首页 / 专利库 / 生物学 / 真菌 / 虫生真菌 / 水的酶促净化

的酶促净化

阅读:1032发布:2020-05-23

专利汇可以提供的酶促净化专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 旨在通过使用酶来改善 水 处理 系统中污水的 净化 。提供了包含酶的 过滤器 和用于生产所述过滤器的方法,以及所述过滤器的用途、包含所述过滤器的模 块 系统(10),以及所述模块系统的用途。,下面是的酶促净化专利的具体信息内容。

1.过滤器,其适用于针对一种或更多种对环境有害的有机物质来净化,所述对环境有害的有机物质为例如药物分子、增塑剂、阻燃剂、除草剂杀虫剂、杀真菌剂、化妆品、织物添加剂等,所述过滤器包含H2O稳定的开孔泡沫材料和与所述材料共价结合的一种或更多种酶,其中所述酶具有消除所述对环境有害的物质的能,并且其中所述过滤器适合放置在污水处理系统内的模系统中,以使得水将流过一个或更多个过滤器,从而使所述水与所述一种或更多种酶接触,并且所述酶将消除所述水中存在的任何一种或更多种对环境有害的有机物质,从而针对所述一种或更多种对环境有害的有机物质将所述污水净化至至少60%至95%,优选至少75%至95%,甚至更优选至少80%至95%的程度。
2.根据权利要求1所述的过滤器,其中所述H2O稳定的开孔泡沫材料选自聚乙烯醇、基于纤维素的材料、聚乙烯亚胺和聚酯/聚酯。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的过滤器,其中所述过滤器包含聚乙烯醇。
4.根据权利要求1或2中任一项所述的过滤器,其中所述基于纤维素的材料是纤维素泡沫。
5.根据权利要求1或2中任一项所述的过滤器,其中所述基于纤维素的材料是纤维素泡沫。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的过滤器,其中所述对环境有害的有机物质是选自包含以下的组的药物分子:环丙沙星、西酞普兰、克拉霉素、双氯芬酸、红霉素、雌二醇、炔雌醇、氟康唑、布洛芬、卡西平、康唑、左炔诺孕酮、氯沙坦、美托洛尔、甲氨喋呤、普生、奥沙西泮、舍曲林、磺胺甲 唑、曲马多、甲苄啶、唑吡坦、酮洛芬、利培酮、氟西汀、文拉法辛、氧氟沙星、多西环素、诺氟沙星和四环素
7.根据权利要求1至6中任一项所述的过滤器,其中所述一种或更多种酶选自包含以下的组:漆酶、木质素过氧化物酶、环氧化物水解酶、P450 BM3、三聚氰胺脱氨酶、乙酰乙酸脱羧酶、脱卤酶和LinB,并且其中所述酶被修饰以在pH为5.5至8.5,温度为+8℃至20℃下消除对环境有害的有机物质。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的过滤器的用途,其中流过所述过滤器的水将与所述过滤器的材料表面上呈现的所述一种或更多种酶接触,以使得所述酶可消除存在于所述水中的任何对环境有害的有机物质,例如药物分子、增塑剂、阻燃剂、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、化妆品、织物添加剂。
9.模块系统(10),其包含入口(1)、至少一个过滤室(2)、出口(3)、连接至其上游的每个过滤室用于调节从所述入口到所述过滤室的水流的第一(4),和连接至其下游的每个过滤室用于调节从所述过滤室到所述出口的水流的第二阀门(5),每个过滤室(2)包含顶部部分(6)、底部部分(7)、壁表面(8;8a;8b;8c)和舱口(9),其中所述模块系统连接至水处理系统,以使得待处理的水被引导至所述入口(1),允许所述水流过所述入口(1)到达所述至少一个过滤室(2),然后流过所述模块系统的所述出口(3),其中每个所述至少一个过滤室(2)包含根据权利要求1至权利要求7中任一项所述的过滤器。
10.根据权利要求9所述的模块系统,其还包含含有爆破片的溢流通道(11)。
11.根据权利要求9或10中任一项所述的模块系统,其还包含流量计。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的模块系统的用途,其用于在水处理厂或水处理系统内钏对任何对环境有害的有机物质来净化污水,所述对环境有害的有机物质为例如药物分子、增塑剂、阻燃剂、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、化妆品、织物添加剂等。
