)结果分析:排除死亡细胞,并通过Cleaved-PARP阳性排除凋亡细胞后,根据活细胞的γ-H2AX、p53蛋白、组蛋白H3的表达分析细胞毒性信息,γ-H2AX、p53蛋白表达阳性可提示致遗传毒性机制为断裂剂;组蛋白H3和p53蛋白表达阳性可提示致遗传毒性机制为非整倍体诱导剂;γ-H2AX、组蛋白H3和p53蛋白表达阴性提示没有致遗传毒性作用。
[0021] 本发明还提供一种基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测试剂盒,所述的试剂盒包括抗Cleaved PARP抗体以及抗γ-H2AX抗体;较佳地,所述的生物标志物遗传毒性检测试剂盒还包括抗p53蛋白抗体和/或抗组蛋白H3抗体。更佳地,所述的生物标志物遗传毒性检测试剂盒还包括PBS、计数微珠、封闭液和/或通透液;所述的封闭液优选1%牛白蛋白,所述的通透液优选1×Perm/Wash buffer。
[0022] 本发明还提供一种Cleaved-PARP在基于γ-H2AX的生物标志物遗传毒性检测方法中的应用。
[0023] 在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
[0024] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0025] 本发明的积极进步效果在于:
[0026] 本发明提供了一种基于流式细胞术分析方法,简便、快速、准确和提供多种机制信息的体外遗传毒性检测方法;以Cleaved-PARP为生物标志物排除凋亡细胞,添加计数微珠计算细胞毒性,降低了细胞毒性导致的假阳性结果。并可以将多个遗传毒性检测指标整合在同一试验中,提供了一种假阳性率低、灵敏度高、检测指标多和可提供作用机制信息的预测化学品潜在遗传毒性检测方法。本方法可使用具有野生型p53基因的人成淋巴TK6细胞作为遗传毒性检测材料避免了使用微生物或动物细胞株进行遗传毒性检测由于种属差异使得试验数据不能进行有效的外推。附图说明
[0027] 图1A~F为检测组蛋白H3磷酸化的流式图。
[0028] 图2A~H为多终点检测的建立流式图。
[0029] 图3A~C为ETO、CP和COL的组蛋白H3磷酸化阳性细胞比例。
[0030] 图4A~C为ETO、CP和COL的细胞毒性、细胞凋亡比例和γ-H2AX、p53蛋白表达荧光强度相对于溶剂对照增加的倍数。
[0031] 图5A~C为MMC在+/-S9条件下分别处理TK6细胞后,γ-H2AX平均荧光强度、p53蛋白平均荧光强度和组蛋白H3磷酸化比例统计图。与溶剂对照组相比,*P≤0.05,**P≤0.01。
[0032] 图6A~C为B[α]P在+/-S9条件下分别处理TK6细胞后,γ-H2AX平均荧光强度、p53蛋白平均荧光强度和组蛋白H3磷酸化比例统计图。与溶剂对照组相比,*P≤0.05,**P≤0.01。
[0033] 图7A~C为VCR在+/-S9条件下分别处理TK6细胞后,γ-H2AX平均荧光强度、p53蛋白平均荧光强度和组蛋白H3磷酸化比例统计图。与溶剂对照组相比,*P≤0.05,**P≤0.01。
[0034] 图8A~C为Amp G在+/-S9条件下分别处理TK6细胞后,γ-H2AX平均荧光强度、p53蛋白平均荧光强度和组蛋白H3磷酸化比例统计图。与溶剂对照组相比,*P≤0.05,**P≤0.01。

具体实施方式

[0035] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
[0036] 依托泊苷(货号:E1383)、环磷酰胺(货号:C0768)和RNA酶(RNaseA)(货号:R6513)均购自Sigma公司;人成淋巴TK6细胞购自美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC)(货号:CRL-8015);RPMI-1640培养基(货号:72400-047)、热灭活马血清(货号:26050-088)均购自Gibco公司;细胞通透/洗涤缓冲液(BD Perm/WashTM Buffer)(货号:51-2091KZ)、anti-H2AX(pS139)Alexa  647抗体(货号:560447)、PEMouse Anti-p53Set(RUO)antibody(货号:557027)、FITC Mouse anti-Cleaved PARP(Asp214)Clone F21-852antibody(货号:558576)、Alexa  647Rat anti-Histone H3(pS28)Clone HTA28(RUO)antibody(货号:558217)、7-AAD染液(货号:559925)、均购自BD公司;大鼠肝S9购自Moltox公司(货号:6256);PeakFlowGreen flow cytometry reference beads,6um计数微珠(货号:C36950)购自;ThermoFisher scientific;辅助因子为本实验室制备的储备液;U型底96孔板(货号:3799)购自康宁公司;流式细胞仪为BD公司的AccuriTM C6型。
