包含愈合子的组合物及其用途
阅读：555发布：2020-05-08
专利汇可以提供包含愈合子的组合物及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 一般涉及愈合子的药物组合物和制备及其用途。，下面是包含愈合子的组合物及其用途专利的具体信息内容。
1.一种合成的愈合子，其包含：
(i)遗传元件，其包含启动子元件和编码外源性效应子的核酸序列，以及蛋白质结合序列，其中所述遗传元件包含以下一种或两种：
(a)与表11的核酸序列的核苷酸323-393的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列具有至少85％序列同一性的序列，或
(b)与表11的核酸序列的核苷酸2868-2929的指环病毒GC富集区具有至少85％序列同一性的序列；
以及
(ii)蛋白质外部；其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；并且
其中所述合成的愈合子能够将所述遗传元件递送到真核细胞中。
2.如权利要求1所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件是单链的。
3.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件是DNA。
4.如权利要求3所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件是负链DNA。
5.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件以少于进入所述细胞的所述愈合子的10％、8％、6％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％的频率整合，例如，其中所述合成的愈合子是非整合的。
6.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包含表16-1中所示的共有5'UTR核酸序列的序列。
7.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包含表16-2中所示的共有GC富集区的序列。
8.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包含长度为至少
100个核苷酸的序列，所述序列的至少70％(例如，约70％-100％、75％-95％、80％-95％、
85％-95％、或85％-90％)位置由G或C组成。
9.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包含与表11的核酸序列的核苷酸1-393的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列具有至少85％序列同一性的序列和与表11的核酸序列的核苷酸2868-2929的指环病毒GC富集区具有至少85％序列同一性的序列。
10.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件与表11的核苷酸序列具有至少75％同一性。
11.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述启动子元件对于野生型指环病毒是外源性的。
12.如权利要求1-10中任一项所述的合成的愈合子，其中所述启动子元件对于野生型指环病毒是内源性的。
13.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述外源性效应子编码治疗剂，例如治疗性肽或多肽或治疗性核酸。
14.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述外源性效应子包含调节性核酸，例如，miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA；荧光标签或标记、抗原、肽、天然生物活性肽的合成或类似物肽、激动剂或拮抗剂肽、抗微生物肽、成孔肽、双环肽、靶向或细胞毒性肽、降解或自毁肽、小分子、免疫效应子(例如，影响对免疫反应/信号的敏感性)、死亡蛋白(例如，凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非裂解性抑制剂(例如，癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体激活剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶的竞争性抑制剂、蛋白质合成效应子或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体、抗体、受体或CRISPR系统或组分。
15.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述外源性效应子包含
miRNA，并减少宿主基因的表达。
16.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述外源性效应子包含长度为约20-200、30-180、40-160、50-140或60-120个核苷酸的核酸序列。
17.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中编码所述外源性效应子的核酸序列的长度为约20-200、30-180、40-160、50-140或60-120个核苷酸。
18.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中编码所述外源性效应子的序列位于以下项中的一个或多个处、之内或附近(例如，5’或3’)：ORF1基因座，例如在ORF1基因座的C末端，或聚A区下游的3'非编码区。
19.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中编码所述外源性效应子的序列位于所述遗传元件的聚A区和GC富集区之间。
20.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，所述合成的愈合子(例如在所述蛋白质外部中)包含选自表12的ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1、ORF1/1或ORF1/2的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列中一个或多个。
21.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中除所述效应子之外的所述遗传元件部分的组合大小为约2.5kb-5kb(例如，约2.8kb-4kb、约2.8kb-3.2kb、约3.6kb-
3.9kb或约2.8kb-2.9kb)、小于约5kb(例如，小于约2.9kb、3.2kb、3.6kb、3.9kb或4kb)或至少100个核苷酸(例如，至少1kb)。
22.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子不包含脂质双层。
23.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子能够感染哺乳动物细胞，例如人细胞，例如免疫细胞、肝细胞或肺上皮细胞。
24.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件能够复制，例如能够每个细胞产生至少102、2x 102、5x 102、103、2x 103、5x 103或104个基因组当量的遗传元件，例如通过定量PCR测定法测定。
25.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，所述合成的愈合子是基本上非致病性的，例如，在受试者中不诱导可检测到的有害症状(例如，相对于未暴露于所述愈合子的受试者，增加的细胞死亡或毒性)。
26.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，所述合成的愈合子是基本上非免疫原性的，例如不诱导可检测的和/或不想要的免疫反应，例如根据实例4中所述的方法检测到的。
27.如权利要求26所述的合成的愈合子，其中所述基本上非免疫原性的愈合子在受试者中具有缺乏免疫反应的参考受试者中效力的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、
70％、80％、90％、95％或100％的效力。
28.如权利要求26或27所述的合成的愈合子，其中所述免疫反应包括以下一种或多种：
对所述愈合子具有特异性的抗体；针对所述愈合子或包含所述愈合子的细胞的细胞反应(例如免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)反应)；或巨噬细胞对所述愈合子或包含所述愈合子的细胞的吞噬。
29.如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，其中至少1000个所述合成的愈合子的群体能够将所述遗传元件的至少100个拷贝递送到一个或多个所述真核细胞中。
30.一种合成的愈合子，其包含：
(i)遗传元件，其包含启动子元件和编码外源性效应子的核酸序列，以及蛋白质结合序列，其中所述遗传元件包含以下一种或两种：
(a)与表1、3、5、7、9或13的核酸序列的指环病毒5'UTR保守结构域具有至少85％序列同一性的序列；或
(b)与表1、3、5、7、9或13的核酸序列的指环病毒GC富集区具有至少85％序列同一性的序列；
以及
(ii)蛋白质外部；其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；并且
其中所述合成的愈合子能够将所述遗传元件递送到真核细胞中。
31.如权利要求30所述的合成的愈合子，所述合成的愈合子(例如在所述蛋白质外部中)包含选自表2、4、6、8、10或14中任一个的ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、ORF1、ORF1/1或ORF1/2的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列中一个或多个。
32.一种核酸分子，其包含启动子元件和编码外源性效应子的核酸序列以及蛋白质结合序列，其中所述遗传元件包含以下一种或两种：
(a)与表11的核酸序列的核苷酸323-393的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列具有至少85％序列同一性的序列，或
(b)与表11的核酸序列的核苷酸2868-2929的指环病毒GC富集区具有至少85％序列同一性的序列。
33.一种核酸分子，其包含启动子元件和编码外源性效应子的核酸序列以及蛋白质结合序列，其中所述遗传元件包含以下一种或两种：
(a)与表1、3、5、7或13的核酸序列的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列具有至少
85％序列同一性的序列，或
(b)与表1、3、5、7或13的核酸序列的指环病毒GC富集区具有至少85％序列同一性的序列。
34.一种药物组合物，其包含如以上权利要求中任一项所述的合成的愈合子，以及药学上可接受的运载体或赋形剂。
3 4 5 6 7 8 9
35.如权利要求34所述的药物组合物，其包含至少10、10、10、10、10、10或10 个合成的愈合子。
36.一种反应混合物，其包含如权利要求1-31中任一项所述的合成的愈合子和编码选自表12的ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1、ORF1/1或ORF1/2的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列中一个或多个的第二核酸序列。
37.一种反应混合物，其包含如权利要求1-31中任一项所述的合成的愈合子和编码选自表2、4、6、8、10或14中任一个的ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、ORF1、ORF1/1或ORF1/2的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列中一个或多个的第二核酸序列。
38.如权利要求36或37所述的反应混合物，其中所述第二核酸序列是所述遗传元件的一部分。
39.如权利要求36或37所述的反应混合物，其中所述第二核酸序列不是所述遗传元件的一部分，例如，所述第二核酸序列包含在辅助细胞或辅助病毒中。
40.如权利要求1-31中任一项所述的合成的愈合子或如权利要求34-35中任一项所述的药物组合物用于将所述遗传元件递送到宿主细胞中的用途。
41.如权利要求1-31中任一项所述的合成的愈合子或如权利要求34-35中任一项所述的药物组合物用于治疗受试者疾病或障碍的用途。
42.如权利要求41所述的用途，其中所述疾病或障碍选自免疫障碍、干扰素病(例如I型干扰素病)、感染性疾病、炎性障碍、自身免疫病、癌症(例如实体瘤，例如肺癌)和胃肠道障碍。
43.如权利要求1-31中任一项所述的合成的愈合子或如权利要求34-35中任一项所述的药物组合物，其用于治疗受试者的疾病或障碍。
44.一种治疗受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-31中任一项所述的合成的愈合子或如权利要求34-35中任一项所述的药物组合物，其中所述疾病或障碍选自免疫障碍、干扰素病(例如I型干扰素病)、感染性疾病、炎性障碍、自身免疫病、癌症(例如实体瘤，例如肺癌)和胃肠道障碍。
45.一种制备合成的愈合子组合物的方法，所述方法包括：
a)提供多个如权利要求1-31所述的合成的愈合子，或如权利要求34-35中任一项所述组合物或药物组合物；
b)任选地对所述多个合成的愈合子评估以下一种或多种：本文所述的污染物、光密度测量值(例如OD260)、颗粒数(例如通过HPLC)、感染性(例如颗粒:感染单位比)；以及c)例如，如果(b)的一种或多种参数满足指定的阈值，则将所述多个合成的愈合子例如配制为适于施用于受试者的药物组合物。
包含愈合子的组合物及其用途
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2017年6月13日提交的美国序列号62/518,898，2017年12月11日提交的美国序列号62/597,387和2018年5月25日提交的美国序列号62/676,730的优先权，其中每一个都通过引用整体并入文中。
[0004] 本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用整体并入文中。所述ASCII副本创建于2018年6月13日，名为V2057-7000WO_SL.txt，大小为1,066,292字节。
背景技术
[0006] 本发明提供了一种可以用作例如用于将治疗剂递送至真核细胞的递送媒介物的愈合子(CURON)，例如合成的愈合子。在一些实施例中，愈合子包括包含包封在蛋白质外部中的遗传元件的颗粒，其能够将遗传元件引入细胞(例如人细胞)中。在一些情况下，遗传元件包含有效负载，例如，其编码在细胞中表达的外源性效应子(例如，核酸效应子，例如非编码RNA，或多肽效应子，例如蛋白质)。例如，愈合子可以通过接触细胞并将编码外源性效应子的遗传元件引入细胞中而将外源性效应子递送到细胞中，从而外源性效应子由细胞产生或表达。在一些情况下，外源性效应子可以调节细胞的功能或调节细胞中靶分子的活性或水平。例如，外源性效应子可以降低癌细胞的存活力(例如，如实例22中所述)或降低细胞中靶蛋白例如干扰素的水平(例如，如实例3和4中所述)。在另一个实例中，外源性效应子可以是由细胞表达的蛋白质(例如，如实例9中所述)。
[0007] 与野生型病毒相比，合成的愈合子具有至少一种结构差异，例如相对于野生型病毒的缺失、插入、置换、酶促修饰。通常，合成的愈合子包括封闭在蛋白质外部内的外源性遗传元件，所述蛋白质外部可用作基本非免疫原性媒介物用以将遗传元件，或其中编码的效应子(例如，外源性效应子或内源性效应子)(例如，多肽或核酸效应子)递送到真核细胞中。愈合子可例如通过将治疗剂递送至所需细胞或组织而用于疾病和障碍的治疗。本发明的合成的愈合子的遗传元件可以是环状单链DNA分子，并且通常包括与蛋白质外部结合的蛋白质结合序列或附接于其上的多肽，其可以促进遗传元件封闭在蛋白质外部内和/或遗传元件相对于其他核酸在蛋白质外部内富集。
[0008] 在一个方面，本发明的特征在于一种合成的愈合子，其包含：(i)遗传元件，其包含启动子元件，编码外源性效应子(例如，有效负载)的序列和蛋白质结合序列(例如，外部蛋白质结合序列，例如包装信号)。在一些实施例中，遗传元件是单链DNA。可替代地或组合地，遗传元件具有以下一种或两种性质：呈环状和/或以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合到真核细胞的基因组中；和(ii)蛋白质外部。在一些实施例中，遗传元件被包封在蛋白质外部内。在一些实施例中，合成的愈合子能够将遗传元件递送到真核细胞中。
[0009] 在一个方面，本发明的特征在于一种合成的愈合子，其包含：(i)遗传元件，其包含启动子元件和编码外源性效应子(例如，有效负载)的序列，以及蛋白质结合序列(例如，外部蛋白质结合序列)；以及(ii)蛋白质外部；其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；且其中合成的愈合子能够将遗传元件递送到真核细胞中。在一些实施例中，遗传元件包含与野生型指环病毒序列(例如，野生型细环病毒(TTV)、细小环病毒(TTMV)或TTMDV序列，例如，表1、3、5、7、9、11或13中任一个列出的野生型指环病毒序列)具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99或100％)序列同一性的核酸序列(例如，300-4000个核苷酸的核酸序列，例如300-3500个核苷酸、300-3000个核苷酸、300-2500个核苷酸、300-2000个核苷酸、300-1500个核苷酸)。
在一些实施例中，遗传元件包含与野生型指环病毒序列(例如，野生型细环病毒(TTV)、细小环病毒(TTMV)或TTMDV序列，例如，表1、3、5、7、9、11或13中任一个列出的野生型指环病毒序列)具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99或100％)序列同一性的核酸序列(例如，至少300个核苷酸、
500个核苷酸、1000个核苷酸、1500个核苷酸、2000个核苷酸、2500个核苷酸、3000个核苷酸或更多的核酸序列)。
在一些实施例中，遗传元件包含与野生型指环病毒序列(例如，野生型细环病毒(TTV)、细小环病毒(TTMV)或TTMDV序列，例如，表1、3、5、7、9、11或13中任一个列出的野生型指环病毒序列)具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99或100％)序列同一性的核酸序列(例如，至少300个核苷酸、
500个核苷酸、1000个核苷酸、1500个核苷酸、2000个核苷酸、2500个核苷酸、3000个核苷酸或更多的核酸序列)。
[0010] 在一方面，本发明的特征在于一种治疗受试者的疾病或障碍的方法，该方法包括向受试者施用例如本文所述的愈合子，例如合成的愈合子。在一些实施例中，该愈合子包括：(i)遗传元件，其包含启动子元件和编码效应子(例如有效负载)的序列以及外部蛋白质结合序列。在一些实施例中，遗传元件是单链DNA，并且其中遗传元件是环状的和/或以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合；以及(ii)蛋白质外部；其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；并且其中愈合子能够将遗传元件递送到真核细胞中。
[0011] 在一个方面，本发明的特征在于一种将有效负载递送到细胞、组织或受试者的方法，该方法包括向受试者施用例如本文所述的愈合子，例如合成的愈合子，其中该愈合子包含编码有效负载的核酸序列。在一些实施例中，该愈合子包括：(i)遗传元件，其包含启动子元件和编码效应子(例如有效负载)的序列以及外部蛋白质结合序列。在一些实施例中，遗传元件是单链DNA，并且其中遗传元件是环状的和/或以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合；以及(ii)蛋白质外部；其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；并且其中愈合子能够将遗传元件递送到真核细胞中。在实施例中，有效负载是核酸。在实施例中，有效负载是蛋白质。
[0013] 在一方面，本发明的特征在于一种药物组合物，其包含本文所述的愈合子(例如合成的愈合子)。在实施例中，药物组合物还包含药学上可接受的运载体或赋形剂。在实施例中，药物组合物包含以下剂量，所述剂量包含包含约105-1014基因组当量的愈合子/千克。
[0014] 在一方面，本发明的特征在于一种核酸分子，其包含遗传元件，该遗传元件含有启动子元件和编码效应子(例如有效负载)的序列以及外部蛋白质结合序列。在实施例中，遗传元件是单链DNA，并且其中遗传元件是环状的和/或以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合。在实施例中，效应子不是源自TTV，并且不是SV40-miR-S1。在实施例中，核酸分子不包含TTMV-LY的多核苷酸序列。在实施例中，启动子元件能够指导效应子在真核细胞中的表达。
[0015] 在一方面，本发明的特征在于一种遗传元件，其包含以下中的一个、两个或三个：(i)启动子元件和编码效应子例如有效负载的序列；其中所述效应子相对于野生型指环病毒序列是外源的；(ii)与野生型指环病毒序列具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、
78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的至少72个连续核苷酸(例如，至少72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100或150个核苷酸)；或与野生型指环病毒序列具有至少72％(例如，至少72、73、74、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的至少100(例如，至少300、500、1000、1500)个连续核苷酸；以及(iii)蛋白质结合序列，例如外部蛋白质结合序列，其中核酸构建体是单链DNA；并且其中核酸构建体是环状的和/或以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、
1％、1.5％或2％的频率整合。
78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的至少72个连续核苷酸(例如，至少72、73、74、75、76、77、78、79、80、90、100或150个核苷酸)；或与野生型指环病毒序列具有至少72％(例如，至少72、73、74、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的至少100(例如，至少300、500、1000、1500)个连续核苷酸；以及(iii)蛋白质结合序列，例如外部蛋白质结合序列，其中核酸构建体是单链DNA；并且其中核酸构建体是环状的和/或以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、
1％、1.5％或2％的频率整合。
[0016] 在一个方面，本发明的特征在于一种制造合成的愈合子的组合物的方法，其包括：
[0017] a)提供宿主细胞，其包含例如表达例如本文所述的愈合子(例如合成的愈合子)的一种或多种组分(例如，所有组分)；
[0018] b)从宿主细胞产生愈合子的制剂，其中所述制剂的合成的愈合子包含蛋白质外部和遗传元件，所述遗传元件包含启动子元件，编码外源性效应子(例如有效负载)的序列和蛋白质结合序列(例如，外部蛋白质结合序列，例如包装信号)，从而制备合成的愈合子的制剂；以及
[0019] c)将合成的愈合子的制剂配制为例如适于向受试者施用的药物组合物。
[0020] 在一个方面，本发明的特征在于一种制造合成的愈合子的组合物的方法，其包括：a)提供多个本文所述的合成的愈合子或本文所述的药物组合物；以及b)将合成的愈合子配制为例如作为适于向受试者施用的药物组合物。
[0021] 在一方面，本发明的特征在于一种制备包含合成的愈合子的宿主细胞的方法，所述宿主细胞例如第一宿主细胞或生产者细胞(例如，如图12所示)，例如第一宿主细胞的群体，所述方法包括将例如本文所述的遗传元件引入宿主细胞中并在适合于生产合成的愈合子的条件下培养宿主细胞。在实施例中，所述方法进一步包括将辅助物例如辅助病毒引入宿主细胞中。在实施例中，引入包括用合成的愈合子对宿主细胞进行转染(例如化学转染)或电穿孔。
[0022] 在一方面，本发明的特征在于一种制备合成的愈合子的方法，其包括提供包含例如本文所述的合成的愈合子的宿主细胞，例如第一宿主细胞或生产者细胞(例如，如图12所示)，并从宿主细胞中纯化愈合子。在一些实施例中，所述方法进一步包括，在提供步骤之前，使宿主细胞与例如本文所述的合成的愈合子接触，并且在适合于生产合成的愈合子的条件下温育宿主细胞。在实施例中，宿主细胞是在上述制备宿主细胞的方法中描述的第一宿主细胞或生产者细胞。在实施例中，从宿主细胞中纯化愈合子包括裂解宿主细胞。
[0023] 在一些实施例中，所述方法进一步包括第二步骤，所述步骤使由第一宿主细胞或生产者细胞产生的合成的愈合子与第二宿主细胞，例如允许细胞(例如，如图12所示)，例如第二宿主细胞群体接触。在一些实施例中，所述方法进一步包括在适合于生产合成的愈合子的条件下温育第二宿主细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括从第二宿主细胞中纯化合成的愈合子，例如从而产生愈合子种子群体。在实施例中，与第一宿主细胞群体相比，第二宿主细胞群体产生至少约2-100倍更多的合成的愈合子。在实施例中，从第二宿主细胞中纯化愈合子包括裂解第二宿主细胞。
[0024] 在一些实施例中，所述方法进一步包括第二步骤，所述步骤使第二宿主细胞产生的合成的愈合子与第三宿主细胞，例如允许细胞(例如，如图12所示)，例如第三宿主细胞群体接触。在一些实施例中，所述方法进一步包括在适合于生产合成的愈合子的条件下温育第三宿主细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括从第三宿主细胞中纯化合成的愈合子，例如从而产生愈合子储备群体。在实施例中，从第三宿主细胞中纯化愈合子包括裂解第三宿主细胞。在实施例中，与第二宿主细胞群体相比，第三宿主细胞群体产生至少约2-100倍更多的合成的愈合子。
[0025] 在一些实施例中，所述方法进一步包括针对一种或多种质量控制参数，例如纯度、滴度、效价(例如，以基因组当量/愈合子颗粒)、和/或核酸序列(例如，来自合成的愈合子所包含的遗传元件)，评估来自愈合子种子群体或愈合子储备群体的一种或多种合成的愈合子。在一些实施例中，所评估的核酸序列包含编码外源性效应子的核酸序列。
[0026] 在一方面，所述方法包括针对一种或多种质量控制参数，例如纯度、滴度、效价、和/或核酸序列(例如，来自合成的愈合子所包含的遗传元件)，评估例如来自愈合子种子群体或愈合子储备群体的一种或多种合成的愈合子。在一些实施例中，所评估的核酸序列包含编码外源性效应子的核酸序列。
[0027] 在一方面，本发明的特征在于一种反应混合物，其包含本文所述的合成的愈合子和辅助病毒，其中所述辅助病毒包含多核苷酸，例如编码外部蛋白质的多核苷酸(例如，能够结合外部蛋白质结合序列和任选的脂质包膜的外部蛋白质)，编码复制蛋白(例如聚合酶)的多核苷酸或其任何组合。
[0028] 在一些实施例中，分离愈合子(例如，合成的愈合子)，例如从宿主细胞中分离和/或从溶液(例如，上清液)中的其他成分中分离。在一些实施例中，例如从溶液(例如上清液)中纯化愈合子(例如，合成的愈合子)。在一些实施例中，相对于溶液中的其他成分，富集溶液中的愈合子。
[0029] 在任何前述愈合子、组合物或方法的一些实施例中，遗传元件包含最小愈合子基因组，例如，根据实例9中所述的方法鉴定。在一些实施例中，最小愈合子基因组包含对于愈合子(例如，在宿主细胞中)的复制足够的最小指环病毒基因组。在实施例中，最小愈合子基因组包含TTV-tth8核酸序列，例如表5中所示的TTV-tth8核酸序列，所述最小愈合子基因组具有TTV-tth8核酸序列的核苷酸3436-3707的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的缺失。在实施例中，最小愈合子基因组包含TTMV-LY2核酸序列，例如表11中所示的TTMV-LY2核酸序列，所述最小愈合子基因组具有TTMV-LY2核酸序列的核苷酸574-1371、1432-2210、574-2210和/或2610-2809的至少10％、20％、30％、
40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的缺失。在实施例中，最小愈合子基因组是能够自我复制和/或自我扩增的最小愈合子基因组。在实施例中，最小愈合子基因组是能够在辅助物例如辅助病毒的存在下复制或扩增的最小愈合子基因组。
40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的缺失。在实施例中，最小愈合子基因组是能够自我复制和/或自我扩增的最小愈合子基因组。在实施例中，最小愈合子基因组是能够在辅助物例如辅助病毒的存在下复制或扩增的最小愈合子基因组。
[0030] 任何前述愈合子、组合物或方法的附加特征包括以下列举的实施例中的一个或多个。
[0031] 本领域技术人员将认知到、或不使用过度常规实验就能够确定本案所述发明的特定实施例的许多等效实例。此类等效实施例意在由以下列举的实施例涵盖。
[0032] 列举的实施例
[0033] 1.一种合成的愈合子，其包含：
[0034] (i)遗传元件，其包含启动子元件，编码外源性效应子(例如有效负载)的核酸序列(例如DNA序列)和蛋白质结合序列(例如外部蛋白质结合序列，例如包装信号)，其中所述遗传元件是单链DNA，并具有以下一种或两种性质：呈环状和/或以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合到真核细胞的基因组中；以及
[0035] (ii)蛋白质外部；
[0036] 其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；并且
[0037] 其中所述合成的愈合子能够将所述遗传元件递送到真核细胞中。
[0038] 2.一种合成的愈合子，其包含：
[0039] (i)遗传元件，其包含启动子元件和编码外源性效应子(例如有效负载)的核酸序列(例如DNA序列)和蛋白质结合序列(例如外部蛋白质结合序列)，
[0040] 其中所述遗传元件与野生型指环病毒序列(例如，野生型细环病毒(TTV)、细小环病毒(TTMV)或TTMDV序列，例如野生型指环病毒序列，例如表1、3、5、7、9、11或13中任一个所列)具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性；以及
[0041] (ii)蛋白质外部；
[0042] 其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；并且
[0043] 其中所述合成的愈合子能够将所述遗传元件递送到真核细胞中。
[0044] 3.一种合成的愈合子，其包含：
[0045] (i)遗传元件，其包含启动子元件和编码效应子(例如，外源性效应子或内源性效应子，例如内源性miRNA)的核酸序列(例如，DNA序列)，和蛋白质结合序列(例如，外部蛋白质结合序列)，
[0046] 其中所述遗传元件与野生型指环病毒序列(例如，野生型细环病毒(TTV)、细小环病毒(TTMV)或TTMDV序列，例如野生型指环病毒序列，例如表1、3、5、7、9、11或13中任一个所列)具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性；以及
[0047] 其中所述遗传元件不是天然存在的序列(例如，相对于野生型指环病毒序列包含缺失、置换或插入(例如，野生型细环病毒(TTV)、细小环病毒(TTMV)或TTMDV序列，例如野生型指环病毒序列，例如表1、3、5、7、9、11或13中任一个所列)；
[0048] (ii)蛋白质外部；
[0049] 其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；并且
[0050] 其中所述合成的愈合子能够将所述遗传元件递送到真核细胞中。
[0051] 4.一种合成的愈合子，其包含：
[0052] (i)遗传元件，其包含启动子元件和编码外源性效应子(例如有效负载)的核酸序列(例如DNA序列)和蛋白质结合序列(例如外部蛋白质结合序列)，
[0053] 其中蛋白质结合序列与表16-1中所示的共有5'UTR序列，或与表16-2中所示的共有GC富集序列，或与表16-1中所示的共有5'UTR序列和表16-2中所示的共有GC富集序列具有至少75％(例如至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性；以及
94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性；以及
[0054] (ii)蛋白质外部；
[0055] 其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；并且
[0056] 其中所述合成的愈合子能够将所述遗传元件递送到真核细胞中。
[0057] 5.一种合成的愈合子，其包含：
[0058] (i)遗传元件，其包含启动子元件和编码外源性效应子的核酸序列，以及蛋白质结合序列，其中所述遗传元件包含以下一种或两种：
[0059] (a)与表11的核酸序列的核苷酸323-393的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列具有至少85％序列同一性的序列，或
[0060] (b)与表11的核酸序列的核苷酸2868-2929的指环病毒GC富集区具有至少85％序列同一性的序列；
[0061] 以及
[0062] (ii)蛋白质外部；其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；并且
[0063] 其中所述合成的愈合子能够将所述遗传元件递送到真核细胞中。
[0064] 6.一种合成的愈合子，其包含：
[0065] (i)遗传元件，其包含启动子元件和编码外源性效应子的核酸序列，以及蛋白质结合序列，其中所述遗传元件包含以下一种或两种：
[0066] (a)与表1、3、5、7、9或13的核酸序列的指环病毒5'UTR保守结构域具有至少85％序列同一性的序列；或
[0067] (b)与表1、3、5、7、9或13的核酸序列的指环病毒GC富集区具有至少85％序列同一性的序列；
[0068] 以及
[0069] (ii)蛋白质外部；其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；并且
[0070] 其中所述合成的愈合子能够将所述遗传元件递送到真核细胞中。
[0071] 7.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述启动子元件包括RNA聚合酶II依赖性启动子、RNA聚合酶III依赖性启动子、PGK启动子、CMV启动子、EF-1α启动子、SV40启动子、CAGG启动子或UBC启动子、TTV病毒启动子、组织特异性U6(pollIII)、具有激活蛋白(TetR-VP16、Gal4-VP16、dCas9-VP16等)的上游DNA结合位点的最小CMV启动子。
[0072] 8.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述启动子元件包含TATA盒。
[0073] 9.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述启动子元件对于野生型指环病毒，例如表1、3、5、6、9、11或13中任一个所列的野生型指环病毒序列是内源性的。
[0074] 10.如实施例1-8中任一项所述的合成的愈合子，其中所述启动子元件对于野生型指环病毒是外源性的。
[0075] 11.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述外源性效应子编码治疗剂，例如治疗性肽或多肽或治疗性核酸。
[0076] 12.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述外源性效应子包含调节性核酸，例如，miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA；荧光标签或标记、抗原、肽、天然生物活性肽的合成或类似物肽、激动剂或拮抗剂肽、抗微生物肽、成孔肽、双环肽、靶向或细胞毒性肽、降解或自毁肽、小分子、免疫效应子(例如，影响对免疫反应/信号的敏感性)、死亡蛋白(例如，凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非裂解性抑制剂(例如，癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体激活剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶的竞争性抑制剂、蛋白质合成效应子或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体、抗体、受体或CRISPR系统或组分。
[0077] 13.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述外源性效应子包含miRNA。
[0078] 14.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述效应子例如miRNA靶向宿主基因，例如调节基因的表达，例如增加或减少基因的表达。
[0079] 15.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述外源性效应子包含miRNA，并减少宿主基因的表达。
[0080] 16.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述外源性效应子包含长度为约20-200、30-180、40-160、50-140或60-120个核苷酸的核酸序列。
[0081] 17.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中编码所述外源性效应子的核酸序列的长度为约20-200、30-180、40-160、50-140或60-120个核苷酸。
[0082] 18.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中编码所述外源性效应子的序列的大小为至少约100个核苷酸。
[0083] 19.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中编码所述外源性效应子的序列的大小为约100至约5000个核苷酸。
[0084] 20.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中编码所述外源性效应子的序列的大小为约100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-
900、900-1000、1000-1500或1500-2000个核苷酸。
900、900-1000、1000-1500或1500-2000个核苷酸。
[0085] 21.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中编码所述外源性效应子的序列位于ORF1基因座(例如，ORF1基因座的C末端)、miRNA基因座、TATA盒上游的5'非编码区、5'UTR、聚A区下游的3'非编码区、或所述遗传元件的GC富集区上游的非编码区中一个或多个处、之内或附近(例如，5’或3’)。
[0086] 22.如实施例21所述的合成的愈合子，其中编码所述外源性效应子的序列位于所述遗传元件的聚A区和GC富集区之间。
[0087] 23.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，所述合成的愈合子(例如在蛋白质外部中)包含选自表12的ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1、ORF1/1或ORF1/2的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列中一个或多个。
[0088] 24.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，所述合成的愈合子(例如在蛋白质外部中)包含选自表2、4、6、8、10或14中任一个的ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、ORF1、ORF1/1或ORF1/2的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列中一个或多个。
[0089] 25.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述蛋白质结合序列包含与野生型指环病毒(例如表1、3、5、6、9、11、13、A或B中任一个所列的野生型指环病毒序列)的5'UTR保守结构域或GC富集结构域具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、
79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的核酸序列。
79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的核酸序列。
[0090] 26.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-1中所示的共有5'UTR核酸序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0091] 27.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-1中所示的示例性TTV 5’UTR核酸序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0092] 28.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-1中所示的TTV-CT30F 5’UTR核酸序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0093] 29.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-1中所示的TTV-HD23a 5’UTR核酸序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0094] 30.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-1中所示的TTV-JA20 5’UTR核酸序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0095] 31.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-1中所示的TTV-TJN02 5’UTR核酸序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0096] 32.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-1中所示的TTV-tth8 5’UTR核酸序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0097] 33.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-2中所示的共有GC富集区具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0098] 34.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-2中所示的示例性TTV GC富集区具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0099] 35.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-2中所示的TTV-CT30F GC富集区具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0100] 36.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-2中所示的TTV-HD23a GC富集区具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0101] 37.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-2中所示的TTV-JA20 GC富集区具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0102] 38.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-2中所示的TTV-TJN02 GC富集区具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0103] 39.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件(例如所述遗传元件的蛋白质结合序列)与表16-2中所示的TTV-tth8 GC富集区具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性。
[0104] 40.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述蛋白质结合序列的至少60％(例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)由G或C组成。
[0105] 41.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包含长度为至少80、90、100、110、120、130或140个核苷酸的序列，所述序列的至少70％(例如，至少
70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)或约70％-100％、75％-
95％、80％-95％、85％-95％、或85％-90％位置由G或C组成。
70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)或约70％-100％、75％-
95％、80％-95％、85％-95％、或85％-90％位置由G或C组成。
[0106] 42.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包含与表11的核酸序列的核苷酸1-393的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列具有至少85％序列同
一性的序列和与表11的核酸序列的核苷酸2868-2929的指环病毒GC富集区具有至少85％序列同一性的序列。
一性的序列和与表11的核酸序列的核苷酸2868-2929的指环病毒GC富集区具有至少85％序列同一性的序列。
[0107] 43.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述蛋白质结合序列能够结合外部蛋白质，例如衣壳蛋白，例如指环病毒衣壳蛋白，例如包含与表1-14、16或18中列出的任一序列具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白。