13.针对一种或更多种对环境有害的有机物质来净化污水的方法,其包括以下步骤:
a)提供编码一种或更多种酶的一种或更多种多核苷酸,所述酶具有消除对环境有害的有机物质的能力;
b)在用包含来自a)的所述多核苷酸的载体例如质粒转化的生物体中重组地产生酶,其中由所述生物体产生所述酶,从而获得酶溶液;
c)将所述酶溶液添加至过滤器,其中所述过滤器包含具有结合所述酶的能力的材料,其中所述酶与所述材料共价结合,该过滤器将与待针对对环境有害的有机物质进行净化的水接触;
d)在污水处理系统中使用所述过滤器,其中将针对一种或更多种对环境有害的有机物质净化水,以使得所述过滤器从所述水中酶促减少和/或消除所述一种或更多种对环境有害的有机物质。
14.根据权利要求13所述的方法,其中步骤b)中的所述载体包含与编码所述酶的多核苷酸偶联的信号肽,并且其中所述信号肽指导所述所产生的酶的胞外转运。
15.根据权利要求13或14所述的方法,其中所述酶由能够胞外产生所述酶的生物体重组地产生,以使得所述酶被所述生物体转运至所述生物体的培养物中的上清液。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法,其中所述酶由大肠杆菌(E.Coli)、芽孢杆菌属物种或在酵母中重组地产生。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法,其中在步骤b)中获得的所述酶溶液是包含所产生的酶的培养物上清液,其在步骤c)中直接添加至所述过滤器以将所述酶共价结合在所述过滤器中。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法,其中所述一种或更多种酶选自包含以下的组:漆酶、木质素过氧化物酶、环氧化物水解酶、P450 BM3、三聚氰胺脱氨酶、乙酰乙酸脱羧酶、脱卤酶和LinB,并且其中所述酶被修饰以在pH为5.5至8.5,温度为+8℃至20℃下消除对环境有害的有机物质。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法,其中所述过滤器的材料是H2O稳定的开孔泡沫材料。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的方法,其中在步骤c)中,所述过滤器包含选自包含以下的组的材料:聚乙烯醇、基于纤维素的材料、聚乙烯亚胺和聚酯/聚氨酯。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的方法,其中所述过滤器包含聚乙烯醇。
22.根据权利要求13至21中任一项所述的方法,其中所述基于纤维素的材料是棉纤维素或纤维素泡沫。

说明书全文

的酶促净化

技术领域

[0001] 本发明涉及使用酶针对有机物质的水的净化的领域。

背景技术

[0002] 水污染是严重的环境问题。今天,在使用机械过滤器之后,污水的水处理通常包括活性污泥的使用(其包括总固体的沉降,随后有机物质的需降解和随后的沉降)以去除生物质。之后水可通过化学处理。然而,某些污染物例如对环境有害的有机物质(例如药物分子)并未通过常规沉降技术从水中完全消除。事实上,污水的沉降消除了极少量的药物分子。因此,许多对环境有害的有机物质保留在水中并对环境产生负面影响,特别是对水生生物产生负面影响。
[0003] Periodic Report Summary 2-ENDETECH(Enzymatic Decontamination Technology)(European Commission,CORDIS,Sejoume,Florence,196264-N1)讨论了开发技术的目标,该技术旨在使用生物反应器中的固定化酶从水消除持久性药物污染物。ENDETECH公开了酶在膜上和珠上的固定化。
[0004] WO 2009/076711A1公开了使用多肽来降解为有害生物防治剂的氯化s-三嗪。与AtzA相比,具有增强的降解能的多肽被鉴定、表达并与例如水接触,以消除其中存在的s-三嗪。
