一种小体鲟卵泡膜细胞系的体外构建方法及其所用试剂
阅读：241发布：2023-03-26
专利汇可以提供一种小体鲟卵泡膜细胞系的体外构建方法及其所用试剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种小体鲟卵泡膜细胞系的体外构建方法及其所用 试剂 。该方法包括：1)用消化液消化小体鲟卵巢组织，得到小体鲟卵巢组织细胞悬液；2)静置-离心法 收获 小体鲟卵泡膜细胞：将小体鲟卵巢组织细胞悬液进行静置，收集含有细胞及细胞团的上清液；将上清液进行离心，收集沉淀，向沉淀中加入培养液，制成细胞悬液接种培养，得到小体鲟卵泡膜细胞；3)二次消化进行传代培养：待小体鲟卵泡膜细胞长成 单层 后，用消化液进行两次消化后传代培养得到小体鲟卵泡膜细胞系。本发明利用静置-离心法和二次消化法建立了小体鲟卵泡膜细胞系，建立的细胞系可以连续传代，经过这种方法所获得的细胞可传60代以上，能在体外提供大量的卵泡膜细胞。，下面是一种小体鲟卵泡膜细胞系的体外构建方法及其所用试剂专利的具体信息内容。
1.体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)消化小体鲟卵巢组织：用消化液消化离体的小体鲟卵巢组织，得到经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液；
2)静置-离心法收获小体鲟卵泡膜细胞：将所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液进行静置，收集含有细胞及细胞团的上清液；将所述含有细胞及细胞团的上清液进行离心，收集沉淀，向所述沉淀中加入培养液，制成细胞悬液，将所述细胞悬液接种，在所述培养液中进行培养，得到小体鲟卵泡膜细胞；
3)二次消化进行传代培养：待步骤2)的小体鲟卵泡膜细胞长成单层后，用所述消化液进行两次消化后，传代在所述培养液中培养，得到小体鲟卵泡膜细胞系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述两次消化为待步骤2)的小体鲟卵泡膜细胞长成单层后，加入所述消化液消化1分钟后，吸去所述消化液，再加入所述消化液消化2分钟。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述培养液为培养基AB、培养基A、培养基B1或培养基B2；所述培养基AB是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质含有胎牛血清，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％；所述培养基A是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质由胎牛血清、青霉素和链霉素组成，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％、青霉素的含量为100IU/mL，链霉素的含量为100μg/mL；所述培养基B1是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质含有胎牛血清、2-巯基乙醇和碱性成纤维细胞生长因子，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％、2-巯基乙醇的含量为50mmol/L和碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL；所述培养基B2是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质由胎牛血清、2-巯基乙醇、青霉素和链霉素和碱性成纤维细胞生长因子组成，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％、2-巯基乙醇的含量为50mmol/L、青霉素的含量为100IU/mL，链霉素的含量为100μg/mL和碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL。
4.制备小体鲟卵泡膜细胞的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)消化小体鲟卵巢组织：用消化液消化离体的小体鲟卵巢组织，得到经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液；所述消化液为含有EDTA和胰蛋白酶的溶液；
2)静置-离心法收获小体鲟卵泡膜细胞：将所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液进行静置，收集含有细胞及细胞团的上清液；将所述含有细胞及细胞团的上清液进行离心，收集沉淀，向所述沉淀中加入培养液，制成细胞悬液，将所述细胞悬液接种，在所述培养液中进行培养，得到小体鲟卵泡膜细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述培养液为培养基AB、培养基A、培养基B1或培养基B2；所述培养基AB是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质含有胎牛血清，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％；所述培养基A是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质由胎牛血清、青霉素和链霉素组成，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％、青霉素的含量为100IU/mL，链霉素的含量为100μg/mL；所述培养基B1是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