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以LppA基因为检测靶标进行牛支原体检测的组合物、试剂盒和方法

阅读：957发布：2023-03-26

专利汇可以提供以LppA基因为检测靶标进行牛支原体检测的组合物、试剂盒和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开以LppA基因为检测靶标进行牛支原体检测的组合物、试剂盒和方法。本发明的组合物的检测靶标为牛支原体的LppA基因，可以针对该基因中的多种不同片段，并且通过实验验证了本发明的组合物可设计出多种不同具体组合情形以应用于传统PCR、basic RPA、nfo RPA和exo-RPA等多种扩增方法，另外可借助琼脂糖凝胶电泳、测流层析试纸条以及恒温荧光扩增仪来观察实验结果。本发明的组合组能够做到牛支原体标准株及野生株种内的保守性以及牛支原体与其他致病菌种间的特异性。基于本发明的组合物可建立特异性好、敏感性高且可以稳定重复的牛支原体快速检测方法，具有操作简单，便捷省时，无需大型的实验仪器设备。，下面是以LppA基因为检测靶标进行牛支原体检测的组合物、试剂盒和方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于检测牛支原体的组合物，其特征在于，包括能够与牛支原体的LppA基因杂交的第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和溶解所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的缓冲液，其中：
所述第一寡核苷酸与所述LppA基因的第一区域选择性杂交，所述第二寡核苷酸与所述LppA基因的第二区域选择性杂交，且所述第一区域位于所述LppA基因的5’端侧，所述第二区域位于所述LppA基因的3’端侧，所述第一区域与所述第二区域之间的距离在50bp～
2000bp之间。
2.根据权利要求1所述的用于检测牛支原体的组合物，其特征在于，所述LppA基因的序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的用于检测牛支原体的组合物，其特征在于，所述缓冲液的pH为
6.9～7.0，且所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸在所述缓冲液中的浓度各自分别为
0.5～1μmol/L。
4.根据权利要求1所述的用于检测牛支原体的组合物，其特征在于，进一步包括第三寡核苷酸，且所述第三寡核苷酸与所述LppA基因的第三区域选择性杂交，所述第三区域位于所述第一区域和所述第二区域之间。
5.根据权利要求4所述的用于检测牛支原体的组合物，其特征在于，所述第一寡核苷酸的长度为35～45nt；所述第二寡核苷酸的长度为35～50nt，且其5’端带有Biotin标记；所述第三寡核苷酸的长度为40～55nt，且其5’端带有可检测基团，3’端带有终止磷酸基团和位于所述第三寡核苷酸中间的THF切割位点。
6.根据权利要求5所述的用于检测牛支原体的组合物，其特征在于，所述第一寡核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示，所述第二寡核苷酸的序列如SEQ ID No.3所示，所述SEQ ID No.4所示，且在所述第三寡核苷酸第31至32中间具有THF切割位点。
7.一种用于检测牛支原体的试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1～6任一项所述的组合物。
8.一种用于检测牛支原体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提供来源于牛的生物样本的模板；
(2)使所述模板与根据权利要求1～6任一项所述的组合物组成反应体系，在34℃～42℃下使所述反应体系反应5～20分钟得到扩增产物；
(3)检测扩增产物。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测扩增产物包括使扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的步骤。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述检测扩增产物包括使扩增产物与带有标记的测流层析试纸条接触，当在检测线和质控线处都显示红色时，判定所述生物样本为阳性样本，当在质控线处显示红色而检测线未显色时，判定所述生物样本为阴性样本，当质控线不显示红色时证明试纸条失效。

说明书全文

以LppA基因为检测靶标进行牛支原体检测的组合物、试剂盒

和方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物技术领域，具体地涉及一种以LppA基因为检测靶标进行牛支原体检测的组合物、试剂盒和方法。