[0005] WO 2012/007536A1公开了使用酶来灭活环境中的抗生素,特别是在废物和废水流出物到达环境之前使来自其的抗生素失活的方法。酶可包含在施用于任何待处理流出物的组合物中,或者可固定在固体支持物(优选二氧化或玻璃珠或膜)上。
[0006] 上述方法均不适用于针对对环境有害的有机物质的水的有效大规模净化。
[0007] 使用包含酶促膜的生物反应器用于进行水净化的方法包括使水通过膜,因此水中可能存在没有通过膜并因此将保留在膜的上游侧的物质。这可能对酶促膜的效率产生负面影响,并因此影响生物反应器的效率。另外,生物膜的生产可能是昂贵的。
[0008] 因此,需要改善净化方法,以便以较低的成本和较高的效率消除污水中存在的大多数(如果不是全部)对环境有害的有机物质。

发明内容

[0009] 本发明旨在通过使用酶来改善污水的净化。使用酶促净化代替化学净化的优势是环境足迹将更小。通过化学处理,需要在使用之前和之后以环境安全并遵循管理协议的方式安全地处理化学物质。化学物质的活性不是特定的,因此可以发挥除期望活性之外的另外的活性。如果化学物质进入环境,其将因此对其将遇到的一切产生影响。使用酶的优势在于其活性非常特异,并且具有有时间限制期的活性。因此,如上所述的化学物质的任何下游问题都被最小化,这提供了显著的环境优势。
[0010] 本发明旨在解决改善当前的水净化方法以便以较低的成本和较高的效率消除污水中存在的大多数(如果不是全部的话)对环境有害的有机物质的问题。这是通过针对一种或更多种对环境有害的有机物质(例如药物分子、增塑剂、阻燃剂、除草剂杀虫剂(pesticide)、杀真菌剂、化妆品、织物添加剂等)来净化污水的方法来实现的,其包括以下步骤:
[0011] a)提供编码一种或更多种酶的一种或更多种多核苷酸,所述酶具有消除对环境有害的有机物质的能力;
[0012] b)在用包含来自a)的多核苷酸的载体(例如质粒)转化的生物体中重组地产生酶,其中由生物体产生所述酶,从而获得酶溶液;
[0013] c)将酶溶液添加至过滤器,其中过滤器包含具有结合酶的能力的材料,其中酶与所述材料共价结合,该过滤器将与待针对对环境有害的有机物质进行净化的水接触;
[0014] d)在污水处理系统中使用过滤器,其中将针对一种或更多种对环境有害的有机物质净化水,以使得过滤器从水中酶促减少和/或消除一种或更多种对环境有害的有机物质。
[0015] 另外,本发明提供了适用于针对一种或更多种对环境有害的有机物质来净化污水的过滤器,所述对环境有害的有机物质为例如药物分子、增塑剂、阻燃剂、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、化妆品、织物添加剂等,所述过滤器包含H2O稳定的开孔泡沫材料和与所述材料共价结合的一种或更多种酶,其中所述过滤器适合放置在污水处理系统内的模系统中,以使得水将流过一个或更多个过滤器,从而针对一种或更多种对环境有害的有机物质将污水净化至至少60%至95%,优选至少75%至95%,甚至更优选至少80%至95%的程度。
[0016] 过滤器的材料优选地选自聚乙烯醇、纤维素、纤维素泡沫、聚乙烯亚胺和聚酯/聚酯。
[0017] 根据本发明的过滤器包含具有消除一种或更多种对环境有害的有机物质(例如药物分子)的能力的酶,所述药物分子选自包含以下的组:环丙沙星、西酞普兰、克拉霉素、双氯芬酸、红霉素、雌二醇、炔雌醇、氟康唑、布洛芬、卡西平、康唑、左炔诺孕酮、氯沙坦、美托洛尔、甲氨蝶呤、普生、奥沙西泮、舍曲林、磺胺甲 唑、曲马多、甲氧苄啶(Trimetroprim)、唑吡坦、酮洛芬、利培酮、氟西汀、文拉法辛、氧氟沙星、多西环素,诺氟沙星和四环素
[0018] 与过滤材料共价结合的一种或更多种酶选自包含以下的组:漆酶、木质素过氧化物酶、环氧化物水解酶、P450 BM3、三聚氰胺脱氨酶、乙酰乙酸脱羧酶、脱卤酶和LinB。
[0019] 另外,本发明提供了根据上述的过滤器的用途,其中流过过滤器的水将与过滤器的材料表面上呈现的一种或更多种酶接触,以使得所述酶可消除存在于所述水中的任何对环境有害的有机物质,例如药物分子、增塑剂、阻燃剂、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、化妆品、织物添加剂。