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白。
[0108] 44.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件与表11的核苷酸序列具有至少75％同一性。
[0109] 45.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述蛋白质结合序列结合所述蛋白质外部的精氨酸富集区。
[0110] 46.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述蛋白质外部包含能够与蛋白质结合序列特异性结合的外部蛋白质。
[0111] 47.如实施例46所述的合成的愈合子，其中所述外部蛋白质包含衣壳蛋白，例如指环病毒衣壳蛋白，例如包含与表1-14、16或18中任一个列出的任一序列或由表1-14、15、17或19中列出的任一序列编码的氨基酸序列或其片段具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列的衣壳蛋白。
[0112] 48.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述蛋白质外部包含以下一种或多种：一个或多个糖基化蛋白、亲水性DNA结合区、精氨酸富集区、苏氨酸富集区、谷氨酰胺富集区、N端聚精氨酸序列、可变区、C端聚谷氨酰胺/谷氨酸序列、以及一个或多个二硫键。
[0113] 49.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述蛋白质外部包含以下一种或多种特征：二十面体对称、识别和/或结合与一个或多个宿主细胞分子相互作用以介导进入宿主细胞的分子、缺乏脂质分子、缺乏碳水化合物、pH和温度稳定、耐洗涤剂、以及在宿主中基本上是非免疫原性的或基本上是非致病性的。
[0114] 50.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述蛋白质外部包含至少一个提供一个或多个功能的功能结构域，所述功能是例如，物种和/或组织和/或细胞选择性、遗传元件结合和/或包装、免疫逃逸(基本上非免疫原性的和/或耐受性)、药代动力学、内吞作用和/或细胞附着、核进入、细胞内调节和定位、胞吐作用调节、繁殖和核酸保护。
[0115] 51.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中除所述效应子之外的遗传元件部分的组合大小为约2.5kb-5kb(例如，约2.8kb-4kb、约2.8kb-3.2kb、约3.6kb-3.9kb或约2.8kb-2.9kb)、小于约5kb(例如，小于约2.9kb、3.2kb、3.6kb、3.9kb或4kb)或至少100个核苷酸(例如，至少1kb)。
[0116] 52.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件是单链的。
[0117] 53.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件是环状的。
[0118] 54.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件是DNA。
[0119] 55.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件是负链DNA。
[0120] 56.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包括附加体。
[0121] 57.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子的脂质含量按重量计小于10％、5％、2％或1％，例如不包含脂质双层。
[0123] 59.如实施例58所述的合成的愈合子，其中至少约50％(例如，至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％)的合成的愈合子在
37℃下与洗涤剂(例如，按重量计0.5％的洗涤剂)温育30分钟后不会被降解。
37℃下与洗涤剂(例如，按重量计0.5％的洗涤剂)温育30分钟后不会被降解。
[0124] 60.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件与野生型圆环病毒序列或野生型指环病毒序列(例如，野生型细环病毒(TTV)、细小环病毒(TTMV)或
TTMDV序列，例如表1、3、5、7、9、11或13中任一个所列的序列)具有至少75％(例如，至少
75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％)序列同一性。
TTMDV序列，例如表1、3、5、7、9、11或13中任一个所列的序列)具有至少75％(例如，至少
75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％)序列同一性。
[0125] 61.如实施例60所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包括相对于野生型指环病毒序列，例如野生型TTV序列或野生型TTMV序列的至少一个元件的缺失，例如表1、3、5、7、
9、11或13中任一个所列的元件。
9、11或13中任一个所列的元件。
[0126] 62.如实施例61所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包含缺失，所述缺失包含对应于TTV-tth8序列的核苷酸3436-3607的核酸序列，例如表5中所示的核酸序列。
[0127] 63.如实施例61所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包含缺失，所述缺失包含对应于TTMV-LY2序列的核苷酸574-1371和/或核苷酸1432-2210的核酸序列，例如表11中所示的核酸序列。
[0128] 64.如实施例61或62所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包含缺失，所述缺失包含对应于TTMV-LY2序列的核苷酸1372-1431的核酸序列，例如表11中所示的核酸序列。
[0129] 65.如实施例61、63或64所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包含缺失，所述缺失包含对应于TTMV-LY2序列的核苷酸2610-2809的核酸序列，例如表11中所示的核酸序列。
[0130] 66.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件包括野生型指环病毒序列(例如，野生型细环病毒(TTV)、细小环病毒(TTMV)或TTMDV序列，例如表1、3、
5、7、9、11或13中任一个所列的序列)的至少72个核苷酸(例如至少73、74、75等个核苷酸，任选地小于基因组的全长)。
5、7、9、11或13中任一个所列的序列)的至少72个核苷酸(例如至少73、74、75等个核苷酸，任选地小于基因组的全长)。
[0131] 67.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件进一步包括以下序列中的一个或多个：编码一个或多个miRNA的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂序列的序列、调节性序列(例如启动子、增强子)、编码一个或多个靶向内源基因的调节性序列(siRNA、lncRNA、shRNA)的序列、编码治疗性mRNA或蛋白质的序列以及编码细胞溶解/细胞毒性RNA或蛋白质的序列。
[0132] 68.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子进一步包括第二遗传元件，例如封闭在所述蛋白质外部内的第二遗传元件。
[0133] 69.如实施例68所述的合成的愈合子，其中所述第二遗传元件包含蛋白质结合序列，例如外部蛋白质结合序列，例如包装信号，例如5’UTR保守结构域或GC富集区，例如本文所述。
[0134] 70.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子不能可检测地感染细菌细胞，例如感染少于1％、0.5％、0.1％或0.01％的细菌细胞。
[0135] 71.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子能够例如在体外感染哺乳动物细胞，例如人细胞，例如免疫细胞、肝细胞、上皮细胞。
[0136] 72.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件以少于进入细胞的愈合子的10％、8％、6％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％的频率整合，例如，其中所述合成的愈合子是非整合的。
[0137] 73.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件能够复制，例如能够每个细胞产生至少102、2x 102、5x 102、103、2x 103、5x 103或104个基因组当量的遗传元件，例如通过定量PCR测定法测定。
[0138] 74.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件能够复制，例如与将所述遗传元件递送到细胞中之前的合成的愈合子中所存在量相比，能够在所述细胞中多产生至少102、2x 102、5x 102、103、2x 103、5x 103或104个基因组当量的遗传元件，例如通过定量PCR测定法测定。
[0139] 75.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件不能够复制，例如其中所述遗传元件在复制起点发生改变或缺乏复制起点。
[0140] 76.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述遗传元件不能够自我复制，例如在不整合到宿主细胞基因组中的情况下不能够复制。
[0141] 77.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子基本上是非致病性的，例如，在受试者中不诱导可检测到的有害症状(例如，相对于未暴露于愈合子的受试者，增加的细胞死亡或毒性)。
[0142] 78.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子基本上是非免疫原性的，例如不诱导可检测的和/或不想要的免疫反应，例如根据实例4中所述的方法检测到的。
[0143] 79.如实施例78所述的合成的愈合子，其中所述基本上非免疫原性的愈合子在受试者中具有缺乏免疫反应的参考受试者中效力的至少约10％、20％、30％、40％、50％、
60％、70％、80％、90％、95％或100％的效力。
60％、70％、80％、90％、95％或100％的效力。
[0144] 80.如实施例78或79所述的合成的愈合子，其中所述免疫反应包括以下一种或多种：对愈合子具有特异性的抗体；针对所述愈合子或包含所述愈合子的细胞的细胞反应(例如免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)反应)；或巨噬细胞对所述愈合子或包含所述愈合子的细胞的吞噬。
[0145] 81.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子的免疫原性低于AAV，例如如通过文中所述的测定法测定的引发的免疫反应低于同等量的AAV所检测到的免疫反应，如通过文中所述的测定法测定的诱导的抗体流行率小于70％(例如小于约60％、50％、40％、30％、20％或10％抗体流行率)，或者基本上是非免疫原性的。
[0146] 82.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中至少1000个所述合成的愈合子的群体能够将所述遗传元件的至少100个拷贝递送到一个或多个真核细胞中。
[0147] 83.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子的群体能够将遗传元件递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、
99％或更多的真核细胞群体中。
99％或更多的真核细胞群体中。
[0148] 84.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子的群体能够将所述遗传元件的至少1、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、8,000、1x
104、1x 105、1x 106、1x 107或更多个拷贝/细胞递送到真核细胞群体中。
104、1x 105、1x 106、1x 107或更多个拷贝/细胞递送到真核细胞群体中。
[0149] 85.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子的群体能够将所述遗传元件的1x 104-1x 105、1x 104-1x 106、1x 104-1x 107、1x 105-1x 106、1x
105-1x 107或1x 106-1x 107个拷贝/细胞递送到真核细胞群体中。
105-1x 107或1x 106-1x 107个拷贝/细胞递送到真核细胞群体中。
[0150] 86.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子在至少两次传代后而存在。
[0151] 87.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子是通过包括至少两次传代的方法而产生的。
[0152] 88.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子将所述外源性效应子选择性地递送至所需细胞类型、组织或器官(例如，视网膜中的感光体、上皮衬里或胰腺)。
[0153] 89.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子对胚胎肾细胞系(例如，HEK293T)显示出比肺上皮癌细胞系(例如，A549)更大的体外选择性。
[0154] 90.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子在所需器官或组织中以相对于其他器官或组织更高的水平存在(例如，优先积累在其中)。
[0155] 91.如实施例90所述的合成的愈合子，其中所述所需器官或组织包括骨髓、血液、心脏、胃肠道或皮肤。
[0156] 92.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。
[0157] 93.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中所述合成的愈合子或其拷贝在递送到细胞中后24小时(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、30天或1个月)可在细胞中检测到。
[0158] 94.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，其中例如相对于感染细胞所用的合成的愈合子的量，在感染后3-4天后，例如，使用感染性测定法，例如根据实例7的测定法，所述合成的愈合子在细胞沉淀和上清液中以至少约108倍(例如，约105倍、106倍、107倍、
8 9 10
10倍、10倍或10 倍)基因组当量/mL产生。
8 9 10
10倍、10倍或10 倍)基因组当量/mL产生。
[0159] 95.一种组合物，其包括如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子。
[0160] 96.一种药物组合物，其包括如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，以及药学上可接受的运载体或赋形剂。
[0161] 97.如实施例95或96所述的组合物或药物组合物，其包括至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多愈合子，例如合成的愈合子。
[0162] 98.如实施例95-97中任一项所述的组合物或药物组合物，其包括至少103、104、105、106、107、108或109个合成的愈合子。
[0163] 99.一种药物组合物，其包括：
[0164] a)至少103、104、105、106、107、108或109个愈合子(例如，本文所述的合成的愈合子)，其包括：
[0165] (i)本文所述的遗传元件，例如包含启动子元件、编码外源性效应子(例如有效负载)的核酸序列(例如DNA序列)和蛋白质结合序列(例如外部蛋白质结合序列，例如包装信号)的遗传元件，其中所述遗传元件是单链DNA，并具有以下一种或两种性质：呈环状和/或以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合到真核细胞的基因组中；以及
[0166] (ii)蛋白质外部，
[0167] 其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；以及
[0168] 其中所述合成的愈合子能够将所述遗传元件递送到真核细胞中；
[0169] b)药物赋形剂，以及任选地，
[0170] c)少于预定量的：支原体、内毒素、宿主细胞核酸(例如，宿主细胞DNA和/或宿主细胞RNA)、动物来源的过程杂质(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、具有复制能力的因子(RCA)，例如具有复制能力的病毒或不需要的愈合子、游离病毒衣壳蛋白、外源因子和/或聚集体。
[0171] 100.一种药物组合物，其包括：
[0172] a)至少103、104、105、106、107、108或109个愈合子(例如，本文所述的合成的愈合子)，其包括：
[0173] (i)本文所述的遗传元件，例如包含启动子元件和编码外源性效应子(例如有效负载)的核酸序列(例如DNA序列)、以及蛋白质结合序列(例如外部蛋白质结合序列)的遗传元件，
[0174] 其中所述遗传元件与野生型指环病毒序列(例如，野生型细环病毒(TTV)、细小环病毒(TTMV)或TTMDV序列，例如野生型指环病毒序列，例如表1、3、5、7、9、11或13中任一个所列)具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性；以及
[0175] (ii)蛋白质外部；
[0176] 其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；以及
[0177] 其中所述合成的愈合子能够将所述遗传元件递送到真核细胞中
[0178] b)药物赋形剂，以及任选地，
[0179] c)少于预定量的：支原体、内毒素、宿主细胞核酸(例如，宿主细胞DNA和/或宿主细胞RNA)、动物来源的过程杂质(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、具有复制能力的因子(RCA)，例如具有复制能力的病毒或不需要的愈合子、游离病毒衣壳蛋白、外源因子和/或聚集体。
[0180] 101.如实施例95-100中任一项所述的组合物或药物组合物，其具有以下一种或多种特征：
[0181] a)所述药物组合物满足药物或良好生产规范(GMP)标准；
[0182] b)所述药物组合物是根据良好生产规范(GMP)制成的；
[0183] c)所述药物组合物具有低于预定参考值的病原体水平，例如基本上不含病原体；
[0184] d)所述药物组合物具有低于预定参考值的污染物水平，例如，基本上不含污染物；
[0185] e)所述药物组合物具有预定水平的非感染性颗粒或预定比例的颗粒:感染性单位(例如，<300:1、<200:1、<100:1或<50:1)，或
[0186] f)所述药物组合物具有低免疫原性或基本上是非免疫原性的，例如，如本文所述。
[0187] 102.如实施例95-101中任一项所述的组合物或药物组合物，其中所述药物组合物具有低于预定参考值的污染物水平，例如，基本上不含污染物。
[0188] 103.如实施例102所述的组合物或药物组合物，其中所述污染物选自由以下组成的组：支原体、内毒素、宿主细胞核酸(例如，宿主细胞DNA和/或宿主细胞RNA)、动物来源的过程杂质(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、具有复制能力的因子(RCA)，例如具有复制能力的病毒或不需要的愈合子(例如，除所需的愈合子例如本文所述的合成的愈合子以外的愈合子)、游离病毒衣壳蛋白、外源因子和聚集体。
[0189] 104.如实施例103所述的组合物或药物组合物，其中所述污染物是宿主细胞DNA，并且阈值量是约500ng宿主细胞DNA/所述剂量药物组合物。
[0190] 105.如实施例95-104中任一项所述的组合物或药物组合物，其中所述药物组合物包含按重量计小于10％(例如小于约10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％)的污染物。
[0191] 106.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子、组合物或药物组合物用于治疗受试者的疾病或障碍的用途。
[0192] 107.如实施例106所述的用途，其中所述疾病或障碍选自免疫障碍、干扰素病(例如I型干扰素病)、感染性疾病、炎性障碍、自身免疫病、癌症(例如实体瘤，例如肺癌)和胃肠道障碍。
[0193] 108.如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子、组合物或药物组合物，其用于治疗受试者的疾病或障碍。
[0194] 109.一种治疗受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向受试者施用如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子或如实施例95-105中任一项所述的药物组合物。
[0195] 110.如实施例109所述的方法，其中所述疾病或障碍选自免疫障碍、干扰素病(例如I型干扰素病)、感染性疾病、炎性障碍、自身免疫病、癌症(例如实体瘤，例如肺癌)和胃肠道障碍。
[0196] 111.一种调节例如增强受试者的生物学功能的方法，所述方法包括向所述受试者施用如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子或如实施例95-105中任一项所述的药物组合物。
[0197] 112.一种治疗受试者的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用愈合子，例如合成的愈合子，其包括：
[0198] (i)遗传元件，其包含启动子元件和编码效应子(例如有效负载)的序列以及外部蛋白质结合序列；
[0199] 其中所述遗传元件是单链DNA，并且其中所述遗传元件呈环状和/或以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合；以及
[0200] (ii)蛋白质外部；
[0201] 其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；以及
[0202] 其中所述愈合子，例如合成的愈合子，能够将所述遗传元件递送到真核细胞中。
[0203] 113.如实施例112所述的方法，其中所述疾病或障碍选自免疫障碍、干扰素病(例如I型干扰素病)、感染性疾病、炎性障碍、自身免疫病、癌症(例如实体瘤，例如肺癌)和胃肠道障碍。
[0204] 114.如实施例109-113中任一项所述的方法，其中所述效应子不是SV40-miR-S1，例如其中所述效应子是编码蛋白质的有效负载。
[0205] 115.如实施例109-114中任一项所述的方法，其中所述愈合子不包括外源性效应子。
[0206] 116.如实施例109-115中任一项所述的方法，其中所述愈合子包括野生型圆环病毒或野生型指环病毒，例如TTV或TTMV。
[0207] 117.如实施例109-116中任一项所述的方法，其中施用所述愈合子例如合成的愈合子导致将所述遗传元件递送到所述受试者中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、
70％、80％、90％、95％、99％或更多的靶细胞群体中。
70％、80％、90％、95％、99％或更多的靶细胞群体中。
[0208] 118.如实施例109-117中任一项所述的方法，其中施用所述愈合子例如合成的愈合子导致将所述外源性效应子递送到所述受试者中至少10％、20％、30％、40％、50％、
60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多的靶细胞群体中。
60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多的靶细胞群体中。
[0209] 119.如实施例117或118所述的方法，其中所述靶细胞包括例如体外的哺乳动物细胞，例如人细胞，例如免疫细胞、肝细胞、肺上皮细胞。
[0210] 120.如实施例117-119中任一项所述的方法，其中所述靶细胞存在于肝或肺中。
[0211] 121.如实施例117-120中任一项所述的方法，其中所述遗传元件被递送到其中的靶细胞各自接受所述遗传元件的至少10、50、100、500、1000、10,000、50,000、100,000或更多个拷贝。
[0212] 122.如实施例109-121中任一项所述的方法，其中所述效应子包含miRNA，并且其中所述miRNA降低(例如所述愈合子被递送到其中的)细胞或细胞群体中靶蛋白或RNA的水平例如至少10％、20％、30％、40％或50％。
[0213] 123.一种向细胞递送合成的愈合子的方法，其包括使如前述实施例中任一个所述的合成的愈合子与细胞，例如真核细胞，例如哺乳动物细胞接触。
[0214] 124.如实施例123所述的方法，其进一步包括使辅助病毒与所述细胞接触，其中所述辅助病毒包含多核苷酸，例如编码外部蛋白质例如能够结合所述外部蛋白质结合序列的外部蛋白质和任选的脂质包膜的多核苷酸。
[0215] 125.如实施例124所述的方法，其中使所述辅助病毒在所述合成的愈合子与所述细胞接触之前、同时或之后与所述细胞接触。
[0216] 126.如实施例123所述的方法，其进一步包括使辅助多核苷酸与所述细胞接触。
[0217] 127.如实施例126所述的方法，其中所述辅助多核苷酸包含编码外部蛋白质例如能够结合所述外部蛋白质结合序列的外部蛋白质和脂质包膜的序列多核苷酸。
[0218] 128.如实施例126所述的方法，其中所述辅助多核苷酸是RNA(例如，mRNA)、DNA、质粒、病毒多核苷酸或其任何组合。
[0219] 129.如实施例126-128中任一项所述的方法，其中使所述辅助多核苷酸在所述合成的愈合子与所述细胞接触之前、同时或之后与所述细胞接触。
[0220] 130.如实施例123-129中任一项所述的方法，其进一步包括使辅助蛋白与所述细胞接触。
[0221] 131.如实施例130所述的方法，其中所述辅助蛋白包括病毒复制蛋白或衣壳蛋白。
[0222] 132.一种宿主细胞，其包括如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子。
[0223] 133.一种核酸分子，其包括启动子元件、编码效应子(例如有效负载)的序列和外部蛋白质结合序列，
[0224] 其中所述核酸分子是单链DNA，并且其中所述核酸分子呈环状和/或以少于进入细胞的核酸分子的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合；
[0225] 其中所述效应子不是源自TTV，并且不是SV40-miR-S1；
[0226] 其中所述核酸分子不包含TTMV-LY的多核苷酸序列；
[0227] 其中所述启动子元件能够指导效应子在真核细胞中的表达。
[0228] 134.一种核酸分子，其包含启动子元件和编码外源性效应子的核酸序列以及蛋白质结合序列，其中所述遗传元件包含以下一种或两种：
[0229] (a)与表11的核酸序列的核苷酸323-393的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列具有至少85％序列同一性的序列，或
[0230] (b)与表11的核酸序列的核苷酸2868-2929的指环病毒GC富集区具有至少85％序列同一性的序列。
[0231] 135.一种核酸分子，其包含启动子元件和编码外源性效应子的核酸序列以及蛋白质结合序列，其中所述遗传元件包含以下一种或两种：
[0232] (a)与表1、3、5、7、9或13的核酸序列的指环病毒5'UTR保守结构域具有至少85％序列同一性的序列；或
[0233] (b)与表1、3、5、7、9或13的核酸序列的指环病毒GC富集区具有至少85％序列同一性的序列。
[0234] 136.一种遗传元件，其包含：
[0235] (i)启动子元件和编码效应子例如有效负载的序列，其中所述效应子相对于野生型指环病毒序列是外源的；
[0236] (ii)与野生型指环病毒序列具有至少75％序列同一性的至少72个连续核苷酸(例如，至少72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、90个、100个或150个核苷酸)；
或与野生型指环病毒序列具有至少72％(例如，至少72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99或100％)序列同一性的至少100个连续核苷酸；以及
或与野生型指环病毒序列具有至少72％(例如，至少72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99或100％)序列同一性的至少100个连续核苷酸；以及
[0237] (iii)蛋白质结合序列，例如外部蛋白质结合序列，以及
[0238] 其中所述核酸构建体是单链DNA；以及
[0239] 其中所述核酸构建体呈环状和/或以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合；
[0240] 137.一种制备合成的愈合子组合物的方法，所述方法包括：
[0241] a)提供宿主细胞，其包含编码合成的愈合子(例如文中所述的合成的愈合子)的组分的一个或多个核酸分子，其中所述合成的愈合子包含蛋白质外部和遗传元件，例如，包含启动子元件、编码外源性效应子(例如有效负载)的序列和蛋白质结合序列(例如外部蛋白质结合序列，例如包装信号)的遗传元件；
[0242] b)从所述宿主细胞产生合成的愈合子，从而制备合成的愈合子；以及
[0243] c)将所述合成的愈合子配制为例如适于向受试者施用的药物组合物。
[0244] 138.一种制备合成的愈合子组合物的方法，所述方法包括：
[0245] a)提供多个如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子，或如实施例95-105中任一项所述的组合物或药物组合物；
[0246] b)任选地对所述多个合成的愈合子评估以下一种或多种：本文所述的污染物、光密度测量值(例如OD260)、颗粒数(例如通过HPLC)、感染性(例如颗粒:感染单位比)；以及[0247] c)例如，如果(b)的一种或多种参数满足指定的阈值，则将所述多个合成的愈合子例如配制为适于施用于受试者的药物组合物。
[0248] 139.如实施例138所述的方法，其中所述合成的愈合子的组合物包含至少105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个合成的愈合子。
[0249] 140.如实施例138或139所述的方法，其中所述合成的愈合子的组合物包含至少10ml、20ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1L、2L、5L、10L、20L或50L。
[0250] 141.一种反应混合物，所述反应混合物包含如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子和辅助病毒，其中所述辅助病毒包含多核苷酸，例如编码外部蛋白质例如能够结合所述外部蛋白质结合序列的外部蛋白质和任选的脂质包膜的多核苷酸。
[0251] 142.一种反应混合物，所述反应混合物包含如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子和编码选自表12的ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF1、ORF1/1或ORF1/2的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列中一个或多个的第二核酸序列。
[0252] 143.一种反应混合物，所述反应混合物包含如前述实施例中任一项所述的合成的愈合子和编码选自表2、4、6、8、10或14中任一个的ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、ORF1、ORF1/1或ORF1/2的氨基酸序列或与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列中一个或多个的第二核酸序列。
[0253] 144.如实施例142或143所述的反应混合物，其中所述第二核酸序列是所述遗传元件的一部分。
[0254] 145.如实施例144所述的反应混合物，其中所述第二核酸序列不是所述遗传元件的一部分，例如，所述第二核酸序列包含在辅助细胞或辅助病毒中。
[0255] 146.一种合成的愈合子，其包含：
[0256] 遗传元件，其包含(i)编码非致病性外部蛋白质的序列，(ii)使所述遗传元件与所述非致病性外部蛋白质结合的外部蛋白质结合序列，和(iii)编码效应子例如调节性核酸的序列；以及
[0257] 与所述遗传元件相关联(例如包封或封闭所述遗传元件)的蛋白质外部。
[0258] 147.一种药物组合物，其包括：
[0259] a)愈合子，其包含：
[0260] 遗传元件，其包含(i)编码非致病性外部蛋白质的序列，(ii)使所述遗传元件与所述非致病性外部蛋白质结合的外部蛋白质结合序列，和(iii)编码效应子例如调节性核酸的序列；以及
[0261] 与所述遗传元件相关联(例如包封或封闭所述遗传元件)的蛋白质外部；以及
[0262] b)药物赋形剂。
[0263] 148.一种药物组合物，其包括：
[0264] a)至少103、104、105、106、107、108或109个愈合子(例如，本文所述的合成的愈合子)，其包括：
[0265] 遗传元件，其包含(i)编码非致病性外部蛋白质的序列，(ii)使所述遗传元件与所述非致病性外部蛋白质结合的外部蛋白质结合序列，和(iii)编码效应子例如调节性核酸的序列；以及
[0266] 与所述遗传元件相关联(例如包封或封闭所述遗传元件)的蛋白质外部；
[0267] b)药物赋形剂，以及任选地，
[0268] c)少于预定量的：支原体、内毒素、宿主细胞核酸(例如，宿主细胞DNA和/或宿主细胞RNA)、动物来源的过程杂质(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、具有复制能力的因子(RCA)，例如具有复制能力的病毒或不需要的愈合子、游离病毒衣壳蛋白、外源因子和/或聚集体。
[0269] 149.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，所述愈合子或组合物进一步包括以下特征中的至少一个：所述遗传元件是单链DNA；所述遗传元件呈环状；所述愈合子是非整合的；所述愈合子具有基于指环病毒或其他非致病性病毒的序列、结构和/或功能，并且所述愈合子是非致病性的。
[0270] 150.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述蛋白质外部包含非致病性外部蛋白质。
[0271] 151.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述蛋白质外部包含以下一种或多种：一个或多个糖基化蛋白、亲水性DNA结合区、精氨酸富集区、苏氨酸富集区、谷氨酰胺富集区、N端聚精氨酸序列、可变区、C端聚谷氨酰胺/谷氨酸序列、以及一个或多个二硫键。
[0272] 152.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述蛋白质外部包含以下一种或多种特征：二十面体对称、识别和/或结合与一个或多个宿主细胞分子相互作用以介导进入宿主细胞的分子、缺乏脂质分子、缺乏碳水化合物、pH和温度稳定、耐洗涤剂、以及在宿主中是非免疫原性的或是非致病性的。
[0273] 153.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中编码所述非致病性外部蛋白质的序列包含与表15中所列的一个或多个序列或其片段具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。
[0274] 154.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述非致病性外部蛋白质包含与表16或表17中所列的一个或多个序列或其片段具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。
[0275] 155.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述非致病性外部蛋白质包含至少一个提供一个或多个功能的功能结构域，所述功能是例如物种和/或组织和/或细胞嗜性、病毒基因组结合和/或包装、免疫逃逸(非免疫原性和/或耐受性)、药代动力学、内吞作用和/或细胞附着、核进入、细胞内调节和定位、胞吐作用调节、繁殖和核酸保护。
[0276] 156.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述效应子包含调节性核酸，例如，miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA；治疗剂，例如荧光标签或标记、抗原、肽治疗剂、天然生物活性肽的合成或类似物肽、激动剂或拮抗剂肽、抗微生物肽、成孔肽、双环肽、靶向或细胞毒性肽、降解或自毁肽、以及多种降解或自毁肽、小分子、免疫效应子(例如，影响对免疫反应/信号的敏感性)、死亡蛋白(例如，凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非裂解性抑制剂(例如，癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体激活剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶的竞争性抑制剂、蛋白质合成效应子或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体或受体、以及CRISPR系统或组分。
[0277] 157.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述效应子包含与表18中列出的一个或多个miRNA序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。
[0278] 158.如前述实施例所述的愈合子或组合物，其中所述效应子例如miRNA靶向宿主基因，例如调节所述基因的表达。
[0279] 159.如前述实施例所述的愈合子或组合物，其中所述miRNA例如与表16中列出的一个或多个序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
[0280] 160.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述遗传元件进一步包含以下一个或多个序列：编码一个或多个miRNA的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂序列的序列、调节性序列(例如启动子、增强子)、编码一个或多个靶向内源基因的调节性序列(siRNA、lncRNA、shRNA)的序列、编码治疗性mRNA或蛋白质的序列以及编码细胞溶解/细胞毒性RNA或蛋白质的序列。
[0281] 161.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述遗传元件具有以下一个或多个特征：与宿主细胞的基因组不整合、是附加体核酸、是单链DNA、是约1kb至10kb、存在于细胞核内、能够与内源蛋白结合，以及产生靶向宿主基因的微小RNA。
[0282] 162.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述遗传元件包含至少一个病毒序列或与表19或表20中所列的一个或多个序列或其片段具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性。
[0283] 163.前述实施例的愈合子或组合物，其中所述病毒序列来自以下至少一种：单链DNA病毒(例如指环病毒、比那病毒、圆环病毒、双生病毒、基诺病毒、丝状病毒、微小病毒、纳米病毒、细小病毒和斯派拉病毒)、双链DNA病毒(例如腺病毒、瓶状病毒、囊泡病毒、非洲猪瘟病毒、杆状病毒、福斯罗病毒、球状病毒、滴状病毒、腺炎病毒、疱疹病毒、虹彩病毒、脂毛病毒、线性病毒和痘病毒)、RNA病毒(例如甲病毒、真菌传杆状病毒、肝炎病毒、大麦病毒、烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒、三角病毒、风疹病毒、双RNA病毒、囊状病毒、分体病毒和呼肠病毒)。
[0284] 164.如前述实施例所述的愈合子或组合物，其中病毒序列来自一种或多种非指环病毒，例如腺病毒、疱疹病毒、pox病毒、痘苗病毒、SV40、乳头瘤病毒、RNA病毒(例如逆转录病毒、例如慢病毒)、单链RNA病毒(例如肝炎病毒)或双链RNA病毒(例如轮状病毒)。
[0285] 165.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述蛋白质结合序列与所述蛋白质外部的精氨酸富集区相互作用。
[0286] 166.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述愈合子能够在哺乳动物细胞例如人细胞中复制。
[0287] 167.如前述实施例所述的愈合子或组合物，其中所述愈合子在宿主细胞中是非致病性的和/或非整合的。
[0288] 168.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述愈合子在宿主中是非免疫原性的。
[0289] 169.如前述实施例中任一项所述的愈合子或组合物，其中所述愈合子在宿主或宿主细胞中抑制/增强一种或多种病毒特性，例如选择性，例如感染性，例如免疫抑制/激活。
[0290] 170.如前述实施例所述的愈合子或组合物，其中所述愈合子的量足以调节(例如表型、病毒水平、基因表达、与其他病毒竞争、疾病状态等至少约5％、10％、15％、20％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高)。
25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高)。
[0291] 171.如前述实施例中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含至少一种病毒或包含所述病毒的基因组的载体，例如所述愈合子的变体，例如普通/天然病毒。
[0292] 172.如前述实施例中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含异源部分、至少一个小分子、抗体、多肽、核酸、靶向剂、显像剂、纳米颗粒及其组合。
[0293] 173.一种载体，所述载体包含遗传元件，所述遗传元件包含(i)编码非致病性外部蛋白质的序列，(ii)使所述遗传元件与所述非致病性外部蛋白质结合的外部蛋白质结合序列，和(iii)编码效应子例如调节性核酸的序列。
[0294] 174.如前述实施例所述的载体，其中所述遗传元件无法与宿主细胞的基因组整合。
[0295] 175.如前述实施例中任一项所述的载体，其中所述遗传元件能够在哺乳动物细胞例如人细胞中复制。
[0296] 176.如前述实施例中任一项所述的载体，所述载体进一步包含外源核酸序列，例如，所述外源核酸序列被选择来调节基因例如人基因的表达。
[0297] 177.一种药物组合物，其包含如前述实施例中任一项所述的载体和药物赋形剂。
[0298] 178.如前述实施例所述的组合物，其中所述载体在宿主细胞中是非致病性的和/或非整合的。
[0299] 179.如前述实施例中任一项所述的组合物，其中所述载体在宿主中是非免疫原性的。
[0300] 180.如前述实施例所述的组合物，其中所述载体的量足以调节(例如表型、病毒水平、基因表达、与其他病毒竞争、疾病状态等至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高)。
[0301] 181.如前述实施例中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含至少一种病毒或包含所述病毒的基因组的载体，例如所述愈合子的变体，普通/天然病毒、辅助病毒、非指环病毒。
[0302] 182.如前述实施例中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含异源部分、至少一个小分子、抗体、多肽、核酸、靶向剂、显像剂、纳米颗粒及其组合。
[0303] 183.一种产生、繁殖和收获如前述实施例中任一项所述的愈合子的方法。
[0304] 184.一种设计和制造如前述实施例中任一项所述的载体的方法。
[0305] 185.一种向受试者施用有效量的如前述实施例中任一项所述的组合物的方法。
[0306] 186.一种在受试者中鉴定病毒缺乏症(dysvirosis)的方法，所述方法包括：
[0307] 从获自有需要的受试者的样品中分析遗传信息，其中从所述受试者的遗传信息和其他微生物中分离出病毒遗传信息；
[0308] 将所述病毒遗传信息与参考(例如对照，健康受试者)进行比较；以及
[0309] 如果所述病毒遗传信息的比较得出所述受试者中病毒遗传信息的比例不平衡或不规则，则鉴定所述受试者中的病毒缺乏症。
[0310] 187.一种将核酸或蛋白质有效负载递送至靶细胞、组织或受试者的方法，所述方法包括使所述靶细胞、组织或受试者与核酸组合物接触，所述核酸组合物包含(a)衍生自病毒的第一DNA序列，其中所述第一DNA序列足以产生能够感染所述靶细胞、组织或受试者的颗粒，以及(a)编码所述核酸或蛋白质有效负载的第二DNA序列，改进包括：
[0311] 所述第一DNA序列包含与表1、3、5、7、9、11或13中任一个列出的相应序列具有至少80％(至少85％、90％、95％、97％、99％、100％)序列同一性的至少500个(至少600、700、
800、900、1000、1200、1400、1500、1600、1800、2000)个核苷酸，或
800、900、1000、1200、1400、1500、1600、1800、2000)个核苷酸，或
[0312] 所述第一DNA序列编码与表2、4、6、8、10、12或14中列出的ORF具有至少80％(至少85％、90％、95％、97％、99％、100％)序列同一性的序列，或
[0313] 所述第一DNA序列包含与表14-1中列出的共有序列具有至少90％(至少95％、97％、99％、100％)序列同一性的序列。
[0315] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。所有的公开物、专利申请、专利、以及在此提及的其他参考文献以其全文通过引用结合。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不旨在限制。
附图说明