背景技术

[0002] 牛支原体(Mycoplasma bovis，M.bovis)隶属于原核生物界，厚壁菌门，柔膜体纲，支原体目，支原体科，支原体属，是一种主要感染牛呼吸道的病原体，其能够持续感染宿主，引发包括牛肺炎在内的多种慢性疾病，如乳腺炎、中耳炎、生殖障碍、关节炎、脑膜炎以及角膜结膜炎等，这些疾病常被称为牛支原体相关疾病(Mycoplasma bovis associated disease，MbAD)。

[0003] 目前检测牛支原体的方法大致包括以下。培养法是是检测病原体存在的直接证据，是检测M.bovis的金标准。一旦检出，即可确诊。可分为一般的固体培养法和快速培养法。然而由于M.bovis生长缓慢，从临床样本中初次分离一般需要盲传2～4代才能通过显微镜在固体培养基上看到菌落，需要数日才能得到检测结果，不仅检出率低，而且存在耗时过多、中间环节复杂、培养条件要求高等缺陷，给M.bovis的临床分离带来了一定的困难，不适合临床快速诊断。血清学检测技术具有特异性较高、灵敏度较好、快速、易于操作等优点，非常适合临床样本的快速检查和大规模的流行病学调查，但是支原体类大多具有共同抗原，容易造成假阳性的实验结果。免疫组化技术是一门将组织学与免疫学相结合的技术，是在组织细胞原位，通过抗原-抗体特异性结合反应和组织化学显色反应，借助可见的标记物对相应抗原或抗体进行定位、定性和定量检测，但对于病情不重或者选择病灶部位出现偏差较大时，免疫组化则难以检测到M.bovis的存在。在众多检测方法中，多聚酶链式反应是简便且行之有效的检测方法。PCR法检测快速、特异性和敏感性高，检测样本不需要是活体，不受患者免疫功能、病程、感染程度、有无使用药物治疗及未达到血清检测水平的影响，使早期诊断和抗生素的正确选择成为可能。对早期及未生成抗体者及抗体已消失的感染患者有积极的意义；有助于早期诊断，及时治疗，并且不存在交叉反应和放射性污染，易标准化。虽然PCR法检测快速，在某种意义上可替代培养法，但其高敏感性也使PCR法对实验环境和仪器要求比较高，存在着技术条件要求高、操作复杂、不易普及的问题，一般基层实验室难以开展，且价格也相对较高。

发明内容

[0004] 为解决现有技术中的至少部分技术问题，本发明提供一种快速、特异检测牛支原体的组合物、试剂盒和方法。具体地，本发明包括以下内容：

[0005] 本发明的第一方面，提供用于检测牛支原体的组合物，其包括能够与牛支原体的LppA基因杂交的第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和溶解所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的缓冲液。

[0006] LppA是丝状支原体山羊亚种重要的抗原组成成份。针对该蛋白或其基因的研究较少，并且目前的研究关注于蛋白的功能或其结构，例如，蛋白分子的二级结构、亲水性区域及抗原指数。与目前所关注的研究不同，本发明发现在牛支原体中LppA基因具有种内保守性及其种间特异性，从而可以高特异性和敏感性地检测牛支原体。本发明的LppA基因具有SEQ ID No.1所示的序列。

[0007] 本发明中，第一寡核苷酸的长度一般为35～45nt，优选为35～40nt。本发明中，第二寡核苷酸的长度一般为35～50nt，优选为35～45nt。在某些实施方案中，第二寡核苷酸的5’端没有任何修饰。在另外的实施方案中，本发明的第二寡核苷酸的5’端带有Biotin标记。
优选地，第二寡核苷酸的5’端带有Biotin标记。优选地，本发明还包括第三寡核苷酸，其长度一般为40～55nt，优选40～50nt。第三寡核苷酸的5’端带有检测标记，例如FAM荧光基团。
第三寡核苷酸的3’端带有终止磷酸基团。优选地，第三寡核苷酸的序列中间含有THF切割位点。