[0020] 另外,本发明提供了模块系统(10),其包含入口(1)、至少一个过滤室(2)、出口(3)、连接至其上游的每个过滤室用于调节从入口到过滤室的水流的第一(4),和连接至其下游的每个过滤室用于调节从过滤室到出口的水流的第二阀门(5),每个过滤室(2)包含顶部部分(6)、底部部分(7)、壁表面(8;8a;8b;8c)和舱口(hatch)(9),其中模块系统连接至水处理系统,以使得待处理的水被引导至入口(1),允许所述水流过入口(1)到达至少一个过滤室(2),然后流过模块系统的出口(3),其中每个所述至少一个过滤室(2)包含根据上述的过滤器。附图说明
[0021] 图1:根据本发明的一个实施方案的模块系统。
[0022] 发明详述
[0023] 由于我们社会对对环境有害的有机物质的利用,其存在于污水中。其可能涉及消费品制造过程中使用的有机物质,例如阻燃剂、增塑剂、织物添加剂,或农业中使用的有机物质,例如除草剂、杀虫剂、杀真菌剂等。其还可能与使用者通过体液、粪便等排泄到污水中的药物分子有关。其还可能涉及化妆品,或卫生用品(例如肥皂、洗发水等)中使用的抗菌剂,其可从其制造或使用进入水中。无论对环境有害的有机分子的来源如何,本发明中感兴趣的对环境有害的有机分子是已被鉴定为对环境和/或水生生物构成威胁,并且使用现有技术难以将其从污水中消除的分子。例如,欧洲指令2008/105/EG解决了该问题,并列出了许多优先从水中消除的对环境有害的有机分子。
[0024] 污水意指来自社区的携带废物的水。其可能涉及主要由灰水(greywater)、黑水(blackwater)、肥皂和洗涤剂,以及卫生纸组成的家庭或城市废水。灰水包括来自水槽、浴缸、淋浴、洗碗机洗衣机的水。黑水包括用于冲洗厕所的水,以及其冲洗掉的人的废物。
[0025] 在消费品的制造中使用的感兴趣的为了从污水中消除的对环境有害的有机物质可以是例如壬基酚、双酚A或PFAS(全氟烷基物质和多氟烷基物质)。
[0026] 壬基酚是不易生物降解的物质,用于制造抗氧化剂润滑油添加剂、洗衣和餐具洗涤剂、乳化剂和增溶剂,并且还可存在于例如纺织品中。其在欧盟内部被禁止,但来自欧盟以外的进口产品可能仍包含该物质。由于壬基酚发挥雌激素样活性作用的能力,所以其具有作为内分泌干扰物和异雌激素(xenoestrogen)的潜在作用。壬基酚很容易在与物质接触的生物体中进行生物积累。
[0027] 双酚A用于制造某些塑料和环氧树脂,并且已经用于例如许多食品和饮料罐中。已经表明,双酚A表现出模仿雌激素、激素样特性,也表明了神经系统效应和癌症。
[0028] PFAS(全氟烷基物质和多氟烷基物质)是用于生产光滑、防水、抗脂肪表面的化学物质,但也存在于例如灭火泡沫中。PFAS可降解为全氟烷基酸(perflourated alkylic acids,PFAA),而其继而是不可降解的,因此可能在生物体中积累。其已被证明会造成肝脏损伤,还可能影响脂肪代谢、免疫系统和生殖能力。
[0029] 待从污水中消除的目标药物分子很多,且包括例如抗生素、抗抑郁剂、抗炎剂、激素、抗真菌剂、血压药、肿瘤剂(抗癌剂)、镇静剂、止痛药。
[0030] 对于从污水中消除作为抗击发生抗生素抗性之斗争的一部分,抗生素是特别令人感兴趣的。待从污水中消除的感兴趣的抗生素的一些实例是例如环丙沙星、克拉霉素、红霉素、磺胺甲 唑、甲氧苄啶、氧氟沙星、多西环素、诺氟沙星和四环素
[0031] 待从污水中消除的感兴趣的抗抑郁剂的一些实例是例如西酞普兰、舍曲林、氟西汀和文拉法辛。
[0032] 待从污水中消除的感兴趣的抗真菌剂的一些实例是例如氟康唑和酮康唑。
[0033] 待从污水中消除的感兴趣的抗炎剂的一些实例是例如双氯芬酸、布洛芬、萘普生、酮洛芬和甲氨蝶呤。
[0034] 待从污水中消除的感兴趣的血压药的一些实例是例如氯沙坦和美托洛尔。
[0035] 待从污水中消除的感兴趣的激素的一些实例是例如雌二醇、炔雌醇和左炔诺孕酮。
[0036] 待从污水中消除的感兴趣的止痛药的一个实例是例如曲马多。
[0037] 待从污水中消除的感兴趣的镇静剂的一些实例是例如唑吡坦、利培酮、卡马西平和奥沙西泮。
[0038] 根据本发明,获得了编码能够消除上述对环境有害的有机物质的酶的多核苷酸。待用于本发明中的所述酶的标准是其在以下条件中具有发挥其活性的能力:
[0039] 1.在+8℃至20℃的温度范围内;
[0040] 2.在5.5至8.5的pH范围内;并且