[0316] 当结合附图阅读时，将更好地理解以下详细描述的本发明的实施例。出于说明本发明的目的，在附图中示出了本发明示例的实施例。然而，应当理解，本发明不限于附图中所示实施例的精确安排和手段。
[0317] 图1A是示出衣壳蛋白序列的氨基酸区的百分比序列相似性的图示。
[0318] 图1B是示出衣壳蛋白序列的百分比序列相似性的图示。
[0319] 图2是示出愈合子的一个实施例的图示。
[0320] 图3描绘了编码TTMiniV的LY1菌株(“愈合子1”)的卡那霉素载体的示意图。
[0321] 图4描绘了编码TTMiniV的LY2菌株(“愈合子2”)的卡那霉素载体的示意图。
[0322] 图5描述了293T和A549细胞中合成的愈合子的转染效率。
[0323] 图6A和6B描述了定量PCR结果，所述结果说明了合成的愈合子对293T细胞的成功感染。
[0324] 图7A和7B描述了定量PCR结果，所述结果说明了合成的愈合子对A549细胞的成功感染。
[0325] 图8A和8B描述了定量PCR结果，所述结果说明了合成的愈合子对Raji细胞的成功感染。
[0326] 图9A和9B描述了定量PCR结果，所述结果说明了合成的愈合子对Jurkat细胞的成功感染。
[0327] 图10A和10B描述了定量PCR结果，所述结果说明了合成的愈合子对Chang细胞的成功感染。
[0328] 图11A-11B是一系列图表，其显示了用TTMV-LY2Δ574-1371、Δ1432-2210、2610::nLuc转染或感染的细胞中萤光素酶的表达。在受感染的细胞中观察到发光，这表明成功复制和包装。
[0329] 图11C是描绘了甲型细环病毒(细环病毒；TTV)的系统进化树的图，其中进化分枝突出显示。代表了至少100个指环病毒菌株，分为五个进化分枝。本文例如在表1-14中提供了来自五个进化分枝中的每一个的示例性序列。顶框＝进化分枝1；中间框上框＝进化分枝2；中间框＝进化分枝3，中间框下框＝进化分枝4；底框＝进化分枝5。
[0331] 图13是示出了针对设计用于定量TTV和TTMV基因组当量的引物组的引物特异性的图。基于SYBR绿色化学的定量PCR显示在编码各个基因组的质粒上，使用TTMV或TTV特异性引物组(如所示)对每个扩增产物都有一个不同的峰。
[0332] 图14是一系列图，其显示了通过qPCR定量TTV基因组当量的PCR效率。浓度增加的引物和固定浓度的水解探针(250nM)与两种不同的商业qPCR预混合物一起使用。90％-110％的效率产生定量过程中最低的误差传播。
[0333] 图15是图，其示出了利用7个基因组当量浓度log10，线性扩增TTMV(靶标1)或TTV(靶标2)的示例性扩增图。用7个10倍稀释以高PCR效率和线性对基因组当量进行定量(R2 TTMV：0.996；R2 TTV：0.997)。
[0334] 图16A-16B是一系列图，其显示了对愈合子储备物中TTMV基因组当量的定量。(A)两种储备物的扩增图，每种按1:10稀释并一式两份运行。(B)与图A相同的两个样品，此处在线性范围的情况下显示。显示的是两个代表性样品的上限和下限。PCR效率：99.58％，R2：0988。
[0335] 图17A和17B是一系列图，其显示了包含外源性miRNA，miR-625的合成的愈合子的功能作用。(A)当在三种不同的NSCLC细胞系(A549细胞、NCI-H40细胞和SW900细胞)中用表达miR-625的愈合子感染时，对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的细胞活力的影响。(B)表达miR-625的愈合子对HEK293T细胞表达YFP报道分子的影响。
[0336] 图17C是示出了SW900细胞的归一化至总蛋白的p65免疫印迹分析的定量的图，所述SW900细胞与指定愈合子接触或未被处理。
[0337] 图18是示出了在五个甲型细环病毒进化分枝内病毒DNA序列的比对的成对同一性的图。将来自每个TTV进化分枝的病毒的DNA序列进行比对。沿着每个进化分枝的比对长度显示了50bp滑动窗口中的成对百分比同一性。指示平均成对同一性。
[0338] 图19是示出了来自每个甲型细环病毒进化分枝的代表性序列的比对的成对同一性的图。将TTV-CT30F、TTV-TJN02、TTV-tth8、TTV-JA20和TTV-HD23a的DNA序列进行比对。沿着比对长度显示了50bp滑动窗口中的成对百分比同一性。上方的括号指示了成对同一性的非编码和编码区，其中指示了成对同一性。下面的括号指示高序列保守区。
[0339] 图20是示出了五个甲型细环病毒进化分枝中推定蛋白质的氨基酸比对的成对同一性的图。将来自TTV-CT30F、TTV-TJN02、TTV-tth8、TTV-JA20和TTV-HD23a的推定蛋白质的氨基酸序列进行比对。沿着每个比对的长度显示了50aa滑动窗口中的成对百分比同一性。
指示了开放阅读框DNA序列和蛋白质氨基酸序列的成对同一性。
指示了开放阅读框DNA序列和蛋白质氨基酸序列的成对同一性。
[0340] 图21是示出了五个甲型细环病毒进化分枝中5’UTR内结构域高度保守的图。将每个代表性甲型细环病毒的71-bp 5’UTR保守结构域序列进行比对。所述序列在五个进化分枝之间具有96.6％的成对同一性。还列出了图21中所示的序列(分别为SEQ ID NOS 703-708，按照出现的顺序)，例如在本文的表16-1中列出。
[0341] 图22是示出了来自五个甲型细环病毒进化分枝的GC富集结构域的比对的图。每种指环病毒在ORF的下游都有GC含量大于70％的区。显示的是来自TTV-CT30F、TTV-TJN02、TTV-tth8、TTV-JA20和TTV-HD23a的GC富集区的比对。这些区的长度不同，但是在比对时，它们显示出81.8％的成对同一性。还列出了图22中所示的序列(分别为SEQ ID NOS 709-714，按照出现的顺序)，例如在本文的表16-2中列出。
具体实施方式
[0342] 定义
[0343] 词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”应理解为是指本身适合于所指示的治疗、调节等目的的化合物、组合物、产物等。词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”另外作为一个实施例披露了这种化合物、组合物、产物等用于治疗、调节等。
[0344] 词语“用于…的化合物、组合物、产物等”或“化合物、组合物、产物等用于制造用以…的药物、药物组合物、兽用组合物、诊断组合物等的用途”表示这些化合物、组合物、产物等将用于可在人体或动物身上实施的治疗方法中。它们被认为是涉及治疗方法等的实施例和权利要求的等同披露。如果实施例或权利要求因此是指“用于治疗疑似患有疾病的人或动物的化合物”，则这也被认为是披露“化合物在制造用于治疗疑似患有疾病的人或动物的药物中的用途”或“通过向疑似患有疾病的人或动物施用化合物的治疗方法”。词语“用于治疗、调节等的化合物、组合物、产物等”应理解为是指本身适合于所指示的治疗、调节等目的的化合物、组合物、产物等。
[0345] 如果在下文中在括号中提供术语、值、数量等的实例，则这将被理解为表示在括号中提及的实例可以构成实施例。例如，如果指出“在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF1核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸571-2613)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列”，则一些实施例涉及包含与表1的核酸序列的核苷酸571-2613具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列的核酸分子。
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列的核酸分子。
[0346] 如本文所用，术语“愈合子”是指包含封闭在蛋白质外部中的遗传元件，例如附加体，例如环状DNA的媒介物。如本文所用，“合成的愈合子”通常是指非天然存在的愈合子，例如具有相对于野生型病毒(例如，如本文所述的野生型指环病毒)修饰的序列。在一些实施例中，合成的愈合子被工程化或重组，例如，包含遗传元件，所述遗传元件包含相对于野生型病毒基因组(例如，如本文所述的野生型指环病毒基因组)的修饰。在一些实施例中，封闭在蛋白质外部中包含被蛋白质外部100％覆盖，以及小于100％覆盖，例如95％、90％、85％、80％、70％、60％、50％或更少。例如，在蛋白质外部可以存在间隙或不连续(例如，使得所述蛋白质外部可透过水、离子、肽或小分子)，只要遗传元件例如进入宿主细胞之前保留在蛋白质外部中即可，。在一些实施例中，将愈合子纯化，例如，将其从其原始来源中分离和/或基本上不含(>50％、>60％、>70％、>80％、>90％)其他组分。
[0347] 如本文所用，“编码”的核酸是指编码氨基酸序列或功能性多核苷酸(例如非编码RNA，例如siRNA或miRNA)的核酸序列。
[0348] 如本文所用，术语“病毒缺乏症”是指受试者中病毒组的失调。
[0349] 如本文所用，“外源性”因子(例如，效应子、核酸(例如，RNA)、基因、有效负载、蛋白质)是指不被相应的野生型病毒(例如，文中所述的指环病毒)包括或编码的因子。在一些实施例中，外源性因子不是天然存在的，例如具有相对于天然存在的蛋白质或核酸(例如，通过插入、缺失或置换)发生改变的序列的蛋白质或核酸。在一些实施例中，外源性因子不天然存在于宿主细胞中。在一些实施例中，外源性因子天然存在于宿主细胞中，但是对于病毒是外源的。在一些实施例中，外源性因子天然存在于宿主细胞中，但是不以期望的水平或在期望的时间存在。
[0350] 如本文所用，术语“遗传元件”是指通常在愈合子中的核酸序列。应当理解，遗传元件可以作为裸DNA产生，并且任选地进一步装配到蛋白质外部中。还应理解，愈合子可将其遗传元件插入细胞中，从而导致遗传元件存在于细胞中，而蛋白质外部不一定进入细胞。
[0351] 如本文所用，“基本上非致病性的”生物体、颗粒或组分是指例如在宿主生物例如哺乳动物例如人中不会引起或诱导可检测的疾病或致病性状况的生物、颗粒(例如，病毒或愈合子，例如文中所述)或其组分。在一些实施例中，向受试者施用愈合子可导致轻微的反应或副作用，其作为护理标准的一部分是可接受的。
[0352] 如本文所用，术语“非致病性的”是指例如在宿主生物例如哺乳动物例如人中不会引起或诱导可检测的疾病或致病性状况的生物体或其组分。
[0353] 如本文所用，“基本上非整合的”遗传元件是指一种遗传元件，例如病毒或愈合子中的遗传元件，例如如本文所述，其中进入宿主细胞(例如，真核细胞)或生物体(例如，哺乳动物，例如人)的遗传元件中的少于约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％或1％整合到基因组中。在一些实施例中，遗传元件没有可检测地整合到例如宿主细胞的基因组中。在一些实施例中，可以使用本文所述的技术，例如核酸测序、PCR检测和/或核酸杂交，检测遗传元件整合到基因组中。
[0354] 如本文所用，“基本上非免疫原性的”生物体、颗粒或组分是指例如在宿主组织或生物体(例如哺乳动物，例如人)中不会引起或诱导不期望或未靶向的免疫反应的生物体、颗粒(例如，病毒或愈合子，例如文中所述)或其组分。在实施例中，基本上非免疫原性的生物体、颗粒或组分不产生可检测的免疫反应。在实施例中，基本上非免疫原性的愈合子对包含表1-14中任一个所示的氨基酸序列或由表1-14中任一个所示的核酸序列编码的蛋白质不产生可检测的免疫反应。在实施例中，通过测定受试者中抗体的存在或水平(例如，抗愈合子抗体的存在或水平，例如针对文中所述的合成的愈合子的抗体的存在或水平)来检测免疫反应(例如，不期望的或未靶向的免疫反应)，例如，根据Tsuda等人(1999；
J.Virol.Methods[病毒学方法杂志]77:199-206；通过引用并入文中)中所述的抗TTV抗体检测方法和/或Kakkola等人(2008；Virology[病毒学]382:182-189；通过引用并入文中)中所述的测定抗TTV IgG水平的方法。还可以通过本领域中检测抗病毒抗体的方法检测针对指环病毒或基于其的愈合子的抗体，例如检测抗AAV抗体的方法，例如Calcedo等人(2013；
Front.Immunol.[免疫学前沿]4(341):1-7；通过引用并入文中)中所述。
J.Virol.Methods[病毒学方法杂志]77:199-206；通过引用并入文中)中所述的抗TTV抗体检测方法和/或Kakkola等人(2008；Virology[病毒学]382:182-189；通过引用并入文中)中所述的测定抗TTV IgG水平的方法。还可以通过本领域中检测抗病毒抗体的方法检测针对指环病毒或基于其的愈合子的抗体，例如检测抗AAV抗体的方法，例如Calcedo等人(2013；
Front.Immunol.[免疫学前沿]4(341):1-7；通过引用并入文中)中所述。
[0355] 如本文所用，术语“蛋白质外部”是指主要是蛋白质的外部组分。
[0356] 如本文所用，术语“调节性核酸”是指修饰编码表达产物的DNA序列的表达，例如转录和/或翻译的核酸序列。在实施例中，表达产物包含RNA或蛋白质。
[0357] 如本文所用，术语“调节性序列”是指修饰靶基因产物的转录的核酸序列。在一些实施例中，调节性序列是启动子或增强子。
[0358] 如本文所用，术语“复制蛋白”是指在感染、病毒基因组复制/表达、病毒蛋白合成和/或病毒组分装配过程中使用的蛋白，例如病毒蛋白。
[0359] 如本文所用，“治疗(treatment)”，“治疗(treating)”及其同源词是指旨在改善、改进、稳定、预防或治愈疾病、病理状况或障碍的受试者的医学管理。该术语包括积极治疗(旨在改善疾病、病理状况或障碍的治疗)、因果治疗(针对相关疾病、病理状况或障碍的原因的治疗)、姑息治疗(旨在缓解症状而设计的治疗)、预防性治疗(旨在预防、最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或障碍进展的治疗)；以及支持治疗(用于补充另一治疗的治疗)。
[0360] 如本文所用，术语“病毒组”是指在特定环境中，例如身体的一部分，例如在生物体中，例如在细胞中，例如在组织中的病毒。
[0361] 本发明一般涉及愈合子，例如合成的愈合子，及其用途。本发明提供合成的愈合子，包含合成的愈合子的组合物，以及制备或使用合成的愈合子的方法。合成的愈合子通常用作递送媒介物，例如用于将治疗剂递送至真核细胞。通常，合成的愈合子将包括遗传元件，所述遗传元件包含封闭在蛋白质外部内的外源性核酸序列(例如，编码外源性效应子)。合成的愈合子可以用作基本上非免疫原性的媒介物，用于将遗传元件或其中编码的效应子(例如，多肽或核酸效应子，例如如本文所述)递送到真核细胞中，例如用以治疗包含所述细胞的受试者的疾病或障碍。
[0362] 愈合子
[0363] 在一些方面，本文所述的本发明包括组合物和使用和制备合成的愈合子的方法。在一些实施例中，愈合子包含遗传元件(例如，环状DNA，例如单链DNA)，其相对于遗传元件的其余部分和/或蛋白质外部包含至少一个外源元件(例如，编码效应子的外源元件，例如，如本文所述)。愈合子可以是用于将有效负载进入宿主例如人的递送媒介物(例如，基本上非致病性的递送媒介物)。在一些实施例中，愈合子能够在真核细胞例如哺乳动物细胞例如人细胞中复制。在一些实施例中，愈合子在哺乳动物(例如人)细胞中是基本上非致病性的和/或基本上非整合的。在一些实施例中，愈合子在哺乳动物例如人中是基本上非免疫原性的。在一些实施例中，愈合子具有基于指环病毒(例如，所述的指环病毒，例如，包含含有表
1-14中任一个所示的序列的核酸或多肽的指环病毒)或其他基本上非致病性的病毒(例如
共生病毒(symbiotic virus)、普通病毒(commensal virus)、天然病毒)的序列、结构和/或功能。通常，基于指环病毒的愈合子包含至少一个对于指环病毒是外源的元件，例如，外源效应子或编码愈合子的遗传元件内的外源效应子的核酸序列。在一些实施例中，愈合子是复制缺陷型。在一些实施例中，愈合子具有复制能力。
1-14中任一个所示的序列的核酸或多肽的指环病毒)或其他基本上非致病性的病毒(例如
共生病毒(symbiotic virus)、普通病毒(commensal virus)、天然病毒)的序列、结构和/或功能。通常，基于指环病毒的愈合子包含至少一个对于指环病毒是外源的元件，例如，外源效应子或编码愈合子的遗传元件内的外源效应子的核酸序列。在一些实施例中，愈合子是复制缺陷型。在一些实施例中，愈合子具有复制能力。
[0364] 在一个方面，本发明包括合成的愈合子，所述愈合子包含(i)遗传元件，其包含启动子元件，编码外源性效应子(例如有效负载)的序列和蛋白质结合序列(例如外部蛋白质结合序列，例如包装信号)，其中遗传元件是单链DNA，并具有以下一种或两种性质：呈环状和/或以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合到真核细胞的基因组中；以及(ii)蛋白质外部；其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；且其中合成的愈合子能够将遗传元件递送到真核细胞
中。
中。
[0365] 在本文描述的合成的愈合子的一些实施例中，遗传元件以少于进入细胞的遗传元件的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％或2％的频率整合。在一些实施例中，施用给受试者的多个合成的愈合子的少于约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％的遗传元件将整合到受试者的一个或多个宿主细胞的基因组中。在一些实施例中，例如本文所述的合成的愈合子的群体的遗传元件以低于相当的AAV病毒群体的频率的频率整合到宿主细胞的基因组中，例如以比相当的AAV病毒群体的频率低约
50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更低的频率。
50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更低的频率。
[0366] 在一个方面，本发明包括合成的愈合子，其包含：(i)遗传元件，其包含启动子元件和编码外源性效应子(例如有效负载)的序列，以及蛋白质结合序列(例如外部蛋白质结合序列)，其中遗传元件与野生型指环病毒序列(例如，野生型细环病毒(TTV)、细小环病毒(TTMV)或TTMDV序列，例如，表1、3、5、7、9、11或13中任一个列出的野生型指环病毒序列)具有至少75％(例如，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性；以及(ii)蛋白质外部；其中所述遗传元件被封闭在所述蛋白质外部内；且其中合成的愈合子能够将遗传元件递送到真核细胞中。
[0367] 在一方面，本发明包括一种合成的愈合子，其包含：
[0368] a)遗传元件，其包含(i)编码非致病性的外部蛋白质的序列，(ii)使所述遗传元件与非致病性的外部蛋白质结合的外部蛋白质结合序列，和(iii)编码调节性核酸的序列；以及
[0369] b)与所述遗传元件相关联(例如包封或封闭所述遗传元件)的蛋白质外部。
[0370] 在一些实施例中，所述愈合子包括来自非包膜、环状、单链DNA病毒的序列或表达产物(或与其具有>70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％同源性)。动物环状单链DNA病毒通常是指感染真核非植物宿主并具有环状基因组的单链DNA(ssDNA)病毒亚组。因此，动物环状ssDNA病毒可区别于感染原核生物的ssDNA病毒(即微病毒科和丝状噬菌体科)和感染植物的ssDNA病毒(即双生病毒科和矮化病毒科)。它们也可区别于感染非植物真核生物的线性ssDNA病毒(即细小病毒科)。
[0371] 在一些实施例中，所述愈合子例如瞬时或长期地调节宿主细胞功能。在某些实施例中，细胞功能发生稳定地改变，例如调节持续至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。
[0372] 在某些实施例中，细胞功能发生瞬时地改变，例如调节持续不超过约30分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。
[0373] 在一些实施例中，遗传元件包括启动子元件。在实施例中，启动子元件选自RNA聚合酶II依赖性启动子、RNA聚合酶III依赖性启动子、PGK启动子、CMV启动子、EF-1α启动子、SV40启动子、CAGG启动子或UBC启动子、TTV病毒启动子、组织特异性U6(pollIII)、具有激活蛋白(TetR-VP16、Gal4-VP16、dCas9-VP16等)的上游DNA结合位点的最小CMV启动子。在实施例中，启动子元件包含TATA盒。在实施例中，启动子元件对于野生型指环病毒(例如本文所述)是内源性的。
[0374] 在一些实施例中，遗传元件包括以下一种或多种特征：单链、环状、负链和/或DNA。在实施例中，遗传元件包括附加体。在一些实施例中，除效应子之外的遗传元件部分的组合大小为约2.5kb-5kb(例如，约2.8kb-4kb、约2.8kb-3.2kb、约3.6kb-3.9kb或约2.8kb-
2.9kb)、小于约5kb(例如，小于约2.9kb、3.2kb、3.6kb、3.9kb或4kb)或至少100个核苷酸(例如，至少1kb)。
2.9kb)、小于约5kb(例如，小于约2.9kb、3.2kb、3.6kb、3.9kb或4kb)或至少100个核苷酸(例如，至少1kb)。
[0375] 在一些情况下，本文所述的愈合子、包含愈合子的组合物、使用所述愈合子的方法等部分基于实例，这些实例说明了不同的效应子(例如miRNA(例如针对IFN或miR-625)、shRNA等)和蛋白质结合序列(例如与衣壳蛋白例如Q99153结合的DNA序列)如何与蛋白质外部(例如Arch Virol[病毒学文献](2007)152:1961-1975中披露的衣壳)组合，产生可随后用于将外源性效应子递送至细胞(例如动物细胞，例如人细胞或非人动物细胞，例如猪或小鼠细胞)的愈合子。在实施例中，外源性效应子可以沉默诸如干扰素的因子的表达。实例进一步描述了如何通过将外源性效应子插入例如衍生自指环病毒的序列中来制备愈合子。基于这些实例，下文中的描述考虑了实例中所考虑的具体发现和组合的各种变型。例如，技术人员将从实例中理解，特定miRNA仅用作外源性效应子的实例，而其他外源性效应子可以是例如其他调节性核酸或治疗性肽。类似地，实例中使用的特定衣壳可以替换为下文所述的基本上非致病性的蛋白质。在实例中描述的特定指环病毒序列也可以替换为下文描述的指环病毒序列。这些考虑类似地适用于蛋白质结合序列、调节性序列例如启动子等。独立于此，本领域技术人员将特别考虑与实例紧密相关的这些实施例。
[0376] 在一些实施例中，将愈合子或愈合子中包含的遗传元件引入细胞(例如人细胞)中。在一些实施例中，例如由愈合子的遗传元件编码的外源性效应子(例如，RNA，例如
miRNA)在细胞(例如，人细胞)中表达，例如，一旦将愈合子或遗传元件引入细胞中，例如实例19中所述。在实施例中，将愈合子或其中包含的遗传元件引入细胞中例如通过改变细胞中靶分子的表达水平(例如，实例22所述)，来调节(例如，增加或减少)靶分子(例如，靶核酸，例如RNA，或靶多肽)在细胞中的水平。在实施例中，引入愈合子或其中包含的遗传元件降低了细胞产生的干扰素的水平，例如实例3和4中所述。在实施例中，将愈合子或其中包含的遗传元件引入细胞中调节(例如，增加或减少)细胞的功能。在实施例中，将愈合子或其中包含的遗传元件引入细胞中调节(例如，增加或降低)细胞的存活力。在实施例中，将愈合子或其中包含的遗传元件引入细胞中降低了细胞(例如癌细胞)的存活力，例如实例22中所
述。
miRNA)在细胞(例如，人细胞)中表达，例如，一旦将愈合子或遗传元件引入细胞中，例如实例19中所述。在实施例中，将愈合子或其中包含的遗传元件引入细胞中例如通过改变细胞中靶分子的表达水平(例如，实例22所述)，来调节(例如，增加或减少)靶分子(例如，靶核酸，例如RNA，或靶多肽)在细胞中的水平。在实施例中，引入愈合子或其中包含的遗传元件降低了细胞产生的干扰素的水平，例如实例3和4中所述。在实施例中，将愈合子或其中包含的遗传元件引入细胞中调节(例如，增加或减少)细胞的功能。在实施例中，将愈合子或其中包含的遗传元件引入细胞中调节(例如，增加或降低)细胞的存活力。在实施例中，将愈合子或其中包含的遗传元件引入细胞中降低了细胞(例如癌细胞)的存活力，例如实例22中所
述。
[0377] 在一些实施例中，本文描述的愈合子(例如，合成的愈合子)诱导小于70％的抗体流行率(例如小于约60％、50％、40％、30％、20％或10％抗体流行率)。在实施例中，根据本领域已知的方法测定抗体流行率。在实施例中，通过检测生物样品中的针对指环病毒(例如本文所述)或基于其的愈合子的抗体来测定抗体流行率，例如，根据Tsuda等人(1999；J.Virol.Methods[病毒学方法杂志]77:199-206；通过引用并入文中)中所述的抗TTV抗体检测方法和/或Kakkola等人(2008；Virology[病毒学]382:182-189；通过引用并入文中)中所述的测定抗TTV IgG血清阳性率的方法。针对指环病毒或基于其的愈合子的抗体还可以通过本领域中检测抗病毒抗体的方法来检测，例如检测抗AAV抗体的方法，例如Calcedo等人(2013；Front.Immunol.[免疫学前沿]4(341):1-7；通过引用并入文中)中所述。
[0378] 指环病毒
[0379] 在一些实施例中，例如本文所述的合成的愈合子包括衍生自指环病毒的序列或表达产物。通常，合成的愈合子包括相对于指环病毒是外源的一种或多种序列或表达产物。指环病毒属曾经被分类为圆环病毒科的进化分枝，最近被分类为单独科。指环病毒通常具有负极性的单链环状DNA基因组。指环病毒尚未与任何人类疾病相关联。但是，在一个或多个对照队列群体中无症状的指环病毒病毒血症发生率高，指环病毒病毒科内显著的基因组多样性，病史上无法在体外传播所述因子以及缺乏指环病毒疾病的一种或多种动物模型妨碍了将指环病毒感染与人类疾病相关联的尝试(Yzebe等人,Panminerva Med.(2002)44:167-177；Biagini,P.,Vet.Microbiol.[兽医微生物学](2004)98:95-101)。
[0380] 指环病毒似乎是通过口鼻或粪口感染、母婴传播和/或子宫内传播而传播的(Gerner等人,Ped.Infect.Dis.J.[国际传染病杂志](2000)19:1074-1077)。感染者的特征是延长(数月至数年)的指环病毒病毒血症。人可以共同感染一种以上的基因群或菌株
(Saback,等人,Scad.J.Infect.Dis.[斯堪的纳维亚感染病杂志](2001)33:121-125)。有建议认为这些基因群可以在感染者内重组(Rey等人,Infect.[感染](2003)31:226-233)。在诸如肝脏、外周血单核细胞和骨髓的几种组织中发现了双链同工型(复制性)中间体
(Kikuchi等人,J.Med.Virol.[医学病毒学杂志](2000)61:165-170；Okamoto等人,
Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学和生物物理研究通讯](2002)270:657-662；
Rodriguez-lnigo等人,Am.J.Pathol.[美国病理学杂志](2000)156:1227-1234)。
(Saback,等人,Scad.J.Infect.Dis.[斯堪的纳维亚感染病杂志](2001)33:121-125)。有建议认为这些基因群可以在感染者内重组(Rey等人,Infect.[感染](2003)31:226-233)。在诸如肝脏、外周血单核细胞和骨髓的几种组织中发现了双链同工型(复制性)中间体
(Kikuchi等人,J.Med.Virol.[医学病毒学杂志](2000)61:165-170；Okamoto等人,
Biochem.Biophys.Res.Commun.[生物化学和生物物理研究通讯](2002)270:657-662；
Rodriguez-lnigo等人,Am.J.Pathol.[美国病理学杂志](2000)156:1227-1234)。
[0381] 在一些实施例中，本文所述的愈合子包含一个或多个核酸分子(例如本文所述的遗传元件)，其包含与例如文中所述的指环病毒序列或其片段具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在实施例中，指环病毒序列选自表1、3、5、7、9、11或13中任一个所示的序列。在一些实施例中，本文所述的愈合子包含一个或多个核酸分子(例如，如本文所述的遗传元件)，其包含与文中所述的任一指环病毒(例如，表1-16或19中任一个注释或所列序列编码的指环病毒序列)的TATA盒、帽位点、转录起始位点、5'UTR保守结构域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、三开放阅读框区、聚(A)信号、GC富集区、或其任何组合具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码衣壳蛋白的序列，例如文中所述的任一指环病毒(例如，表1-16或19中任一个注释或所列序列编码的指环病毒序列)的ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3序列。在实施例中，核酸分子包含编码衣壳蛋白的序列，所述衣壳蛋白包含与指环病毒ORF1或ORF2蛋白(例如，表2、4、6、8、10、12、14或16中任一个所示的ORF1或ORF2氨基酸序列，或表
1、3、5、7、9、11、13、15或19中任一个所示的核酸序列编码的ORF1或ORF2氨基酸序列)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在实施例中，指环病毒序列选自表1、3、5、7、9、11或13中任一个所示的序列。在一些实施例中，本文所述的愈合子包含一个或多个核酸分子(例如，如本文所述的遗传元件)，其包含与文中所述的任一指环病毒(例如，表1-16或19中任一个注释或所列序列编码的指环病毒序列)的TATA盒、帽位点、转录起始位点、5'UTR保守结构域、ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3、三开放阅读框区、聚(A)信号、GC富集区、或其任何组合具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施例中，核酸分子包含编码衣壳蛋白的序列，例如文中所述的任一指环病毒(例如，表1-16或19中任一个注释或所列序列编码的指环病毒序列)的ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3、ORF2t/3序列。在实施例中，核酸分子包含编码衣壳蛋白的序列，所述衣壳蛋白包含与指环病毒ORF1或ORF2蛋白(例如，表2、4、6、8、10、12、14或16中任一个所示的ORF1或ORF2氨基酸序列，或表
1、3、5、7、9、11、13、15或19中任一个所示的核酸序列编码的ORF1或ORF2氨基酸序列)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
[0382] 在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF1核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸571-2613)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF1/1核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸571-587和/或2137-2613)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸
571-687和/或2339-2659)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸299-691)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸299-687和/或
2137-2659)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸299-687和/或2339-2831)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF2t/3核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸299-348和/或2339-2831)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸84-90)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸107-114)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸114)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸177-247)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒三开放阅读框区核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸2325-
2610)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸2813-2818)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸3415-3570)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸
571-687和/或2339-2659)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸299-691)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸299-687和/或
2137-2659)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸299-687和/或2339-2831)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒ORF2t/3核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸299-348和/或2339-2831)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸84-90)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸107-114)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸114)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸177-247)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒三开放阅读框区核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸2325-
2610)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸2813-2818)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表1的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸3415-3570)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
[0383] 在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒ORF1核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸599-2839)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒ORF1/1核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸599-727和/或2381-2839)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸
599-727和/或2619-2813)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸357-731)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸357-727和/或
2381-2813)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸357-727和/或2619-3021)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒ORF2t/3核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸357-406和/或2619-3021)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸89-90)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸107-114)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸114)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸174-244)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒三开放阅读框区核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸2596-
2810)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸3017-3022)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸3691-3794)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸
599-727和/或2619-2813)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸357-731)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸357-727和/或
2381-2813)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸357-727和/或2619-3021)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒ORF2t/3核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸357-406和/或2619-3021)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸89-90)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸107-114)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸114)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸174-244)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒三开放阅读框区核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸2596-
2810)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸3017-3022)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表3的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸3691-3794)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
[0384] 在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒ORF1核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸599-2830)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒ORF1/1核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸599-715和/或2363-2830)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸
599-715和/或2565-2789)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸336-719)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸336-715和/或
2363-2789)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸336-715和/或2565-3015)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒ORF2t/3核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸336-388和/或2565-3015)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸83-88)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸104-111)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸111)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸170-240)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒三开放阅读框区域核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸2551-
2786)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸3011-3016)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸3632-3753)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸
599-715和/或2565-2789)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸336-719)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸336-715和/或
2363-2789)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸336-715和/或2565-3015)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒ORF2t/3核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸336-388和/或2565-3015)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸83-88)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸104-111)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸111)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸170-240)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒三开放阅读框区域核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸2551-
2786)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸3011-3016)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表5的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸3632-3753)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
[0385] 在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒ORF1核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸590-2899)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒ORF1/1核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸590-712和/或2372-2899)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸
590-712和/或2565-2873)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸354-716)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸354-712和/或
2372-2873)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸354-712和/或2565-3075)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒ORF2t/3核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸354-400和/或2565-3075)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸86-90)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸107-114)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸114)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸174-244)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒三开放阅读框区域核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸2551-