[0008] 本发明中，第一寡核苷酸能够与LppA基因5’端的第一区域选择性杂交，第二寡核苷酸能够与LppA基因3’端的第二区域选择性杂交。在某些实施方案中，本发明还包括第三寡核苷酸能够，其与LppA基因的第三区域选择性杂交。所述第一区域位于所述LppA基因的5’端侧，所述第二区域位于所述LppA基因的3’端侧。其中，第一区域与第二区域之间最近的距离在50bp～2000bp之间，优选70～1000bp，更优选100～500bp，例如100～200bp。此处最近的距离是指第一区域3’端最后一个碱基与第二区域5’端第一个碱基之间的距离。第三区域位于第一区域和第二区域之间。此处第三区域优选与第一区域或第二区域之间不存在重叠。

[0009] 在某些实施方案中，本发明的组合物包含第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸，且第一寡核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示，第二核苷酸的序列如SEQ ID No.3所示，第三核苷酸的序列如SEQ ID No.4所示，且在5’端带有FAM，在3’端带有终止磷酸基团和在第31-32位碱基之间为idSp。

[0010] 在某些实施方案中，本发明的组合物包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，且第一寡核苷酸的序列如SEQ ID No.5所示，第二核苷酸的序列如SEQ ID No.6所示。

[0011] 需要说明的是，本发明的“5’端侧”是指靠近LppA基因5’端的区域，该区域可以从5’端第一个核苷酸开始，也可以从5’端更下游的某个核苷酸开始，并非仅指LppA基因的5’端。同理可知，“3’端侧”也具有相似的含义。

[0012] 本发明的第二方面，提供用于检测牛支原体的试剂盒，其包含本发明第一方面的组合物。如上文所述，已对组合物进行了详细说明，在此不再赘述。下面说明本发明试剂盒的其他部分。

[0013] 本发明的试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。

[0014] 本发明的第三方面，提供用于检测牛支原体的方法，包括以下步骤：

[0015] (1)提供来源于牛的生物样本的模板；

[0016] (2)使模板与组合物组成反应体系，在34℃～42℃下反应5～20分钟得到扩增产物；

[0017] (3)检测扩增产物。

[0018] 本发明中，检测扩增产物可包括使扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳的步骤。在某些实施方案中，检测扩增产物包括使扩增产物与带有标记的测流层析试纸条接触，当在检测线和质控线处都显示红色时，判定所述生物样本为阳性样本，当在质控线处显示红色而检测线未显色时，判定所述生物样本为阴性样本，当质控线不显示红色时证明试纸条失效。

[0019] 本发明的生物样本指源自待检测的牛的体液或分泌物。优选地，生物样本源自患有相关疾病的牛。其中体液的实例包括但不限于囊液、鼻液和关节液、乳液等。本发明的生物样本为牛鼻液或关节液。作为模板的物质可以是DNA也可以是RNA。

[0020] 本发明的方法可以是基于PCR的方法。也可以与一般的PCR反应不同。此时本发明的方法包括使反应体系维持在恒定温度下的过程，并且反应温度较低，一般需在34℃～42℃的温度环境中进行，并且反应时间也只需5～20分钟，优选8～15分钟。最优选地实施方案中，本发明的反应温度为39℃，反应时间为10分钟。

[0021] 在示例性实施方案中，本发明的反应体系(不包括模板)包括：

[0022]

[0023]

[0024] 本领域已知牛支原体与无乳支原体在常规用于区别不同物种或菌种的16S rRNA、甚至与支原体致病机制相关的膜表面脂蛋白家族基因，乃至于二者的全基因组序列上均表现出了极大的相似性。这对于牛支原体的特异性检测带来极大挑战。本发明通过大量数据的分析与筛选，从中发现常规与抗原性相关的LppA基因，特别是其中的特定区域可以用来设计重组聚合扩增反应的引物靶区域。

[0025] 本发明的组合物可以在肺炎链球菌、克雷伯氏菌、铜绿假单孢杆菌中特异的检测出M.bovis，并且这些组合物不仅可以检测出M.bovis标准株PG45还可以检测出M.bovis野生株ltb和WWM。当这些组合物用于牛支原体的检测时，可做到牛支原体种内保守性以及牛支原体与其他致病菌种间的特异性，基于该发现，本发明设计针对该基因的特定区域的重组聚合扩增反应的寡核苷酸序列。