质含有胎牛血清、2-巯基乙醇和碱性成纤维细胞生长因子，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％、2-巯基乙醇的含量为50mmol/L和碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL；所述培养基B2是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质由胎牛血清、2-巯基乙醇、青霉素和链霉素和碱性成纤维细胞生长因子组成，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％、2-巯基乙醇的含量为50mmol/L、青霉素的含量为100IU/mL，链霉素的含量为100μg/mL和碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL。
6.用于获得原代培养的小体鲟卵泡膜细胞和/或用于获得小体鲟卵泡膜细胞系的成套试剂，所述成套试剂含有培养基和下述至少一种物质：MS222、乙醇水溶液、DMEM/F12、PBS溶液和消化液，所述培养基为权利要求3中所述培养基AB、权利要求3中所述培养基A、权利要求3中所述培养基B1或权利要求3中所述培养基B2。
7.权利要求6所述的成套试剂的下述一种用途：
U1、权利要求6所述的成套试剂在制备原代培养的小体鲟卵泡膜细胞中的应用，U2、权利要求6所述的成套试剂在制备离体的小体鲟卵泡膜细胞中的应用，U3、权利要求6所述的成套试剂在制备小体鲟卵泡膜细胞系中的应用。
8.培养基的下述一种用途：
P1、培养基在制备原代培养的小体鲟卵泡膜细胞中的应用，
U2、培养基在制备离体的小体鲟卵泡膜细胞中的应用，
U3、培养基在制备小体鲟卵泡膜细胞系中的应用；
P1-P3中，所述培养基为权利要求3中所述培养基AB、权利要求3中所述培养基A、权利要求3中所述培养基B1或权利要求3中所述培养基B2。
9.培养基在制备用于获得原代培养的小体鲟卵泡膜细胞和/或用于获得小体鲟卵泡膜细胞系的产品中的应用，所述培养基为权利要求3中所述培养基AB、权利要求3中所述培养基A、权利要求3中所述培养基B1或权利要求3中所述培养基B2。
10.由权利要求1-3中任一权利要求所述的方法构建的小体鲟卵泡膜细胞系，或由权利要求4或5所述的方法制备的小体鲟卵泡膜细胞。
一种小体鲟卵泡膜细胞系的体外构建方法及其所用试剂
技术领域
[0001] 本发明属于鱼类细胞培养技术领域，具体涉及一种古老鲟形目鱼类小体鲟(Acipenser ruthenus)卵泡膜细胞(Theca cell)系的体外构建方法及其所用试剂。
背景技术
[0002] 鲟鱼是一类古老的、有重要经济价值的、大型亚冷水鱼类，起源于2亿年前，有“水中活化石”之称。目前全世界的鲟鱼有27种。目前所有的鲟鱼都被列为《国际濒危动植物种贸易保护公约》附录二级保护动物。与此同时，由于其肉质鲜美，鱼子酱更有“卵黄金”的美誉，市场对鲟鱼卵、鱼肉等产品的需求却逐年增加。随着人工繁殖技术的不断改进，研究团队已经实现了养殖鲟鱼的周年人工繁殖。但是鲟鱼在人工养殖环境条件下，雌鱼性腺发育不整齐导致养殖效率降低依然困扰着养殖业主和研究人员。人工养殖鲟鱼性腺不能正常发育，往往由于环境条件不能够刺激调节性腺发育的内分泌激素正常分泌。脊椎动物促进性腺发育和繁殖主要是通过下丘脑-脑垂体-靶腺(性腺、肝脏)轴分泌的一系列内分泌激素来调控。而直接作用于性腺的主要是由脑垂体分泌的促性腺激素(Gonadotropin，GtH)，包括促卵泡激素(FSH)和促黄体激素(LH)。在鱼类脑垂体中也已分离出FSH和LH。LH促进卵泡膜细胞合成并分泌雄烯二酮和睾酮，后二者透过细胞膜转运至颗粒细胞，颗粒细胞内的芳香化酶将二者转化为雌二醇。因此卵巢膜细胞作为卵巢重要的内分泌细胞在性激素的合成过程中发挥了重要作用。研究膜细胞内的内分泌调控机制也具有重要的生物学意义。
[0003] 小体鲟卵泡膜细胞的体外培养对于研究性激素合成调控机制及卵母细胞与膜细胞相互作用具有重要的应用价值。卵泡膜细胞系还可广泛应用到病毒学、免疫学、基因组学、发育生物学及环境毒理学等研究领域。传统细胞培养方法并不适合小体鲟卵泡膜细胞系的建立，传统方法获得细胞数量少，细胞活性差，无法启动原代培养或者无法传代。鱼类卵巢组织细胞的体外培养一直是鱼类细胞培养中的难点，到目前为止鲟鱼卵泡膜细胞系未见报道。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的问题是如何体外构建小体鲟卵泡膜细胞系。
[0005] 为了解决以上技术问题，本发明提供了体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法。
[0006] 本发明所提供的体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法包括如下步骤：
[0007] 1)消化小体鲟卵巢组织：用消化液消化离体的小体鲟卵巢组织，得到经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液；2)静置-离心法收获小体鲟卵泡膜细胞：将所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液进行静置，收集含有细胞及细胞团的上清液；将所述含有细胞及细胞团的上清液进行离心，收集沉淀，向所述沉淀中加入培养液，制成细胞悬液，将所述细胞悬液接种，在所述培养液中进行培养，得到小体鲟卵泡膜细胞；
[0008] 3)二次消化进行传代培养：待步骤2)的小体鲟卵泡膜细胞长成单层后，用所述消化液进行两次消化后，传代在所述培养液中培养，得到小体鲟卵泡膜细胞系。
[0009] 上述体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法中，所述两次消化为待步骤2)的小体鲟卵泡膜细胞长成单层后，加入所述消化液消化1分钟后，吸去所述消化液，再加入所述消化液消化2分钟。