[0037] 统计分析方法
[0038] 流式细胞仪检测的结果使用BD Accuri C6TM software(Version 1.0.264.21)导出数据。采用IBM SPSS Statistics 21(Version 21)软件进行统计学分析,不同浓度化合物与溶剂对照之间的H3组蛋白磷酸化比例使用Fisher精确概率法、四格表卡方检验,以α=0.05为检验水准。γ-H2AX和p53蛋白表达的荧光强度值以倍数关系表示。
[0039] 实施例1
[0040] 取培养中的对数期生长的TK6,计数后,调整细胞密度为3×105/mL。加样时,在U型底的96孔板中,每孔加入2μL受试物或者溶剂对照后再加入198μL细胞悬液,每孔接种细胞数约为6×104/孔。不添加体外代谢活化系统的24h长时处理组(24h-S9组)选择0.2、0.4、0.8和1.6μg/mL 4个浓度的ETO(依托泊苷)和0.0063、0.0125、0.025和0.05μg/mL 4个浓度的COL(秋水仙素);添加体外代谢活化系统的4h短时处理组(4h+S9组)选择3.75、7.5、15和
30μg/mL 4个浓度的CP(环磷酰胺)。其中4h+S9处理组处理TK6细胞4h后,使用无血清培养基洗涤细胞,去除培养基后加入完全培养基继续培养。每个浓度设置3个复孔,两个处理组于开始培养后约24h收获细胞。
[0041] 细胞收获步骤如下:
[0042] 洗涤:96孔板在200g离心6min后,尽可能的弃去上清。每孔加入200μL PBS洗涤1次。200g再次离心6min后弃去约200μL上清。
[0043] 固定:每孔逐滴、缓慢加入-20℃预冷的70%乙醇,分散细胞后,-20℃固定过夜(约16h)。
[0044] 洗脱:固定后的细胞离心条件为400g离心6min。在PBS中加入计数微珠,使其浓度约为1×104个/mL,混匀,每孔加入200μL的含计数微珠PBS洗涤细胞1次,离心后弃去上清,每孔余留约50μL,混匀后转移20μL细胞悬液至另一96孔板。
[0045] 通透,每孔加入200μL的Perm/Wash缓冲液室温条件下通透30min,离心后弃去上清。封闭,每孔加入含有1%牛白蛋白(BSA)的PBS溶液200μL,室温条件下封闭25min。
[0046] 抗体标记:余留有30μL细胞悬液的96孔板中,每孔加入含有入FITC Mouse anti-Cleaved PARP抗体(1:25)、PE Mouse Anti-p53抗体(1:15)和anti-H2AX(pS139)Alexa 647抗体(1:25)、1×Perm/Wash buffer和1%牛白蛋白的PBS溶液50μL。另一96孔板中每孔加入含有Alexa  647Rat anti-Histone H3(pS28)抗体、1×Perm/Wash buffer和1%牛白蛋白的PBS溶液50μL。轻轻拍打混匀细胞后,将96孔板置于室温、避光条件下孵育1h。标记结束后每孔使用200μL PBS洗涤1次。
[0047] 核酸标记:离心弃上清后,每孔加入含有7-AAD(2μL/孔)和RNase A(5μg/mL)的PBS溶液150μL。室温条件下孵育10min,使用流式细胞仪分析样品的各个指标(7-AAD为核酸染色剂,主要标记DNA,用于在检测各个指标时辅助流式作图。而RNase A为RNA酶,主要作用是酶解RNA,防止核酸染液7-AAD染色RNA)。
[0048] 流式细胞仪分析:样品检测时,用溶剂对照孔建立、调试模板,设置逻辑关系图,去除粘连体细胞、死细胞,分析细胞的γ-H2AX荧光强度和p53蛋白荧光强度以及组蛋白H3磷酸化阳性细胞比例。具体如下:
[0049] 建立两个流式检测模板,分别检测组蛋白H3磷酸化的表达和多终点的检测。多终点包括p53蛋白表达、γ-H2AX表达、Cleaved-PARP和计数微珠的检测。
[0050] 其中检测组蛋白H3磷酸化流式图如图1E~F。