[0026] 在优选的实施方案中，本发明优化了反应体系，并且得到最佳反应时间与最佳反应温度，从而使检测的特异性、敏感性、重复性与稳定性均大大提升，建立得到特异性好、敏感性高、且可以稳定重复的M.bovis快速检测方法。

[0027] 另外，本发明的所建立的方案在检测M.bovis时方法操作简单，便捷省时，无需大型的实验仪器设备，非常适合没有任何实验基础的人员操作在野外或现场快速检测，值得推广使用。

[0028] 综上所述，本发明的组合物的检测靶标为牛支原体的LppA基因，可以针对该基因中的多种不同片段，并且通过实验验证了本发明的组合物可设计出多种不同具体组合情形以应用于传统PCR、basic RPA、nfo RPA和exo-RPA等多种扩增方法，另外可借助琼脂糖凝胶电泳、测流层析试纸条以及恒温荧光扩增仪来观察实验结果。本发明的组合组能够做到牛支原体标准株及野生株种内的保守性以及牛支原体与其他致病菌种间的特异性。基于本发明的组合物可建立特异性好、敏感性高且可以稳定重复的牛支原体快速检测方法，具有操作简单，便捷省时，无需大型的实验仪器设备。附图说明

[0029] 图1：牛支原体标识基因LppA的第一扩增反应检测结果图。M：分子质量标准1：牛支原体标准株PG45 2：牛支原体野生株Ltb 3：牛支原体野生株WWM 4：绵羊肺炎支原体标准株Y98 5：无乳支原体标准株PG2 6：丝状支原体山羊亚种标准株PG3 7：山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38 8：巴氏杆菌9：金黄色葡萄球菌10：克雷伯氏菌11：肺炎链球菌12：居泉沙雷菌13：沙门氏菌14：大肠杆菌15：绿脓杆菌16：无模板对照。

[0030] 图2：针对LppA基因的第二扩增反应的时间反应梯度结果观察示意图。M：分子质量标准；1：0min；2：5min；3：10min；4：15min；5：20min；6：25min；7：30min；8：35min；9：40min；10：45min；C：无模板对照。

[0031] 图3：针对LppA基因的第二扩增反应的温度反应梯度结果观察示意图。M：DNA分子质量标准；1：34℃；2：35℃；3：36℃；4：37℃；5：38℃；6：39℃；7：40℃；8：41℃；9：42℃；C：无模板对照。

[0032] 图4：针对LppA基因的第二扩增反应的特异性反应结果观察示意图。M：分子质量标准1：牛支原体标准株PG45 2：牛支原体野生株Ltb 3：牛支原体野生株WWM 4：绵羊肺炎支原体标准株Y98 5：无乳支原体标准株PG2 6：丝状支原体山羊亚种标准株PG3 7：山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38 8：巴氏杆菌9：金黄色葡萄球菌10：克雷伯氏菌11：肺炎链球菌12：居泉沙雷菌13：沙门氏菌14：大肠杆菌15：绿脓杆菌16：无模板对照。

[0033] 图5：针对LppA基因的第二扩增反应的敏感性反应结果观察示意图。M：DNA分子质量标准；1：6×1010；2：6×109；3：6×108；4：6×107；5：6×106；6：6×105；7：6×104；8：6×103；9：6×102；10：6×101；10：6×100；C：无模板对照。