2870)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列例如，表7的核酸序列的核苷酸3071-3076)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列(。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸3733-3853)具有至少约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸
590-712和/或2565-2873)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸354-716)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸354-712和/或
2372-2873)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸354-712和/或2565-3075)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒ORF2t/3核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸354-400和/或2565-3075)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸86-90)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸107-114)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸114)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸174-244)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒三开放阅读框区域核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸2551-
2870)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列例如，表7的核酸序列的核苷酸3071-3076)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列(。在实施例中，核酸分子包含与表7的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸3733-3853)具有至少约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
[0386] 在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒ORF1核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸577-2787)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒ORF1/1核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸577-699和/或2311-2787)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸
577-699和/或2504-2806)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸341-703)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸341-699和/或
2311-2806)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸341-699和/或2504-2978)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒ORF2t/3核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸341-387和/或2504-2978)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸83-87)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸104-111)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸111)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸171-241)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒三开放阅读框区核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸2463-
2784)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸2974-2979)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸3644-3758)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸
577-699和/或2504-2806)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸341-703)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸341-699和/或
2311-2806)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸341-699和/或2504-2978)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒ORF2t/3核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸341-387和/或2504-2978)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸83-87)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸104-111)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸111)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸171-241)具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒三开放阅读框区核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸2463-
2784)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸2974-2979)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表9的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸3644-3758)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
[0387] 在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒ORF1核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸612-2612)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒ORF1/1核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸612-719和/或2274-2612)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸612-719和/或2449-2589)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸424-723)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸424-719
和/或2274-2589)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸424-719和/或2449-2812)具有至少约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸
237-243)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸260-267)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸267)具有至少约
70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸323-393)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒三开放阅读框区核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸2441-2586)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸2808-2813)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸2868-2929)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸612-719和/或2449-2589)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸424-723)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸424-719
和/或2274-2589)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸424-719和/或2449-2812)具有至少约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸
237-243)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸260-267)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸267)具有至少约
70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸323-393)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒三开放阅读框区核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸2441-2586)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸2808-2813)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表11的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸2868-2929)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
[0388] 在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒ORF1核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸432-2453)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒ORF1/1核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸432-584和/或1977-2453)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸432-584和/或2197-2388)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸283-588)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸283-584
和/或1977-2388)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸283-584和/或2197-2614)具有至少约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸
21-25)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸42-49)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸49)具有至少约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸117-187)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒三开放阅读框区核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸2186-2385)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸2676-
2681)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸3054-3172)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒ORF1/2核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸432-584和/或2197-2388)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒ORF2核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸283-588)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒ORF2/2核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸283-584
和/或1977-2388)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒ORF2/3核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸283-584和/或2197-2614)具有至少约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒TATA盒核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸
21-25)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒帽位点核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸42-49)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒转录起始位点核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸49)具有至少约70％、75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒5'UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸117-187)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒三开放阅读框区核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸2186-2385)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒聚(A)信号核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸2676-
2681)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含与表13的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸3054-3172)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。
[0389] 在实施例中，核酸分子包含编码与表2的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表2的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表2的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表2的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表2的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表2的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表2的指环病毒
ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
[0390] 在实施例中，核酸分子包含编码与表4的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表4的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表4的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表4的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表4的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表4的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表4的指环病毒
ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
[0391] 在实施例中，核酸分子包含编码与表6的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表6的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表6的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表6的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表6的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表6的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表6的指环病毒
ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
[0392] 在实施例中，核酸分子包含编码与表8的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表8的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表8的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表8的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表8的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表8的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表8的指环病毒
ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
[0393] 在实施例中，核酸分子包含编码与表10的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表10的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表10的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表10的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表10的指环病毒ORF2/
2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表10的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表10的指环病毒ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表10的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表10的指环病毒ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
[0394] 在实施例中，核酸分子包含编码与表12的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表12的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表12的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表12的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表12的指环病毒ORF2/
2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表12的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表12的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
[0395] 在实施例中，核酸分子包含编码与表14的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表14的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表14的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表14的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表14的指环病毒ORF2/
2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表14的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。在实施例中，核酸分子包含编码与表14的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的氨基酸序列的核酸序列。
[0396] 在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表2的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表2的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表2的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表2的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表2的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表2的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表2的指环病毒ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表2的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表2的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表2的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表2的指环病毒ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[0397] 在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表4的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表4的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表4的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表4的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表4的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表4的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表4的指环病毒ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表4的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表4的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表4的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表4的指环病毒ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[0398] 在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表6的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表6的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表6的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表6的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表6的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表6的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表6的指环病毒ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表6的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表6的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表6的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表6的指环病毒ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[0399] 在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表8的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表8的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表8的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表8的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表8的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表8的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表8的指环病毒ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表8的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表8的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表8的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表8的指环病毒ORF2t/3氨基酸序列具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[0400] 在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表10的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表10的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表10的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表10的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表10的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表10的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表10的指环病毒ORF2t/3氨基酸序列具有至少约
70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表10的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表10的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表10的指环病毒ORF2t/3氨基酸序列具有至少约
70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[0401] 在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表12的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表12的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表12的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表12的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表12的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表12的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表12的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表12的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[0402] 在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表14的指环病毒ORF1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表14的指环病毒ORF1/1氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表14的指环病毒ORF1/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表14的指环病毒ORF2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表14的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表14的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表14的指环病毒ORF2/2氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。在实施例中，文中所述的愈合子包含具有与表14的指环病毒ORF2/3氨基酸序列具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。
[0403] 表1.示例性指环病毒核酸序列(甲型细环病毒，进化分枝1)
[0404]
[0405]
[0406] 注释:
[0407] 推定结构域 碱基范围
[0408] TATA盒 84-90
[0409] 帽位点 107-114
[0410] 转录起始位点 114
[0411] 5'UTR保守结构域 177-247
[0412] ORF2 299-691
[0413] ORF2/2 299-687；2137-2659
[0414] ORF2/3 299-687；2339-2831
[0415] ORF2t/3 299-348；2339-2831
[0416] ORF1 571-2613
[0417] ORF1/1 571-687；2137-2613
[0418] ORF1/2 571-687；2339-2659
[0419] 三开放阅读框区 2325-2610
[0420] 聚(A)信号 2813-2818
[0421] GC富集区 3415-3570
[0422] 表2.示例性指环病毒氨基酸序列(甲型细环病毒，进化分枝1)
[0423]
[0424]
[0425] 表3.示例性指环病毒核酸序列(甲型细环病毒，进化分枝2)
[0426]
[0427]
[0428] 注释:
[0429] 推定结构域 碱基范围
[0430] TATA盒 89-90
[0431] 帽位点 107-114
[0432] 转录起始位点 114
[0433] 5'UTR保守结构域 174-244
[0434] ORF2 357-731
[0435] ORF2/2 357-727；2381-2813
[0436] ORF2/3 357-727；2619-3021
[0437] ORF2t/3 357-406；2619-3021
[0438] ORF1 599-2839
[0439] ORF1/1 599-727；2381-2839
[0440] ORF1/2 599-727；2619-2813
[0441] 三开放阅读框区 2596-2810
[0442] 聚(A)信号 3017-3022
[0443] GC富集区 3691-3794
[0444] 表4.示例性指环病毒氨基酸序列(甲型细环病毒，进化分枝2)
[0445]
[0446]
[0447] 表5.示例性指环病毒核酸序列(甲型细环病毒，进化分枝3)
[0448]
[0449]
[0450] 注释:
[0451] 推定结构域 碱基范围
[0452] TATA盒 83-88
[0453] 帽位点 104-111
[0454] 转录起始位点 111
[0455] 5'UTR保守结构域 170-240
[0456] ORF2 336-719
[0457] ORF2/2 336-715；2363-2789
[0458] ORF2/3 336-715；2565-3015
[0459] ORF2t/3 336-388；2565-3015
[0460] ORF1 599-2830
[0461] ORF1/1 599-715；2363-2830
[0462] ORF1/2 599-715；2565-2789
[0463] 三开放阅读框区 2551-2786
[0464] 聚(A)信号 3011-3016
[0465] GC富集区 3632-3753
[0466] 表6.示例性指环病毒氨基酸序列(甲型细环病毒，进化分枝3)
[0467]
[0468]
[0469] 表7.示例性指环病毒核酸序列(甲型细环病毒，进化分枝4)
[0470]
[0471]
[0472]
[0473] 注释:
[0474] 推定结构域 碱基范围
[0475] TATA盒 86-90
[0476] 帽位点 107-114
[0477] 转录起始位点 114
[0478] 5'UTR保守结构域 174-244
[0479] ORF2 354-716
[0480] ORF2/2 354-712；2372-2873
[0481] ORF2/3 354-712；2565-3075
[0482] ORF2t/3 354-400；2565-3075
[0483] ORF1 590-2899
[0484] ORF1/1 590-712；2372-2899
[0485] ORF1/2 590-712；2565-2873
[0486] 三开放阅读框区 2551-2870
[0487] 聚(A)信号 3071-3076
[0488] GC富集区 3733-3853
[0489] 表8.示例性指环病毒氨基酸序列(甲型细环病毒，进化分枝4)
[0490]
[0491]
[0492]
[0493] 表9.示例性指环病毒核酸序列(甲型细环病毒，进化分枝5)
[0494]
[0495]
[0496] 注释:
[0497] 推定结构域 碱基范围
[0498] TATA盒 83-87
[0499] 帽位点 104-111
[0500] 转录起始位点 111
[0501] 5'UTR保守结构域 171-241
[0502] ORF2 341-703
[0503] ORF2/2 341-699；2311-2806
[0504] ORF2/3 341-699；2504-2978
[0505] ORF2t/3 341-387；2504-2978
[0506] ORF1 577-2787
[0507] ORF1/1 577-699；2311-2787
[0508] ORF1/2 577-699；2504-2806
[0509] 三开放阅读框区 2463-2784
[0510] 聚(A)信号 2974-2979
[0511] GC富集区 3644-3758
[0512] 表10.示例性指环病毒氨基酸序列(甲型细环病毒，进化分枝5)
[0513]
[0514]
[0515] 表11.示例性指环病毒核酸序列(乙型细环病毒)
[0516]
[0517]
[0518] 注释:
[0519] 推定结构域 碱基范围
[0520] TATA盒 237-243
[0521] 帽位点 260-267
[0522] 转录起始位点 267
[0523] 5'UTR保守结构域 323-393
[0524] ORF2 424-723
[0525] ORF2/2 424-719；2274-2589
[0526] ORF2/3 424-719；2449-2812
[0527] ORF1 612-2612
[0528] ORF1/1 612-719；2274-2612
[0529] ORF1/2 612-719；2449-2589
[0530] 三开放阅读框区 2441-2586
[0531] 聚(A)信号 2808-2813
[0532] GC富集区 2868-2929
[0533] 表12.示例性指环病毒氨基酸序列(乙型细环病毒)
[0534]
[0535] 表13.示例性指环病毒核酸序列(丙型细环病毒)
[0536]
[0537]
[0538] 注释:
[0539] 推定结构域 碱基范围
[0540] TATA盒 21-25
[0541] 帽位点 42-49
[0542] 转录起始位点 49
[0543] 5'UTR保守结构域 117-187
[0544] ORF2 283-588
[0545] ORF2/2 283-584；1977-2388
[0546] ORF2/3 283-584；2197-2614
[0547] ORF1 432-2453
[0548] ORF1/1 432-584；1977-2453
[0549] ORF1/2 432-584；2197-2388
[0550] 三开放阅读框区 2186-2385
[0551] 聚(A)信号 2676-2681
[0552] GC富集区 3054-3172
[0553] 表14.示例性指环病毒氨基酸序列(丙型细环病毒)
[0554]
[0555]
[0556] 在一些实施例中，合成的愈合子包含最小的指环病毒基因组，例如，根据实例9中所述的方法所鉴定的。在一些实施例中，合成的愈合子包含指环病毒序列或其一部分，如实例13中所述。
[0557] 在一些实施例中，合成的愈合子包含遗传元件，所述遗传元件包含共有的指环病毒基序，例如，如表14-1所示。在一些实施例中，合成的愈合子包含遗传元件，所述遗传元件包含共有的指环病毒ORF1基序，例如，如表14-1所示。在一些实施例中，合成的愈合子包含遗传元件，所述遗传元件包含共有的指环病毒ORF1/1基序，例如，如表14-1所示。在一些实施例中，合成的愈合子包含遗传元件，所述遗传元件包含共有的指环病毒ORF1/2基序，例如，如表14-1所示。在一些实施例中，合成的愈合子包含遗传元件，所述遗传元件包含共有的指环病毒ORF2/2基序，例如，如表14-1所示。在一些实施例中，合成的愈合子包含遗传元件，所述遗传元件包含共有的指环病毒ORF2/3基序，例如，如表14-1所示。在一些实施例中，合成的愈合子包含遗传元件，所述遗传元件包含共有的指环病毒ORF2t/3基序，例如，如表14-1所示。在一些实施例中，如表14-1中所示，X表示任何氨基酸。在一些实施例中，如表14-
1中所示，Z表示谷氨酸或谷氨酰胺。在一些实施例中，如表14-1所示，B表示天冬氨酸或天冬酰胺。在一些实施例中，如表14-1中所示，J表示亮氨酸或异亮氨酸。
1中所示，Z表示谷氨酸或谷氨酰胺。在一些实施例中，如表14-1所示，B表示天冬氨酸或天冬酰胺。在一些实施例中，如表14-1中所示，J表示亮氨酸或异亮氨酸。
[0558] 表14-1.指环病毒的开放阅读框(ORF)中的共有基序
[0559]
[0560]
[0561] 遗传元件
[0562] 在一些实施例中，愈合子包含遗传元件。在一些实施例中，遗传元件具有以下一种或多种特征：与宿主细胞的基因组基本不整合，游离核酸，单链DNA，环状，约1kb至10kb，存在于细胞核内，可与内源蛋白结合，并产生靶向宿主基因的微小RNA。在一个实施例中，遗传元件是基本上非整合的DNA。在一实施例中，遗传元件与例如文中所述(例如，表1-14中任一个所述)的指环病毒序列或其片段具有至少约70％、75％、80％、8％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，遗传元件包含编码外源性效应子(例如有效负载)，例如多肽效应子(例如蛋白质)或核酸效应子(例如非编码RNA，例如miRNA、
siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA)的序列。
siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA)的序列。
[0563] 在一些实施例中，遗传元件的长度小于20kb(例如，小于约19kb、18kb、17kb、16kb、15kb、14kb、13kb、12kb、11kb、10kb、9kb、8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb或更小)。在一些实施例中，遗传元件独立地或额外地具有大于1000b的长度(例如，至少约1.1kb、1.2kb、
1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、
2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、
3.9kb、4kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5kb或更大)。在一些实施例中，遗传元件的长度为约2.5kb-4.6kb、2.8kb-4.0kb、3.0kb-3.8kb或3.2kb-
3.7kb。
1.3kb、1.4kb、1.5kb、1.6kb、1.7kb、1.8kb、1.9kb、2kb、2.1kb、2.2kb、2.3kb、2.4kb、2.5kb、
2.6kb、2.7kb、2.8kb、2.9kb、3kb、3.1kb、3.2kb、3.3kb、3.4kb、3.5kb、3.6kb、3.7kb、3.8kb、
3.9kb、4kb、4.1kb、4.2kb、4.3kb、4.4kb、4.5kb、4.6kb、4.7kb、4.8kb、4.9kb、5kb或更大)。在一些实施例中，遗传元件的长度为约2.5kb-4.6kb、2.8kb-4.0kb、3.0kb-3.8kb或3.2kb-
3.7kb。
[0564] 在一些实施例中，遗传元件包含本文描述的一个或多个特征，例如，编码基本上非致病性蛋白的序列，蛋白质结合序列，编码调节性核酸的一个或多个序列，一个或多个调节性序列，编码复制蛋白的一个或多个序列，以及其他序列。
[0565] 在一个实施例中，本发明包括一种遗传元件，所述遗传元件包括编码(i)基本上非致病性的外部蛋白质，(ii)将所述遗传元件结合至所述基本上非致病性的外部蛋白质的外部蛋白质结合序列，以及(iii)调节性核酸的核酸序列(例如DNA序列)。在这样的实施例中，遗传元件可包含一个或多个序列，所述序列与天然病毒序列的核苷酸序列中任一个具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸序列同一性。
[0566] 蛋白质，例如，基本上非致病性的蛋白质
[0567] 在一些实施例中，遗传元件包含编码蛋白质例如基本上非致病性的蛋白质的序列。在实施例中，基本上非致病性的蛋白质是愈合子的蛋白质外部的主要组分。多个基本上非致病性的蛋白质分子可以自装配成构成蛋白质外部的二十面体形式。在实施例中，蛋白质存在于蛋白质外部中。
[0568] 在一些实施例中，蛋白质，例如基本上非致病性的蛋白质和/或蛋白质外部蛋白质，包含一个或多个糖基化氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个。
[0569] 在一些实施例中，蛋白质，例如基本上非致病性的蛋白质和/或蛋白质外部蛋白质，包含至少一个亲水性DNA结合区、精氨酸富集区、苏氨酸富集区、谷氨酰胺富集区、N-末端聚精氨酸序列、可变区、C-末端聚谷氨酰胺/谷氨酸序列和一个或多个二硫键。