[0010] 上述体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法中，1)中用消化液消化离体的小体鲟卵巢组织可为用消化液消化离体的小体鲟卵巢组织20-25分钟。
[0011] 上述体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法中，所述培养液可为培养基AB、培养基A、培养基B1或培养基B2；所述培养基AB是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质含有胎牛血清，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％；所述培养基A是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质由胎牛血清、青霉素和链霉素组成，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％，青霉素的含量为100IU/mL，链霉素的含量为100μg/mL；所述培养基B1是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质含有胎牛血清、2-巯基乙醇和碱性成纤维细胞生长因子，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％、2-巯基乙醇的含量为50mmol/L和碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL；所述培养基B2是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质由胎牛血清、2-巯基乙醇、青霉素、链霉素和碱性成纤维细胞生长因子组成，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％、2-巯基乙醇的含量为
50mmol/L和碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL，青霉素的含量为100IU/mL，链霉素的含量为100μg/mL。
50mmol/L和碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL，青霉素的含量为100IU/mL，链霉素的含量为100μg/mL。
[0012] 上述体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法中，所述消化液可为含有EDTA和胰蛋白酶的溶液，如0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液。
[0013] 上述体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法中，3)中的所述传代培养可为培养至60代。
[0014] 上述体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法中，步骤2)中的培养和步骤3)中的培养均可在24℃进行。
[0015] 上述体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法中，所述离心可为1000rpm/min离心10分钟。
[0016] 上述体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法中，将所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液进行静置，收集含有细胞及细胞团的上清液可为将所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液进行静置至所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液分层，将漂浮在上清液上层的结缔组织吸出丢弃，使沉淀中的细胞、细胞团及未消化组织分散悬浮，再次静置至分层，收集上清液得到含有细胞及细胞团的上清液。
[0018] 为了解决以上技术问题，本发明提供了体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法。
[0019] 本发明所提供的制备小体鲟卵泡膜细胞的方法包括如下步骤：
[0020] 1)消化小体鲟卵巢组织：用消化液消化离体的小体鲟卵巢组织，得到经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液；
[0021] 2)静置-离心法收获小体鲟卵泡膜细胞：将所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液进行静置，收集含有细胞及细胞团的上清液；将所述含有细胞及细胞团的上清液进行离心，收集沉淀，向所述沉淀中加入培养液，制成细胞悬液，将所述细胞悬液接种，在所述培养液中进行培养，得到小体鲟卵泡膜细胞。