[0041] 同时保持至少103s-1M-1(kcat/Km)的活力。
[0042] 酶
[0043] 提供了编码一种或更多种酶的一种或更多种多核苷酸,所述酶具有消除对环境有害的有机物质的能力。这通过包括鉴定、选择和修饰可用于消除对环境有害的有机物质的酶的方法来完成。
[0044] 为了筛选酶文库以寻找用于消除对环境有害的有机物质的合适的酶,鉴定了涉及对环境有害的有机物质的生物学活性的化学结构。然后搜索酶活性的数据库,以鉴定具有针对与已经鉴定为参与上述生物学活性的那些化学结构相似的结构的活性的酶。用于这样的搜索的数据库的一些实例是例如ExPaSy或BRENDA。
[0045] 在鉴定酶的第一步中,鉴定了对环境有害的有机物质的生物学活性必需的化学官能团,例如醇、羧酸、酯、卤素等。在第二步中,鉴定了能够消化这样的化学官能团的酶的类型。其涉及-OH,-COOH,-C-O-C等的消化。在第三步中,将对环境有害的有机物质的骨架结构与由酶消化或已知将由其消化的基质的碳骨架结构进行比较。这是为了确保对环境有害的有机物质能够适应在酶的结合位点中,并且该实例不存在空间位阻。
[0046] 一旦确定,就会获得这些酶,以进一步测试其针对相关的对环境有害的有机物质的活性。酶可以以所生产的纯化的形式购买。酶也可以作为质粒或载体中的多核苷酸购买,其将促进多核苷酸的诱变并允许选择表达系统或表达生物体。还可以获得最初产生酶的生物体,用于内部测序和随后在任何表达系统中表达。存在许多商业渠道,通过这些渠道可购买酶、编码酶的多核苷酸,或产生酶的生物体,其是本领域技术人员已知的。
[0047] 选择显示出针对对环境有害的有机物质的活性的酶用于根据本发明的方法中。对于表现出针对对环境有害的有机物质的活性并因此具有消除所述对环境有害的有机物质的能力的酶,所述酶需要在根据上述鉴定的功能性化学基团处消化对环境有害的有机物质。通常通过质谱法检测底物与酶反应之后底物的存在。然而,也可使用技术人员已知的用于该目的的任何其他手段。为了确定酶是否适合于根据本发明的方法,因此确定了消除能力。通过在+8℃至20℃的温度范围内和5.5至8.5的pH范围内反应1小时之后测量相对于底物和100μmol对环境有害的有机物质,1U酶浓度的底物消除的程度来确定消除能力。对于根据本发明的方法选择的酶,必须观察到对环境有害的有机物质减少15%,因此消除能力为15%。
[0048] 根据本发明的方法的目的是提供在以下条件中具有或通过诱变进行修饰以具有针对对环境有害的有机物质发挥其活性之能力的所选择的酶:
[0049] 在+8℃至20℃的温度范围内;
[0050] 在5.5至8.5的pH范围内;
[0051] 具有至少103s-1M-1(kcat/Km)的活力。
[0052] 因此,必须满足根据上述的温度、pH和酶活力的所有三个标准。这些是酶必须满足以便能够用于对抗对环境有害的有机物质的预设标准。
[0053] 针对相关的对环境有害的有机物质显示出活性并因此具有至少15%的消除能力,但在最初不满足所有三个上述标准的酶,将经受诱变过程,其包括以下步骤:
[0054] 1.通过DNA合成或通过从原物种开始的PCR获得针对所鉴定的酶的原始基因。
[0055] 2.然后酶基因经历诱变以获得可满足上述特定标准的新突变的酶基因[0056] 3.将突变的酶基因转化到包含突变酶基因的载体DNA的大肠杆菌宿主中。
[0057] 4.将适当等分的大肠杆菌宿主细胞涂布在包含合适的抗生素的LB(Lysogeny broth)板上,以获得分离良好的菌落并因此产生突变文库。
[0058] 5.挑取宿主细胞的单菌落并将其接种到96孔板中的LB培养基中并在30℃下储存过夜。
[0059] 6.将等分的宿主细胞培养物转移到包含TB(Terrific broth)和诱导剂的新96孔板中,并在30℃下培养过夜。
[0060] 7.将宿主细胞离心并重悬于包含溶菌酶和DNA酶的缓冲液中,并再次离心以获得包含产生的任何酶的上清液。
[0061] 8.来自步骤7的上清液用于在上述标准内测试针对相关的对环境有害的有机物质的酶活性,
[0062] 9.选择性能最佳的突变并从步骤2重新开始,直到已满足所有三个标准。
[0063] 在根据本发明的方法中使用的所有材料和试剂都在技术领域内的公知常识中,并且可从商业渠道获得。