[0570] 在一些实施例中，遗传元件包含编码衣壳蛋白或衣壳蛋白片段的核苷酸序列或与编码文中所述的衣壳蛋白的核苷酸序列中任一个(例如，表1-16或19中任一个所列)具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的序列。在一些实施例中，遗传元件包含编码衣壳蛋白或衣壳蛋白的功能片段的核苷酸序列或与文中所述的核苷酸序列中任一个(例如，表1-16或19中任一个所列)具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施例中，基本上非致病性的蛋白包含衣壳蛋白或衣壳蛋白的功能片段，其由衣壳核苷酸序列或与文中所述的核苷酸序列中任一个(例如表1、3、5、7、9、11、13或15中任一个所列)具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的序列编码。
[0571] 表15：编码病毒蛋白例如衣壳蛋白的病毒序列的实例。
[0572]
[0573]
[0574]
[0575]
[0576]
[0577]
[0578]
[0579]
[0580]
[0581]
[0582]
[0583]
[0584]
[0585]
[0586]
[0587]
[0588]
[0589]
[0590]
[0591]
[0592]
[0593]
[0594]
[0595]
[0596]
[0597]
[0598]
[0599]
[0600]
[0601]
[0602]
[0603]
[0604]
[0605]
[0606]
[0607]
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[0610]
[0611]
[0612]
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[0615]
[0616]
[0617]
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[0619]
[0620]
[0621]
[0622]
[0623]
[0624]
[0625]
[0626]
[0627]
[0628]
[0629]
[0630]
[0631]
[0632]
[0633]
[0634]
[0635] 在一些实施例中，遗传元件包含编码以下的核苷酸序列：衣壳蛋白或衣壳蛋白的功能片段或与文中所述的氨基酸序列中任一个(例如，表2、4、6、8、10、12、14或16中任一个)具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施例中，基本上非致病性的蛋白包含衣壳蛋白或衣壳蛋白的功能片段或与文中所述的氨基酸序列中任一个(例如，表2、4、6、8、10、12、14或16中任一个)具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
[0636] 表16：基本上非致病性的蛋白例如衣壳蛋白的氨基酸序列的实例
[0637]
[0638]
[0639]
[0640]
[0641]
[0642]
[0643]
[0644]
[0645]
[0646]
[0647]
[0648]
[0649]
[0650]
[0651]
[0652]
[0653]
[0654]
[0655]
[0656] 在一些实施例中，遗传元件包含编码以下的核苷酸序列：氨基酸序列或其功能片段或与文中所述的氨基酸序列中任一个(例如，表17)具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施例中，基本上非致病性的蛋白包含氨基酸序列或其功能片段或与文中所述的氨基酸序列中任一个(例如，表2、4、6、8、10、12、14、16或17中任一个所列)具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
[0657] 在一些实施例中，遗传元件包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有文中所述的氨基酸序列(例如，表2、4、6、8、10、12、14、16或17中任一个所列，或图1中所示)或其功能片段的约1位至约150位(例如，或每个范围内的氨基酸的任何子集，例如约20位至约35位、约25位至约30位、约26位至约30)、约150位至约390位(例如，或每个范围内的氨基酸的任何子集，例如约200位至约380位、约205位至约375位、约205位至约371)、约390至约525位、约525位至约850位(例如，或每个范围内的氨基酸的任何子集，例如约530位至约840位、约545位至约830位、约550位至约820)、约850至约950位(例如，或每个范围内的氨基酸的任何子集，例如约860位至约940位、约870位至约930位、约880位至约923)的氨基酸序列。在一些实施例中，基本上非致病性的蛋白质包含氨基酸序列或其功能片段或与文中所述的氨基酸序列(例如，表2、4、6、8、10、12、14、16或17中任一个所列，或图1中所示)的约1位至约150位(例如，或文中所述的每个范围内的氨基酸的任何子集)、约150位至约390位、约390位至约525位、约525位至约850位、约850位至约950位具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
[0658] 在一些实施例中，基本上非致病性的蛋白质包含氨基酸序列或其功能片段或与文中所述的氨基酸序列或氨基酸范围中任一个(例如，表2、4、6、8、10、12、14、16或17中任一个所列，或图1中所示)具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，其中所述序列是功能结构域或提供以下功能，例如，物种和/或组织和/或细胞嗜性、病毒基因组结合和/或包装、免疫逃逸(非免疫原性和/或耐受性)、药代动力学、内吞作用和/或细胞附着、核进入、细胞内调节和定位、胞吐作用调节、繁殖、核酸保护及其组合。在一些实施例中，具有较少序列同一性的氨基酸范围可以提供本文所述的一种或多种性质以及细胞/组织/物种特异性(例如嗜性)的差异。
[0659] 蛋白质结合序列
[0660] 许多病毒采用的策略是病毒衣壳蛋白识别其基因组中的特定蛋白质结合序列。例如，在具有未分段基因组的病毒(例如酵母的L-A病毒)中，在基因组的5'端有二级结构(茎环)和特定序列，它们都用于结合病毒衣壳蛋白。但是，具有分段基因组的病毒(如呼肠孤病毒科、正粘病毒科(流行性感冒)、布尼亚病毒科和沙粒病毒)需要包装每个基因组片段。一些病毒利用片段的互补区来帮助病毒包括每个基因组分子中的一个。其他病毒对于每个不同的片段具有特定的结合位点。例如，参见Curr Opin Struct Biol.[结构生物学最新观点]2010年2月；20(1):114-120；和Journal of Virology[病毒学杂志](2003),77(24),13036-13041。
[0661] 在一些实施例中，遗传元件编码与基本上非致病性的蛋白质结合的蛋白质结合序列。在一些实施例中，蛋白质结合序列有助于将遗传元件包装到蛋白质外部中。在一些实施例中，蛋白质结合序列特异性结合基本上非致病性的蛋白质的精氨酸富集区。在一些实施例中，遗传元件包含如实例8中所述的蛋白质结合序列。在一些实施例中，遗传元件包含蛋白质结合序列，其与指环病毒序列的5’UTR保守结构域或GC富集结构域(例如，如表1、3、5、7、9、11或13中任一个所示)具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表1的指环病毒5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸177-247)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表1的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸3415-3570)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表3的指环病毒5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸
174-244)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表3的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸3691-3794)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表5的指环病毒5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸170-240)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表5的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸3632-3753)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表7的指环病毒5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸174-244)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表7的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸3733-3853)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表9的指环病毒
5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸171-241)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表9的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸3644-
3758)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表11的指环病毒5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸323-393)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表11的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸2868-2929)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表13的指环病毒5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸117-187)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在实施例中，蛋白质结合序列与表13的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸3054-3172)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表1的指环病毒5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸177-247)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表1的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表1的核酸序列的核苷酸3415-3570)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表3的指环病毒5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸
174-244)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表3的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表3的核酸序列的核苷酸3691-3794)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表5的指环病毒5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸170-240)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表5的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表5的核酸序列的核苷酸3632-3753)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表7的指环病毒5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸174-244)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表7的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表7的核酸序列的核苷酸3733-3853)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、
96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表9的指环病毒
5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸171-241)具有至少约70％、
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表9的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表9的核酸序列的核苷酸3644-
3758)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表11的指环病毒5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸323-393)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表11的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表11的核酸序列的核苷酸2868-2929)具有至少约70％、75％、80％、
85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在实施例中，蛋白质结合序列与表13的指环病毒5’UTR保守结构域核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸117-187)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在实施例中，蛋白质结合序列与表13的指环病毒GC富集核苷酸序列(例如，表13的核酸序列的核苷酸3054-3172)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
[0662] 在一些实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1和/或图21中所示的核酸序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在一些实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括表16-1所示的共有5'UTR序列的核酸序列，其中X1、X2、X3、X4和X5各自独立地是任何核苷酸，例如其中X1＝G或T，X2＝C或A，X3＝G或A，X4＝T或C，并且X5＝A、C或T)。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的共有
5'UTR序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的示例性TTV 5’UTR序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的TTV-CT30F 5’UTR序列具有至少约
75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的TTV-HD23a 5’UTR序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的TTV-JA20 5’UTR序列具有至少约75％(例如，至少
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的TTV-TJN02 5’UTR序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的TTV-tth8 5’UTR序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。
5'UTR序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的示例性TTV 5’UTR序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的TTV-CT30F 5’UTR序列具有至少约
75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的TTV-HD23a 5’UTR序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的TTV-JA20 5’UTR序列具有至少约75％(例如，至少
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的TTV-TJN02 5’UTR序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中所示的TTV-tth8 5’UTR序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、
90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。
[0663] 表16-1.来自指环病毒的示例性5'UTR序列
[0664]
[0665]
[0666] 在一些实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-2和/或图22中所示的核酸序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包含表16-1中所示的共有GC富集序列的核酸序列，其中X1、X4、X5、X6、X7、X12、X13、X14、X15、X20、X21、X22、X26、X29、X30和X33各自独立地是任何核苷酸，并且其中X2、X3、X8、X9、X10、X11、X16、X17、X18、X19、X23、X24、X25、X27、X28、X31、X32和X34各自独立地是不存在的或任何核苷酸。在一些实施例中，X1至X34中的一个或多个(例如全部)各自独立地是表16-2中指定的核苷酸(或不存在)。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中显示的共有GC富集序列具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中显示的示例性TTV GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段
2、片段3或其任何组合，例如按顺序排列的片段1-3)具有至少约75％(例如，至少75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中显示的TTV-CT30F GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8或其任何组合，例如按顺序排列的片段1-7)具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中显示的TTV-HD23a GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段
2、片段3、片段4、片段5、片段6、或其任何组合，例如按顺序排列的片段1-6)具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中显示的TTV-JA20 GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段2或其任何组合，例如按顺序排列的片段1和2)具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表
16-1中显示的TTV-TJN02 GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8或其任何组合，例如按顺序排列的片段1-8)具有至少约75％(例如，至少
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中显示的TTV-tth8 GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、或其任何组合，例如按顺序排列的片段1-6)具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％)同一性的核酸序列。
97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中显示的示例性TTV GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段
2、片段3或其任何组合，例如按顺序排列的片段1-3)具有至少约75％(例如，至少75％、
80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中显示的TTV-CT30F GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8或其任何组合，例如按顺序排列的片段1-7)具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中显示的TTV-HD23a GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段
2、片段3、片段4、片段5、片段6、或其任何组合，例如按顺序排列的片段1-6)具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中显示的TTV-JA20 GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段2或其任何组合，例如按顺序排列的片段1和2)具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表
16-1中显示的TTV-TJN02 GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、片段7、片段8或其任何组合，例如按顺序排列的片段1-8)具有至少约75％(例如，至少
75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的核酸序列。在实施例中，遗传元件(例如，遗传元件的蛋白质结合序列)包括与表16-1中显示的TTV-tth8 GC富集序列(例如，全序列、片段1、片段2、片段3、片段4、片段5、片段6、或其任何组合，例如按顺序排列的片段1-6)具有至少约75％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％或100％)同一性的核酸序列。
[0667] 表16-2.来自指环病毒的示例性GC富集序列
[0668]
[0669]
[0670]
[0671] 效应子
[0672] 在一些实施例中，遗传元件可以包括一个或多个编码功能性核酸，例如外源性效应子，例如治疗剂，例如调节性核酸，例如细胞毒性或细胞溶解RNA或蛋白质的序列。在一些实施例中，功能性核酸是非编码RNA。
[0673] 在一些实施例中，例如在如实例10、12或22中所述的插入位点处，将编码外源性效应子的序列插入遗传元件中。在实施例中，在非编码区处将编码外源性效应子的序列插入遗传元件中，例如，位于开放阅读框的3'和遗传元件的GC富集区的5'的非编码区，在TATA盒上游的5'非编码区中，在5’UTR中，在聚A信号下游或GC富集区上游的3'非编码区中。在实施例中，在例如文中所述的TTV-tth8质粒的约核苷酸3588处或在例如文中所述的TTMV-LY2质粒的约核苷酸2843处将编码外源性效应子的序列插入遗传元件中。在实施例中，在例如文中所述的TTV-tth8质粒的核苷酸336-3015处或之内或在例如文中所述的TTV-LY2质粒的核苷酸242-2812处或之内将编码外源性效应子的序列插入遗传元件中。在一些实施例中，编码外源性效应子的序列替代了开放阅读框的一部分或全部(例如，本文所述的ORF，例如，表1-14中任一个所示的ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3和/或ORF2t/3)。
[0674] 在一些实施例中，编码外源性效应子的序列包括100-2000、100-1000、100-500、100-200、200-2000、200-1000、200-500、500-1000、500-2000或1000-2000个核苷酸。在一些实施例中，外源性效应子是核酸或蛋白质有效负载，例如，如实例11中所述。
[0675] 调节性核酸
[0676] 在一些实施例中，调节性核酸修饰内源基因和/或外源基因的表达。在一实施例中，调节性核酸靶向宿主基因。调节性核酸可包括但不限于与内源基因杂交的核酸(例如，如本文其他地方所述的miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA)、与外源核酸(例如病毒DNA或RNA)杂交的核酸、与RNA杂交的核酸、干扰基因转录的核酸、干扰RNA翻译的核酸、稳定RNA或去稳定RNA的核酸(例如通过靶向降解)，以及调节DNA或RNA结合因子的核酸。在实施例中，调节性核酸编码miRNA。
[0677] 在一些实施例中，调节性核酸包含通常包含5-500个碱基对的RNA或RNA样结构(取决于特定的RNA结构，例如miRNA5-30bp、lncRNA 200-500bp)并且可以具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列或编码细胞内表达的靶基因的序列相同(或互补)或几乎相同(或基本上互补)的核碱基序列。
[0678] 在一些实施例中，调节性核酸包含核酸序列，例如，指导RNA(gRNA)。在一些实施例中，DNA靶向部分包含指导RNA或编码指导RNA的核酸。gRNA短合成RNA可以由与不完整的效应子部分结合所必需的“支架”序列和用于基因组靶标的用户定义的约20个核苷酸靶向序列组成。在实践中，指导RNA序列通常被设计为具有17-24个核苷酸(例如19、20或21个核苷酸)的长度，并且与靶核酸序列互补。定制的gRNA生成器和算法可从商业上获得，用于设计有效的指导RNA。还使用嵌合的“单指导RNA”(“sgRNA”)，一种模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物并包含tracrRNA(用于结合核酸酶)和至少一个crRNA(以将核酸酶指导至编辑目标序列)的工程化(合成)单RNA分子，实现了基因编辑。也已经证明，在基因组编辑中，化学修饰的sgRNA是有效的；参见，例如，Hendel等人(2015)Nature Biotechnol.[自然生物技术],985-991。
[0679] 调节性核酸包含识别特定DNA序列(例如，与基因的启动子、增强子、沉默子或阻遏子相邻或在其内的序列)的gRNA。
[0680] 某些调节性核酸可以通过RNA干扰(RNAi)的生物过程抑制基因表达。RNAi分子包含RNA或RNA样结构，其通常包含15-50个碱基对(例如约18-25个碱基对)并且具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。RNAi分子包括但不限于：短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双螺旋和dicer底物(美国专利号8,084,599、8,349,809和8,513,207)。
[0681] 长非编码RNA(lncRNA)定义为长于100个核苷酸的非蛋白质编码转录物。这个有点随意的限制将lncRNA与小型调节性RNA(例如微小RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)和其他短RNA)区分开来。通常，大多数(约78％)lncRNA的特征为组织特异性的。以与附近蛋白质编码基因相反的方向转录的发散lncRNA(占哺乳动物基因组中总lncRNA的约20％大比例)可能会调节附近基因的转录。
[0682] 遗传元件可以编码具有与内源基因或基因产物(例如，mRNA)的全部或片段基本上互补或完全互补的序列的调节性核酸。调节性核酸可以与内含子和外显子之间的边界处的序列互补，从而防止特异性基因的新生成的核RNA转录物成熟为用于转录的mRNA。与特定性基因互补的调节性核酸可与该基因的mRNA杂交并阻止其翻译。反义调节性核酸可以是DNA、RNA或其衍生物或杂交体。
[0683] 与目的转录物杂交的调节性核酸的长度可以在5至30个核苷酸之间，在约10至30个核苷酸之间，或约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个核苷酸。调节性核酸与靶向转录物的同一性程度应为至少75％、至少80％、至少
85％、至少90％或至少95％。
85％、至少90％或至少95％。
[0684] 遗传元件可以编码调节性核酸，例如与靶基因的约5至约25个连续核苷酸相同的微小RNA(miRNA)分子。在一些实施例中，miRNA序列靶向mRNA并从二核苷酸AA开始，其GC含量为约30％-70％(约30％-60％、约40％-60％或约45％-55％)，并且例如通过标准BLAST搜索测定，与要引入其中的哺乳动物基因组中的靶标以外的任何核苷酸序列不具有高百分比同一性。
[0685] 在一些实施例中，调节性核酸是至少一种miRNA，例如2、3、4、5、6种或更多种。在一些实施例中，遗传元件包含编码miRNA的序列，所述miRNA与文中所述例如表18中所述的核苷酸序列或与序列互补的序列中任一个具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性。
[0686] 表18：调节性核酸例如miRNA的实例。
[0687]
[0688]
[0689]
[0690]
[0691]
[0692]
[0693]
[0694]
[0695] siRNA和shRNA类似于内源性微小RNA(miRNA)基因的加工途径中的中间体(Bartel,Cell[细胞]116:281-297,2004)。在一些实施例中，siRNA可以用作miRNA，反之亦然(Zeng等人,Mol Cell[分子细胞学]9:1327-1333,2002；Doench等人,Genes Dev[基因与发育]17:438-442,2003)。像siRNA一样，微小RNA使用RISC来下调靶基因，但与siRNA不同，大多数动物miRNA都不切割mRNA。相反，miRNA通过翻译抑制或聚A去除和mRNA降解降低蛋白质输出(Wu等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国科学院院报]103:4034-4039,2006)。已知的miRNA结合位点位于mRNA3'UTR内；miRNA似乎靶向与miRNA5'末端的2-8个核苷酸几乎完全互补的位点(Rajewsky,Nat Genet[自然遗传学]38增刊:S8-13,2006；Lim等人,Nature
[自然]433:769-773,2005)。该区域称为种子区域。由于siRNA和miRNA是可互换的，因此外源siRNA下调与siRNA具有种子互补性的mRNA(Birmingham等人,Nat Methods[自然方法]3:
199-204,2006)。3'UTR内的多个靶位点会产生更强的下调(Doench等人,Genes Dev[基因与发育]17:438-442,2003)。
[自然]433:769-773,2005)。该区域称为种子区域。由于siRNA和miRNA是可互换的，因此外源siRNA下调与siRNA具有种子互补性的mRNA(Birmingham等人,Nat Methods[自然方法]3:
199-204,2006)。3'UTR内的多个靶位点会产生更强的下调(Doench等人,Genes Dev[基因与发育]17:438-442,2003)。
[0696] 已知miRNA序列的列表可在研究组织维护的数据库中找到，这些组织例如维康信托基金会桑格研究院(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾夕法尼亚生物信息学中心(Penn Center for Bioinformatics)、斯隆凯特灵癌症中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)和欧洲分子生物学实验室(European Molecule Biology Laboratory)等。
已知的有效的siRNA序列和同源结合位点也很好地呈现在相关文献中。通过本领域已知的技术，RNAi分子易于设计和生产的。此外，存在增加发现有效并且特异性的基序的机会的计算工具(Lagana等人,Methods Mol.Bio.[分子生物学方法],2015,1269:393-412)。
已知的有效的siRNA序列和同源结合位点也很好地呈现在相关文献中。通过本领域已知的技术，RNAi分子易于设计和生产的。此外，存在增加发现有效并且特异性的基序的机会的计算工具(Lagana等人,Methods Mol.Bio.[分子生物学方法],2015,1269:393-412)。
[0697] 调节性核酸可以调节基因编码的RNA的表达。因为多个基因可以彼此共享一定程度的序列同源性，所以在一些实施例中，可以将调节性核酸设计为靶向具有足够序列同源性的一类基因。在一些实施例中，调节性核酸可包含与在不同基因靶之间共享的序列互补的或特定基因靶所特有的序列。在一些实施例中，可以将调节性核酸设计为靶向在几个基因之间具有同源性的RNA序列的保守区，从而靶向基因家族中的几个基因(例如，不同的基因同工型、剪接变体、突变基因等)。在一些实施例中，可以将调节性核酸设计为靶向单一基因的特定RNA序列所特有的序列。
[0698] 在一些实施例中，遗传元件可以包括一个或多个编码调节一个或多个基因表达的调节性核酸的序列。
[0699] 在一个实施例中，本文其他地方描述的gRNA被用作用于基因编辑的CRISPR系统的一部分。出于基因编辑的目的，可将愈合子设计为包括一个或多个与所需的靶DNA序列相对应的指导RNA序列；参见，例如，Cong等人(2013)Science[科学],339:819-823；Ran等人(2013)Nature Protocols[自然实验手册],8:2281-2308。gRNA序列的至少约16或17个核苷酸通常允许Cas9介导的DNA切割发生；对于Cpf1，需要gRNA序列的至少约16个核苷酸，从而实现可检测的DNA切割。
[0700] 治疗性肽或多肽
[0701] 在一些实施例中，遗传元件包含编码治疗性肽或多肽的序列。这样的治疗剂包括但不限于小肽、拟肽(例如类肽)、氨基酸和氨基酸类似物。这样的治疗剂通常具有小于约5,000克/摩尔的分子量、小于约2,000克/摩尔的分子量、小于约1,000克/摩尔的分子量、小于约500克/摩尔的分子量和此类化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。这样的治疗剂可以包括但不限于神经递质、激素、药物、毒素、病毒或微生物颗粒、合成分子及其激动剂或拮抗剂。
[0702] 在一些实施例中，遗传元件包括编码肽例如治疗性肽的序列。肽可以是直链或支链的。所述肽的长度为约5至约500个氨基酸、约15至约400个氨基酸、约20至约325个氨基酸、约25至约250个氨基酸、约50至约150个氨基酸或其间的任何范围。
[0703] 肽的一些实例包括但不限于荧光标签或标记、抗原、治疗性肽、天然生物活性肽的合成或类似物肽、激动剂或拮抗剂肽、抗微生物肽、靶向或细胞毒性肽、降解或自毁肽、以及多种降解或自毁肽。本文所述的可用于本发明的肽还包括抗原结合肽，例如抗原结合抗体或抗体样片段，例如单链抗体、纳米抗体(参见，例如，Steeland等人2016.Nanobodies as therapeutics:big opportunities for small antibodies.[纳米抗体作为治疗剂：小抗体的巨大机会]Drug Discov Today[今日药物发现]:21(7):1076-113)。这样的抗原结合肽可以结合细胞质抗原、核抗原或细胞内抗原。
[0704] 在一些实施例中，遗传元件包括编码蛋白质例如治疗性蛋白质的序列。治疗性蛋白质的一些实例可以包括但不限于激素、细胞因子、酶、抗体、转录因子、受体(例如膜受体)、配体、膜转运蛋白、分泌的蛋白质、肽、载体蛋白、结构蛋白、核酸酶或其组分。
[0705] 在一些实施例中，本文所述的组合物或愈合子包括与能够靶向特定位置、组织或细胞的配体连接的多肽。
[0706] 调节性序列
[0707] 在一些实施例中，遗传元件包含调节性序列，例如启动子或增强子。
[0708] 在一些实施例中，启动子包括与编码表达产物的DNA序列相邻的DNA序列。启动子可以可操作地连接至相邻的DNA序列。与不存在启动子时表达的产物的量相比，启动子通常增加DNA序列表达的产物的量。来自一种生物体的启动子可用于增强来自另一生物体的DNA序列的产物表达。例如，脊椎动物启动子可用于在脊椎动物中表达水母GFP。另外，一个启动子元件可以增加串联连接的多个DNA序列表达的产物的量。因此，一种启动子元件可以增强一种或多种产物的表达。多个启动子元件是本领域普通技术人员众所周知的。
[0709] 在一个实施例中，期望高水平的组成型表达。此类启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)长末端重复(LTR)启动子/增强子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子/增强子(参见，例如，Boshart等人,Cell[细胞],41:521-530(1985))、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、细胞质β-肌动蛋白启动子和磷酸甘油激酶(PGK)启动子。
[0710] 在另一个实施例中，可能期望诱导型启动子。诱导型启动子是由外源供应的化合物以顺式或反式调节的那些启动子，包括但不限于锌诱导的绵羊金属硫蛋白(MT)启动子；地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子；T7聚合酶启动子系统(WO 98/
10088)；四环素阻抑型系统(Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报],89:
5547-5551(1992))；四环素诱导型系统(Gossen等人,Science[科学],268:1766-1769
(1995)；还参见Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol.[化学生物学新见],2:512-518
(1998))；RU486诱导型系统(Wang等人,Nat.Biotech.[自然生物技术],15:239-243(1997)和Wang等人,Gene Ther.[基因治疗],4:432-441(1997))；和雷帕霉素诱导型系统(Magari等人,J.Clin.Invest.[临床投资杂志],100:2865-2872(1997)；Rivera等人,
Nat.Medicine.[自然医学]2:1028-1032(1996))。可在本文中使用的其他类型的诱导型启动子是那些由特定的生理状态例如温度、急性期或仅在复制细胞中调节的启动子。
10088)；四环素阻抑型系统(Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报],89:
5547-5551(1992))；四环素诱导型系统(Gossen等人,Science[科学],268:1766-1769
(1995)；还参见Harvey等人,Curr.Opin.Chem.Biol.[化学生物学新见],2:512-518
(1998))；RU486诱导型系统(Wang等人,Nat.Biotech.[自然生物技术],15:239-243(1997)和Wang等人,Gene Ther.[基因治疗],4:432-441(1997))；和雷帕霉素诱导型系统(Magari等人,J.Clin.Invest.[临床投资杂志],100:2865-2872(1997)；Rivera等人,
Nat.Medicine.[自然医学]2:1028-1032(1996))。可在本文中使用的其他类型的诱导型启动子是那些由特定的生理状态例如温度、急性期或仅在复制细胞中调节的启动子。
[0711] 在一些实施例中，使用目的基因或核酸序列的天然启动子。当期望基因或核酸序列的表达应模拟天然表达时，可以使用天然启动子。当基因或其他核酸序列的表达必须在时间或发育上，或以组织特异性方式或响应于特定转录刺激进行调节时，可以使用天然启动子。在另一个实施例中，也可以使用其他天然表达控制元件，例如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列来模拟天然表达。
[0712] 在一些实施例中，遗传元件包含可操作地连接至组织特异性启动子的基因。例如，如果需要在骨骼肌中表达，则可以使用在肌肉中有活性的启动子。这些包括来自编码骨骼肌α-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌营养不良蛋白、肌肉肌酸激酶、以及具有比天然启动子更高活性的合成肌肉启动子的启动子。参见Li等人,Nat.Biotech.[自然生物技术],17:241-245(1999)。对于以下的组织特异性的启动子的实例是已知的：肝白蛋白，Miyatake等人J.Virol.[病毒学杂志],71:5124-32(1997)；乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人,
Gene Ther.[基因治疗]3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人,Hum.Gene Ther.[人类基因治疗],7:1503-14(1996)，骨骼(骨钙素，Stein等人,Mol.Biol.Rep.[分子生物学报告],24:185-96(1997)；骨骼唾液蛋白，Chen等人,J.Bone Miner.Res.[骨与矿物质研究杂志]11:654-64(1996))，淋巴细胞(CD2，Hansal等人,J.Immunol.[免疫学杂志],161:
1063-8(1998)；免疫球蛋白重链；T细胞受体A链)，神经元(神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子，Andersen等人Cell.Mol.Neurobiol.[细胞与分子神经生物学],13:503-15(1993)；神经丝轻链基因，Piccioli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报],88:5611-5
(1991)；神经元特异性vgf基因，Piccioli等人,Neuron[神经元],15:373-84(1995)]；等。
Gene Ther.[基因治疗]3:1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人,Hum.Gene Ther.[人类基因治疗],7:1503-14(1996)，骨骼(骨钙素，Stein等人,Mol.Biol.Rep.[分子生物学报告],24:185-96(1997)；骨骼唾液蛋白，Chen等人,J.Bone Miner.Res.[骨与矿物质研究杂志]11:654-64(1996))，淋巴细胞(CD2，Hansal等人,J.Immunol.[免疫学杂志],161:
1063-8(1998)；免疫球蛋白重链；T细胞受体A链)，神经元(神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子，Andersen等人Cell.Mol.Neurobiol.[细胞与分子神经生物学],13:503-15(1993)；神经丝轻链基因，Piccioli等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报],88:5611-5
(1991)；神经元特异性vgf基因，Piccioli等人,Neuron[神经元],15:373-84(1995)]；等。
[0713] 遗传元件可包括增强子，例如与编码基因的DNA序列相邻的DNA序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游，或者可以位于编码DNA序列(例如，转录或翻译成一种或多种产物的DNA序列)的下游或之内。因此，增强子元件可位于编码产物的DNA序列上游或下游的100个碱基对、200个碱基对或300个或更多个碱基对。增强子元件可以增加DNA序列表达的重组产物的量，超出由启动子元件提供的增加的表达。对于本领域普通技术人员而言，多个增强子元件是容易获得的。
[0714] 在一些实施例中，遗传元件包括在编码本文所述的表达产物的序列侧翼的一个或多个反向末端重复序列(ITR)。在一些实施例中，遗传元件包含在编码本文所述的表达产物的序列侧翼的一个或多个长末端重复序列(LTR)。可以使用的启动子序列的实例包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、Epstein-Barr病毒立即早期启动子和劳斯肉瘤病毒启动子。
[0715] 复制蛋白
[0716] 在一些实施例中，愈合子例如合成的愈合子的遗传元件可包括编码一种或多种复制蛋白的序列。在一些实施例中，愈合子可以通过滚环复制法复制，例如，前导链和滞后链的合成是不偶联的。在这样的实施例中，愈合子包含三个附加元件：i)编码起始蛋白的基因，ii)双链起点，和iii)单链起点。包含复制蛋白的滚环复制(RCR)蛋白复合物与前导链结合并使复制起点去稳定。RCR复合物切割基因组以产生游离的3'OH末端。细胞DNA聚合酶从游离的3'OH末端开始病毒DNA复制。复制基因组后，RCR复合物共价地闭合环。这导致释放出正的环状单链亲本DNA分子和由负的亲本链和新合成的正链组成的环状双链DNA分子。单链DNA分子可以被包壳或涉及第二轮复制。参见例如Virology Journal[病毒学杂志]2009,6:60doi:10.1186/1743-422X-6-60。
[0717] 遗传元件可包含编码聚合酶，例如RNA聚合酶或DNA聚合酶的序列。
[0718] 其他序列
[0719] 在一些实施例中，遗传元件还包括编码产物(例如核酶、编码蛋白质的治疗性mRNA、外源基因)的核酸。
[0720] 在一些实施例中，遗传元件包括一个或多个影响愈合子在宿主或宿主细胞中的物种和/或组织和/或细胞嗜性(例如衣壳蛋白序列)、感染性(例如衣壳蛋白序列)、免疫抑制/激活(例如调节核酸)、病毒基因组结合和/或包装、免疫逃逸(非免疫原性和/或耐受性)、药代动力学、内吞作用和/或细胞附着、核进入、细胞内调节和定位、胞吐作用调节、繁殖和核酸保护的序列。