[0022] 上述制备小体鲟卵泡膜细胞的方法中，所述培养液可为培养基AB、培养基A、培养基B1或培养基B2；所述培养基AB是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质含有胎牛血清，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％；所述培养基A是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质由胎牛血清、青霉素和链霉素组成，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％，青霉素的含量为100IU/mL，链霉素的含量为100μg/mL；所述培养基B1是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质含有胎牛血清、2-巯基乙醇和碱性成纤维细胞生长因子，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％、2-巯基乙醇的含量为50mmol/L和碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL；所述培养基B2是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质由胎牛血清、2-巯基乙醇、青霉素、链霉素和碱性成纤维细胞生长因子组成，所述培养液中，胎牛血清的体积百分含量为15％、2-巯基乙醇的含量为50mmol/L和碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL，青霉素的含量为100IU/mL，链霉素的含量为100μg/mL。
[0023] 上述制备小体鲟卵泡膜细胞的方法中，1)中用消化液消化离体的小体鲟卵巢组织可为用消化液消化离体的小体鲟卵巢组织20-25分钟。
[0024] 上述制备小体鲟卵泡膜细胞的方法中，所述消化液可为含有EDTA和胰蛋白酶的溶液，如0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液。
[0025] 上述制备小体鲟卵泡膜细胞的方法中，步骤2)中的培养可在24℃进行。
[0026] 上述制备小体鲟卵泡膜细胞的方法中，所述离心可为1000rpm/min离心10分钟。
[0027] 上述制备小体鲟卵泡膜细胞的方法中，将所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液进行静置，收集含有细胞及细胞团的上清液可为将所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液进行静置至所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液分层，将漂浮在上清液上层的结缔组织吸出丢弃，使沉淀中的细胞、细胞团及未消化组织分散悬浮，再次静置至分层，收集上清液得到含有细胞及细胞团的上清液。
[0028] 上述制备小体鲟卵泡膜细胞的方法中，所述离体的小体鲟卵巢组织是将小体鲟卵巢组织在无血清DMEM/F12培养液中剪成1mm3的组织块。
[0029] 为了解决以上技术问题，本发明提供了用于获得原代培养的小体鲟卵泡膜细胞和/或用于获得小体鲟卵泡膜细胞系的成套试剂。
[0030] 本发明所提供的用于获得原代培养的小体鲟卵泡膜细胞和/或用于获得小体鲟卵泡膜细胞系的成套试剂含有培养基和下述至少一种物质：MS222、乙醇水溶液、DMEM/F12、PBS溶液和消化液，所述培养基可为上述培养基AB、上述培养基A、上述培养基B1或上述培养基B2。
[0031] 上述成套试剂中，培养基和MS222、乙醇水溶液、DMEM/F12、PBS溶液和消化液均可独立包装，分步使用。
[0032] 上述成套试剂中，所述消化液可为含有EDTA和胰蛋白酶的溶液，如0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液。
[0033] 上述成套试剂的下述一种用途也属于本发明的保护范围：
[0034] U1、上述成套试剂在制备原代培养的小体鲟卵泡膜细胞中的应用，
[0035] U2、上述成套试剂在制备离体的小体鲟卵泡膜细胞中的应用，
[0036] U3、上述成套试剂在制备小体鲟卵泡膜细胞系中的应用。
[0037] 培养基的下述一种用途也属于本发明的保护范围：
[0038] P1、培养基在制备原代培养的小体鲟卵泡膜细胞中的应用，
[0039] U2、培养基在制备离体的小体鲟卵泡膜细胞中的应用，
[0040] U3、培养基在制备小体鲟卵泡膜细胞系中的应用；
[0041] P1-P3中，所述培养基为上述培养基AB、上述培养基培养基A、上述培养基B1或上述培养基B2。
[0042] 下述用途也属于本发明的保护范围：培养基在制备用于获得原代培养的小体鲟卵泡膜细胞和/或用于获得小体鲟卵泡膜细胞系的产品中的应用，所述培养基为上述培养基AB、上述培养基培养基A、上述培养基B1或上述培养基B2。
[0043] 上述用途中，所述产品具体可为上述成套试剂或含有所述成套试剂的试剂盒。
[0044] 由上述体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的方法构建的小体鲟卵泡膜细胞系，或由上述制备小体鲟卵泡膜细胞的方法制备的小体鲟卵泡膜细胞也属于本发明的保护范围。
[0045] 本发明利用静置-离心法和二次消化法建立了小体鲟卵泡膜细胞系，建立的细胞系可以连续传代，经过这种方法所获得的细胞可传60代以上，能在体外提供大量的卵泡膜细胞。小体鲟卵泡膜细胞系可广泛用于外源基因、质粒的转染，性别相关基因功能的研究，也可用于鱼类常见病毒的繁殖及病毒与细胞相互作用机制的研究，还可以进行环境污染物检测等，为研究小体鲟性激素合成和卵巢发育调控机制提供基础。附图说明
[0046] 图1为小体鲟卵泡膜细胞原代及传代光镜照片。其中：A，原代小体鲟卵泡膜细胞长成单层；B，小体鲟卵泡膜细胞第45代；标尺＝100μm。
[0047] 图2为小体鲟卵泡膜细胞第60代，标尺＝100μm。
[0048] 图3为小体鲟卵泡膜细胞系标志基因鉴定。其中OV为小体鲟卵巢组织，OVC为小体鲟卵泡膜细胞系。
[0049] 图4为方法A和方法B的小体鲟卵泡膜细胞系的细胞周期流式细胞仪分析图。图中，A为方法A的小体鲟卵泡膜细胞系；B为方法B的小体鲟卵泡膜细胞系。