[0064] 在步骤1中进行的DNA合成或PCR过程是本领域内公知常识的一部分,并且本领域技术人员将能够容易地执行本领域内当前使用的任何方法。
[0065] 步骤2中使用的诱变可以是在Salazar,O.等,Evaluating a Screen and Analysis of Mutant Libraries,Methods in Molecular Biology,第230卷:Directed Enzyme Evolution:Screening and Selection Method中公开的任何方法。本领域技术人员能够容易地利用其中公开的方法用于根据本发明的诱变的目的。
[0066] 在步骤3中,用包含对于酶的突变菌株基因的载体转化大肠杆菌可根据该领域中常用的任何转化进行,并且可选自例如电穿孔、基因枪技术、用玻璃珠搅拌、声波和冲击波。
[0067] 在根据上述的诱变和随后的测试之后,不满足达到温度、pH和针对底物的酶促活性之标准的要求的酶,可进行进一步的诱变直至满足要求。
[0068] 在初始筛选中显示在特定的温度和pH区间内已经具有至少103s-1M-1(kcat/Km)活性的酶不需要进行诱变,并且可直接用于消除来自水处理厂(water treatment plant)或系统内的水之对环境有害的有机物质的目的。
[0069] 下表1列出了根据上述进行鉴定和/或修饰的本发明中使用的酶,以及通过使用本发明中的所述酶消除的对环境有害的有机物质。
[0070] 表1
[0071]
[0072]
[0073] 酶的产生
[0074] 使用本领域内常规遗传工程技术将编码满足上述标准并根据上述进行鉴定和/或修饰的一种或更多种酶的多核苷酸放置在包含胞外信号肽的载体质粒中。
[0075] 将携带编码满足上述活性标准的一种或更多种酶的一种或更多种多核苷酸的载体质粒转化到生产宿主中。生产宿主的转化方法对于本领域技术人员来说是常用的,并且可以是例如电穿孔、基因枪技术、用玻璃珠搅拌、超声波和冲击波。生产宿主必须具有用于胞外转运从上述转化的多核苷酸产生的酶的能力。这样的生产宿主可以是例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)或酵母
[0076] 信号肽是存在于蛋白质(例如酶)的N-末端的短肽,使得蛋白质定向于细胞中的特定分泌途径。信号肽可将蛋白质引导或转移至细胞的特定区室。其还可将蛋白质引导至细胞膜以通过细胞膜内的通道转运,从而将蛋白质转运至细胞外部。因此,实现了蛋白质的胞外转运。
[0077] 为了将所产生的根据本发明的酶转运到宿主细胞外,多核苷酸必须与信号肽偶联,该信号肽负责以正确的方式指导酶的胞外转运。本领域技术人员已知有大量信号肽可用于指导转运至胞外。因此,技术人员将能够根据待产生的酶选择合适的信号肽,以及用于产生的载体质粒和宿主细胞,以确保胞外转运或转移。
[0078] 还可以在无细胞表达系统中产生酶。在这样的情况下,多核苷酸在适于在这样的系统中表达多核苷酸的载体中提供。用于无细胞表达的系统和材料是本领域技术人员公知的,本领域技术人员将容易地将这样的产生应用于本发明。
[0079] 无论用于酶产生的系统如何,培养物或反应上清液都将包含所产生的酶。根据本发明,所述上清液可用于将酶添加至过滤器的下一步骤,而无需任何上清液的纯化。
[0080] 过滤器
[0081] 根据本发明的过滤器包含防水且适于酶与其表面共价结合的材料。用作用于过滤器的固体支持物的材料还应具有泡沫结构,优选开孔泡沫结构,并且该材料必须具有足够的刚性以形成可插入流通室但仍然适应所述室形状的3D结构。同样重要的是,过滤器的材料具有每24小时至少1000m3水/m3材料的流通能力。优选地,过滤器包含聚乙烯醇、基于纤维素的材料、聚乙烯亚胺和/或聚酯/聚氨酯。
[0082] 酶与过滤材料的结合或固定是通过活化或打开材料中的侧链以使得酶可与其共价结合来完成的。以下描述了过滤材料和将酶结合或固定到该过滤材料的方法。
[0083] 用于过滤和固定酶的材料
[0084] 固定化被设计为酶与固体支持物之间的化学稳定附接(attachment)。
[0085] 对于本发明,使用H2O稳定的开孔泡沫材料,其具有与主聚合物骨架正交的官能化基团(亲核体/亲电体),或者利用不干扰线性聚合物骨架的结构稳定性的官能团。