[0721] 在一些实施例中，遗传元件可以包含其他序列，其包括DNA、RNA或人工核酸。其他序列可以包括但不限于基因组DNA，cDNA或编码tRNA、mRNA、rRNA、miRNA、gRNA、siRNA或其他RNAi分子的序列。在一个实施例中，遗传元件包括编码siRNA的序列，以靶向与调节性核酸相同的基因表达产物的不同基因座。在一个实施例中，遗传元件包括编码siRNA的序列，以靶向与调节性核酸不同的基因表达产物。
[0722] 在一些实施例中，遗传元件进一步包含以下序列中的一个或多个：编码一个或多个miRNA的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂的序列、调节性序列(例如启动子、增强子)、编码一个或多个靶向内源基因(siRNA、lncRNA、shRNA)的调节性序列的序列和编码治疗性mRNA或蛋白质的序列。
[0723] 其他序列的长度可为约2nt至约5000nt、约10nt至约100nt、约50nt至约150nt、约100nt至约200nt、约150nt至约250nt、约200至约300nt、约250nt至约350nt、约300nt至约
500nt、约10nt至约1000nt、约50nt至约1000nt、约100nt至约1000nt、约1000nt至约2000nt、约2000nt至约3000nt、约3000nt至约4000nt、约4000nt至约5000nt或其间的任何范围。
500nt、约10nt至约1000nt、约50nt至约1000nt、约100nt至约1000nt、约1000nt至约2000nt、约2000nt至约3000nt、约3000nt至约4000nt、约4000nt至约5000nt或其间的任何范围。
[0724] 外源基因
[0725] 例如，遗传元件可以包括与信号传导生化途径相关的基因，例如与信号传导生化途径相关的基因或多核苷酸。实例包括与疾病相关的基因或多核苷酸。“与疾病相关的”基因或多核苷酸是指与非疾病对照的组织或细胞相比，在患病组织衍生的细胞中以异常水平或异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷酸。它可能是会以异常高水平表达的基因；它可能是会以异常低水平表达的基因，其中表达的改变与疾病的发生和/或进展相关。与疾病相关的基因还指具有直接引起病因或与引起病因的一个或多个基因连锁不平衡的一个或多个突变或基因变异的基因。
[0726] 与疾病相关的基因和多核苷酸的实例可得自约翰·霍普金斯大学的麦考斯克-纳森斯遗传医学研究所(马里兰州巴尔的摩)(McKusick-Nathans Institute of Genetic
Medicine,Johns Hopkins University(Baltimore,Md.))和国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(马里兰州贝塞斯达)(National Center for Biotechnology Information,
National Library of Medicine(Bethesda,Md.))。与疾病相关的基因和多核苷酸的实例列于美国专利号：8,697,359的表A和B中，所述专利通过引用整体并入本文。特定疾病信息可获自约翰·霍普金斯大学的麦考斯克-纳森斯遗传医学研究所(马里兰州巴尔的摩)
(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns Hopkins University
(Baltimore,Md.))和国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(马里兰州贝塞斯达)
(National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine
(Bethesda,Md.))。与信号传导生化途径相关的基因和多核苷酸的实例列于美国专利号：8,
697,359的表A-C中，所述专利通过引用整体并入本文。
Medicine,Johns Hopkins University(Baltimore,Md.))和国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(马里兰州贝塞斯达)(National Center for Biotechnology Information,
National Library of Medicine(Bethesda,Md.))。与疾病相关的基因和多核苷酸的实例列于美国专利号：8,697,359的表A和B中，所述专利通过引用整体并入本文。特定疾病信息可获自约翰·霍普金斯大学的麦考斯克-纳森斯遗传医学研究所(马里兰州巴尔的摩)
(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns Hopkins University
(Baltimore,Md.))和国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(马里兰州贝塞斯达)
(National Center for Biotechnology Information,National Library of Medicine
(Bethesda,Md.))。与信号传导生化途径相关的基因和多核苷酸的实例列于美国专利号：8,
697,359的表A-C中，所述专利通过引用整体并入本文。
[0727] 此外，如本文其他地方所述，遗传元件可以编码靶向部分。这可以例如通过插入编码糖、糖脂或蛋白质例如抗体的多核苷酸来实现。本领域技术人员知道用于生成靶向部分的其他方法。
[0728] 病毒序列
[0729] 在一些实施例中，遗传元件包含至少一个病毒序列。在一些实施例中，所述序列与来自单链DNA病毒，例如指环病毒、比那病毒、圆环病毒、双生病毒、基诺病毒、丝状病毒、微小病毒、纳米病毒、细小病毒和斯派拉病毒的一个或多个序列具有同源性或同一性。在一些实施例中，所述序列与来自双链DNA病毒，例如腺病毒、瓶状病毒、囊泡病毒、非洲猪瘟病毒、杆状病毒、福斯罗病毒、球状病毒、滴状病毒、腺炎病毒、疱疹病毒、虹彩病毒、脂毛病毒、尼马病毒和痘病毒的一个或多个序列具有同源性或同一性。在一些实施例中，所述序列与来自RNA病毒，例如甲病毒、真菌传杆状病毒、肝炎病毒、大麦病毒、烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒、三角病毒、风疹病毒、双RNA病毒、囊状病毒、分体病毒和呼肠病毒的一个或多个序列具有同源性或同一性。
[0730] 在一些实施例中，遗传元件可包含来自非致病性病毒，例如共生病毒(symbiotic virus)，例如共栖病毒(commensal virus)，例如天然病毒，例如指环病毒的一个或多个序列。命名法的最新变化已将三种能够感染人细胞的指环病毒划分为病毒的指环病毒科的甲型细环病毒(TT)、乙型细环病毒(TTM)和丙型细环病毒(TTMD)属。迄今为止，指环病毒尚未与任何人疾病相关联。在一些实施例中，遗传元件可包含与细环病毒(TT)具有同源性或同一性的序列，所述细环病毒(TT)是一种具有环状负义基因组的非包膜单链DNA病毒。在一些实施例中，遗传元件可包含与SEN病毒、前哨病毒、TTV样微小病毒和TT病毒具有同源性或同一性的序列。已经描述了不同类型的TT病毒，包括TT病毒基因型6、TT病毒群、TTV样病毒DXL1和TTV样病毒DXL2。在一些实施例中，遗传元件可包含与较小病毒、细环样微小病毒(TTM)或基因组大小在TTV和TTMV之间的第三种病毒(称为细环样中型病毒(TTMD))具有同源性或同一性的序列。在一些实施例中，遗传元件可包含与文中所述例如表19中核苷酸序列中任一个具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸序列同一性的来自非致病性病毒的一个或多个序列或序列的片段。
[0731] 表19：例如编码衣壳蛋白的病毒序列的实例。第一列通过其全基因组登记号鉴定株系。第二列鉴定第三列中列出的ORF编码的蛋白质的登记号。第四列显示了编码第三列中列出的ORF的核酸序列。
[0732]
[0733]
[0734]
[0735]
[0736]
[0737]
[0738]
[0739]
[0740]
[0741]
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[0751]
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[0753]
[0754]
[0755]
[0756]
[0757] 在一些实施例中，遗传元件可包含与文中所述例如表20中核苷酸序列中任一个具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸序列同一性的来自基本上非致病性病毒的一个或多个序列或序列的片段。
[0758] 表20：指环病毒及其序列的实例。登记号 和相关序列信息可在www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/上获得，以2017年6月12日作为参考。
[0759]
[0760]
[0761]
[0762]
[0763] 在一些实施例中，遗传元件包含与来自一种或多种非指环病毒，例如腺病毒、疱疹病毒、pox病毒、痘苗病毒、SV40、乳头瘤病毒、RNA病毒(例如逆转录病毒、例如慢病毒)、单链RNA病毒(例如肝炎病毒)或双链RNA病毒(例如轮状病毒)的一个或多个序列具有同源性或同一性的一个或多个序列。由于在一些实施例中，重组逆转录病毒是有缺陷的，因此可以提供协助以产生感染性颗粒。可以例如通过使用辅助细胞系来提供这种协助，所述辅助细胞系包含在LTR内的调节性序列的控制下编码逆转录病毒的所有结构基因的质粒。用于复制本文所述的愈合子的合适细胞系包括本领域已知的细胞系，例如A549细胞，其可以如本文所述进行修饰。所述遗传元件可以另外包含编码可选择标记的基因，从而可以鉴定期望的遗传元件。
[0764] 在一些实施例中，遗传元件包括非沉默突变，例如导致编码的多肽中氨基酸差异的碱基置换、缺失或添加，只要序列与由第一核苷酸序列编码的多肽保持至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或以其他方式可用于实施本发明。在这方面，可以进行某些保守的氨基酸置换，这些置换通常被认为不会使蛋白质的整体功能失活：例如对于带正电的氨基酸(反之亦然)，赖氨酸、精氨酸和组氨酸；对于带负电的氨基酸(反之亦然)，天冬氨酸和谷氨酸；对于某些电中性氨基酸的组(在所有情况下，反之亦然)，(1)丙氨酸和丝氨酸，(2)天冬酰胺、谷氨酰胺和组氨酸，(3)半胱氨酸和丝氨酸，(4)甘氨酸和脯氨酸，(5)异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，(6)蛋氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(7)苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和酪氨酸，(8)丝氨酸和苏氨酸，(9)色氨酸和酪氨酸，(10)以及例如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。氨基酸可以根据物理性质以及对二级和三级蛋白质结构的贡献进行分类。保守置换在本领域中被认为是一个氨基酸被具有相似特性的另一氨基酸置换。
[0765] 具有相同或指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个核酸或多肽序列的同一性(例如，当在比较窗口或指定区域内进行最大对应性的比较和对齐时，在具体区域内约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或更高同一性)可使用具有以下所述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，或通过手动比对和目视检查(例如，参见NCBI网站www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)进行测量。同一性也可以指或可以用于对测试序列的补充。同一性还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有置换的序列。如本文所述，算法考虑了缺口等。同一性可以在长度为至少约10个氨基酸或核苷酸、长度为约15个氨基酸或核苷酸、长度为约20个氨基酸或核苷酸、长度为约25个氨基酸或核苷酸、长度为约30个氨基酸或核苷酸、长度为约35个氨基酸或核苷酸、长度为约40个氨基酸或核苷酸、长度为约45个氨基酸或核苷酸、长度为约50个氨基酸或核苷酸、或更多的区域中存在。
97％、98％、99％或更高同一性)可使用具有以下所述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法，或通过手动比对和目视检查(例如，参见NCBI网站www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/等)进行测量。同一性也可以指或可以用于对测试序列的补充。同一性还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有置换的序列。如本文所述，算法考虑了缺口等。同一性可以在长度为至少约10个氨基酸或核苷酸、长度为约15个氨基酸或核苷酸、长度为约20个氨基酸或核苷酸、长度为约25个氨基酸或核苷酸、长度为约30个氨基酸或核苷酸、长度为约35个氨基酸或核苷酸、长度为约40个氨基酸或核苷酸、长度为约45个氨基酸或核苷酸、长度为约50个氨基酸或核苷酸、或更多的区域中存在。
[0766] 在一些实施例中，遗传元件包含与文中所述例如表19或表20中核苷酸序列中任一个具有至少约75％核苷酸序列同一性，至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。由于遗传密码是简并的，因此同源核苷酸序列可包括任何数目的“沉默”碱基改变，即仍然编码相同氨基酸的核苷酸置换。
[0767] 基因编辑组分
[0768] 合成的愈合子的遗传元件可以包括一个或多个编码基因编辑系统的组分的基因。示例性的基因编辑系统包括成簇的调节性间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、锌指核酸酶(ZFN)和基于转录激活子样效应子的核酸酶(TALEN)。基于ZFN、TALEN和CRISPR的方法已在例如在Gaj等人Trends Biotechnol.[生物技术动向]31.7(2013):397-405中描述；CRISPR基因编辑方法例如在Guan等人,Application of CRISPR-Cas system in gene therapy:
Pre-clinical progress in animal model.[CRISPR-Cas系统在基因治疗中的应用：动物模型中的临床前进展]DNA Repair[DNA修复]2016年10月；46:1-8.doi:10.1016/
j.dnarep.2016.07.004；Zheng等人,Precise gene deletion and replacement using
the CRISPR/Cas9 system in human cells[使用CRISPR/Cas9系统在人细胞中进行精确基因缺失和替换].BioTechniques[生物技术],第57卷,第3号,2014年9月,第115-124页中描
述。
Pre-clinical progress in animal model.[CRISPR-Cas系统在基因治疗中的应用：动物模型中的临床前进展]DNA Repair[DNA修复]2016年10月；46:1-8.doi:10.1016/
j.dnarep.2016.07.004；Zheng等人,Precise gene deletion and replacement using
the CRISPR/Cas9 system in human cells[使用CRISPR/Cas9系统在人细胞中进行精确基因缺失和替换].BioTechniques[生物技术],第57卷,第3号,2014年9月,第115-124页中描
述。
[0769] CRISPR系统是最初在细菌和古细菌中发现的自适应防御系统。CRISPR系统使用称为CRISPR相关或“Cas”内切核酸酶的RNA指导的核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)来切割外源DNA。在典型的CRISPR/Cas系统中，内切核酸酶通过靶向单链或双链DNA序列的序列特异性的非编码“指导RNA”定向到靶核苷酸序列(例如，基因组中待序列编辑的位点)。已经鉴定了三类(I-III)CRISPR系统。II类CRISPR系统使用单个Cas内切核酸酶(而不是多个Cas蛋白)。一种II类CRISPR系统包括II类Cas内切核酸酶，例如Cas9、CRISPR RNA(“crRNA”)和反式激活crRNA(“tracrRNA”)。crRNA包含“指导RNA”，即通常对应于靶DNA序列的约20个核苷酸RNA序列。crRNA还包含与tracrRNA结合的区域，以形成被RNase III切割的部分双链结构，产生crRNA/tracrRNA杂交体。然后，crRNA/tracrRNA杂交体指导Cas9内切核酸酶识别并切割靶DNA序列。靶DNA序列必须总体上邻近针对给定Cas内切核酸酶来说是特异性的“原间隔子邻近基序”(“PAM”)；然而，PAM序列似乎遍布整个给定基因组。
[0770] 在一些实施例中，愈合子包括CRISPR内切核酸酶的基因。例如，从不同原核物种鉴定的一些CRISPR内切核酸酶具有独特的PAM序列要求；PAM序列的实例包括5’-NGG(酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、5’-NNAGAA(嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CRISPR1)、5’-NGGNG(嗜热链球菌CRISPR3)、和5’-NNNGATT(奈瑟氏脑膜炎双球菌(Neisseria meningiditis))。一些内切核酸酶例如Cas9内切核酸酶与富含G的PAM位点例如5'-NGG有关，并在距PAM位点上游(5')3个核苷酸处对靶DNA进行平末端切割。另一个II类CRISPR系统包括小于Cas9的V型内切核酸酶Cpf1；实例包括AsCpf1(来自氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.))和LbCpf1(来自毛螺旋菌属(Lachnospiraceae sp.))。Cpf1内切核酸酶与富含T的PAM位点例如5'-TTN相关。Cpf1也可以识别5'-CTA PAM基序。Cpf1通过引入具有4或5个核苷酸的5'突出端的错位或交错的双链断裂来切割靶DNA，例如切割如下靶DNA，该靶DNA中的5个核苷酸的错位或交错的切割位于距离编码链上的PAM位点下游(3’)18个核苷酸的位置处和距离互补链上的PAM位点下游23个核苷酸的位置处；由这种错位切割产生的5个核苷酸突出端使得通过同源重组的DNA插入比在平末端切割的DNA的插入更精确地进行基因组编辑。参见例如，Zetsche等人(2015)Cell[细胞],163:759-771。
[0771] 愈合子中可以包括多种CRISPR相关(Cas)基因。基因的具体实例是那些编码来自II类系统的Cas蛋白(包括Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cpf1、C2C1或C2C3)的基因。在一些实施例中，愈合子包括编码Cas蛋白例如Cas9蛋白的基因，所述Cas蛋白可以来自多种原核物种中的任一种。在一些实施例中，愈合子包括编码特定Cas蛋白例如特定Cas9蛋白的基因，所述Cas蛋白被选择以识别特定的原间隔子邻近基序(PAM)序列。在一些实施例中，愈合子包括编码两种或更多种不同Cas蛋白或两种或更多种Cas蛋白的核酸，所述Cas蛋白可以被引入细胞、合子、胚胎或动物中，例如，以允许识别和修饰包含相同、相似或不同PAM基序的位点。在一些实施例中，愈合子包括编码具有失活的核酸酶的修饰的Cas蛋白(例如，核酸酶缺陷的Cas9)的基因。
[0772] 野生型Cas9蛋白在被gRNA靶向的特定DNA序列上产生双链断裂(DSB)，而许多具有经修饰的功能的CRISPR内切核酸酶是已知的，例如：Cas9的“切口酶”版本仅产生单链断裂；不具有催化活性的Cas9(“dCas9”)不会切割靶DNA。可以将编码dCas9的基因与编码效应子结构域的基因融合，以抑制(CRISPRi)或激活(CRISPRa)靶基因的表达。例如，所述基因可以编码Cas9与转录沉默子(例如KRAB结构域)或转录激活子(例如dCas9-VP64融合体)的融合
体。可以包括编码与FokI核酸酶(“dCas9-FokI”)融合的不具有催化活性的Cas9(dCas9)的基因，以在与两个gRNA同源的靶序列处产生DSB。参见，例如，在Addgene储存库中披露并可公开获得的众多CRISPR/Cas9质粒(Addgene,02139马萨诸塞州剑桥市西德尼街75号550A室(75Sidney St.,Suite 550A,Cambridge,MA 02139)；addgene.org/crispr/)。Ran等人
(2013)Cell[细胞],154:1380-1389将引入两个独立的双链断裂(每个断裂被独立的指导
RNA指向)的“双切口酶”Cas9描述为实现了更准确的基因组编辑。
体。可以包括编码与FokI核酸酶(“dCas9-FokI”)融合的不具有催化活性的Cas9(dCas9)的基因，以在与两个gRNA同源的靶序列处产生DSB。参见，例如，在Addgene储存库中披露并可公开获得的众多CRISPR/Cas9质粒(Addgene,02139马萨诸塞州剑桥市西德尼街75号550A室(75Sidney St.,Suite 550A,Cambridge,MA 02139)；addgene.org/crispr/)。Ran等人
(2013)Cell[细胞],154:1380-1389将引入两个独立的双链断裂(每个断裂被独立的指导
RNA指向)的“双切口酶”Cas9描述为实现了更准确的基因组编辑。
[0773] 在美国专利申请公开2016/0138008A1和US2015/0344912A1以及美国专利8,697,359、8,771,945、8,945,839、8,999,641、8,993,233、8,895,308、8,865,406、8,889,418、8,
871,445、8,889,356、8,932,814、8,795,965和8,906,616中披露了用于编辑真核生物的基因的CRISPR技术。Cpf1内切核酸酶和相应的指导RNA和PAM位点在美国专利申请公开2016/
0208243A1中披露。
871,445、8,889,356、8,932,814、8,795,965和8,906,616中披露了用于编辑真核生物的基因的CRISPR技术。Cpf1内切核酸酶和相应的指导RNA和PAM位点在美国专利申请公开2016/
0208243A1中披露。
[0774] 在一些实施例中，愈合子包含编码本文所述多肽(例如靶向核酸酶，例如Cas9，例如野生型Cas9、切口酶Cas9(例如Cas9 D10A)、失活Cas9(dCas9)、eSpCas9、Cpf1、C2C1或C2C3)以及gRNA的基因。编码核酸酶和一个或多个gRNA的基因的选择取决于靶向突变是核苷酸的缺失、置换或添加，例如靶序列的核苷酸缺失、置换或添加。编码与(一个或多个)效应子结构域(例如VP64)的全部或部分(例如，其生物活性部分)连接在一起的不具有催化活性的内切核酸酶(例如，失活Cas9(dCas9，例如D10A；H840A))的基因产生可以调节一个或多个靶核酸序列的活性和/或表达的嵌合蛋白。
[0775] 如本文所用，“效应子结构域的生物活性部分”是维持效应子结构域(例如，“最小”或“核心”结构域)的功能(例如，完全、部分或最小功能)的部分。在一些实施例中，愈合子包括编码dCas9与一个或多个效应子结构域的全部或一部分的融合体的基因，以产生可用于本文所述方法的嵌合蛋白。因此，在一些实施例中，愈合子包括编码dCas9-甲基化酶融合体的基因。在其他一些实施例中，愈合子包括编码dCas9酶与位点特异性gRNA的融合体的基因，以靶向内源基因。
[0776] 在其他方面，愈合子包括编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多个与dCas9融合的效应子结构域(全部或生物学活性部分)的基因。
[0777] 蛋白质外部
[0778] 在一些实施例中，愈合子例如合成的愈合子包含封闭遗传元件的蛋白质外部。蛋白质外部可以包含不能引起哺乳动物免疫反应的基本上非致病性的外部蛋白质。在一些实施例中，合成的愈合子在蛋白质外部缺少脂质。在一些实施例中，合成的愈合子缺少脂质双层，例如病毒包膜。在一些实施例中，合成的愈合子的内部被蛋白质外部完全覆盖(例如100％覆盖)。在一些实施例中，合成的愈合子内部被蛋白质外部覆盖少于100％，例如95％、
90％、85％、80％、70％、60％、50％或更少的覆盖。在一些实施例中，蛋白质外部包括间隙或不连续，例如，使得可透过水、离子、肽或小分子，只要遗传元件保留在愈合子中即可。
90％、85％、80％、70％、60％、50％或更少的覆盖。在一些实施例中，蛋白质外部包括间隙或不连续，例如，使得可透过水、离子、肽或小分子，只要遗传元件保留在愈合子中即可。
[0779] 在一些实施例中，蛋白质外部包含特异性识别和/或结合宿主细胞例如互补蛋白或多肽以介导遗传元件进入宿主细胞的一种或多种蛋白质或多肽。
[0780] 在一些实施例中，蛋白质外部包含以下一种或多种：一个或多个糖基化蛋白、亲水性DNA结合区、精氨酸富集区、苏氨酸富集区、谷氨酰胺富集区、N端聚精氨酸序列、可变区、C端聚谷氨酰胺/谷氨酸序列、以及一个或多个二硫键。
[0781] 在一些实施例中，蛋白质外部包括以下一种或多种特征：二十面体对称、识别和/或结合与一个或多个宿主细胞分子相互作用以介导进入宿主细胞的分子、缺乏脂质分子、缺乏碳水化合物、pH和温度稳定、耐洗涤剂、以及在宿主中基本上是非免疫原性的或是非致病性的。
[0782] 载体
[0783] 本文所述的遗传元件可以包含在载体中。合适的载体及其制造和使用方法在现有技术中是众所周知的。
[0784] 一方面，本发明包括一种载体，所述载体包含遗传元件，所述遗传元件包含(i)编码非致病性外部蛋白质的序列，(ii)使所述遗传元件与所述非致病性外部蛋白质结合的外部蛋白质结合序列，和(iii)编码调节性核酸的序列。
[0785] 遗传元件或遗传元件内的任何序列可以使用任何合适的方法获得。多种重组方法在本领域中是已知的，例如，使用标准技术，从具有病毒序列的细胞中筛选文库，从已知包含序列的载体中获得所述序列，或直接从包含序列的细胞和组织中分离所述序列。可替代地或组合地，遗传元件的部分或全部可以合成产生，而不是克隆。
[0786] 在一些实施例中，载体包括调节性元件，与靶基因同源的核酸序列，以及用于在活细胞内和/或当靶细胞内存在细胞内分子时引起报道分子表达的各种报道构建体。
[0787] 报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评估调节性序列的功能。通常，报告基因是如下基因，所述基因不存在于受体生物体或组织中或由其表达并且编码多肽，所述多肽的表达通过一些可易于检测的特性(例如，酶活性)表现出来。在将DNA引入受体细胞后，在适当的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶、或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，可以使用已知技术制备或商业获得。通常，具有显示报告基因最高表达水平的最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以连接至报告基因，并且用于评估药剂调节启动子驱动的转录的能力。
[0788] 在一些实施例中，载体在宿主细胞中是基本上非致病性的和/或基本上非整合的，或者在宿主中是基本上非免疫原性的。
[0789] 在一些实施例中，载体的量足以调节表型、病毒水平、基因表达、与其他病毒竞争、疾病状态等中的一种或多种至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高。
[0790] 组合物
[0791] 本文所述的合成的愈合子或载体也可以包括在具有例如本文所述的药物赋形剂的药物组合物中。在一些实施例中，药物组合物包含至少105、106、107、108、109、1010、1011、
12 13 14 15 5 15 5
10 、10 、10 或10 个合成的愈合子。在一些实施例中，药物组合物包含约10-10 、10 -
1010、或1010-1015个合成的愈合子。在一些实施例中，药物组合物包含约108(例如约105、106、
107、108、109、或1010)个基因组当量/mL的合成的愈合子。在一些实施例中，药物组合物包含
105-1010、106-1010、107-1010、108-1010、109-1010、105-106、105-107、105-108或105-109个基因组当量/mL的合成的愈合子，例如，根据实例18的方法所测定。在一些实施例中，药物组合物包含足够的合成的愈合子以将愈合子中包含的遗传元件的至少1、2、5或10、100、500、1000、
2000、5000、8,000、1x 104、1x 105、1x 106、1x 107个或更大数量的拷贝/细胞递送到真核细胞群体中。在一些实施例中，药物组合物包含足够的合成的愈合子以将愈合子中包含的遗传元件的至少约1x 104、1x 105、1x 106、1x 107、或约1x 104-1x 105、1x 104-1x 106、1x
104-1x 107、1x 105-1x 106、1x 105-1x 107、或1x 106-1x 107个拷贝/细胞递送到真核细胞群体中。
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10 、10 、10 或10 个合成的愈合子。在一些实施例中，药物组合物包含约10-10 、10 -
1010、或1010-1015个合成的愈合子。在一些实施例中，药物组合物包含约108(例如约105、106、
107、108、109、或1010)个基因组当量/mL的合成的愈合子。在一些实施例中，药物组合物包含
105-1010、106-1010、107-1010、108-1010、109-1010、105-106、105-107、105-108或105-109个基因组当量/mL的合成的愈合子，例如，根据实例18的方法所测定。在一些实施例中，药物组合物包含足够的合成的愈合子以将愈合子中包含的遗传元件的至少1、2、5或10、100、500、1000、
2000、5000、8,000、1x 104、1x 105、1x 106、1x 107个或更大数量的拷贝/细胞递送到真核细胞群体中。在一些实施例中，药物组合物包含足够的合成的愈合子以将愈合子中包含的遗传元件的至少约1x 104、1x 105、1x 106、1x 107、或约1x 104-1x 105、1x 104-1x 106、1x
104-1x 107、1x 105-1x 106、1x 105-1x 107、或1x 106-1x 107个拷贝/细胞递送到真核细胞群体中。
[0792] 在一些实施例中，药物组合物具有以下一种或多种特征：所述药物组合物满足药物或良好生产规范(GMP)标准；所述药物组合物是根据良好生产规范(GMP)制成的；所述药物组合物具有低于预定参考值的病原体水平，例如基本上不含病原体；所述药物组合物具有低于预定参考值的污染物水平，例如，基本上不含污染物；或所述药物组合物具有低免疫原性或基本上是非免疫原性的，例如，如本文所述。
[0793] 在一些实施例中，药物组合物包含低于阈值量的一种或多种污染物。在药物组合物中理想地不包括或最少包括的示例性污染物包括但不限于宿主细胞核酸(例如，宿主细胞DNA和/或宿主细胞RNA)、动物来源的组分(例如，血清白蛋白或胰蛋白酶)、具有复制能力的病毒、非感染性颗粒、游离病毒衣壳蛋白、外源因子和聚集体。在实施例中，污染物是宿主细胞DNA。在实施例中，组合物包含少于约500ng的宿主细胞DNA/剂量。在实施例中，药物组合物由按重量计小于10％(例如小于约10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％)的污染物组成。
[0794] 一方面，本文所述的发明包括药物组合物，其包含：
[0795] a)合成的愈合子，其包含遗传元件，所述遗传元件包含(i)编码非致病性外部蛋白质的序列，(ii)使所述遗传元件与所述非致病性外部蛋白质结合的外部蛋白质结合序列，和(iii)编码调节性核酸的序列；和与所述遗传元件相关联(例如包封或封闭所述遗传元件)的蛋白质外部；以及
[0796] b)药物赋形剂。
[0797] 囊泡
[0798] 在一些实施例中，组合物还包含运载体组分，例如微粒、脂质体、囊泡或外来体。在一些实施例中，脂质体包含球形囊泡结构，所述球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体通常具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其货物免受血浆酶的降解，并将其负载运输穿过生物膜(关于综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。
[0799] 囊泡可由几种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于产生脂质体作为药物运载体。囊泡可包括但不限于DOTMA、DOTAP、DOTIM、DDAB，单独使用或与胆固醇一起产生DOTMA和胆固醇、DOTAP和胆固醇、DOTIM和胆固醇以及DDAB和胆固醇。制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的教导通过引用并入文中)。尽管当脂质膜与水溶液混合时，囊泡的形成是自发的，但也可以通过使用均质器、超声仪或挤压装置以振荡的形式施加力来加快囊泡的形成(关于综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如Templeton等人,Nature Biotech[自然生物技术],15:647-652,1997中所述，其关于挤出脂质制备的教导通过引用并入文中。
[0800] 如本文所述，可将添加剂添加至囊泡以改变其结构和/或性质。例如，可以将胆固醇或鞘磷脂加入混合物中，以帮助稳定结构并防止内部货物泄漏。此外，可以由氢化的卵磷脂酰胆碱或卵磷脂酰胆碱、胆固醇和磷酸二鲸蜡酯制备囊泡。(关于综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。同样，囊泡可以在合成期间或之后进行表面修饰以包括与受体细胞上的反应性基团互补的反应性基团。这样的反应性基团包括但不限于马来酰亚胺基团。例如，可以合成囊泡以包括马来酰亚胺缀合的磷脂，例如但不限于DSPE-MaL-PEG2000。
[0801] 囊泡制剂可以主要由天然磷脂和脂质(例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱和单唾液酸神经节苷脂)构成。仅由磷脂组成的制剂在血浆中不太稳定。然而，用胆固醇操纵脂质膜降低了包封的货物的快速释放，或者1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)增加了稳定性(关于综述，参见，例如，Spuch和
Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,
2011.doi:10.1155/2011/469679)。
Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,
2011.doi:10.1155/2011/469679)。
[0802] 在实施例中，脂质可用于形成脂质微粒。脂质包括但不限于DLin-KC2-DMA4、C12-200和可使用自发囊泡形成程序配制的共脂质二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-DMG(参见例如Novobrantseva,Molecular Therapy-Nucleic Acids[分子治疗-核酸](2012)1,e4；
doi:10.1038/mtna.2011.3)。组分摩尔比可以为约50/10/38.5/1.5(DLin-KC2-DMA或C12-
200/二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-DMG)。Tekmira在美国和国外拥有约95个专利同族组合，涉及脂质微粒和脂质微粒制剂的各个方面(参见，例如，美国专利7,982,027；7,799,
565；8,058,069；8,283,333；7,901,708；7,745,651；7,803,397；8,101,741；8,188,263；7,
915,399；8,236,943和7,838,658以及欧洲专利号1766035；1519714；1781593和1664316)，它们均可以用于和/或适用于本发明。
doi:10.1038/mtna.2011.3)。组分摩尔比可以为约50/10/38.5/1.5(DLin-KC2-DMA或C12-
200/二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇/PEG-DMG)。Tekmira在美国和国外拥有约95个专利同族组合，涉及脂质微粒和脂质微粒制剂的各个方面(参见，例如，美国专利7,982,027；7,799,
565；8,058,069；8,283,333；7,901,708；7,745,651；7,803,397；8,101,741；8,188,263；7,
915,399；8,236,943和7,838,658以及欧洲专利号1766035；1519714；1781593和1664316)，它们均可以用于和/或适用于本发明。
[0803] 在一些实施例中，微粒包含以随机方式排列的一种或多种固化聚合物。微粒可以是可生物降解的。可生物降解的微粒可以例如使用本领域已知的方法合成，包括但不限于溶剂蒸发、热熔微囊化、溶剂去除和喷雾干燥。Bershteyn等人,Soft Matter[软物质]4:1787-1787,2008和US 2008/0014144 A1中描述了用于合成微粒的示例性方法，其关于微粒合成的具体教导通过引用并入本文。
[0804] 可用于形成可生物降解的微粒的示例性合成聚合物包括但不限于脂肪族聚酯、聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、乳酸和乙醇酸的共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚酐、聚(原)酸酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(丙酸)和聚(丙交酯-己内酯)以及天然聚合物，例如白蛋白、藻酸盐和其他多糖，包括葡聚糖和纤维素、胶原蛋白、其化学衍生物，包括化学基团的取代、添加，例如烷基、亚烷基、羟基化、氧化和本领域技术人员常规进行的其他修饰)、白蛋白和其他亲水蛋白、玉米蛋白和其他醇溶蛋白和疏水性蛋白质、共聚物及其混合物。通常，这些材料通过酶水解或暴露于水、通过表面或整体腐蚀而降解。
[0805] 微粒的直径范围为0.1-1000微米(μm)。在一些实施例中，它们的直径的尺寸范围为1μm-750μm、或50μm-500μm、或100μm-250μm。在一些实施例中，它们的直径的尺寸范围为50μm-1000μm、50μm-750μm、50μm-500μm或50μm-250μm。在一些实施例中，它们的直径的尺寸范围是.05μm-1000μm、10μm-1000μm、100μm-1000μm或500μm-1000μm。在一些实施例中，它们的直径为约0.5μm、约10μm、约50μm、约100μm、约200μm、约300μm、约350μm、约400μm、约450μm、约500μm、约550μm、约600μm、约650μm、约700μm、约750μm、约800μm、约850μm、约900μm、约
950μm或约1000μm。如微粒直径的上下文中所用，术语“约”是指所述绝对值的+/-5％。
950μm或约1000μm。如微粒直径的上下文中所用，术语“约”是指所述绝对值的+/-5％。
[0806] 在一些实施例中，配体通过存在于颗粒表面上并存在于待连接的配体上的官能化学基团(羧酸、醛、胺、巯基和羟基)与微粒表面缀合。可以通过例如在微粒的乳液制备期间，并入具有官能化学基团的稳定剂来将官能度引入微粒中。
[0807] 将官能团引入微粒的另一个实例是在微粒制备后，通过用均双官能或异双官能交联剂直接交联颗粒和配体。该程序可以使用合适的化学物质和一类交联剂(CDI、EDAC、戊二醛等，如下文更详细讨论)或通过制备后对颗粒表面进行化学修饰将配体偶联至颗粒表面的任何其他交联剂。这还包括这样的程序，通过所述程序可以将两亲性分子(例如脂肪酸、脂质或功能稳定剂)被动吸附并粘附到颗粒表面，从而引入官能性端基用以连接到配体上。
[0808] 在一些实施例中，可以合成微粒以在其外表面上包含一个或多个靶向基团以靶向特定的细胞或组织类型(例如，心肌细胞)。这些靶向基团包括但不限于受体、配体、抗体等。这些靶向基团将其配偶体结合在细胞表面上。在一些实施例中，微粒将整合到构成细胞表面的脂质双层中，并且将线粒体递送至细胞中。
[0809] 微粒还可在其最外表面上包含脂质双层。该双层可以由一个或多个相同或不同类型的脂质组成。实例包括但不限于磷脂，例如磷酸胆碱和磷酸肌醇。具体实例包括但不限于DMPC、DOPC、DSPC和各种其他脂质，例如本文针对脂质体所述的那些。
[0810] 在一些实施例中，运载体包含例如本文所述的纳米颗粒。
[0811] 在一些实施例中，本文所述的囊泡或微粒用诊断剂官能化。诊断剂的实例包括但不限于用于正电子发射断层扫描(PET)、计算机辅助断层扫描(CAT)、单光子发射计算机断层扫描、X射线、荧光检查和磁共振成像(MRI)的市售成像剂；和造影剂。在MRI中用作造影剂的合适材料的实例包括钆螯合物，以及铁、镁、锰、铜和铬。
[0812] 膜穿透多肽
[0813] 在一些实施例中，组合物还包含膜穿透多肽(MPP)，以将组分携带到细胞中或穿过膜例如细胞或核膜。能够促进物质跨膜运输的膜穿透多肽包括但不限于细胞穿透肽(CPP)(参见，例如，美国专利号：8,603,966)、用于植物细胞内递送的融合肽(参见，例如，Ng等人,PLoS One,2016,11:e0154081)、蛋白质转导结构域、木马肽和膜移位信号(MTS)(参见，例如，Tung等人,Advanced Drug Delivery Reviews[先进药物递送论述]55:281-294(2003))。一些MPP富含氨基酸，例如精氨酸，带有带正电的侧链。
[0814] 膜穿透多肽具有诱导组分的膜穿透的能力，并且在全身性施用后可在体内在多个组织的细胞内进行大分子移位。膜穿透多肽还可以指在适当条件下与细胞接触时，从外部环境通过进入细胞内环境(包括细胞质，细胞器如线粒体或细胞核)中的肽，其量明显超过被动扩散所能达到的量。
[0815] 跨膜运输的组分可以可逆地或不可逆地连接至膜穿透多肽。接头可以是化学键，例如一个或多个共价键或非共价键。在一些实施例中，接头是肽接头。这样的接头可以在2-30个氨基酸之间，或更长。接头包括柔性、刚性或可切割的接头。
[0816] 组合
[0817] 在一方面，本文所述的合成的愈合子或包含合成的愈合子的组合物还可包含一个或多个异源部分。在一方面，本文所述的愈合子或包含合成的愈合子的组合物还可在融合体中包含一个或多个异源部分。在一些实施例中，异源部分可以与遗传元件连接。在一些实施例中，异源部分可以被封闭在蛋白质外部中作为愈合子的一部分。在一些实施例中，异源部分可以与合成的愈合子一起施用。
[0818] 在一方面，本发明包括一种细胞或组织，其包含本文所述的合成的愈合子和异源部分中的任一种。
[0819] 在另一方面，本发明包括一种药物组合物，其包含本文所述的合成的愈合子和异源部分。
[0820] 在一些实施例中，异源部分可以是病毒(例如，效应子(例如，药物、小分子)、靶向剂(例如，DNA靶向剂、抗体、受体配体)、标签(例如，荧光团、光敏剂例如KillerRed)或本文所述的编辑或靶向部分。在一些实施例中，本文所述的膜移位多肽与一个或多个异源部分连接。在一个实施例中，异源部分是小分子(例如，肽模拟物或分子量小于2000道尔顿的有机小分子)、肽或多肽(例如，抗体或其抗原结合片段)、纳米颗粒、适体或药剂。
[0821] 病毒
[0822] 在一些实施例中，组合物可进一步包含病毒作为异源部分，例如单链DNA病毒，例如指环病毒、比那病毒(Bidnavirus)、圆环病毒、双生病毒、基诺病毒(Genomovirus)、丝状病毒、微小病毒、纳米病毒、细小病毒和斯派拉病毒(Spiravirus)。在一些实施例中，组合物可进一步包含双链DNA病毒，例如腺病毒、瓶状病毒、囊泡病毒、非洲猪瘟病毒、杆状病毒、福斯罗病毒(Fusellovirus)、球状病毒、滴状病毒、腺炎病毒、疱疹病毒、虹彩病毒、脂毛病毒、尼马病毒(Nimavirus)和痘病毒。在一些实施例中，组合物可以进一步包含RNA病毒，例如甲病毒、真菌传杆状病毒、肝炎病毒、大麦病毒、烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒、三角病毒(Tricornavirus)、风疹病毒、双RNA病毒、囊状病毒、分体病毒和呼肠病毒。在一些实施例中，将愈合子与作为异源部分的病毒一起施用。
[0823] 在一些实施例中，异源部分可以包含非致病性病毒，例如，共生病毒、共栖的病毒、天然病毒。在一些实施例中，非致病性病毒是一种或多种指环病毒，例如，甲型细环病毒(TT)、乙型细环病毒(TTM)和丙型细环病毒(TTMD)。在一些实施例中，指环病毒可以包括细环病毒(TT)、SEN病毒、前哨病毒、TTV样微小病毒、TT病毒、TT病毒基因型6、TT病毒群、TTV样病毒DXL1、TTV样病毒DXL2、细环样微小病毒(TTM)或细环样中型病毒(TTMD)。在一些实施例中，非致病性病毒包含与文中所述例如表19或表20中核苷酸序列中任一个具有至少约60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％和99％核苷酸序列同一性的一个或多个序列。
[0824] 在一些实施例中，异源部分可包含一种或多种被鉴定为受试者缺乏的病毒。例如，可以向被鉴定为患有病毒缺乏症的受试者施用组合物，所述组合物包含愈合子和在所述受试者中失衡或具有不同于参考值例如健康受试者的比率的一种或多种病毒组分或病毒。
[0825] 在一些实施例中，异源部分可以包含一种或多种非指环病毒，例如腺病毒、疱疹病毒、pox病毒、痘苗病毒、SV40、乳头瘤病毒、RNA病毒(例如逆转录病毒、例如慢病毒)、单链RNA病毒(例如肝炎病毒)或双链RNA病毒(例如轮状病毒)。在一些实施例中，愈合子或病毒是有缺陷的，或需要协助以产生感染性颗粒。可以例如通过使用辅助细胞系来提供这种协助，所述辅助细胞系包含在LTR内的调节性序列的控制下编码复制缺陷型愈合子或病毒的(例如所有)结构基因中一个或多个的核酸，例如整合到基因组中的质粒或DNA。用于复制本文所述的愈合子的合适细胞系包括本领域已知的细胞系，例如A549细胞，其可以如本文所述进行修饰。
[0826] 效应子
[0827] 在一些实施例中，组合物或合成的愈合子可以进一步包含具有效应子活性的效应子。效应子可以调节生物活性，例如增加或降低酶活性、基因表达、细胞信号传导以及细胞或器官功能。效应子活性还可包括结合调节性蛋白以调节调节子的活性，例如转录或翻译。效应子活性还可以包括激活剂或抑制剂功能。例如，效应子可通过触发酶中底物亲和力的增加来诱导酶活性，例如，果糖2,6-二磷酸激活磷酸果糖激酶1并增加糖酵解响应于胰岛素的速率。在另一个实例中，效应子可以抑制底物与受体的结合并抑制其激活，例如，纳曲酮和纳洛酮结合阿片样物质受体而不激活它们，并阻断受体结合阿片样物质的能力。效应子活性还可以包括调节蛋白质的稳定性/降解和/或转录物的稳定性/降解。例如，可以通过多肽辅因子泛素在蛋白质上以将它们标记为降解，从而将蛋白质靶向降解。在另一个实例中，效应子通过阻断酶的活性位点来抑制酶活性，例如，甲氨蝶呤是四氢叶酸(一种二氢叶酸还原酶的辅酶)的结构类似物，其与二氢叶酸还原酶的结合力比天然底物高1000倍，并抑制核苷酸碱基合成。
[0828] 靶向部分
[0829] 在一些实施例中，本文所述的组合物或愈合子可进一步包含靶向部分，例如与存在于靶细胞上的目的分子特异性结合的靶向部分。靶向部分可调节目的分子或细胞的特定功能，调节特定分子(例如酶、蛋白质或核酸)，例如通路中目的分子下游的特定分子，或特异性结合靶标以定位愈合子或遗传元件。例如，靶向部分可以包括与目的特定分子相互作用以增加，减少或以其他方式调节其功能的治疗剂。
[0830] 标记部分或监测部分