[0050] 图5为本发明实施例1和对比例1获得的原代小体鲟卵泡膜细胞贴壁显微照片。图中，A为本发明实施例1获得的原代小体鲟卵泡膜细胞贴壁显微照片；B为对比例1获得的原代小体鲟卵泡膜细胞贴壁显微照片，标尺＝100μm。
具体实施方式
[0051] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0052] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053] 下文中的DMEM/F12培养基为gibco公司产品，产品目录号为11330032；碱性成纤维细胞生长因子为gibco公司产品，产品目录号为PHG0261；胎牛血清为gibco公司产品，产品目录号为16000044；2-巯基乙醇为sigma公司产品，产品目录号为SHBc2724v；青链霉素混合液为gibco公司产品，产品目录号为15140122；0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液(Trypsin-EDTA(0.25％),phenol red)为gibco公司产品，产品目录号为25200056。
[0054] 下文中的15％FBS DMEM/F12完全培养液A是用于体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的培养基，它是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质为胎牛血清、青霉素和链霉素，15％FBS DMEM/F12完全培养液A中，胎牛血清的体积百分含量为15％、青霉素的含量为100IU/mL和链霉素的含量为100μg/mL。
[0055] 下文中的15％FBS DMEM/F12完全培养液B是用于体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的培养基，它是由溶质和溶剂组成的溶液，所述溶剂为DMEM/F12培养基，所述溶质为胎牛血清、2-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子、青霉素和链霉素，15％FBS DMEM/F12完全培养液B中，胎牛血清的体积百分含量为15％、2-巯基乙醇的含量为50mmol/L、碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL、青霉素的含量为100IU/mL和链霉素的含量为100μg/mL。
[0056] 15％FBS DMEM/F12完全培养液A和15％FBS DMEM/F12完全培养液B的区别仅在于15％FBS DMEM/F12完全培养液A不含有2-巯基乙醇和碱性成纤维细胞生长因子，15％FBS DMEM/F12完全培养液B含有2-巯基乙醇和碱性成纤维细胞生长因子。
[0057] 实施例1、体外构建小体鲟卵泡膜细胞系
[0058] 本实施例采用静置-离心和二次消化法体外构建小体鲟卵泡膜细胞系，具体如下：
[0059] 1.消化小体鲟卵巢组织：用含有EDTA的胰蛋白酶溶液消化离体的小体鲟卵巢组织，得到经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液。具体方法如下：
[0060] 1.1健康的体重1kg的小体鲟用MS222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)麻醉后在70％乙醇水溶液中消毒1分钟，无菌超净台中取下小体鲟的卵巢组织，剥离小体鲟的卵巢组织最外层膜，用眼科剪剔除附着在小体鲟卵巢组织上的脂肪，将小体鲟卵巢组织放入装有无血清DMEM/F12培养液的试管中，在无血清DMEM/F12培养液中将小体鲟卵巢组织剪成1mm3的小块，PBS冲洗3-5遍，PBS每次为40mL。
[0061] 1.2冲洗完成后将PBS全部吸出，加入2mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化，每隔5分钟用1mL的枪头反复吹打小体鲟卵巢组织块，消化20分钟，消化结束后，加入2mL 15％FBS DMEM/F12完全培养液A终止胰蛋白酶的消化作用，得到经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液。
[0062] 2.静置-离心法收获小体鲟卵泡膜细胞：将所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液进行静置，液体分层后收集含有细胞及细胞团的上清液；将所述含有细胞及细胞团的上清液进行离心，收集沉淀，向所述沉淀中加入培养液，制成细胞悬液，将所述细胞悬液进行接种培养，得到小体鲟卵泡膜细胞。具体方法如下：
[0063] 将装有上述1.2的经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液的试管室温静置5-10min,肉眼观察消化后的组织块分别漂至上层和沉淀到底部后，将漂浮在上清液上层的结缔组织吸出丢弃，接着用1mL移液器反复吹打管底部沉淀，使沉淀中的细胞、细胞团及未消化组织分散悬浮，再次静置试管，使质量较大的组织碎块再次沉淀，马上用1mL移液器将含有细胞及细胞团的上清液转入15mL离心管，1000rpm/min离心10分钟，去掉上清液。加入2mL
15％FBS DMEM/F12完全培养液A，用1mL枪头反复吹打悬浮细胞及细胞团，制成细胞悬液。将得到的细胞悬液平均接种到两个25cm2细胞培养瓶中，置于24℃生化培养箱进行培养。24小时后每个培养瓶补加15％FBS DMEM/F12完全培养液A 2mL，于生化培养箱中继续培养，4天后细胞长满单层(图1中A)，该细胞为原代小体鲟卵泡膜细胞。
15％FBS DMEM/F12完全培养液A，用1mL枪头反复吹打悬浮细胞及细胞团，制成细胞悬液。将得到的细胞悬液平均接种到两个25cm2细胞培养瓶中，置于24℃生化培养箱进行培养。24小时后每个培养瓶补加15％FBS DMEM/F12完全培养液A 2mL，于生化培养箱中继续培养，4天后细胞长满单层(图1中A)，该细胞为原代小体鲟卵泡膜细胞。