[0086] 相关官能性:
[0087]
[0088] *BrCN(溴化氰)是已建立的固定技术,因此对于本领域内技术人员来说将是容易理解的。
[0089] 聚乙烯醇
[0090] 聚乙烯醇(PVA)的结构通过对卤代烷的SN2攻击或将醇氧化成随后由胺进行SN2攻击而提供用于共价附接的羟基官能团。PVA以其天然形式属于CatA(参见上表),但可通过使用适当的卤代烷的共价官能化来假定任何其他类别。
[0091]
[0092] 棉纤维素
[0093] 棉纤维的结构由含有游离羟基的纤维素组成,与PVA类似,可用于亲核攻击。纤维素也属于Cat A,但另外包含在Cat B中发现的特征的双羟基。
[0094]
[0095] 纤维素泡沫
[0096] 这与棉纤维素类似,尽管商用纤维素泡沫包含纤维素与黏胶(其中羟基被二硫化碳修饰的纤维素)的混合物。虽然负载能力受到泡沫中黏胶量的限制,但其是潜在的官能化材料。
[0097]
[0098] 聚乙烯亚胺
[0099] 聚乙烯亚胺(PEI)通过对卤代烷的SN2攻击或将醇氧化成醛随后由胺进行SN2攻击而提供用于共价附接的胺官能团。PEI属于Cat.F。PEI的缺点在于其不能作为泡沫商购,而是已经作为凝胶在实验室规模的实验中使用。如果其可以以泡沫获得,则其具有与戊二醛一起作用用于固定化目的的潜力。
[0100]
[0101] 聚酯/聚氨酯
[0102] 聚酯/聚氨酯(PE/PU)提供易受胺类亲核攻击的官能团,这导致形成新的酰胺/脲键。这些材料作为泡沫可商购获得,但是其具有在宏观尺度上随著官能化增加丧失结构稳定性的缺点,这限制了其应用。
[0103]
[0104] 合成策略
[0105] 用于酶的固定的感兴趣的化学合成概述如下。
[0106] 来自Cat A/B的包含羟基之材料的官能化反应的示意图:
[0107]
[0108] 这代表了PVA或纤维素的官能化。每种官能化的各个反应如下所示。
[0109] 使用已建立的BrCN活化方法进行酶附接,随后对来自Cat A/B的材料进行亲核攻击:
[0110]
[0111] 使用来自酶的胺使来自先前方案的环氧化物开环说明了Cat C中材料的官能化。或者,通过水解使环氧化物开环产生Cat B材料:
[0112]
[0113] 使用EDC(N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺)或氯化作用(草酰氯、亚硫酰氯等)活化羧酸,随后是在来自Cat E的材料的酶附接中结束的NHS-酯形成:
[0114]
[0115] 最后的方法是将羟基氧化成醛或酮,随后使用胺进行亲核攻击。可以通过将亚胺还原成仲胺,而使该共价键变得更稳定。这证明了使来自Cat D的材料官能化的原理。
[0116]
[0117] 纤维素的官能化属于这一类。
[0118]
[0119] 使用高碘酸钠(NaIO4)氧化纤维素是获得酶的醛锚定点的潜在合成途径。
[0120]
[0121] 最终的官能化方法利用包含游离胺官能团的材料。胺可用作亲核体以附接任何亲电官能团,参见上述CatA/B合成。或者,胺可用于形成亚胺,随后被还原以获得稳定的仲胺键。聚合物PEI是用于该官能化的潜在候选物并且代表了Cat F中的材料。在还原后,材料可作为Cat D材料处理。
[0122] 酶的固定
[0123] 添加到过滤器固体支持材料的酶溶液是通过上述用于产生酶的方法获得的酶溶液的组合,该组合取决于过滤器期望的消除活性。通过将溶液与所有已鉴定的酶组合并将该组合溶液添加至过滤器,使用所述一个过滤器将消除大多数对环境有害的分子。
[0124] 过滤器的固体支持物是上述所公开的任何材料。一旦过滤器具有与其共价结合的酶,则该过滤器就已经被激活并准备用于水处理系统中。
[0125] 因此,提供了包含与材料共价结合的一种或更多种酶的过滤器,其适合用于放置在水处理厂中的水处理模块内。
[0126] 水净化过程
[0127] 激活的过滤器用于污水处理厂中,以降解物质。在污水处理厂的过程中,激活的过滤器应该能够去除至少60%至95%,优选至少75%至95%,甚至更优选至少80%至95%的对环境有害的有机物质。该过程是通过建立控制水流通过根据本发明的过滤器的系统,以使得酶被提供给水中的物质并且可与其发生反应。这可以通过水流过的管道,或者设计的系统将流引导至过滤器所在的室中。