[0831] 在一些实施例中，本文所述的组合物或合成的愈合子可以进一步包含标签以标记或监测本文所述的愈合子或遗传元件。标记部分或监测部分可以通过化学试剂或酶促裂解，例如蛋白水解或内含肽剪接而去除。亲和标签可用于使用亲和技术纯化标记的多肽。一些实例包括几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和聚(His)标签。增溶标签可用于帮助在分子伴侣缺乏的物种(例如大肠杆菌)中表达的重组蛋白，以帮助蛋白质正确折叠并防止其沉淀。一些实例包括硫氧还蛋白(TRX)和聚(NANP)。标记部分或监测部分可以包括光敏标签，例如荧光。荧光标签对于可视化是有用的。GFP及其变体是通常用作荧光标签的一些实例。蛋白质标签可允许发生特定的酶促修饰(例如通过生物素连接酶进行生物素化)或化学修饰(例如与FlAsH-EDT2反应进行荧光成像)。通常将标记部分或监测部分组合，以便将蛋白质连接到多个其他组分。标记部分或监测部分也可以通过特异性蛋白水解或酶促裂解(例如通过TEV蛋白酶、凝血酶、因子Xa或肠肽酶)去除。
[0832] 纳米颗粒
[0833] 在一些实施例中，本文所述的组合物或合成的愈合子可以进一步包含纳米颗粒。纳米颗粒包括无机材料，其尺寸在约1至约1000纳米之间、在约1至约500纳米之间、在约1至约100nm之间、在约50nm至约300nm之间、在约75nm至约200nm之间、在约100nm至约200nm之间、以及其间的任何范围。纳米颗粒通常具有纳米尺度的复合结构。在一些实施例中，纳米颗粒通常是球形的，尽管取决于纳米颗粒的组成，不同的形态是可能的。纳米颗粒与纳米颗粒外部的环境接触的部分通常被鉴定为纳米颗粒的表面。在本文所述的纳米颗粒中，尺寸限制可被限制为二维，从而纳米颗粒包括直径为约1至约1000nm的复合结构，其中特定直径取决于纳米颗粒的组成和根据实验设计的纳米颗粒的预期用途。例如，用于治疗应用的纳米颗粒通常具有约200nm或更小的尺寸。
[0834] 鉴于感兴趣的具体应用，纳米颗粒的其他期望的性质(例如表面电荷和空间稳定性)也可以变化。在Davis等人,Nature[自然]2008第7卷,第771-782页；Duncan,Nature[自然]2006第6卷,第688-701页；和Allen,Nature[自然]2002第2卷第750-763页中描述了在临床应用(例如癌症治疗)中可能需要的示例性特性，每个文章均通过引用整体并入本文。技术人员在阅读本发明后可以鉴定出其他性质。纳米颗粒的尺寸和性质可以通过本领域已知的技术来检测。检测颗粒尺寸的示例性技术包括但不限于动态光散射(DLS)和各种显微技术，例如透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)。检测颗粒形态的示例性技术包括但不限于TEM和AFM。检测纳米颗粒的表面电荷的示例性技术包括但不限于ζ电势方法。适用于
1 11 13 19
检测其他化学性质的其他技术包括通过H、B、和 C和 F NMR、UV/Vis和红外/拉曼光谱和荧光光谱(当纳米颗粒与荧光标记组合使用时)和技术人员可以鉴定的其他技术。
1 11 13 19
检测其他化学性质的其他技术包括通过H、B、和 C和 F NMR、UV/Vis和红外/拉曼光谱和荧光光谱(当纳米颗粒与荧光标记组合使用时)和技术人员可以鉴定的其他技术。
[0835] 小分子
[0836] 在一些实施例中，本文所述的组合物或合成的愈合子可以进一步包含小分子。小分子部分包括但不限于小肽、拟肽(例如类肽)、氨基酸、氨基酸类似物、合成多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、通常具有小于约5,000克/摩尔的分子量的有机和无机化合物(包括杂有机和有机金属化合物)，例如，具有小于约2,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物，例如，具有小于约1,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物，例如，具有小于约500克/摩尔的分子量的有机或无机化合物，以及此类化合物的盐、酯和其他医药可接受形式。小分子可以包括但不限于神经递质、激素、药物、毒素、病毒或微生物颗粒、合成分子以及激动剂或拮抗剂。
[0837] 合适的小分子的实例包括在以下中描述的那些：“The Pharmacological Basis of Therapeutics[治疗学的药理基础],”Goodman和Gilman,McGraw-Hill,纽约州纽约,(1996),第九版，在以下章节：Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector
Junctional Sites[药物作用于突触和神经效应连接点]；Drugs Acting on the Central Nervous System[药物作用于中枢神经系统]；Autacoids:Drug Therapy of Inflammation[自体活性物质：炎症的药物治疗]；Water,Salts and Ions[水，盐和离子]；Drugs
Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism[药物影响肾功能和电解质代
谢]；Cardiovascular Drugs[心血管药物]；Drugs Affecting Gastrointestinal
Function[药物影响胃肠功能]；Drugs Affecting Uterine Motility[药物影响子宫动
力]；Chemotherapy of Parasitic Infections[寄生虫感染的化学疗法]；Chemotherapy of Microbial Diseases[微生物疾病的化学疗法]；Chemotherapy of Neoplastic
Diseases[肿瘤性疾病的化学疗法]；Drugs Used for Immunosuppression[药物用于免疫抑制]；Drugs Acting on Blood-Forming organs[药物作用于造血器官]；Hormones and Hormone Antagonists；[激素和激素拮抗剂]；Vitamins,Dermatology[维生素，皮肤病学]；
和Toxicology[毒理学]，均以引用方式并入本文。小分子的一些实例包括但不限于朊病毒药物，例如他克莫司、泛素连接酶或HECT连接酶抑制剂例如heclin、组蛋白修饰药物例如丁酸钠、酶抑制剂例如5-氮杂胞苷、蒽环类药物例如阿霉素、β-内酰胺类例如青霉素、抗菌剂、化学治疗剂、抗病毒剂、来自其他生物体的调节剂例如VP64、以及生物利用度不足的药物、例如药代动力学不足的化学治疗药。
Junctional Sites[药物作用于突触和神经效应连接点]；Drugs Acting on the Central Nervous System[药物作用于中枢神经系统]；Autacoids:Drug Therapy of Inflammation[自体活性物质：炎症的药物治疗]；Water,Salts and Ions[水，盐和离子]；Drugs
Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism[药物影响肾功能和电解质代
谢]；Cardiovascular Drugs[心血管药物]；Drugs Affecting Gastrointestinal
Function[药物影响胃肠功能]；Drugs Affecting Uterine Motility[药物影响子宫动
力]；Chemotherapy of Parasitic Infections[寄生虫感染的化学疗法]；Chemotherapy of Microbial Diseases[微生物疾病的化学疗法]；Chemotherapy of Neoplastic
Diseases[肿瘤性疾病的化学疗法]；Drugs Used for Immunosuppression[药物用于免疫抑制]；Drugs Acting on Blood-Forming organs[药物作用于造血器官]；Hormones and Hormone Antagonists；[激素和激素拮抗剂]；Vitamins,Dermatology[维生素，皮肤病学]；
和Toxicology[毒理学]，均以引用方式并入本文。小分子的一些实例包括但不限于朊病毒药物，例如他克莫司、泛素连接酶或HECT连接酶抑制剂例如heclin、组蛋白修饰药物例如丁酸钠、酶抑制剂例如5-氮杂胞苷、蒽环类药物例如阿霉素、β-内酰胺类例如青霉素、抗菌剂、化学治疗剂、抗病毒剂、来自其他生物体的调节剂例如VP64、以及生物利用度不足的药物、例如药代动力学不足的化学治疗药。
[0838] 在一些实施例中，小分子是一种表观遗传修饰剂，例如，如de Groote等人Nuc.Acids Res.[核酸研究](2012):1-18中所述的那些。示例性的小分子表观遗传修饰剂描述于例如Lu等人J.Biomolecular Screening[生物分子筛选杂志]17.5(2012):555-71
(例如表1或2)中，其通过引用并入本文。在一些实施例中，表观遗传修饰剂包括伏立诺他或罗米地辛。在一些实施例中，表观遗传修饰剂包含I、II、III和/或IV类组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的抑制剂。在一些实施例中，表观遗传修饰剂包含SirTI的激活剂。在一些实施例中，表观遗传修饰剂包括山竹子素，Lys-CoA、C646、(+)-JQI、I-BET、BICI、MS120、DZNep、UNC0321、EPZ004777、AZ505、AMI-I、吡唑酰胺7b、苯并[d]咪唑17b、酰化氨苯砜衍生物(例如PRMTI)、methylstat、4,4'-二羧基-2,2'-联吡啶、SID 85736331、异羟肟酸酯类似物8、tanylcypromie、双胍和双胍多胺类似物、UNC669、维达扎、地西他滨、苯丁酸钠(SDB)、硫辛酸(LA)、槲皮素、丙戊酸、肼苯哒嗪、新诺明、绿茶提取物(例如表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG))、姜黄素、萝卜硫素和/或大蒜素/二烯丙基二硫化物。在一些实施例中，表观遗传修饰剂抑制DNA甲基化，例如DNA甲基转移酶的抑制剂(例如5-氮杂胞苷和/或地西他滨)。在一些实施例中，表观遗传修饰剂修饰组蛋白修饰，例如组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白类泛素化和/或组蛋白磷酸化。在一些实施例中，表观遗传修饰剂是组蛋白脱乙酰基酶的抑制剂(例如伏立诺他和/或曲古抑菌素A)。
(例如表1或2)中，其通过引用并入本文。在一些实施例中，表观遗传修饰剂包括伏立诺他或罗米地辛。在一些实施例中，表观遗传修饰剂包含I、II、III和/或IV类组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的抑制剂。在一些实施例中，表观遗传修饰剂包含SirTI的激活剂。在一些实施例中，表观遗传修饰剂包括山竹子素，Lys-CoA、C646、(+)-JQI、I-BET、BICI、MS120、DZNep、UNC0321、EPZ004777、AZ505、AMI-I、吡唑酰胺7b、苯并[d]咪唑17b、酰化氨苯砜衍生物(例如PRMTI)、methylstat、4,4'-二羧基-2,2'-联吡啶、SID 85736331、异羟肟酸酯类似物8、tanylcypromie、双胍和双胍多胺类似物、UNC669、维达扎、地西他滨、苯丁酸钠(SDB)、硫辛酸(LA)、槲皮素、丙戊酸、肼苯哒嗪、新诺明、绿茶提取物(例如表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG))、姜黄素、萝卜硫素和/或大蒜素/二烯丙基二硫化物。在一些实施例中，表观遗传修饰剂抑制DNA甲基化，例如DNA甲基转移酶的抑制剂(例如5-氮杂胞苷和/或地西他滨)。在一些实施例中，表观遗传修饰剂修饰组蛋白修饰，例如组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白类泛素化和/或组蛋白磷酸化。在一些实施例中，表观遗传修饰剂是组蛋白脱乙酰基酶的抑制剂(例如伏立诺他和/或曲古抑菌素A)。
[0839] 在一些实施例中，小分子是药物活性剂。在一个实施例中，小分子是代谢活性或组分的抑制剂。有用的药物活性剂类别包括但不限于抗生素、抗炎药、血管生成剂或血管活性剂、生长因子和化学治疗(抗肿瘤)剂(例如肿瘤抑制剂)。可以使用来自本文描述的类别和实例或来自(Orme-Johnson 2007,Methods Cell Biol.[细胞生物学方法]2007；80:813-26)的分子的一种或组合。在一个实施例中，本发明包括一种组合物，其包含抗生素、抗炎药、血管生成剂或血管活性剂、生长因子或化学治疗剂。
[0840] 肽或蛋白质
[0841] 在一些实施例中，本文所述的组合物或合成的愈合子可以进一步包含肽或蛋白质。肽部分可包括但不限于肽配体或抗体片段(例如，结合受体如细胞外受体的抗体片段)、神经肽、激素肽、肽药物、毒性肽、病毒或微生物肽、合成肽、以及激动剂或拮抗剂肽。
[0842] 肽部分可以是直链或支链的。肽的长度为约5至约200个氨基酸、约15至约150个氨基酸、约20至约125个氨基酸、约25至约100个氨基酸或其间的任何范围。
[0843] 肽的一些实例包括但不限于荧光标签或标记、抗原、抗体、抗体片段例如单域抗体、配体和受体例如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、GLP-2受体2、胆囊收缩素B(CCKB)和生长抑素受体、肽治疗剂例如与特定细胞表面受体例如G蛋白偶联受体(GPCR)或离子通道结合的那些、天然生物活性肽的合成或类似物肽、抗微生物肽、成孔肽、肿瘤靶向或细胞毒性肽、以及降解或自毁肽例如凋亡诱导肽信号或光敏肽。
[0844] 本文所述的可用于本发明的肽还包括小抗原结合肽，例如抗原结合抗体或抗体样片段，例如单链抗体、纳米抗体(参见，例如，Steeland等人2016.Nanobodies as therapeutics:big opportunities for small antibodies.[纳米抗体作为治疗剂：小抗体的巨大机会]Drug Discov Today[今日药物发现]:21(7):1076-113)。这样的小抗原结合肽可以结合细胞质抗原、核抗原、细胞内抗原。
[0845] 在一些实施例中，本文所述的组合物或愈合子包括与能够靶向特定位置、组织或细胞的配体连接的多肽。
[0846] 寡核苷酸适体
[0847] 在一些实施例中，本文所述的组合物或合成的愈合子可以进一步包含寡核苷酸适体。适体部分是寡核苷酸或肽适体。寡核苷酸适体是单链DNA或RNA(ssDNA或ssRNA)分子，其可以以高亲和力和特异性结合预先选择的靶标(包括蛋白质和肽)。
[0848] 寡核苷酸适体是可以通过重复多轮的体外选择或等效地SELEX(通过指数富集的配体系统进化)而工程化以结合到各种分子靶标(例如小分子、蛋白质、核酸甚至细胞、组织和生物体)的核酸种类。适体提供区分的分子识别，并且可以通过化学合成来产生。另外，适体可能具有理想的储存特性，并且在治疗应用中几乎没有引起免疫原性。
[0849] DNA和RNA适体均可显示出对各种靶标的稳健结合亲和力。例如，已经选择了DNA和RNA适体用于溶菌酶、凝血酶、人类免疫缺陷病毒反式反应响应元件(HIV TAR)(参见en.wikipedia.org/wiki/Aptamer-cite_note-10)、氯化血红素、干扰素γ、血管内皮生长因子(VEGF)、前列腺特异性抗原(PSA)、多巴胺和非经典癌基因、热休克因子1(HSF1)。
[0850] 肽适体
[0851] 在一些实施例中，本文所述的组合物或合成的愈合子可以进一步包含肽适体。肽适体具有一个(或多个)短可变肽结构域，包括具有低分子量12kDa-14kDa的肽。肽适体可以被设计为特异性结合并干扰细胞内部的蛋白质-蛋白质相互作用。
[0852] 肽适体是经选择或经工程化以结合特定靶分子的人工蛋白质。这些蛋白质包括一个或多个可变序列的肽环。它们通常是从组合文库中分离出来的，并且常常随后通过定向突变或多轮的可变区诱变和选择而得到改进。在体内，肽适体可以结合细胞蛋白靶标并发挥生物学作用，包括干扰其靶向分子与其他蛋白的正常蛋白相互作用。特别地，针对附着于转录因子激活结构域的靶蛋白筛选附着于转录因子结合结构域的可变肽适体环。将肽适体通过该选择策略与其靶标的体内结合检测为下游酵母标记基因的表达。这样的实验鉴定了与适体结合的特定蛋白质，以及适体破坏的蛋白质相互作用以引起表型。另外，用适当的官能部分衍生的肽适体可引起其靶蛋白的特异性翻译后修饰，或改变靶标的亚细胞定位。
[0853] 肽适体还可以在体外识别靶标。已发现它们可代替生物传感器中的抗体，并用于从包含无活性和活性蛋白形式的群体中检测活性蛋白同工型。其中肽适体“头部”与独特的序列双链DNA“尾部”共价连接的称为蝌蚪的衍生物可通过其DNA尾部的PCR(例如，使用定量实时聚合酶链反应)定量混合物中的稀缺靶分子。
[0854] 可以使用不同的系统进行肽适体选择，但目前使用最多的是酵母双杂交系统。肽适体还可以选自通过噬菌体展示和其他表面展示技术(例如mRNA展示、核糖体展示、细菌展示和酵母展示)构建的组合肽文库。这些实验程序也称为生物淘选。在从生物淘选获得的肽中，模拟表位可被认为是一种肽适体。从组合肽文库淘选的所有肽已存储在名为MimoDB的特殊数据库中。
[0855] 宿主
[0856] 本发明进一步涉及包含本文所述的合成的愈合子的宿主或宿主细胞。在一些实施例中，宿主或宿主细胞是植物、昆虫、细菌、真菌、脊椎动物、哺乳动物(例如人)或其他生物体或细胞。在某些实施例中，如本文所证实的，所提供的愈合子感染一系列不同的宿主细胞。靶宿主细胞包括中胚层、内胚层或外胚层来源的细胞。靶宿主细胞包括例如上皮细胞、肌肉细胞、白细胞(例如淋巴细胞)、肾组织细胞、肺组织细胞。
[0857] 在一些实施例中，愈合子在宿主中是基本上非免疫原性的。愈合子或遗传元件无法通过宿主的免疫系统产生不希望的实质性反应。一些免疫反应包括但不限于体液免疫反应(例如，抗原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫反应(例如，淋巴细胞增殖)。
[0858] 在一些实施例中，宿主或宿主细胞与合成的愈合子接触(例如，感染)。在一些实施例中，宿主是哺乳动物，例如人。施用后任何时候都可以测量宿主体内的愈合子的量。在某些实施例中，测定培养物中愈合子生长的时程。
[0859] 在一些实施例中，愈合子例如文中所述的愈合子是可遗传的。在一些实施例中，愈合子在流体和/或细胞中从母亲线性传输给孩子。在一些实施例中，来自原始宿主细胞的子细胞包含愈合子。在一些实施例中，母亲以至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的效率将愈合子传输给孩子或从宿主细胞到子细胞的传输效率为至少25％、
50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，宿主细胞中的愈合子在减数分裂期间具有至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的传输效率。
在一些实施例中，宿主细胞中的愈合子在有丝分裂期间具有至少25％、50％、60％、70％、
80％、85％、90％、95％或99％的传输效率。在一些实施例中，细胞中的愈合子具有约10％-
20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-75％、75％-80％、
80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-99％或其间任何百分比的传输效率。
50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施例中，宿主细胞中的愈合子在减数分裂期间具有至少25％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的传输效率。
在一些实施例中，宿主细胞中的愈合子在有丝分裂期间具有至少25％、50％、60％、70％、
80％、85％、90％、95％或99％的传输效率。在一些实施例中，细胞中的愈合子具有约10％-
20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-75％、75％-80％、
80％-85％、85％-90％、90％-95％、95％-99％或其间任何百分比的传输效率。
[0860] 在一些实施例中，愈合子例如合成的愈合子在宿主细胞内复制。在一实施例中，合成的愈合子能够在哺乳动物细胞例如人细胞中复制。
[0861] 尽管在一些实施例中，合成的愈合子在宿主细胞中复制，但是合成的愈合子未整合到宿主的基因组中，例如未与宿主的染色体整合。在一些实施例中，合成的愈合子具有例如与宿主的染色体的可忽略的重组频率。在一些实施例中，愈合子与例如宿主的染色体的重组频率例如小于约1.0cM/Mb、0.9cM/Mb、0.8cM/Mb、0.7cM/Mb、0.6cM/Mb、0.5cM/Mb、0.4cM/Mb、0.3cM/Mb、0.2cM/Mb、0.1cM/Mb或更低。
[0862] 使用方法
[0863] 本文所述的合成的愈合子和包含合成的愈合子的组合物可用于例如在需要其的受试者(例如哺乳动物受试者，例如人受试者)中治疗疾病、障碍或病症的方法中。本文描述的药物组合物的施用可以例如通过肠胃外(包括静脉内、肿瘤内、腹膜内、肌内、腔内和皮下)施用。合成的愈合子可以单独施用或配制成药物组合物。
[0864] 合成的愈合子可以以单位剂量组合物的形式，例如单位剂量肠胃外组合物的形式来施用。这样的组合物通常通过混合制备，并且可以适合于肠胃外施用。这样的组合物可以是例如可注射和可输注的溶液或悬浮液或栓剂或气雾剂的形式。
[0865] 在一些实施例中，例如本文所述的合成的愈合子或包含其的组合物的施用可导致将合成的愈合子所包含的遗传元件递送至例如受试者的靶细胞中。
[0866] 例如包含外源性效应子或有效负载的本文所述的合成的愈合子或其组合物可用于将外源性效应子或有效负载递送至细胞、组织或受试者。在一些实施例中，合成的愈合子或其组合物用于将外源性效应子或有效负载递送至骨髓、血液、心脏、GI或皮肤。通过施用本文所述的合成的愈合子组合物来递送外源性效应子或有效负载可以调节(例如，增加或减少)细胞、组织或受试者中非编码RNA或多肽的表达水平。以这种方式调节表达水平可导致外源性效应子或有效负载被递送其中的细胞中功能活性的改变。在一些实施例中，调节的功能活性本质上可以是酶促的、结构的或调节的。
[0867] 在一些实施例中，合成的愈合子或其拷贝在递送至细胞中后24小时(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、30天或1个月)可在细胞中检测到。在实施例中，合成的愈合子或其组合物介导对靶细胞的作用，并且所述作用持续至少1、2、3、4、5、6或7天、
2、3或4周或1、2、3、6或12个月。在一些实施例中(例如，其中合成的愈合子或其组合物包含编码外源蛋白质的遗传元件)，所述作用持续少于1、2、3、4、5、6或7天、2、3或4周、或1、2、3、6或12个月。
2、3或4周或1、2、3、6或12个月。在一些实施例中(例如，其中合成的愈合子或其组合物包含编码外源蛋白质的遗传元件)，所述作用持续少于1、2、3、4、5、6或7天、2、3或4周、或1、2、3、6或12个月。
[0868] 可以用本文所述的合成的愈合子或包含该合成的愈合子的组合物治疗的疾病、障碍和病症的实例包括但不限于：免疫障碍、干扰素病(例如I型干扰素病)、传染病、炎性障碍、自身免疫性病症、癌症(例如实体瘤，例如肺癌、非小细胞肺癌，例如，表达对mIR-625有响应的基因(例如，胱天蛋白酶3)的肿瘤)和胃肠道障碍。在一些实施例中，合成的愈合子在与愈合子接触的细胞中调节(例如增加或减少)活性或功能。在一些实施例中，合成的愈合子在与愈合子接触的细胞中调节(例如增加或减少)分子(例如核酸或蛋白质)的水平或活性。在一些实施例中，合成的愈合子将与愈合子接触的细胞例如癌细胞的存活力降低例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高。在一些实施例中，合成的愈合子包含效应子，例如miRNA，例如miR-625，其将与愈合子接触的细胞例如癌细胞的存活力降低例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、
95％、99％或更高。在一些实施例中，合成的愈合子例如通过增加胱天蛋白酶-3活性将与愈合子接触的细胞例如癌细胞的细胞凋亡增加例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、
60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高。在一些实施例中，合成的愈合子包含效应子，例如miRNA，例如miR-625，其例如通过增加胱天蛋白酶-3活性将与愈合子接触的细胞例如癌细胞的细胞凋亡增加例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、
95％、99％或更高。
95％、99％或更高。在一些实施例中，合成的愈合子例如通过增加胱天蛋白酶-3活性将与愈合子接触的细胞例如癌细胞的细胞凋亡增加例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、
60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高。在一些实施例中，合成的愈合子包含效应子，例如miRNA，例如miR-625，其例如通过增加胱天蛋白酶-3活性将与愈合子接触的细胞例如癌细胞的细胞凋亡增加例如至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、
95％、99％或更高。
[0869] 额外的愈合子实施例
[0870] 在一方面，本发明包括一种合成的愈合子，其包含：遗传元件，其包含(i)编码非致病性外部蛋白质的序列，(ii)使所述遗传元件与所述非致病性外部蛋白质结合的外部蛋白质结合序列，和(iii)编码效应子例如调节性核酸的序列；和与所述遗传元件相关联(例如包封或封闭所述遗传元件)的蛋白质外部。
[0871] 在一方面，本发明包括一种药物组合物，其包括：a)愈合子，其包含：遗传元件，其包含(i)编码非致病性外部蛋白质的序列，(ii)使所述遗传元件与所述非致病性外部蛋白质结合的外部蛋白质结合序列，和(iii)编码效应子例如调节性核酸的序列；和与所述遗传元件相关联(例如包封或封闭所述遗传元件)的蛋白质外部；以及b)药物赋形剂。
[0872] 在本文描述的本发明的各个方面中，可将本文描述的各个实施例中的一个或多个组合。
[0873] 在一些实施例中，本文所述的愈合子或组合物还包含以下特征中的至少一种：所述遗传元件是单链DNA；所述遗传元件呈环状；所述愈合子是非整合的；所述愈合子具有基于指环病毒或其他非致病性病毒的序列、结构和/或功能，并且所述愈合子是非致病性的。
[0874] 在一些实施例中，蛋白质外部包含非致病性外部蛋白质。在一些实施例中，蛋白质外部包含以下一种或多种：一个或多个糖基化蛋白、亲水性DNA结合区、精氨酸富集区、苏氨酸富集区、谷氨酰胺富集区、N端聚精氨酸序列、可变区、C端聚谷氨酰胺/谷氨酸序列、以及一个或多个二硫键。在一些实施例中，蛋白质外部包含以下一种或多种特征：二十面体对称、识别和/或结合与一个或多个宿主细胞分子相互作用以介导进入宿主细胞的分子、缺乏脂质分子、缺乏碳水化合物、pH和温度稳定、耐洗涤剂、以及在宿主中是非免疫原性的或是非致病性的。例如，本文提供的数据证实所提供的愈合子具有传染性。
[0875] 在一些实施例中，编码非致病性外部蛋白质的序列包含与表15中所列一个或多个序列或其片段具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。在一些实施例中，非致病性外部蛋白质包含与表16或表17中所列一个或多个序列或其片段具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。在一些实施例中，非致病性外部蛋白质包含至少一个提供一个或多个功能的功能结构域，所述功能是例如物种和/或组织和/或细胞嗜性、病毒基因组结合和/或包装、免疫逃逸(非免疫原性和/或耐受性)、药代动力学、内吞作用和/或细胞附着、核进入、细胞内调节和定位、胞吐作用调节、繁殖和核酸保护。
[0876] 在一些实施例中，效应子包含调节性核酸，例如，miRNA、siRNA、mRNA、lncRNA、RNA、DNA、反义RNA、gRNA；治疗剂，例如荧光标签或标记、抗原、肽治疗剂、天然生物活性肽的合成或类似物肽、激动剂或拮抗剂肽、抗微生物肽、成孔肽、双环肽、靶向或细胞毒性肽、降解或自毁肽、以及多种降解或自毁肽、小分子、免疫效应子(例如，影响对免疫反应/信号的敏感性)、死亡蛋白(例如，凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非裂解性抑制剂(例如，癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体激活剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶的竞争性抑制剂、蛋白质合成效应子或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体或受体、以及CRISPR系统或组分。在一些实施例中，效应子包含与表18中列出的一个或多个miRNA序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列。在一些实施例中，效应子例如miRNA靶向宿主基因，例如调节所述基因的表达。
[0877] 在一些实施例中，遗传元件进一步包含以下序列中的一个或多个：编码一个或多个miRNA的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂序列的序列、调节性序列(例如启动子、增强子)、编码一个或多个靶向内源基因的调节性序列(siRNA、lncRNA、shRNA)的序列、编码治疗性mRNA或蛋白质的序列以及编码细胞溶解/细胞毒性RNA或蛋白质的序列。在一些实施例中，遗传元件具有以下一种或多种特征：与宿主细胞的基因组不整合、是附加体核酸、是单链DNA、是约1kb至10kb、存在于细胞核内、能够与内源蛋白结合，以及产生靶向宿主基因的微小RNA。
[0878] 在一些实施例中，遗传元件包含与表19或表20中所列的一个或多个序列或其片段具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的至少一个病毒序列。在一个这样的实施例中，病毒序列来自以下至少一种：单链DNA病毒(例如指环病毒、比那病毒、圆环病毒、双生病毒、基诺病毒、丝状病毒、微小病毒、纳米病毒、细小病毒和斯派拉病毒)、双链DNA病毒(例如腺病毒、瓶状病毒、囊泡病毒、非洲猪瘟病毒、杆状病毒、福斯罗病毒、球状病毒、滴状病毒、腺炎病毒、疱疹病毒、虹彩病毒、脂毛病毒、线性病毒和痘病毒)、RNA病毒(例如甲病毒、真菌传杆状病毒、肝炎病毒、大麦病毒、烟草花叶病毒、烟草脆裂病毒、三角病毒、风疹病毒、双RNA病毒、囊状病毒、分体病毒和呼肠病毒)。在另一个实施例中，病毒序列来自一种或多种非指环病毒，例如腺病毒、疱疹病毒、pox病毒、痘苗病毒、SV40、乳头瘤病毒、RNA病毒(例如逆转录病毒、例如慢病毒)、单链RNA病毒(例如肝炎病毒)或双链RNA病毒(例如轮状病毒)。
[0879] 在一些实施例中，蛋白质结合序列与蛋白质外部的精氨酸富集区相互作用。
[0880] 在一些实施例中，愈合子能够在哺乳动物细胞例如人细胞中复制。在一些实施例中，愈合子在宿主细胞中是基本上非致病性的和/或非整合的。在一些实施例中，愈合子在宿主中是基本上非免疫原性的。在一些实施例中，愈合子在宿主或宿主细胞中抑制/增强一种或多种病毒特性，例如嗜性，例如感染性，例如免疫抑制/激活。在一些实施例中，愈合子的量足以调节(例如表型、病毒水平、基因表达、与其他病毒竞争、疾病状态等至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高)。
[0881] 在一些实施例中，组合物进一步包含至少一种病毒或包含所述病毒基因组的载体，例如所述愈合子的变体，例如共栖/天然病毒。在一些实施例中，组合物进一步包含异源部分，例如至少一个小分子、抗体、多肽、核酸、靶向剂、显像剂、纳米颗粒及其组合。
[0882] 一方面，本发明包括一种载体，所述载体包含遗传元件，所述遗传元件包含(i)编码非致病性外部蛋白质的序列，(ii)使所述遗传元件与所述非致病性外部蛋白质结合的外部蛋白质结合序列，和(iii)编码效应子例如调节性核酸的序列。
[0883] 在本文描述的本发明的各个方面中，可将本文描述的各个实施例中的一个或多个组合。
[0884] 在一些实施例中，遗传元件无法与宿主细胞的基因组整合。在一些实施例中，遗传元件能够在哺乳动物细胞例如人细胞中复制。
[0885] 在一些实施例中，载体进一步包含外源核酸序列，例如，所述外源核酸序列被选择来调节基因例如人基因的表达。
[0886] 在一方面，本发明包括一种药物组合物，其包含文中所述的载体和药物赋形剂。
[0887] 在本文描述的本发明的各个方面中，可将本文描述的各个实施例中的一个或多个组合。
[0888] 在一些实施例中，载体在宿主细胞中是基本上非致病性的和/或非整合的。在一些实施例中，载体在宿主中是基本上非免疫原性的。
[0889] 在一些实施例中，载体的量足以调节(例如表型、病毒水平、基因表达、与其他病毒竞争、疾病状态等至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高)。
[0890] 在一些实施例中，组合物进一步包含至少一种病毒或包含所述病毒的基因组的载体，例如所述愈合子的变体、共栖/天然病毒、辅助病毒、非指环病毒。在一些实施例中，组合物进一步包含异源部分、至少一个小分子、抗体、多肽、核酸、靶向剂、显像剂、纳米颗粒及其组合。
[0891] 在一方面，本发明包括一种产生、繁殖和收获文中所述的愈合子的方法。
[0892] 在一方面，本发明包括一种设计和制造文中所述的载体的方法。
[0893] 在一方面，本发明包括一种在受试者中鉴定病毒缺乏症的方法，其包括：从获自有需要的受试者的样品中分析遗传信息，其中从所述受试者的遗传信息和其他微生物中分离出病毒遗传信息；将所述病毒遗传信息与参考(例如对照，健康受试者)进行比较；并且如果所述病毒遗传信息的比较得出所述受试者中病毒遗传信息的比例不平衡或不规则，则鉴定所述受试者中的病毒缺乏症。
[0894] 在本文描述的本发明的各个方面中，可将本文描述的各个实施例中的一个或多个组合。
[0895] 在一些实施例中，向受试者施用药物组合物，所述药物组合物还包含一种或多种在病毒遗传信息中未表示的病毒株系。在一些实施例中，受试者患有炎性病症或障碍、自身免疫病症或疾病、慢性/急性病症或障碍、癌症、胃肠病症或障碍或其任何组合。
[0896] 在实施例中，合成的愈合子抑制干扰素表达。
[0897] 产生方法
[0898] 产生遗传元件
[0899] 制备愈合子的遗传元件的方法描述于以下中，例如，Khudyakov&Fields,Artificial DNA:Methods and Applications[人工DNA：方法与应用],CRC出版社(2002)；
Zhao,Synthetic Biology:Tools and Applications[合成生物学：工具和应用],(第一
版),学术出版社(Academic Press)(2013)；和Egli&Herdewijn,Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),Wiley-VCH(2012)。
Zhao,Synthetic Biology:Tools and Applications[合成生物学：工具和应用],(第一
版),学术出版社(Academic Press)(2013)；和Egli&Herdewijn,Chemistry and Biology of Artificial Nucleic Acids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),Wiley-VCH(2012)。
[0900] 在一些实施例中，可以使用计算机辅助设计工具来设计遗传元件。可将愈合子分为更容易合成的较小的重叠块(例如，在约100bp至约10kb片段的范围内或单独的ORF)。这些DNA片段由一组重叠的单链寡核苷酸合成。然后将所得的重叠合成子装配成较大的DNA块，例如愈合子。可以将片段或ORF装配成愈合子，例如，体外重组或在5′和3′末端的独特的限制性位点以实现连接。
[0901] 替代地，可以使用设计算法来合成遗传元件，所述设计算法将愈合子解析为寡核苷酸长度的片段，考虑到序列空间的复杂性，为合成创造最佳的设计条件。然后在基于半导体的高密度芯片上化学合成寡核苷酸，每个芯片可合成超过200,000个单独的寡核苷酸。用诸如 的装配技术装配寡核苷酸，以由较小的寡核苷酸构建更长的DNA片段。这是通过并行方式完成的，因此一次可以构建成百上千个合成的DNA片段。
[0902] 可以对每个遗传元件或遗传元件的片段进行序列验证。在一些实施例中，可以使用AnyDot.chips(Genovoxx，德国)进行RNA或DNA的高通量测序，其允许监测生物学过程(例如，miRNA表达或等位基因变异性(SNP检测)。具体而言，AnyDot.chips使核苷酸荧光信号检测提高10x-50x。AnyDot.chips及其使用方法在以下中有部分地描述：国际公开申请号WO 02088382、WO 03020968、WO 0303 1947、WO 2005044836、PCTEP 05105657、PCMEP
05105655；以及德国专利申请号DE 101 49 786、DE 102 14 395、DE 103 56 837、DE 10
2004 009 704、DE 10 2004 025 696、DE 10 2004 025 746、DE 10 2004 025 694、DE 10
2004 025 695、DE 10 2004 025 744、DE 10 2004 025 745 和DE 10 2005 012 301。
05105655；以及德国专利申请号DE 101 49 786、DE 102 14 395、DE 103 56 837、DE 10
2004 009 704、DE 10 2004 025 696、DE 10 2004 025 746、DE 10 2004 025 694、DE 10
2004 025 695、DE 10 2004 025 744、DE 10 2004 025 745 和DE 10 2005 012 301。
[0903] 其他高通量测序系统包括在Venter,J.,等人Science[科学]2001年2月16日；Adams,M.等人Science[科学]2000年3月24日；和M.J,Levene,等人Science[科学]299:682-
686,2003年1月；以及US公布申请号20030044781和2006/0078937中披露的那些。总体上，这样的系统包括通过经由在核酸分子上测量的聚合反应在时间上添加碱基来对具有多个碱
基的靶核酸分子进行测序，即实时跟踪核酸聚合酶对要测序的模板核酸分子的活性。然后可以通过在碱基添加顺序的每个步骤中通过核酸聚合酶的催化活性来鉴定哪个碱基被掺
入到靶核酸的生长互补链中来推导该序列。在适合于沿着靶核酸分子移动并在活性位点延伸寡核苷酸引物的位置提供在靶核酸分子复合物上的聚合酶。在活性位点附近提供多个经标记的类型的核苷酸类似物，每个可区分类型的核苷酸类似物与靶核酸序列中的不同核苷酸互补。通过使用聚合酶以在活性位点向核酸链添加核苷酸类似物来延伸正在生长的核酸链，其中所添加的核苷酸类似物在活性位点与靶核酸的核苷酸互补。鉴定作为聚合步骤结果的添加至寡核苷酸引物的核苷酸类似物。重复提供经标记的核苷酸类似物，聚合生长的核酸链和鉴定添加的核苷酸类似物的步骤，从而使核酸链进一步延伸并鉴定靶核酸的序
列。
686,2003年1月；以及US公布申请号20030044781和2006/0078937中披露的那些。总体上，这样的系统包括通过经由在核酸分子上测量的聚合反应在时间上添加碱基来对具有多个碱
基的靶核酸分子进行测序，即实时跟踪核酸聚合酶对要测序的模板核酸分子的活性。然后可以通过在碱基添加顺序的每个步骤中通过核酸聚合酶的催化活性来鉴定哪个碱基被掺
入到靶核酸的生长互补链中来推导该序列。在适合于沿着靶核酸分子移动并在活性位点延伸寡核苷酸引物的位置提供在靶核酸分子复合物上的聚合酶。在活性位点附近提供多个经标记的类型的核苷酸类似物，每个可区分类型的核苷酸类似物与靶核酸序列中的不同核苷酸互补。通过使用聚合酶以在活性位点向核酸链添加核苷酸类似物来延伸正在生长的核酸链，其中所添加的核苷酸类似物在活性位点与靶核酸的核苷酸互补。鉴定作为聚合步骤结果的添加至寡核苷酸引物的核苷酸类似物。重复提供经标记的核苷酸类似物，聚合生长的核酸链和鉴定添加的核苷酸类似物的步骤，从而使核酸链进一步延伸并鉴定靶核酸的序
列。
[0904] 在一些实施例中，执行鸟枪测序。在鸟枪测序中，将DNA随机分为许多小片段，使用链终止法对其进行测序以获得读数。通过执行几轮这种片段化和测序，可以获得靶DNA的多个重叠读数。然后，计算机程序使用不同读数的重叠末端以将它们组装成连续序列。
[0905] 产生合成的愈合子
[0906] 可以多种方式使用如本文所述制备的遗传元件和包含遗传元件的载体，以在适当的宿主细胞中表达合成的愈合子。在一些实施例中，遗传元件和包含遗传元件的载体被转染到适当的宿主细胞中，并且所得的RNA可以指导愈合子基因产物例如非致病性蛋白质和蛋白质结合序列的高水平表达。提供高水平表达的宿主细胞系统包括提供病毒功能的连续细胞系，例如分别重叠感染APV或MPV的细胞系，经工程化以补充APV或MPV功能的细胞系等。
[0907] 在一些实施例中，如实例1、2、5、6或15-17中任一项所述地产生合成的愈合子。
[0908] 在一些实施例中，将合成的愈合子在体外在连续的动物细胞系中培养。根据本发明的一个实施例，细胞系可以包括猪细胞系。在本发明的上下文中设想的细胞系包括永生的猪细胞系，例如但不限于猪肾上皮细胞系PK-15和SK、单髓细胞系3D4/31和睾丸细胞系ST。此外，还包括其他哺乳动物细胞，如CHO细胞(中国仓鼠卵巢)、MARC-145、MDBK、RK-13、EEL。另外地或替代地，本发明方法的特定实施例利用了动物细胞系，其是上皮细胞系，即上皮谱系细胞的细胞系。易受愈合子感染的细胞系包括但不限于人或灵长类动物来源的细胞系，例如人或灵长类动物肾癌细胞系。
[0909] 在一些实施例中，遗传元件和包含遗传元件的载体被转染到表达病毒聚合酶蛋白的细胞系中，以实现愈合子的表达。为此，可以将表达愈合子聚合酶蛋白的转化细胞系用作合适的宿主细胞。宿主细胞可以类似地被工程化以提供其他病毒功能或额外功能。
[0910] 为了制备本文披露的合成的愈合子，可以使用本文披露的遗传元件或包含遗传元件的载体来转染细胞，所述细胞提供愈合子蛋白以及复制和产生所需的功能。可替代地，可以在被本文披露的遗传元件或包含遗传元件的载体转染之前、期间或之后用辅助病毒来转染细胞。在一些实施例中，辅助病毒可用于补充不完整病毒颗粒的产生。辅助病毒可能具有条件性生长缺陷，例如宿主范围限制或温度敏感性，从而允许随后选择转染病毒。在一些实施例中，辅助病毒可以提供宿主细胞利用的一种或多种复制蛋白以实现愈合子的表达。在一些实施例中，可以用编码病毒蛋白例如一种或多种复制蛋白的载体转染宿主细胞。
[0911] 可以通过本领域已知的多种技术将本文披露的遗传元件或包含遗传元件的载体复制和产生成愈合子颗粒，例如，美国专利号4,650,764；美国专利号5,166,057；美国专利号5,854,037；欧洲专利公开EP 0702085A1；美国专利申请系列号09/152,845；国际专利公开PCT WO97/12032；WO96/34625；欧洲专利公开EP-A780475；WO 99/02657；WO 98/53078；WO
98/02530；WO 99/15672；WO 98/13501；WO 97/06270；和EPO 780 47SA1中所述，其中每一个均通过引用整体并入本文。
98/02530；WO 99/15672；WO 98/13501；WO 97/06270；和EPO 780 47SA1中所述，其中每一个均通过引用整体并入本文。
[0912] 根据本发明的含愈合子的细胞培养物的产生可以以不同的规模进行，例如在烧瓶、滚瓶或生物反应器中。用于培养要感染的细胞的培养基是技术人员已知的，并且将包含细胞活力所需的标准营养物，但是还可以包含取决于细胞类型的其他营养物。任选地，培养基可以是不含蛋白质的。根据细胞类型，可以将细胞悬浮培养或在底物上培养。
[0913] 可以根据病毒生产的技术人员已知的方法进行合成的愈合子的纯化和分离，例如Rinaldi等人,DNA Vaccines:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)[DNA疫苗：方法和方案(分子生物学方法)],第3版.2014,Humana出版社所描述。
[0914] 在一方面，本发明包括一种本文所述的愈合子的体外复制和繁殖的方法，所述方法可以包括以下步骤：(a)将线性化的遗传元件转染到对愈合子感染敏感的细胞系中；(b)收获所述细胞并分离出显示所述遗传元件存在的细胞；(c)根据实验条件和基因表达，将在步骤(b)中获得的细胞培养至少三天，例如至少一周或更长时间；以及(d)收获步骤(c)的细胞。
[0915] 施用/递送
[0916] 可以将组合物(例如，包含本文所述的合成的愈合子的药物组合物)配制成包括药学上可接受的赋形剂。药物组合物可任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。本发明的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。可以在以下中找到药学制剂的配制和/或生产中的一般考虑：例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy 21st ed.[雷明顿：药学科学与实践第21版],Lippincott Williams&Wilkins,2005(通过引用并入本文)。
[0917] 尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于施用给人的药物组合物，但是本领域技术人员应理解，此类组合物通常适合于施用给任何其他动物，例如非人动物，例如非人哺乳动物。为了使组合物适合于施用给各种动物而对适合于施用给人类的药物组合物的修饰是众所周知的，并且普通兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有的话)来设计和/或进行这种修饰。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括与商业相关的鸟类，例如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡。
[0918] 本文描述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，这样的制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，然后，如果必要和/或期望的话，将产品分开、成形和/或包装。
[0919] 在一方面，本发明的特征在于一种向受试者递送愈合子的方法。所述方法包括向受试者施用包含本文所述的愈合子的药物组合物。在一些实施例中，所施用的愈合子在受试者中复制(例如，成为受试者的病毒组的一部分)。
[0920] 在一方面，本发明的特征在于一种向患有病毒缺乏症的受试者施用愈合子的方法。所述方法包括选择如本文所述的患有病毒缺乏症的受试者，以及向受试者施用包含如本文所述的愈合子的药物组合物。在一些实施例中，所施用的愈合子在受试者中复制(例如，成为受试者的病毒组的一部分)。
[0921] 药物组合物可以包含野生型或天然病毒元件和/或修饰的病毒元件。愈合子可以包括表1-20中任一个中的一个或多个序列(例如，核酸序列或编码其氨基酸序列的核酸序列)或与这些核苷酸序列中的任何一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％,、96％、97％、98％和99％核苷酸序列同一性的序列或与表1-20中任一个中的序列互补的序列。愈合子可以编码表1-20中任一个中的一个或多个序列或与表2、4、6、8、10、
12、14或16中任一个中氨基酸序列中任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％,、96％、97％、98％和99％序列同一性的序列。愈合子可以包括表19或表20中的一个或多个序列或与这些核苷酸序列中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、95％,、96％、97％、98％和99％核苷酸序列同一性的序列或与表19或表20中的序列互补的序列。