[0064] 3.二次消化进行传代培养：待步骤2的原代小体鲟卵泡膜细胞长成单层后，用含有EDTA的胰蛋白酶溶液进行两次消化传代培养，得到小体鲟卵泡膜细胞系。具体方法如下：
[0065] 将步骤2中长满单层的原代小体鲟卵泡膜细胞进行传代，传代时吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入0.8mL浓度为0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻晃动消化液后室温静置消化1分钟，吸去消化液，每培养瓶中再次加入1mL的0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻晃动消化液后静置消化2分钟，将消化液吸出，再次静置3分钟后向培养瓶中加入1mL的15％FBS DMEM/F12完全培养液A后用1mL移液器轻轻吹打培养瓶底制成细胞悬液；取出0.5mL细胞悬液加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加15％FBS DMEM/F12完全培养液A
2.5毫升，使之最终体积至3毫升，置于24℃生化培养箱进行培养。待细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养。细胞每3-4天长成单层传代一次。细胞传代培养至60代，得到小体鲟卵泡膜细胞系。
2.5毫升，使之最终体积至3毫升，置于24℃生化培养箱进行培养。待细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养。细胞每3-4天长成单层传代一次。细胞传代培养至60代，得到小体鲟卵泡膜细胞系。
[0066] 第45代小体鲟卵泡膜细胞(图1中B)和第60代的小体鲟卵泡膜细胞系(图2)为上皮样细胞，细胞均质透明，生长分裂旺盛。
[0067] 4.小体鲟卵泡膜细胞系的鉴定
[0068] 分别提取步骤3的小体鲟卵泡膜细胞系的总RNA和小体鲟卵巢组织的总RNA进行反转录PCR扩增如下卵巢发育调控基因，其中cyp11a1基因是卵泡膜细胞标志基因：cyp11a1基因，dazl基因、fox12基因、cyp19a1基因、erα基因和erβ基因，并以β-actin基因作为内参。结果表明步骤5的小体鲟卵泡膜细胞系和小体鲟卵巢组织中均有上述6中标志基因的表达(图3)，表明步骤3的小体鲟卵泡膜细胞系是来源于小体鲟卵巢组织的卵泡膜细胞。反转录PCR扩增引物及退火温度如表1。
[0069] 表1.反转录PCR扩增引物及退火温度
[0070]
[0071]
[0072] 实施例2、培养液对体外构建小体鲟卵泡膜细胞系的影响
[0073] 本实施例采用两种静置-离心和二次消化法体外构建小体鲟卵泡膜细胞系，分别为方法A和方法B。方法A和方法B的区别仅在于所用的培养液不同，其它操作完全相同。方法A用的培养液是15％FBS DMEM/F12完全培养液A，方法B用的培养液是15％FBS DMEM/F12完全培养液B。方法A和方法B具体如下：
[0074] 方法A同实施例1。
[0075] 方法B采用静置-离心和二次消化法体外构建小体鲟卵泡膜细胞系，具体如下：
[0076] 1.消化小体鲟卵巢组织：用含有EDTA的胰蛋白酶溶液消化离体的小体鲟卵巢组织，得到经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液。具体方法如下：
[0077] 1.1健康的体重1kg的小体鲟用MS222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)麻醉后在70％乙醇水溶液中消毒1分钟，无菌超净台中取下小体鲟的卵巢组织，剥离小体鲟的卵巢组织最外层膜，用眼科剪剔除附着在小体鲟卵巢组织上的脂肪，将小体鲟卵巢组织放入装有无血清DMEM/F12培养液的试管中，在无血清DMEM/F12培养液中将小体鲟卵巢组织剪成1mm3的小块，PBS冲洗3-5遍，PBS每次为40mL。
[0078] 1.2冲洗完成后将PBS全部吸出，加入2mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化，每隔5分钟用1mL的枪头反复吹打小体鲟卵巢组织块，消化20分钟，消化结束后，加入2mL 15％FBS DMEM/F12完全培养液B终止胰蛋白酶的消化作用，得到经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液。
[0079] 2.静置-离心法收获小体鲟卵泡膜细胞：将所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液进行静置，液体分层后收集含有细胞及细胞团的上清液；将所述含有细胞及细胞团的上清液进行离心，收集沉淀，向所述沉淀中加入培养液，制成细胞悬液，将所述细胞悬液进行接种培养，得到小体鲟卵泡膜细胞。具体方法如下：
[0080] 将装有上述1.2的经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液的试管室温静置5-10min,肉眼观察消化后的组织块分别漂至上层和沉淀到底部后，将漂浮在上清液上层的结缔组织吸出丢弃，接着用1mL移液器反复吹打管底部沉淀，使沉淀中的细胞、细胞团及未消化组织分散悬浮，再次静置试管，使质量较大的组织碎块再次沉淀，马上用1mL移液器将含有细胞及细胞团的上清液转入15mL离心管，1000rpm/min离心10分钟，去掉上清液。加入2mL
15％FBS DMEM/F12完全培养液B，用1mL枪头反复吹打悬浮细胞及细胞团，制成细胞悬液。将得到的细胞悬液平均接种到两个25cm2细胞培养瓶中，置于24℃生化培养箱进行培养。24小时后每个培养瓶补加15％FBS DMEM/F12完全培养液B 2mL，于生化培养箱中继续培养，4天后细胞长满单层(图1中A)，该细胞为原代小体鲟卵泡膜细胞。