[0034] 图6：针对LppA基因的第二扩增反应的批内重复性结果观察示意图。

[0035] 图7：针对LppA基因的第二扩增反应的批间重复性结果观察示意图。

[0036] 图8：针对LppA基因的第三扩增反应结果观察示意图。

[0037] 图9：针对LppA基因的第三扩增反应的时间反应梯度结果观察示意图。

[0038] 图10：针对LppA基因的第三扩增反应的温度反应梯度结果观察示意图。

[0039] 图11：针对LppA基因的第三扩增反应的特异性反应结果观察示意图。

[0040] 图12：针对LppA基因的第三扩增反应的敏感性反应结果观察示意图。

[0041] 图13：针对LppA基因的第三扩增反应的批内重复性结果观察示意图。

[0042] 图14：针对LppA基因的第三扩增反应的批间重复性结果观察示意图。

[0043] 图15：针对LppA基因的第四扩增反应的荧光检测结果图。图15中，tube1：为牛支原体标准株PG45 tube2：牛支原体野生株Ltb tube3：牛支原体野生株WWM tube4：绵羊肺炎支原体标准株Y98 tube5：无乳支原体标准株PG2 tube6：丝状支原体山羊亚种标准株PG3 tube7：山羊支原体山羊肺炎亚种标准株F38 tube8：巴氏杆菌tube9：金黄色葡萄球菌tube10：克雷伯氏菌tube11：肺炎链球菌tube12：居泉沙雷菌tube13：沙门氏菌tube14：大肠杆菌tube 15：绿脓杆菌tube 16：无模板对照。图15的曲线中，从上到下前三条曲线依次为tube1、tube2和tube3。

具体实施方式

[0044] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0045] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0046] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

[0047] 由于M.bovis与无乳支原体同源性很高，二者16S rRNA的相似度可达96％，所以寻找其他标识基因对于M.bovis的特异性检测非常重要。本发明在选择标识基因时不仅考虑了基因的保守性或同源性，从而发现针对LppA基因，特别是其中的特定区域设计寡核苷酸可以快速、特异的检测M.bovis。

[0048] 另外，还发现由此得到的重组聚合扩增反应的引物也可以用于传统PCR反应，并且具有优异的扩增结果。这与本领域已知的针对不同保守基因设计的引物均为一般PCR引物或者用于LAMP的常规引物。这些引物均不能用于常温下的重组聚合反应的观点完全不同。

[0049] 实施例1

[0050] 本实施例为针对特异性基因LppA的第一扩增反应的检测体系，即通过多聚酶链式反应对特异性基因进行检测的过程。其中具体包括以下内容：

[0051] (1)本发明第一扩增反应的检测体系：

[0052]

[0053]

[0054] (2)PCR反应条件：

[0055]

[0056] 其中：

[0057] Lppa F:ACTCTTCAGAAATAACAGACACTTCATC(SEQ ID No.5)；

[0058] Lppa R:GAGTTGTCTGCATTAGTTGCGTAATC(SEQ ID No.6)。

[0059] (3)检测结果：反应结束后取5μL反应产物，琼脂糖凝胶(1.5％)电泳检测，其检测结果见图1所示。

[0060] 实施例2

[0061] 本实施例为针对特异性基因LppA的第二扩增反应的检测体系，即基础(basic)RPA检测体系。其中具体包括以下内容：

[0062] (1)本发明的检测体系的构建：

[0063]

[0064] Lppa F:ACTCTTCAGAAATAACAGACACTTCATC(SEQ ID No.5)；

[0065] Lppa R:GAGTTGTCTGCATTAGTTGCGTAATC(SEQ ID No.6)。

[0066] 将上述反应液混合后加入1μL的待测模板和1.25μL MgoAC，涡旋后简短离心，将其反应液放入39℃水浴锅中，反应20min。结果检测：反应结束后取5μL反应产物，琼脂糖凝胶(1.5％)电泳检测。

[0067] (2)最佳反应时间的探索

[0068] 建立反应体系后，设置0min～45min时间梯度反应探索其最佳反应时间，发现反应5min即可开始产生扩增产物，10min可形成可见的检测结果，15min开始反应逐渐稳定，为使反应更加稳定，设定20min为最佳反应时间。检测结果见图2所示。