[0051] 其列表和逻辑关系如下:
[0052] beads:“计数珠数目”;
[0053] cells:“总细胞”=“all cells except beads”;
[0054] single cells-1:“单细胞”=“cells”;
[0055] single cells-2:“单细胞”=“single cells-1in cells”;
[0056] sub-G1:“死亡细胞”=“single cells-2in(single cells-1in cells)”[0057] p-H3:“组蛋白H3磷酸化阳性细胞”=“single cells-2in(single cells-1in cells)except sub-G1”
[0058] 设定完成流式图的门和逻辑关系图后,设定流式细胞仪分析参数。检测速度使用“低速”,分析终止条件为“cells门收集20000个细胞”或者“分析体积为140μL”,最终获得的数据为“p-H3”门的细胞比例,即组蛋白H3磷酸化阳性细胞比例。组蛋白H3磷酸化阳性细胞比例的升高可提示化合物的非整倍体诱导作用。
[0059] 多终点检测的建立流式图如图2A~H。
[0060] 其门列表和逻辑关系如下:
[0061] beads:“计数珠数目”;
[0062] cells:“总细胞”=“all cells except beads”;
[0063] single cells-1:“单细胞”=“cells”;
[0064] single cells-2:“单细胞”=“single cells-1in cells”;
[0065] sub-G1:“死亡细胞”=“single cells-2in(single cells-1in cells)”;
[0066] apoptosis:“凋亡细胞”=“Cleaved-PARP in(single cells-2in(singlecells-1in cells)except sub-G1)”;
[0067] Gamma-H2AX:γ-H2AX荧光强度=“(single cells-2in(single cells-1in cells)except sub-G1)except apoptosis”;
[0068] P53:P53蛋白荧光强度=“(single cells-2in(single cells-1in cells)except sub-G1)except apoptosis”;
[0069] 设定完成流式图的门和逻辑关系图后,设定流式细胞仪分析参数。检测速度使用“低速”,分析终止条件为“cells门收集20000个细胞”或者“分析体积为140μL”,最终获得的数据为“beads”、“cells”门事件数目和“Gamma-H2AX”、“p53”门的荧光强度。“beads”和“cells”事件比值可以用于计算细胞毒性,计算公式见公式一。“Gamma-H2AX”、“p53”门的荧光强度用来评价细胞的γ-H2AX表达和p53蛋白表达,可提示化合物的致双链断裂性和DNA损伤修复启动。
[0070] 公式一:
[0071]
[0072] Tc:受试物组cells门事件数;Tb:受试物组beads门事件数
[0073] Cc:对照组“cells”门事件数;Cb:对照组“beads”门事件数
[0074] 方法建立和方法验证过程均使用该模板进行检测。
[0075] 在方法验证中,本试验选择了4个不同作用机制、不同作用强度的DNA断裂剂,MMC、MMS、B[a]P和cDDP,2个非整倍体诱导剂PT和VCR,3个非遗传毒性化合物NaCL、Amp G和Prop,以ETO、COL和CP为阳性对照品作用于TK6细胞,验证该方法的灵敏度和特异性。每个受试物以1:1(v:v)方法稀释3个浓度,每个浓度设2个副孔。
[0076] 方法建立使用的阳性对照最高浓度选择见表1。
[0077] 方法验证各个受试物最高浓度选择见表2。
[0078] 表1方法建立化合物
[0079]
[0080] 表2方法验证化合物
[0081]
[0082]
[0083] 结果判定标准:
[0084] 受试物的作用机制依据各生物标志物的检测结果的分析判断。如果受试物可引起γ-H2AX和p53蛋白表达阳性升高,组蛋白H3磷酸化阳性细胞比例不升高,则该受试物为DNA断裂剂;如果受试物可引起组蛋白H3的磷酸化阳性细胞比例显著升高,而γ-H2AX表达无明显变化,无论p53蛋白表达是否为阳性,该物质被判断为非整倍体诱导剂;如果受试物不能引起γ-H2AX和p53蛋白表达阳性升高,并且组蛋白H3的磷酸化阳性细胞比例也无显著升高,则该物质为非遗传毒性化合物。其中γ-H2AX和p53蛋白表达荧光平均值与溶剂对照组相比超过2倍,则该指标为阳性。而H3磷酸化阳性细胞比例以统计学有显著差异为阳性标准(p≤0.05)。