15％FBS DMEM/F12完全培养液B，用1mL枪头反复吹打悬浮细胞及细胞团，制成细胞悬液。将得到的细胞悬液平均接种到两个25cm2细胞培养瓶中，置于24℃生化培养箱进行培养。24小时后每个培养瓶补加15％FBS DMEM/F12完全培养液B 2mL，于生化培养箱中继续培养，4天后细胞长满单层(图1中A)，该细胞为原代小体鲟卵泡膜细胞。
[0081] 3.二次消化进行传代培养：待步骤2的原代小体鲟卵泡膜细胞长成单层后，用含有EDTA的胰蛋白酶溶液进行两次消化传代培养，得到小体鲟卵泡膜细胞系。具体方法如下：
[0082] 将步骤2中长满单层的原代小体鲟卵泡膜细胞进行传代，传代时吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入0.8mL浓度为0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻晃动消化液后室温静置消化1分钟，吸去消化液，每培养瓶中再次加入1mL的0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻晃动消化液后静置消化2分钟，将消化液吸出，再次静置3分钟后向培养瓶中加入1mL的15％FBS DMEM/F12完全培养液B后用1mL移液器轻轻吹打培养瓶底制成细胞悬液；取出0.5mL细胞悬液加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加15％FBS DMEM/F12完全培养液B
2.5毫升，使之最终体积至3毫升，置于24℃生化培养箱进行培养。待细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养。细胞每3-4天长成单层传代一次。细胞传代培养至60代，得到小体鲟卵泡膜细胞系。
2.5毫升，使之最终体积至3毫升，置于24℃生化培养箱进行培养。待细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养。细胞每3-4天长成单层传代一次。细胞传代培养至60代，得到小体鲟卵泡膜细胞系。
[0083] 分别取方法A和方法B的小体鲟卵泡膜细胞系通过流式细胞仪检测其增殖分裂活性，结果表明传代相同时间后，方法A的小体鲟卵泡膜细胞系处于细胞周期G1期、M期和G2期的细胞数略高于方法B的小体鲟卵泡膜细胞系(图4)：方法A的小体鲟卵泡膜细胞系处于细胞周期G1期、M期和G2期的细胞数分别为71.0％和18.7％；方法B的小体鲟卵泡膜细胞系处于细胞周期G1期、M期和G2期的细胞数分别为67.4％和16.8％。
[0084] 说明方法A中的培养液(15％FBS DMEM/F12完全培养液A)虽然成分更简单，但是可以给卵泡膜细胞提供足够的营养使其正常的生长分裂。
[0085] 对比例1、过滤-离心法
[0086] 1.消化小体鲟卵巢组织：用含有EDTA的胰蛋白酶溶液消化离体的小体鲟卵巢组织，得到经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液。操作同实施例1的步骤1，具体方法如下：
[0087] 1.1健康的体重1kg的小体鲟用MS222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)麻醉后在70％乙醇水溶液中消毒1分钟，无菌超净台中取下小体鲟的卵巢组织，剥离小体鲟的卵巢组织最外层膜，用眼科剪剔除附着在小体鲟卵巢组织上的脂肪，将小体鲟卵巢组织放入装有无血清DMEM/F12培养液的试管中，在无血清DMEM/F12培养液中将小体鲟卵巢组织剪成1mm3的小块，PBS冲洗3-5遍，PBS每次为40mL。
[0088] 1.2冲洗完成后将PBS全部吸出，加入2mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化，每隔5分钟用1mL的枪头反复吹打小体鲟卵巢组织块，消化20分钟，消化结束后，加入2mL 15％FBS DMEM/F12完全培养液A终止胰蛋白酶的消化作用，得到经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液。
[0089] 2.过滤-离心法收获小体鲟卵泡膜细胞：
[0090] 具体方法如下：将上述步骤1.2的经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液用200目的尼龙筛网过滤后收集滤液，以2200r/min离心2min，将所得沉淀用1mL 15％FBS DMEM/F12完全培养液A悬浮后接种在25cm2培养瓶中，置于24℃生化培养箱进行培养。24小时后每个培养瓶补加15％FBS DMEM/F12完全培养液A 2mL，于生化培养箱中继续培养，21天后细胞长满单层，该细胞为原代小体鲟卵泡膜细胞。
[0091] 3.二次消化进行传代培养：待步骤2的原代小体鲟卵泡膜细胞长成单层后，用含有EDTA的胰蛋白酶溶液进行两次消化传代培养，得到小体鲟卵泡膜细胞系。操作同实施例1的步骤3，具体方法如下：
[0092] 将步骤2中长满单层的原代小体鲟卵泡膜细胞进行传代，传代时吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入0.8mL浓度为0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻晃动消化液后室温静置消化1分钟，吸去消化液，每培养瓶中再次加入1mL的0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻晃动消化液后静置消化2分钟，将消化液吸出，再次静置3分钟后向培养瓶中加入1mL的15％FBS DMEM/F12完全培养液A后用1mL移液器轻轻吹打培养瓶底制成细胞悬液；取出0.5mL细胞悬液加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加15％FBS DMEM/F12完全培养液A