[0069] (3)最佳反应温度的探索

[0070] 以20min为最佳反应时间，设置34℃～42℃反应温度梯度，发现其在34℃～42℃内均可发生反应，温度梯度检测结果如图3所示，在34～42℃均有特异性扩增条带产生，且条带较亮，选择在39℃为最佳反应温度。

[0071] (4)检测的特异性

[0072] 以10min为最佳反应时间，39℃为最佳反应温度，检测本发明的反应的特异性，检测结果见图4。如图4所示，仅能检测出M.bovis标准株PG45以及野生株Ltb和WWM，不能检测出其余致病菌。

[0073] (5)检测的敏感性

[0074] 在特异性良好的前提下，克隆LppA基因的目的片段，计算其拷贝数，并进行10倍梯度稀释，发现可检出的最低限度为6×101，远远高于PCR方法的6×103，检测结果见图5所示。

[0075] (6)检测的稳定性

[0076] 在探究了反应的特异性和敏感性后，需对反应的稳定性进行检测。故选择6×107、6×106、6×105三个不同浓度的阳性质粒标准品，在同一条件下重复三次，观察批内的重复效果，批内稳定性检测结果见图6所示；取上述3个不同浓度的阳性质粒标准品，在同一个实验中重复三次，观察批间的重复效果，批间稳定性实验结果见图6所示。

[0077] 建立方法后，对我区5个牧场53个临床样本进行检测，利用第二扩增体系检测检出阳性样本17个，将临床样本用传统的分子生物学检测方法PCR相比，检出符合率高达96％。说明本实验所建立的第二扩增体系效果良好。

[0078] 实施例3

[0079] 本实施例为基于特异性基因LppA的第三扩增反应的体系，即nfo RPA。

[0080] 具体如下：

[0081] (1)本发明的检测体系的构建：

[0082] 第一检测体系：

[0083]

[0084] 其中，Primer free Rehydration buffer为已知可商购产品。

[0085] 该基础混合物中含有反应所需的全部酶和试剂，只需在其中加入模板和相应的寡核苷酸即可。在反应前需加入例如1.25μl浓度为280mM的醋酸镁(MgOAc)至混合物体系中启动反应。反应后得到扩增产物，此时产物可使用带有标记的测流层析试纸条进行检测。当检测产物与试纸条结合时，阳性样本会在检测线和质控线处都显示红色，而阴性样本只会在指控线处显示红色，当质控线不显示红色时证明试纸条失效，为无效的检测结果。试纸检测结果见图8所示。

[0086] (2)最佳反应时间的探索

[0087] 选择LppA基因进行下述重组聚合扩增的实验条件，设计下述寡核苷酸进行重组聚合扩增反应，从而建立快速检测M.bovis的方法，具体实验过程如下：

[0088] LppA F的序列如下：

[0089] GAAAACATATGATTCATTATGCTAGACACACTTTAAA(包含SEQ ID No.2)

[0090] LppA R的序列如下：

[0091] (Biotin)TAGTAAGCGAGCCGTAAAACGGATAAACTATAGCTTTG(包含SEQ ID No.3)

[0092] LppA P的序列如下：

[0093] (FAM)CAAGCATAAATAATCCAAATAAGCTACGTTT/idSp/GTCAGGTATTT GTTTAC(P)(包含SEQ ID No.4)。

[0094] 反应体系：

[0095]

[0096] 将上述反应液混合后加入反应管中充分混匀，加入1μL的待测模板和1.25μL MgOAC，涡旋后简短离心，放于39℃水浴锅中，反应10min。反应结束后，取2μL反应液与100μL检测缓冲液于无菌的1.5mL离心管中充分混匀，将测流层析试纸条插入混合液中，即可观察反应结果。

[0097] 建立反应体系后，设置0min～45min时间梯度反应探索其最佳反应时间，发现反应5min即可产生肉眼可见的检测结果，为使反应更加稳定，设定10min为最佳反应时间。检测结果见图9所示。