[0128] 模块系统
[0129] 根据本发明,提供了安装在水处理系统厂中的模块系统(10)。模块(10)包含入口(1),用于允许待处理的水进入模块;至少一个过滤室(2),水通过该过滤室流动;和出口(3),用于允许水离开模块。每个过滤室包含根据上述的过滤器。第一阀门(4)连接至其上游的每个过滤室,用于调节从入口到过滤室的水流。第二阀门(5)连接至其下游的每个过滤室,用于调节水从过滤室到出口的流动。每个过滤室包含顶部部分(6)、底部部分(7)和包含舱口(9)的壁表面(8)。可打开舱口(9)以使得可容易地从外部接近过滤室(2)的内部。舱口(9)通过铰链附接并通过紧固装置定,或者通过本领域技术人员已知的任何用于附接和紧固的等同装置进行,这些装置可以容易地打开。
[0130] 顶部部分(6)具有比底部部分(7)更大的表面。这是重要的,因为这将导致从顶部部分(6)到底部部分(7)的室内水流的方向。
[0131] 根据一个实施方案,壁表面(8)可包含一个具有圆形截面的圆形侧壁。在这样的情况下,过滤室(2)和因此在室(2)内使用的过滤器将具有为圆形截面的截锥(truncated cone)的形状。
[0132] 根据第二实施方案,壁表面(8)可包含一个截面为卵形或椭圆形的侧壁。在这样的情况下,过滤室(2)和因此在室(2)内使用的过滤器将具有为卵形或椭圆形截面的截锥的形状。
[0133] 对于第一和第二实施方案,重要的是舱口(9)足够大以打开室的足够部分,以便容易地接近和更换其中的过滤器。
[0134] 根据图1中所示的第三实施方案,壁表面(8)的截面可以是正方形或方形的,并且包含3个侧壁(8a、8b、8c),其中第四侧壁包含舱口(9)。在这样的情况下,过滤室(2)和因此在室(2)内使用的过滤器将具有倒等腰梯形的形状。在第三实施方案的变型中,壁表面的截面可以是矩形的。
[0135] 重要的是,过滤器形状与过滤室形状相同,以使得过滤器在室内的安装变得容易,并且因此防止了在过滤器与侧壁之间的侧通道的形成。
[0136] 模块系统连接至水处理系统,以使得待处理的水被引导至入口(1),从而允许所述水流过入口(1)到达至少一个过滤室(2),然后流过模块系统的出口(3),从而允许水离开模块系统。
[0137] 根据本发明的过滤器是可更换的。连接至过滤室(2)的阀门(4;5)允许调节通过过滤室(2)的水流和完全将其关闭,以使得其能够维护模块(10)和过滤室(2),特别是便于更换包含在过滤室(2)中的过滤器。
[0138] 每个过滤器单元可在模块系统内使用至少1周和多至3个月。此后,固定在过滤器上的酶的活性将降低到低于上述75%的阈值水平的水平。然后必须用新过滤器更换过滤器。通过打开过滤室(2)的舱口(9)来完成过滤器的更换,由此暴露过滤室(2)的内部并且可容易地更换过滤器。
[0139] 过滤室(2)的体积通常为约0.2m3。这使得在更换过滤器期间能够便于管理每个室(2)。例如,由于在更换过滤器时要排出的水体积不是很大,因此便于更换过滤器。
[0140] 模块系统(10)还可设置有溢流通道(11)。如果模块系统(10)在任何时间经历室(2)中的流动停止,或者如果太多的水被引入系统中,则所述溢流通道(11)允许通过破坏其中的爆破片(bursting disc)(未示出)来旁通水,以使得模块系统(10)不会以任何方式被损坏。
[0141] 模块系统(10)还可设置有流量计(未示出),以监测流量。这样的流量计可用于确定在什么点测试过滤器的活动以确定是否需要更换过滤器。例如,其可涉及其中一定体积的水已经通过过滤室(2)中的过滤器的点。
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台,是提供专利分析,专利查询,专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据,免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析,涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度,系统通过AI智能系统对图表进行解读,只需1分钟,一键生成行业专利分析报告。

申请试用

QQ群二维码
意见反馈