2.5毫升，使之最终体积至3毫升，置于24℃生化培养箱进行培养。待细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养。细胞每21天长成单层传代一次。细胞传代培养至10代后停止生长无法继续传代，没有得到小体鲟卵泡膜细胞系。
2.5毫升，使之最终体积至3毫升，置于24℃生化培养箱进行培养。待细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养。细胞每21天长成单层传代一次。细胞传代培养至10代后停止生长无法继续传代，没有得到小体鲟卵泡膜细胞系。
[0093] 对比例1的方法与本发明实施例1的方法相比，对比例1的方法步骤更多，操作更复杂，用时更长，增加了染菌的机会，得到的能贴壁的活细胞少，长成原代细胞单层所需的时间是21天，而本发明实施例1的方法启动原代培养后4天细胞即长成单层。对比例1得到的原代小体鲟卵泡膜细胞经台盼兰染色后血球计数板计数为1.2×104个/mL，本发明实施例1获得的原代小体鲟卵泡膜细胞计数为2.5×105个/mL。细胞贴壁后如图5所示，A为本发明实施例1获得的原代小体鲟卵泡膜细胞贴壁显微照片；B为对比例1获得的原代小体鲟卵泡膜细胞贴壁显微照片，标尺＝100μm。
[0094] 对比例2、消化对小体鲟卵泡膜细胞传代的影响
[0095] 1.消化小体鲟卵巢组织：用含有EDTA的胰蛋白酶溶液消化离体的小体鲟卵巢组织，得到经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液。同实施例1的步骤1，具体方法如下：
[0096] 1.1健康的体重1kg的小体鲟用MS222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)麻醉后在70％乙醇水溶液中消毒1分钟，无菌超净台中取下小体鲟的卵巢组织，剥离小体鲟的卵巢组织最外层膜，用眼科剪剔除附着在小体鲟卵巢组织上的脂肪，将小体鲟卵巢组织放入装有无血清DMEM/F12培养液的试管中，在无血清DMEM/F12培养液中将小体鲟卵巢组织剪成1mm3的小块，PBS冲洗3-5遍，PBS每次为40mL。
[0097] 1.2冲洗完成后将PBS全部吸出，加入2mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化，每隔5分钟用1mL的枪头反复吹打小体鲟卵巢组织块，消化20分钟，消化结束后，加入2mL 15％FBS DMEM/F12完全培养液A终止胰蛋白酶的消化作用，得到经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液。
[0098] 2.静置-离心法收获小体鲟卵泡膜细胞：将所述经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液进行静置，液体分层后收集含有细胞及细胞团的上清液；将所述含有细胞及细胞团的上清液进行离心，收集沉淀，向所述沉淀中加入培养液，制成细胞悬液，将所述细胞悬液进行接种培养，得到小体鲟卵泡膜细胞。同实施例1的步骤2，具体方法如下：
[0099] 将装有上述1.2的经消化处理的小体鲟卵巢组织细胞悬液的试管室温静置5-10min,肉眼观察消化后的组织块分别漂至上层和沉淀到底部后，将漂浮在上清液上层的结缔组织吸出丢弃，接着用1mL移液器反复吹打管底部沉淀，使沉淀中的细胞、细胞团及未消化组织分散悬浮，再次静置试管，使质量较大的组织碎块再次沉淀，马上用1mL移液器将含有细胞及细胞团的上清液转入15mL离心管，1000rpm/min离心10分钟，去掉上清液。加入2mL
15％FBS DMEM/F12完全培养液A，用1mL枪头反复吹打悬浮细胞及细胞团，制成细胞悬液。将得到的细胞悬液平均接种到两个25cm2细胞培养瓶中，置于24℃生化培养箱进行培养。24小时后每个培养瓶补加15％FBS DMEM/F12完全培养液A 2mL，于生化培养箱中继续培养，4天后细胞长满单层(图1中A)，该细胞为原代小体鲟卵泡膜细胞。
15％FBS DMEM/F12完全培养液A，用1mL枪头反复吹打悬浮细胞及细胞团，制成细胞悬液。将得到的细胞悬液平均接种到两个25cm2细胞培养瓶中，置于24℃生化培养箱进行培养。24小时后每个培养瓶补加15％FBS DMEM/F12完全培养液A 2mL，于生化培养箱中继续培养，4天后细胞长满单层(图1中A)，该细胞为原代小体鲟卵泡膜细胞。
[0100] 3.一次消化进行传代培养
[0101] 将步骤2中长满单层的原代小体鲟卵泡膜细胞进行传代，传代时吸出培养瓶中的培养液，向每个培养瓶中加入0.8mL浓度为0.25％胰蛋白酶-EDTA消化液，轻轻晃动消化液后室温静置消化3分钟，吸去消化液，每培养瓶中加入1mL的15％FBS DMEM/F12完全培养液A后用1mL移液器轻轻吹打培养瓶底制成细胞悬液；取出0.5mL细胞悬液加入到新的培养瓶中，每个培养瓶补加15％FBS DMEM/F12完全培养液A 2.5毫升，使之最终体积至3毫升，置于24℃生化培养箱进行培养。待细胞再次长成单层后，仍以上述相同方法进行传代培养。细胞每3-4天长成单层传代一次。卵泡膜细胞传代培养至第8代后停止生长无法继续传代。
[0102] 可见，对比例2中的方法并不适合贴壁性非常强的卵泡膜细胞，消化液消化3分钟后细胞并未变圆，依然牢固贴于细胞瓶底，所以细胞不能被从瓶底吹打下来，下次传代时细胞更难被消化下来，几代以后细胞老龄化，活性变差，增殖分裂能力降低，新分裂出来的细胞数越来越少，最后细胞全部老龄化并死亡。
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