[0098] (3)最佳反应温度的探索

[0099] 以10min为最佳反应时间，设置34℃～42℃反应温度梯度，发现其在34℃～42℃内均可发生反应，检测结果如图10所示，更加证明了本发明的反应是可以在常温下进行的。反应结果中39℃时检测线的红色较深，所以选择在39℃为最佳反应温度。

[0100] (4)检测的特异性

[0101] 以10min为最佳反应时间，39℃为最佳反应温度，检测本发明的反应的特异性，检测结果见图11所示，与PCR的检测结果相同，仅能检测出M.bovis标准株PG45以及野生株Ltb和WWM，不能检测出其余致病菌，证明其特异性良好。

[0102] (5)检测的敏感性

[0103] 在特异性良好的前提下，克隆LppA基因的目的片段，计算其拷贝数，并进行10倍梯度稀释，发现本发明的反应可检出的最低限度为3×101，检测结果见图12所示。

[0104] (6)检测的稳定性

[0105] 在探究了反应的特异性和敏感性后，需对反应的稳定性进行检测。故选择3×107、3×106、3×105三个不同浓度的阳性质粒标准品，在同一条件下重复三次，观察批内的重复效果，批内稳定性检测结果见图13所示；取上述3个不同浓度的阳性质粒标准品，在同一个实验中重复三次，观察批间的重复效果，批间稳定性实验结果见图14所示。

[0106] 建立方法后，对我区5个牧场53个临床样本进行检测，发现本发明的第三扩增体系的检出阳性样本22个，将临床样本用传统的分子生物学检测方法进行检测，发现检测结果与PCR检测结果的符合率为94％。

[0107] 实施例4

[0108] 本实施例为基于特异性基因LppA的第四扩增反应的体系，即exo-RPA。

[0109] 具体如下：

[0110] (1)本发明的检测体系的构建：

[0111] 第一检测体系：

[0112]

[0113]

[0114] 其中，Primer free Rehydration buffer为已知可商购产品。

[0115] 该基础混合物中含有反应所需的全部酶和试剂，只需在其中加入1μL模板和相应的寡核苷酸即可。在反应前需加入例如1.25μl浓度为280mM的醋酸镁(MgOAc)至混合物体系中启动反应。反应结果在恒温荧光扩增仪中进行，可实时检测反应。

[0116] 具体地，本实施例的第一寡核苷酸LppA F的序列与实施例1中的Lppa F:ACTCTTCAGAAATA ACAGACACTTCATC(SEQ ID No.5)相同。

[0117] 本实施例的第二寡核苷酸序列LppA R与实施例1中的Lppa R:GAGTTGTCTGCATTAGTTGCGTAATC(SEQ ID No.6)相同。

[0118] 本实施例的第三寡核苷酸序列LppA P如下所示：TACCTAGAGAAA TATTGGGTTTATATCCCTCA/i6FAMdT/T/idSp/A/iBHQ1dT/AGGAAGTACA ATTCTT(包含SEQ ID No.7，且在第33至34之间具有修改基团i6FAMdT/T/idSp/A/iBHQ1dT)。

[0119] 在一种示例性反应体系中，其包含：

[0120]

[0121] 将上述反应液混合后加入反应管中充分混匀，加入1μL的待测模板和1.25μL MgOAC，涡旋后简短离心，放入恒温荧光扩增仪中反应15min。即可连接电脑，实时观察反应结果。特异性由图15所示，仅可以扩增出牛支原体标准株PG45、野生株LTb和野生株WWM。

[0122] 本发明通过对特异性基因LppA的设计重组聚合扩增反应的特异性引物和探针，对最佳反应时间与最佳反应温度、检测的特异性、敏感性、重复性与稳定性均进行了探索，找到了最佳反应条件，建立的特异性好、敏感性高、且可以稳定重复的M.bovis快速检测方法。本发明所建立的检测M.bovis的方法操作简单，便捷省时，无需大型的实验仪器设备，非常适合没有任何实验基础的人员操作，是值得推广使用的。

[0123] 尽管已经参考示例性实施方案描述了本发明，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或改变。本发明的权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

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