[0085] 试验结果
[0086] 方法建立结果
[0087] 方法建立的结果中,24h-S9处理组0.2、0.4、0.8和1.6μg/mL 4个浓度的ETO和4h+S9处理组7.5、15和30μg/mL 3个浓度的CP中,组蛋白H3磷酸化细胞的比例比阴性对照组有显著的降低。其主要原因是细胞毒性增大,导致细胞的有丝分裂减弱。24h-S9处理组0.0063、0.0125、0.025和0.05μg/mL 4个浓度的COL诱导组蛋白H3磷酸化细胞的比例比阴性对照组均有显著的升高,且呈现剂量浓度关系。见图3A~C。
[0088] 而24h-S9处理组0.8和1.6μg/mL 2个浓度的ETO和4h+S9处理组30μg/mL浓度的CP,可诱导γ-H2AX表达的平均荧光强度相比于溶剂对照组增加均超过2倍,且有浓度-反应关系。其p53蛋白表达的平均荧光强度相比于溶剂对照组增加均超过2倍。24h-S9处理组0.0063、0.0125和0.025μg/mL 3个浓度的COL,诱导γ-H2AX表达的平均荧光强度相比于溶剂对照组增加倍数均不超过2倍。其p53蛋白表达的平均荧光强度相比于溶剂对照组在
0.025μg/mL浓度下增加超过2倍。见图4A~C。
[0089] 结果提示,COL为非整倍体诱导剂,ETO和CP为断裂剂。
[0090] 在方法验证中,MMC在+/-S9处理条件下均可诱导TK6细胞γ-H2AX荧光强度呈现浓度依赖性阳性升高,而H3磷酸化阳性细胞比例无明显升高。MMC诱导p53蛋白表达荧光强度呈现浓度依赖性阳性升高。而B[α]P在+/-S9条件下分别处理TK6细胞后,γ-H2AX平均荧光强度、p53蛋白平均荧光强度和组蛋白H3磷酸化阳性细胞比例,γ-H2AX平均荧光强度在+S9条件下的最高浓度出现阳性升高。依据该结果提示,MMC和B[α]P为断裂剂。其中B[α]P需体外代谢活化。
[0091] VCR在+/-S9处理条件下诱导TK6细胞γ-H2AX荧光强度均无剂量依赖性阳性升高。VCR诱导TK6细胞的H3磷酸化阳性细胞比例出现显著差异,并呈现明显的剂量-效应关系。该结果可证实VCR为非整倍体诱导剂。
[0092] Amp G在有或无S9的条件下处理TK6细胞,所有受试浓度诱导γ-H2AX和p53蛋白表达的平均荧光强度与溶剂对照相比,均无明显变化及浓度-效应关系。同时Amp G在有或无S9的条件下诱导H3组蛋白磷酸化的阳性细胞比例与溶剂对照组相比,均无无明显变化和浓度-效应关系。
[0093] 同时,每次试验各处理条件下,阳性对照ETO、COL和CP的结果均符合预期,可验证ETO和CP为断裂剂,COL为非整倍体诱导剂,提示试验系统稳定、可靠。
[0094] 以上结果见图5A~C、图6A~C、图7A~C以及图8A~C。
[0095] 本发明还发现,由受试物引起的细胞凋亡,可以产生较大的γ-H2AX荧光强大波动,验证了本试验在选择Cleaved-PARP作为细胞凋亡生物标志物,排除细胞凋亡过程激活Caspase-9、Caspase-3表达而产生的γ-H2AX。
[0096] 以吲哚美辛24h-S9组为化合物验证本方法。
[0097] 表1吲哚美辛的24h-S9组γ-H2AX荧光强度在排除凋亡细胞前后对比
[0098]
[0099] *:相对于阴性对照组,增加超过2倍,为阳性结果。
[0100] 表1中,吲哚美辛为非遗传毒性物质,在本次试验中,如果不使用Cleaved-PARP生物标志物其γ-H2AX荧光强度相对于溶剂对照呈现剂量依赖性增加,且最高浓度超过阴性对照组2倍,为阳性结果。同时我们注意到,细胞凋亡比例也随着浓度的升高而呈现明显的增加。因此推测该γ-H2AX增加是由于细胞凋亡引起。因此我们后续采用流式细胞术的门策略排除检测Cleaved-PARP阳性(即凋亡细胞)细胞。之后我们观察到排除凋亡后,γ-H2AX的荧光强度相对于阴性对照组的增加没有超过2倍,并且没有计量依赖性。因此,当排除凋亡细胞后,吲哚美辛的结果为阴性。由此可验证排除凋亡细胞对本方法具有明显的降低假阳性率优势。因此,使用细胞凋亡生物标志物Cleaved-PARP排除凋亡细胞,可以降低细胞毒性较高时由于细胞凋亡引起的假阳性率高问题。
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