90％、95％,、96％、97％、98％和99％核苷酸序列同一性的序列或与表1-20中任一个中的序列互补的序列。愈合子可以编码表1-20中任一个中的一个或多个序列或与表2、4、6、8、10、
12、14或16中任一个中氨基酸序列中任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％,、96％、97％、98％和99％序列同一性的序列。愈合子可以包括表19或表20中的一个或多个序列或与这些核苷酸序列中的任一个具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、
85％、90％、95％,、96％、97％、98％和99％核苷酸序列同一性的序列或与表19或表20中的序列互补的序列。
[0922] 在一些实施例中，合成的愈合子足以与参考例如健康对照相比，增加(刺激)内源基因和蛋白质表达例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。在某些实施例中，与参考例如健康对照相比，合成的愈合子足以降低(抑制)内源基因和蛋白质表达例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。
[0923] 在一些实施例中，与参考例如健康对照相比，合成的愈合子在宿主或宿主细胞中抑制/增强一种或多种病毒特性，例如嗜性、感染性、免疫抑制/激活例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。
[0924] 在一方面，本发明包括一种在受试者中鉴定病毒缺乏症例如宿主中存在的病毒群体的失调的方法，其包括从获自有需要的受试者的样品中分析遗传信息，其中从所述受试者的遗传信息和其他微生物中分离出病毒遗传信息；将所述病毒遗传信息与参考(例如对照，健康受试者)进行比较；并且如果所述病毒遗传信息的比较得出所述受试者中病毒遗传信息的比例不平衡或不规则，则鉴定所述受试者中的病毒缺乏症。
[0925] 在一方面，本发明还包括一种用于生成遗传信息的数据库以在患病受试者中鉴定病毒缺乏症的方法，所述方法可以包括以下步骤(i)确定来自健康受试者的样品中宿主细胞基因组的核苷酸序列；(ii)确定存在于宿主细胞基因组中和/或以游离形式存在的病毒核酸序列；(iii)编译步骤(ii)中确定的与特定病毒株系相关的病毒核酸序列的数据库；以及(iv)对多个受试者重复步骤(i)-(iii)以填充数据库。
[0926] 在一方面，本发明包括一种向患有病毒缺乏症的受试者施用本文所述的药物组合物的方法，所述方法包括如本文所述获得病毒遗传信息，以及施用包含文中所述的愈合子的药物组合物，其剂量足以相对于参考例如健康对照改变受试者内病毒组例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。
[0927] 在一些实施例中，向受试者施用药物组合物，所述药物组合物还包含一种或多种在病毒遗传信息中未表示的病毒株系。
[0928] 在一些实施例中，以足以调节病毒感染的剂量和时间施用包含本文所述的愈合子的药物组合物。病毒感染的一些非限制性实例包括腺相关病毒、爱知病毒、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒、BK多瘤病毒、班纳病毒、巴马森林病毒、布尼亚韦拉病毒、布尼亚病毒拉克罗斯、布尼亚病毒雪兔、鹿角皮膜疱疹疱疹病毒、钱迪普拉病毒、基孔肯雅病毒、科萨病毒(Cosavirus)A、牛痘病毒、柯萨奇病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、登革热病毒、多里病毒、杜拜病毒、杜温哈格病毒、东部马脑炎病毒、埃博拉病毒、回声病毒、脑心肌炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、欧洲蝙蝠狂犬病病毒、GB病毒C型/G型肝炎病毒、汉坦病毒、亨德拉病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、马痘病毒、人腺病毒、人星形病毒、人冠状病毒、人巨细胞病毒、人肠病毒68、人肠病毒70、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒1、人乳头瘤病毒2、人乳头瘤病毒16、人乳头瘤病毒18、人副流感、人细小病毒B19、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、人SARS冠状病毒、人膜细小病毒、人T淋巴病毒、人环状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、伊斯法罕病毒、JC多瘤病毒、日本脑炎病毒、胡宁球菌病毒、KI多瘤病毒、昆津病毒、拉各斯蝙蝠病毒、维多利亚湖马尔堡病毒、兰加特病毒、拉萨病毒、洛兹代尔病毒、跳跃病病毒、淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒、马库波病毒、马亚罗病毒、MERS冠状病毒、麻疹病毒、芒果脑心肌炎病毒、默克尔细胞多瘤病毒、莫可拉病毒、软体动物接触性疱疹病毒、猴痘病毒、腮腺炎病毒、默里谷脑炎病毒、纽约病毒、尼帕病毒、诺沃克病毒、奥-奈氏病毒、口疮病毒、奥罗泼希病毒、皮钦德病毒、脊髓灰质炎病毒、庞塔托鲁静脉病毒、普马拉病毒、狂犬病病毒、裂谷热病毒、罗莎病毒A、罗斯河病毒、轮状病毒A、轮状病毒B、轮状病毒C、风疹病毒、鹭山病毒、萨里病毒(Salivirus)A、桑蝇热西西里病毒、札幌病毒、塞姆利基森林病毒、汉城病毒、猿猴泡沫病毒、猿猴病毒5、辛德比斯病毒、南安普敦病毒、圣路易斯脑炎病毒、蜱传波瓦桑病毒、细环病毒、托斯卡纳病毒、尤库尼米病毒、牛痘病毒、水痘带状疱疹病毒、天花病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、水泡口腔炎病毒、西部马脑炎病毒、WU多瘤病毒、西尼罗河病毒、亚巴猴肿瘤病毒、亚巴样病病毒、黄热病病毒和寨卡病毒。在某些实施例中，相对于参考，愈合子足以胜出和/或替换已经存在于受试者中的病毒例如至少约5％、
10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高。在某些实施例中，愈合子足以与慢性或急性病毒感染竞争。在某些实施例中，可预防性地施用愈合子以免遭病毒感染(例如预防病毒)。在一些实施例中，愈合子的量足以调节(例如表型、病毒水平、基因表达、与其他病毒竞争、疾病状态等至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高)。
10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高。在某些实施例中，愈合子足以与慢性或急性病毒感染竞争。在某些实施例中，可预防性地施用愈合子以免遭病毒感染(例如预防病毒)。在一些实施例中，愈合子的量足以调节(例如表型、病毒水平、基因表达、与其他病毒竞争、疾病状态等至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更高)。
[0929] 本文引用的所有参考和出版物均通过引用并入本文。
[0930] 提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例，但无意于限制本发明的范围；通过它们的示例性性质将理解，可以替换地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。
[0931] 实例
[0932] 实例1：制备愈合子
[0933] 该实例描述了抑制干扰素(IFN)表达的合成的愈合子的设计和合成。
[0934] 设计了一种愈合子(愈合子A)，其起始于1)编码非致病性包装外壳的衣壳基因的DNA序列(Arch Virol(2007)152:1961-1975)，登记号：A7XCE8.1(ORF11_TTW3)；2)编码靶向宿主基因(例如IFN)的微小RNA的DNA序列(PLOS Pathogen(2013),9(12),e1003818)，登记号：AJ620231.1；和3)与衣壳蛋白中的特定区域(例如具有登记号：Q99153.1的衣壳的特定区域)结合的DNA序列(Journal of Virology[病毒学杂志](2003),77(24),13036-13041)。
[0935] 向该序列添加1kb非编码DNA序列(愈合子B)。将所设计的愈合子(图2)化学合成为3kb(总大小)，并进行序列验证。
[0936] 按照制造商的建议，用JetPEI试剂(PolyPlus-transfection,法国伊尔基希(Illkirch,France))将愈合子序列转染到人胚肾293T细胞中(12孔平板上每105个细胞
1mg)。对照转染仅包含载体或单独用JetPEI转染的细胞，并用编码GFP的报告质粒优化了转染效率。测量对照转染的荧光以确保适当转染细胞。将转染培养物在37℃和5％二氧化碳中孵育过夜。
1mg)。对照转染仅包含载体或单独用JetPEI转染的细胞，并用编码GFP的报告质粒优化了转染效率。测量对照转染的荧光以确保适当转染细胞。将转染培养物在37℃和5％二氧化碳中孵育过夜。
[0937] 18小时后，在加入新鲜培养基之前，将细胞用PBS洗涤3次。如下收集上清液，用于超速离心和收获愈合子。通过以4,000xg离心30分钟然后以8,000xg离心15分钟以除去细胞和细胞碎片来清除培养基。然后将上清液通过0.45μm孔径的过滤器过滤。通过5％蔗糖垫(5ml)以27,000rpm将愈合子沉淀1小时，然后将其重悬于1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)和0.1％杆菌肽(以1/100原始体积)中。将浓缩的愈合子以24,000rpm通过20％至35％蔗糖梯度离心2小时。收集梯度结处的愈合子带。然后将愈合子用1x PBS稀释并以27,000rpm沉淀1小时。
将愈合子沉淀重悬于1x PBS中，并通过20％至35％连续蔗糖梯度进一步纯化。
将愈合子沉淀重悬于1x PBS中，并通过20％至35％连续蔗糖梯度进一步纯化。
[0938] 实例2：大规模产生愈合子(愈合子A和/或B)
[0939] 此实例描述了愈合子的产生和繁殖。
[0940] 制备实例1中所述的纯化的愈合子，用于在具有悬浮生长的生产A549细胞的旋转瓶中大规模扩增。将A549细胞维持在F12K培养基、10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素中。
在37℃和5％二氧化碳中孵育24小时后，以106个愈合子的愈合子负载用愈合子感染A549细胞，从而产生约1x107个愈合子颗粒。然后将细胞用PBS洗涤3次，并与新鲜培养基孵育6小时。
在37℃和5％二氧化碳中孵育24小时后，以106个愈合子的愈合子负载用愈合子感染A549细胞，从而产生约1x107个愈合子颗粒。然后将细胞用PBS洗涤3次，并与新鲜培养基孵育6小时。
[0941] 对于愈合子的纯化，如下进行基于氯化铯梯度的两个超速离心步骤，然后进行透析(Bio-Protocol(2012)Bio101:e201)。离心(6000x g，10分钟)除去细胞，然后将上清液先通过0.8μm过滤器过滤，然后再通过0.2μm过滤器过滤。滤液通过滤膜(100,000mw)浓缩至8ml体积。将渗余物负载到硫酸铯溶液中，并以247,000x g离心20h。去除愈合子带，放入14,
000mw截止分子量的透析管中，并进行透析。如果需要，可以进行进一步的浓缩。
000mw截止分子量的透析管中，并进行透析。如果需要，可以进行进一步的浓缩。
[0942] 实例3：愈合子的体外作用(愈合子A)
[0943] 该实例描述了细胞感染后愈合子的表达和效应子功能例如miRNA的表达的体外评估。
[0944] 通过内源基因调节(例如IFN信号传导)在体外评估实例1中所述的纯化的愈合子的作用。将HEK293T细胞用双萤光素酶质粒(具有基于干扰素刺激的响应元件(ISRE)的启动子的萤火虫萤光素酶和具有组成型启动子的转染对照海肾荧光素酶)：萤光素酶报告混合物(pcDNA3.1dsRluc与pISRE-Luc，1:4比率(Clonetech))共转染(J Virol[病毒学杂志]
(2008),82:9823-9828)。
(2008),82:9823-9828)。
[0945] 向接种在6孔板(2组一式三份的3个对照孔和3个使用愈合子A的实验孔)中的HEK293T细胞，以107次感染复数施用愈合子。
[0946] 48小时后，用含或不含100u/ml通用I型干扰素(PBL,新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway,NJ))的新培养基替换培养基。IFN治疗后十六小时，进行了双荧光素酶测定(J Virol[病毒学杂志](2008),82:9823-9828)以测定IFN信号传导。将萤火虫荧光素酶归一化为海肾荧光素酶表达，以控制转染差异。通过将相当的实验孔除以对照孔，计算出ISRE ffLuc报告基因的诱导倍数，并相对于阴性对照比较每种条件的诱导。
[0947] 在一个实施例中，与对照相比，在愈合子治疗组中荧光素酶信号降低将表明该愈合子降低了细胞中IFN的产生。
[0948] 实例4：愈合子的免疫学作用(愈合子A)
[0949] 该实例描述了施用后愈合子的体内效应子功能，例如miRNA的表达。
[0950] 使用的百倍稀释度，从1014个基因组当量/千克开始，降到0个基因组当量/千克，将按照实例1和2中所述制备的纯化的愈合子以各种剂量静脉内施用给健康的猪。为了评估对免疫耐受性的影响，每天向猪注射以上指定剂量的愈合子或媒介物对照PBS，持续3天，并在3天后处死。
[0951] 收获脾脏、骨髓和淋巴结。从每个组织制备单细胞悬浮液，并用MHC-II、CD11c和细胞内IFN的细胞外标记物染色。通过流式细胞术分析来自每个组织的MHC+、CD11c+、IFN+抗原呈递细胞，例如，其中对于上述标记物中给定一种呈阳性的细胞是荧光表现高于在相同条件下缺少标记物表达但在其他方面与细胞分析群体相似的阴性对照群体中99％细胞的细胞。
[0952] 在一个实施例中，与对照相比，愈合子治疗组中IFN+细胞数量的减少将表明愈合子在施用后降低了细胞中IFN的产生。
[0953] 实例5：制备合成的愈合子。
[0954] 该实例说明了合成的愈合子的体外产生。
[0955] 将EcoRV限制性酶切位点之间来自TTMiniV的LY1和LY2株系的DNA序列(Eur Respir J.[欧洲呼吸杂志]2013年8月；42(2):470-9)克隆到卡那霉素载体(集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies))中。在实例6和7以及图6A-10B中，将包括来自TTMiniV的LY1和LY2株系的DNA序列的愈合子分别称为愈合子1和愈合子2。按照制造商的规程，将克隆的构建体转化到10-β感受态大肠杆菌中(新英格兰生物实验室公司(New England
Biolabs Inc.))，然后纯化质粒(凯杰公司(Qiagen))。
Biolabs Inc.))，然后纯化质粒(凯杰公司(Qiagen))。
[0956] 根据制造商的规程，将DNA构建物(图3和图4)在37℃下用EcoRV限制性酶切消化(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs Inc.))线性化6小时，然后进行琼脂糖凝胶电泳，切出正确大小的DNA带(2.9千碱基对)，并使用凝胶提取试剂盒(凯杰公司
(Qiagen))从切下的琼脂糖带中凝胶纯化DNA。
(Qiagen))从切下的琼脂糖带中凝胶纯化DNA。
[0957] 实例6：愈合子的装配和感染
[0958] 该实例说明了使用实例5中所述的合成DNA序列成功地在体外产生感染性愈合子。
[0959] 用脂质转染试剂(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))以完整质粒或线性化形式将愈合子DNA(在实例5中获得)转染到HEK293T细胞(人胚胎肾细胞系)或
A549细胞(人肺癌细胞系)中。将6ug质粒或1.5ug线性化DNA用于在T25烧瓶中转染70％汇合细胞。将缺少愈合子中包含的病毒序列的空载体主链用作阴性对照。转染后6小时，将细胞用PBS洗涤两次，并使其在37℃和5％二氧化碳下在新鲜生长培养基中生长。从IDT合成了编码人Ef1α启动子后跟YFP基因的DNA序列。将该DNA序列平末端连接到克隆载体(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))中。将所得的载体用作评估转染效率的对照。转染后72小时，使用细胞成像系统(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))检测
YFP。HEK293T和A549细胞的转染效率分别计算为85％和40％(图5)。
A549细胞(人肺癌细胞系)中。将6ug质粒或1.5ug线性化DNA用于在T25烧瓶中转染70％汇合细胞。将缺少愈合子中包含的病毒序列的空载体主链用作阴性对照。转染后6小时，将细胞用PBS洗涤两次，并使其在37℃和5％二氧化碳下在新鲜生长培养基中生长。从IDT合成了编码人Ef1α启动子后跟YFP基因的DNA序列。将该DNA序列平末端连接到克隆载体(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))中。将所得的载体用作评估转染效率的对照。转染后72小时，使用细胞成像系统(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))检测
YFP。HEK293T和A549细胞的转染效率分别计算为85％和40％(图5)。
[0960] 转染后96小时，收获用愈合子转染的293T和A549细胞的上清液。将收获的上清液在4℃下以2000rpm离心10分钟，以去除任何细胞碎片。将每种收获的上清液分别用于感染新的293T和A549细胞，它们在24孔板的孔中70％汇合。在37℃和5％二氧化碳中孵育24小时后，将上清液洗掉，然后两次PBS洗涤，并用新鲜的生长培养基替换。将这些细胞在37度和5％二氧化碳中再孵育48小时后，分别收获细胞用于基因组DNA提取。根据制造商的方案，使用基因组DNA提取试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))收集每个样品的基因组DNA。
[0961] 为了证实体外产生的愈合子成功感染了293T和A549细胞，使用针对乙型细环病毒或LY2特异性序列具有特异性的引物，将100ng如本文所述收获的基因组DNA用以进行定量聚合酶链反应(qPCR)。根据制造商的方案，使用SYBR绿色试剂(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))进行qPCR。使用针对GAPDH的基因组DNA序列具有特异性的引物的qPCR进行归一化。表21列出了所有使用的引物的序列。
[0962] 表21：
[0963]
[0964] 如图6A、6B、7A和7B所示的qPCR结果所示，体外产生且如本实例所述的愈合子具有传染性。
[0965] 实例7：愈合子的选择性
[0966] 该实例说明了体外产生的合成的愈合子感染多种组织来源的细胞系的能力。
[0967] 将具有感染性TTMiniV愈合子(如实例5中所述)的上清液与70％汇合293T、A549、Jurkat(急性T细胞白血病细胞系)、Raji(伯基特氏淋巴瘤B细胞系)和Chang(肝癌细胞系)细胞系在37度和5％二氧化碳下在24孔板的孔中一起孵育。感染后24小时，用PBS洗涤细胞两次，然后用新鲜的生长培养基替换。然后将细胞在37度和5％二氧化碳中再次孵育48小时，然后收获进行基因组DNA提取。根据制造商的方案，使用基因组DNA提取试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))收集每个样品的基因组DNA。
[0968] 为了证实在先前实例中产生的愈合子成功感染了这些细胞系，使用针对乙型细环病毒或LY2特异性序列具有特异性的引物，将100ng如本文所述收获的基因组DNA用以进行定量聚合酶链反应(qPCR)。根据制造商的方案，使用SYBR绿色试剂(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))进行qPCR。使用针对GAPDH的基因组DNA序列具有特异性的引物的qPCR进行归一化。表21列出了所有使用的引物的序列。
[0969] 如图6A-10B所示的qPCR结果所示，在体外产生的愈合子不仅具有传染性，而且它们也能够感染多种细胞系，包括上皮细胞、肺组织细胞、肝细胞、癌细胞、淋巴细胞、淋巴母细胞、T细胞、B细胞和肾细胞的实例。还观察到合成的愈合子能够感染HepG2细胞，相对于对照增加超过100倍。
[0970] 实例8：蛋白质结合序列的鉴定和使用
[0971] 该实例描述了指环病毒基因组中推定的蛋白质结合位点，其可用于例如在本文所述的愈合子中扩增和包装效应子。在一些情况下，蛋白质结合位点可能能够结合外部蛋白质，例如衣壳蛋白。
[0972] 指环病毒基因组中的两个保守结构域是假定的复制起点：5'UTR保守结构域(5CD)和GC富集结构域(GCR)(de Villiers等人,Journal of Virology[病毒学杂志]2011；Okamoto等人,Virology[病毒学]1999)。在一个实例中，为了证实这些序列是作为DNA复制位点还是作为衣壳包装信号，在包括TTMV-LY2的质粒中对每个区域进行缺失。用pTTMV-LY2Δ5CD或pTTMV-LY2ΔGCR转染A539细胞。将转染的细胞孵育四天，然后从上清液和细胞沉淀中分离出病毒。用病毒感染A549细胞，四天后，从上清液和感染的细胞沉淀中分离出病毒。
进行qPCR以定量来自样品的病毒基因组。复制起点的破坏阻止了病毒复制酶扩增病毒DNA，与野生型病毒相比，导致从转染的细胞沉淀中分离出的病毒基因组减少。仍包装了少量病毒，并且可以在转染的上清液和感染的细胞沉淀中找到。在一些实施例中，包装信号的破坏将防止病毒DNA被衣壳蛋白包封。因此，在实施例中，在转染的细胞中仍然存在病毒基因组的扩增，但是在上清液或感染的细胞沉淀中未发现病毒基因组。
进行qPCR以定量来自样品的病毒基因组。复制起点的破坏阻止了病毒复制酶扩增病毒DNA，与野生型病毒相比，导致从转染的细胞沉淀中分离出的病毒基因组减少。仍包装了少量病毒，并且可以在转染的上清液和感染的细胞沉淀中找到。在一些实施例中，包装信号的破坏将防止病毒DNA被衣壳蛋白包封。因此，在实施例中，在转染的细胞中仍然存在病毒基因组的扩增，但是在上清液或感染的细胞沉淀中未发现病毒基因组。
[0973] 在另一个实例中，为了表征DNA中的额外复制或包装信号，使用了整个TTMV-LY2基因组上的一系列缺失。在序列的长度上逐步缺失100bp。将包括TTMV-LY2缺失的质粒转染到A549中并如上所述进行测试。在一些实施例中，破坏病毒扩增或包装的缺失将包含潜在的顺式调节结构域。
[0974] 可以将复制和包装信号掺入编码效应子的DNA序列中(例如在愈合子的遗传元件中)以诱导扩增和包封。这是在愈合子基因组的较大区域的背景下完成的(即将效应子插入基因组的特定位点，或用效应子代替病毒ORF等)，或者通过将最小的顺式信号掺入效应子DNA中来完成。在愈合子缺乏反式复制或包装因子(例如，复制酶和衣壳蛋白等)的情况下，反式因子由辅助基因提供。辅助基因表达足以诱导扩增和包装的所有蛋白质和RNA，但缺乏其自身的包装信号。愈合子DNA与辅助基因共转染，导致效应子而非辅助基因的扩增和包装。
[0975] 实例9：最小的指环病毒基因组
[0976] 该实例描述了指环病毒基因组中的缺失，以帮助表征足以复制病毒并插入效应有效负载的最小基因组。
[0977] 在ORF下游但GC富集区上游的TTV-tth8的非编码区(NCR)中缺失了172个核苷酸(nt)(nt 3436至3607)。将56-nt随机序列TTTGTGACACAAGATGGCCGACTTCCTTCCTCTTTAGTCTTCCCCAAAGAAGACAA(SEQ ID NO:696))插入缺失中。使用lipofectamine 2000，将2μg环状或线性化(通过SmaI)pTTV-tth8(3436-3707::56nt)(一种含有改变的TTV-tth8的DNA质粒)转染到在6cm板上60％汇合的HEK293或A549细胞中，一式两份。转染后96小时，通过冻融从细胞沉淀和上清液中分离出病毒，在液氮与37℃水浴之间交替进行三次。将来自上清液的病毒用于再感染细胞(HEK293细胞被从HEK293分离出的病毒感染，并且A549细胞被从A549分离出的病毒感染)。感染后72小时，通过冻融从细胞沉淀和上清液中分离出病毒。对所有样品进行qPCR。如下表22所示，在感染的细胞的细胞沉淀和上清液中均观察到TTV-tth8，表明pTTV-tth8(3436-3707::56nt)成功产生了病毒。因此，TTV-tth8能够耐受nt 3436至3707的缺失。
[0978] 表22：HEK293和A549中的TTV-tth8(3436-3707::56nt)感染导致病毒扩增。与不添加质粒或病毒的阴性对照细胞相比，重复实验得到的平均基因组当量。
[0979]
[0980] 装配了TTMV-LY2的工程化版本，缺失了核苷酸574至1371和1432至2210(1577bp缺失)，并在ORF1的C端(野生型TTMV-LY2的nt 2609之后)插入了513bp NanoLuc(nLuc)报告基因ORF。如实例17所述，将包括用于工程化TTMV-LY2的DNA序列的质粒(pVL46-015B)转染到A549细胞中，然后分离病毒并用于感染新的A549细胞。在感染的细胞的细胞沉淀和上清液中检测到nLuc发光，表明病毒复制(图11A-11B)。这说明TTMV-LY2可以耐受ORF区域中缺失至少1577bp。
[0981] 为了进一步表征足以复制的最小病毒基因组，在TTMV-LY2 DNA中进行了一系列缺失。如前所述，制备了具有nt 574-1371和1432-2210缺失但没有nLuc插入的TTMV-LY2，并测试其病毒复制。对TTMV-LY2Δ574-1371,Δ1432-2210进行了进一步缺失。缺失nt 1372-1431，以产生TTMV-LY2Δ574-2210。此外，将ORF1下游的ORF3序列缺失(Δ2610-2809)。最后，为了测试非编码区的缺失，在整个NCR上依次进行了一系列100bp的缺失。如前所述，测试所有缺失突变体的病毒复制。将导致成功病毒产生的缺失(表明缺失的区域对于病毒复制不是必不可少的)组合在一起，以制成具有更多缺失核苷酸的TTMV-LY2变体。该策略将提供足以自我扩增的最小病毒。为了鉴定可以用辅助基因扩增的最小病毒，将破坏病毒复制的每个缺失突变体与携带反式复制和包装元件的辅助基因一起进行测试。通过复制元件的反式表达挽救的缺失表明病毒基因组当从单独的来源提供辅助基因时可以缺失以形成最
小的病毒的区域。
小的病毒的区域。
[0982] 实例10：将各种长度的核苷酸插入指环病毒基因组中
[0983] 该实例描述了将各种长度的DNA序列添加到指环病毒基因组中，其在某些情况下可用于产生本文所述的愈合子。
[0984] 将DNA序列克隆到含有TTV-tth8(GenBank登记号AJ620231.1)和TTMV-LY2(GenBank登记号JX134045.1)的质粒中。在开放阅读框的非编码区(NCR)3'和GC富集区的5'中进行插入：在TTV-tth8的核苷酸3588或TTMV-LY2的核苷酸2843之后。
[0985] 将以下长度的随机DNA序列插入TTV-tth8和TTMV-LY2的NCR中：100个碱基对(bp)、200bp、500bp、1000bp和2000bp。设计这些序列以匹配每个病毒基因组的相对GC含量：约
50％GC用于插入TTV-tth8，而约38％GC用于TTMV-LY2。另外，将几个转基因插入到NCR中。这些包括由U6启动子(351bp)驱动的miRNA和由组成型hEF1a启动子(2509bp)驱动的EGFP。
50％GC用于插入TTV-tth8，而约38％GC用于TTMV-LY2。另外，将几个转基因插入到NCR中。这些包括由U6启动子(351bp)驱动的miRNA和由组成型hEF1a启动子(2509bp)驱动的EGFP。
[0986] 如前所述，将包括各种大小的DNA插入物的TTV-tth8和TTMV-LY2变体转染到哺乳动物细胞系中，包括HEK293和A549。从上清液或细胞沉淀中分离出病毒。将分离的病毒用于感染其他细胞。通过定量PCR监测从感染细胞产生病毒。在一些实施例中，病毒的成功产生将指示插入的耐受性。
[0987] 实例11：要递送的示例性货物
[0988] 该实例描述了可以与例如文中所述的愈合子例如基于指环病毒的愈合子一起递送的示例性类别的核酸和蛋白质有效负载。
[0989] 有效负载的一个实例是用于蛋白质表达的mRNA。目的编码序列是从源病毒(例如指环病毒)天然的病毒启动子转录的，或者是从与有效负载一起作为转基因一部分而引入的启动子转录的。可替代地，在病毒mRNA的开放阅读框内编码mRNA，导致病毒蛋白与目的蛋白之间的融合。当需要时，切割结构域例如2A肽或蛋白酶靶位点可用于将目的蛋白与病毒蛋白分离。
[0990] 非编码RNA(ncRNA)是有效负载的另一个实例。通常使用RNA聚合酶III启动子(例如U6或VA)转录这些RNA。可替代地，使用RNA聚合酶II(例如天然病毒启动子或可调节的合成启动子)转录ncRNA。当从RNA聚合酶II启动子表达时，ncRNA被编码为mRNA外显子、内含子或在聚A信号下游转录的额外RNA的一部分。ncRNA通常被编码为较大RNA分子的一部分，或者使用核酶或核糖内切核酸酶切割。可在愈合子基因组中编码为货物的ncRNA包括微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义RNA、miRNA海绵、长非编码RNA
(lncRNA)和指导RNA(gRNA)。
(lncRNA)和指导RNA(gRNA)。
[0991] DNA可以用作功能元件，而无需RNA转录。例如，DNA可用作同源重组的模板。在另一个实例中，可以使用蛋白质结合DNA序列来驱动目的蛋白质包装到衣壳中(例如愈合子的蛋白质外部)。为了同源重组，将与人基因组DNA同源的区域编码到载体DNA中以充当同源臂。重组可以由靶向内切核酸酶(例如具有gRNA的Cas9，或锌指核酸酶)驱动，所述靶向内切核酸酶可以从载体或从单独的来源表达。在细胞内部，单链DNA基因组被转换为双链DNA，然后作为基因组DNA断裂位点的同源重组的模板。为了募集目的蛋白质，可以将蛋白质结合序列编码到愈合子DNA中。目的DNA结合蛋白或与DNA结合蛋白(例如Gal4)融合的目的蛋白与愈合子DNA结合。当愈合子DNA被衣壳蛋白包封时，DNA结合蛋白也被包封，并且可以与愈合子一起递送到细胞中。
[0992] 实例12：示例性有效负载整合位点
[0993] 该实例描述了核酸有效负载可插入其中的TTV-tth8(GenBank登记号AJ620231.1)和TTMV-LY2(GenBank登记号JX134045)的基因组中的示例性位点。
[0994] 可以采用几种策略以插入TTV-tth8(核苷酸336至3015)和TTMV-LY2(核苷酸424至2812)的开放阅读框(ORF)区。在一个实例中，为了标记病毒蛋白或产生融合蛋白，将有效负载按读框插入目的特定ORF内。替代地，缺失部分或全部ORF区，这可能会或可能不会破坏病毒蛋白功能。然后将有效负载插入缺失区域。另外，TTV-tth8(核苷酸716和2362之间)或TTMV-LY2(核苷酸724和2273之间)的ORF1中的高变结构域(HVD)可以用作插入位点。
[0995] 替代地，将有效负载插入与TTV-tth8或TTMV-LY2的非编码区(NCR)相当的载体区中。特别是，在TATA盒上游的5'NCR、5'非翻译区(UTR)、聚A信号下游和GC富集区上游的3'NCR中进行插入。另外，在TTV-tth8的miRNA区(核苷酸3429至3506)中插入。对于5'NCR区，在TATA盒上游进行插入(在TTV-tth8中的核苷酸1和82之间，在TTMV-LY2中的核苷酸1和236之间)。在一些实施例中，以相反方向插入转基因以减少启动子干扰。对于5'UTR，在转录起始位点的下游(TTV-tth8中的核苷酸111，TTMV-LY2中的核苷酸267)和ORF2起始密码子的上游(TTV-tth8中的核苷酸336，TTMV-LY2中的核苷酸421)进行插入。5'UTR插入会在5'UTR中添加或替换核苷酸。如实例10中所述，在GC富集区上游进行3'NCR插入，特别是在TTV-tth8中的核苷酸3588或TTMV-LY2中的核苷酸2843之后。将TTV-tth8的miRNA替换为可替代的天然或合成miRNA发夹。
[0996] 实例13：定义的类别的指环病毒和其保守区
[0997] 人中存在三种指环病毒属：甲型细环病毒(细环病毒，TTV)、乙型细环病毒(细环中型病毒，TTMDV)和丙型细环病毒(细小环病毒，TTMV)。在甲型细环病毒中，存在五个充分证实的系统进化进化分枝(图11C)。可以预期的是，这些指环病毒中的任一种都可以用作来源病毒(例如，病毒DNA序列的来源)，用于产生本文所述的愈合子。
[0998] 在这些序列中，在5'UTR结构域(约75％保守性)和GC富集结构域(大于100个碱基对，GC含量大于70％，约70％保守性)中发现了最高保守性。另外，序列中的高变结构域(HVD)具有非常低的保守性(约30％保守性)。所有指环病毒也都包含其中所有三个阅读框均开放的区域。
[0999] 本文还提供了来自TTV进化分枝以及TTMDV和TTMV中每一个的代表性病毒的示例性序列，其用保守区注释(参见，例如，表1-14)。
[1000] 实例14：复制缺陷型愈合子和辅助病毒
[1001] 为了复制和包装愈合子，可以反式提供一些元件。这些包括指导或支持DNA复制或包装的蛋白质或非编码RNA。在某些情况下，反式元件可以从替代愈合子的来源中获得，例如辅助病毒、质粒或从细胞基因组中获得。
[1002] 通常以顺式提供其他元件。这些元件可以是例如愈合子DNA中的序列或结构，其充当复制起点(例如，允许愈合子DNA的扩增)或包装信号(例如，结合蛋白以将基因组负载到衣壳中)。通常，复制缺陷型病毒或愈合子将丢失这些元件中的一个或多个，使得即使反式提供其他元件，DNA也不能包装成传染性病毒粒子或愈合子。
[1003] 复制缺陷型病毒可用作辅助病毒，例如，用于控制愈合子(例如复制缺陷型或包装缺陷型愈合子)在同一细胞中的复制。在某些情况下，辅助病毒将缺少顺式复制或包装元件，但会表达反式元件，例如蛋白质和非编码RNA。通常，治疗性愈合子将缺少这些反式元件中的一些或所有，因此将无法单独复制，但会保留顺式元件。当共转染/感染到细胞中时，复制缺陷型辅助病毒将驱动愈合子的扩增和包装。因此，收集的包装颗粒将仅由治疗性愈合子组成，而不会感染辅助病毒。
[1004] 为了开发复制缺陷型愈合子，将去除指环病毒的非编码区域中的保守元件。特别是，将分别或一起测试保守的5'UTR结构域和GC富集结构域的缺失。两种元件被认为对于病毒复制或包装是重要的。此外，将在整个非编码区中进行一系列缺失，以鉴定以前未知的目的区。
[1005] 复制元件的成功缺失将导致细胞内的愈合子DNA扩增减少，例如，通过qPCR所测量，但将支持某些传染性愈合子产生，例如，通过对受感染的细胞的测定所监测，所述测定可包括qPCR、蛋白质印迹、荧光测定或发光测定中任一种或全部。包装元件的成功缺失不会破坏愈合子DNA扩增，因此通过qPCR在转染的细胞中可观察到愈合子DNA的增加。但是，愈合子基因组不会被包封，因此不会观察到传染性愈合子产生。
[1006] 实例15：具有复制能力的愈合子的制造方法
[1007] 此实例描述了一种用于回收和扩大具有复制能力的愈合子的产生的方法。当它们在基因组中编码在细胞中复制所需的所有必需遗传元件和ORF时，愈合子具有复制能力。由于这些愈合子的复制没有缺陷，因此它们不需要反式提供的互补活性。但是，它们可能需要辅助活性，例如转录增强子(例如丁酸钠)或病毒转录因子(例如腺病毒E1、E2、E4、VA；HSV Vp16和立即早期蛋白)。
[1008] 在该实例中，将编码线性或环状形式的合成愈合子的全序列的双链DNA通过化学转染引入T75烧瓶中的5E+05粘附哺乳动物细胞中，或通过电穿孔引入5E+05悬浮细胞中。在最佳时间段后(例如，转染后3-7天)，通过将细胞刮入上清液培养基中来收集细胞和上清液。加入温和洗涤剂(如胆盐)至最终浓度为0.5％，并在37℃下孵育30分钟。加入氯化钙和氯化镁至最终浓度分别为0.5mM和2.5mM。加入内切核酸酶(例如DNAse I，Benzonase)，并在
25℃-37℃下孵育0.5-4小时。将愈合子悬浮液在4℃下以1000x g离心10分钟。将澄清的上清液转移至新试管中，并用冷冻保护剂缓冲液(也称为稳定化缓冲液)以1:1稀释，并根据需要在-80℃下保存。这将产生第0代的愈合子(P0)。为了使洗涤剂的浓度低于用于培养细胞的安全极限，根据愈合子效价，将这种接种物在无血清培养基(SFM)中稀释至少100倍或更多倍。
25℃-37℃下孵育0.5-4小时。将愈合子悬浮液在4℃下以1000x g离心10分钟。将澄清的上清液转移至新试管中，并用冷冻保护剂缓冲液(也称为稳定化缓冲液)以1:1稀释，并根据需要在-80℃下保存。这将产生第0代的愈合子(P0)。为了使洗涤剂的浓度低于用于培养细胞的安全极限，根据愈合子效价，将这种接种物在无血清培养基(SFM)中稀释至少100倍或更多倍。
[1009] 将T225烧瓶中新鲜的哺乳动物细胞单层用足以覆盖培养物表面的最小体积覆盖，并在37℃和5％二氧化碳下以温和摇动孵育90分钟。用于该步骤的哺乳动物细胞可以与用于P0回收的细胞类型相同或不同。孵育后，将接种物替换为40ml无血清、无动物源的培养基。将细胞在37℃和5％二氧化碳下孵育3-7天。加入4ml先前使用的相同温和洗涤剂的10X溶液，以使最终洗涤剂浓度达到0.5％，然后将混合物在37℃下以温和搅拌孵育30分钟。加入内切核酸酶并在25℃-37℃下孵育0.5-4小时。然后收集培养基，并在4℃下以1000x g离心10分钟。将澄清的上清液与40ml稳定缓冲液混合，并在-80℃下保存。这将产生种子储备物或第一代的愈合子(P1)。
[1010] 根据储备物的效价，将其在SFM中稀释不少于100倍，并添加到在所需大小的多层烧瓶中生长的细胞中。感染复数(MOI)和孵育时间已在较小的规模上进行了优化，以确保最大的愈合子生产。收获后，可根据需要纯化和浓缩愈合子。图12中提供了显示工作流程的示意图，例如，本实例中所述。
[1011] 实例16：复制缺陷型愈合子的制造方法
[1012] 此实例描述了一种用于回收和扩大复制缺陷型愈合子的产生的方法。
[1013] 通过缺失复制中涉及的一个或多个ORF(例如，ORF1、ORF1/1、ORF1/2、ORF2、ORF2/2、ORF2/3和/或ORF2t/3)，可以使愈合子成为复制缺陷型。复制缺陷型愈合子可以在互补细胞系中生长。这种细胞系组成型表达促进愈合子生长但在愈合子的基因组中丢失或无功能的组分。
[1014] 在一个实例中，将参与愈合子繁殖的任何一个或多个ORF的一个或多个序列克隆到适合于产生编码选择标记的稳定细胞系的慢病毒表达系统中，并如本文所述产生慢病毒载体。使能够支持愈合子繁殖的哺乳动物细胞系感染该慢病毒载体，并经受选择标记(例如嘌呤霉素或任何其他抗生素)的选择压力，以选择已稳定整合了克隆的ORF的细胞群。一旦对这种细胞系进行了表征并证明可以互补工程化的愈合子中的缺陷，从而支持此类愈合子的生长和繁殖，就可以将其扩增并储存在低温储存库中。在这些细胞的扩增和维持过程中，将选择抗生素添加到培养基中以维持选择压力。一旦将愈合子引入这些细胞中，就可以抑制选择抗生素。
[1015] 一旦建立了该细胞系，就进行复制缺陷型愈合子的生长和产生，例如，实例15中所述。
[1016] 实例17：使用悬浮细胞产生愈合子
[1017] 该实例描述了悬浮细胞中产生愈合子。
[1018] 在该实例中，使适于在悬浮条件下生长的A549或293T生产细胞系在无动物组分和无抗生素的悬浮培养基(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))中于WAVE生物反应器袋中于37度和5％二氧化碳下生长。使用lipofectamine 2000(赛默飞世尔科技公
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司(Thermo Fisher Scientific))在目前的良好生产规范(cGMP)下，将以1x 10个活细胞/mL接种的这些细胞用含有愈合子序列的质粒以及适合或需要包装愈合子的任何互补质粒
(例如在复制缺陷型愈合子的情况下，例如，如实例16中所述)进行转染。在一些情况下，互补质粒可以编码已经从愈合子基因组(例如，基于例如文中所述例如指环病毒基因组的病毒基因组的愈合子基因组)中缺失但是用于或需要用于复制和包装愈合子的病毒蛋白。转染的细胞在WAVE生物反应器袋中生长，并在以下时间点收获上清液：转染后48小时、72小时和96小时。使用离心将上清液与每个样品的细胞沉淀分离。然后，使用离子交换色谱法从收获的上清液和裂解的细胞沉淀中纯化包装的愈合子颗粒。
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司(Thermo Fisher Scientific))在目前的良好生产规范(cGMP)下，将以1x 10个活细胞/mL接种的这些细胞用含有愈合子序列的质粒以及适合或需要包装愈合子的任何互补质粒
(例如在复制缺陷型愈合子的情况下，例如，如实例16中所述)进行转染。在一些情况下，互补质粒可以编码已经从愈合子基因组(例如，基于例如文中所述例如指环病毒基因组的病毒基因组的愈合子基因组)中缺失但是用于或需要用于复制和包装愈合子的病毒蛋白。转染的细胞在WAVE生物反应器袋中生长，并在以下时间点收获上清液：转染后48小时、72小时和96小时。使用离心将上清液与每个样品的细胞沉淀分离。然后，使用离子交换色谱法从收获的上清液和裂解的细胞沉淀中纯化包装的愈合子颗粒。
[1019] 可以例如通过使用纯化的制备物的少量等分试样以使用病毒基因组提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen))来收获愈合子基因组，然后使用靶向愈合子DNA序列的引物和探针进行qPCR，例如实例18中所述，来测定愈合子的纯化制备物中的基因组当量。
[1020] 可通过对纯化的制备物进行连续稀释以感染新的A549细胞来定量纯化的制备物中的愈合子的感染性。转染后72小时，收获这些细胞，然后使用对愈合子DNA序列具有特异性的引物和探针对基因组DNA进行qPCR测定。
[1021] 实例18：通过qPCR对愈合子基因组当量进行定量
[1022] 该实例说明了用以定量愈合子的基于水解探针的定量PCR测定的开发。使用Geneious软件，基于选择的TTV(登记号AJ620231.1)和TTMV(登记号JX134045.1)的基因组序列设计引物和探针组，并进行最终用户优化。引物序列显示在下表23中。
[1023] 表23：正向和反向引物和水解探针的序列，用于通过定量PCR定量TTMV和TTV基因组当量。
[1024]
[1025]
[1026] TTV 正向引物 5'-AGCAACAGGTAATGGAGGAC-3’ 700
反向引物 5'-TGGAAGCTGGGGTCTTTAAC-3’ 701
探针 5'-TCTACCTTAGGTGCAAAGGGCC-3’ 702
反向引物 5'-TGGAAGCTGGGGTCTTTAAC-3’ 701
探针 5'-TCTACCTTAGGTGCAAAGGGCC-3’ 702
[1027] 作为开发方法的第一步，使用TTV和TTMV引物以及SYBR绿色化学进行qPCR，以检查引物特异性。图13显示了每个引物对的一个不同的扩增峰。
[1028] 订购的水解探针在5'末端标记有荧光团6FAM，在3'末端标记有小沟结合非荧光猝灭剂(MGBNFQ)。然后使用两种不同的商业预混物，使用纯化的质粒DNA作为标准曲线的组成并增加引物的浓度来评估新引物和探针的PCR效率。通过使用纯化的质粒建立标准曲线，所述纯化的质粒包含用于不同引物-探针组的靶序列。进行了七次十倍系列稀释，以实现7个对数内的线性范围和每20ul反应15个拷贝的定量下限。2号预混物能够产生90％-110％的PCR效率，这是定量PCR可接受的值(图14)。qPCR的所有引物均购自IDT。与荧光团6FAM和小沟结合非荧光猝灭剂(MGBNFQ)缀合的水解探针以及所有qPCR预混物均购自赛默飞世尔(Thermo Fisher)。示例性扩增图如图15所示。
[1029] 使用这些引物-探针组和试剂，对基因组当量(GEq)/ml愈合子储备物进行定量。线性范围为每20ul反应1.5E+07-15GEq，然后用于计算GEq/ml，如图16A-16B所示。浓度高于线性范围的样品可以根据需要进行稀释。
[1030] 实例19：利用愈合子在小鼠中表达外源蛋白
[1031] 此实例描述了愈合子的用法，其中将细小环病毒(TTMV)基因组工程化以在小鼠中表达萤火虫荧光素酶蛋白。
[1032] 将编码工程化TTMV的DNA序列的质粒通过化学转染引入A549细胞(人肺癌细胞系)中，所述工程化TTMV编码萤火虫荧光素酶基因。将18ug质粒DNA用于转染10cm组织培养板中
70％汇合的细胞。将缺少TTMV序列的空载体主链用作阴性对照。转染后5小时，将细胞用PBS洗涤两次，并使其在37℃和5％二氧化碳下于新鲜生长培养基中生长。
70％汇合的细胞。将缺少TTMV序列的空载体主链用作阴性对照。转染后5小时，将细胞用PBS洗涤两次，并使其在37℃和5％二氧化碳下于新鲜生长培养基中生长。
[1033] 转染后96小时，收获转染的A549细胞及其上清液。将收获的物质在37℃下用0.5％脱氧胆酸盐(体积重量)处理1小时，然后进行内切核酸酶处理。使用离子交换色谱从该裂解物中纯化愈合子颗粒。为了测定愈合子浓度，将愈合子储备物的样品运行通过病毒DNA纯化试剂盒，并使用靶向愈合子DNA序列的引物和探针通过qPCR测定每ml的基因组当量。
[1034] 通过多种注射途径(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内)在8-10周龄的小鼠中进行1x磷酸盐缓冲液中的愈合子的基因组当量的剂量范围。在注射后3、7、10和15天，对每只动物进行腹侧和背侧生物发光成像。根据制造商的规程，在指定的时间点通过向每只动物腹膜内添加荧光素酶底物(Perkin-Elmer)，然后进行活体成像来进行成像。
[1035] 实例20：基因组比对，以测定愈合子DNA是否整合到宿主基因组中
[1036] 此实例描述了通过检查细环病毒(TTV)是否已整合到人基因组中来测定愈合子DNA是否可以整合到宿主基因组中而进行的计算分析。
[1037] 使用基本局部比对检索工具(BLAST)将来自进化分枝1-5中每一个的代表性TTV序列的全基因组与人基因组序列进行比对，所述工具会发现序列之间的局部相似性区域。分析了表24中所示的代表性TTV序列：
[1038] 表24：代表性TTV序列
[1039] TTV进化分枝 NCBI登记号进化分枝1 AB064597.1
进化分枝2 AB028669.1
进化分枝3 AJ20231.1
进化分枝4 AF122914.3
进化分枝5 AF298585.1
进化分枝2 AB028669.1
进化分枝3 AJ20231.1
进化分枝4 AF122914.3
进化分枝5 AF298585.1
[1040] 没有发现来自对齐的TTV的序列与人基因组具有任何显著相似性，这表明TTV尚未整合到人基因组中。
[1041] 实例21：愈合子整合到宿主基因组中的评估
[1042] 在此实例中，将A549细胞(人肺癌细胞系)和HEK293T细胞(人胚胎肾细胞系)以5、10、30或50的MOI感染愈合子颗粒或AAV颗粒。感染后5小时，将细胞用PBS洗涤，更换为新鲜的生长培养基。然后使细胞在37度和5％二氧化碳下生长。感染后五天，收获细胞，并使用基因组DNA提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen))将其处理以收获基因组DNA。还从未感染的细胞中收获基因组DNA(阴性对照)。根据制造商规程，使用Nextera DNA文库制备试剂盒
(Illumina)为这些收获的DNA制备全基因组测序文库。根据制造商规程，使用NextSeq 550系统(Illumina)对DNA文库进行测序。将测序数据装配到参考基因组中，并进行分析以寻找愈合子或AAV基因组与宿主基因组之间的连接。在检测到连接的情况下，将在原始基因组DNA样品中对其进行验证，然后再通过PCR进行测序文库制备。设计引物来扩增包含连接和连接周围的区域。通过qPCR定量样品中的连接数(代表整合事件)和愈合子拷贝总数，来测定愈合子整合到宿主基因组中的频率。可以将该比率与AAV的比率进行比较。
(Illumina)为这些收获的DNA制备全基因组测序文库。根据制造商规程，使用NextSeq 550系统(Illumina)对DNA文库进行测序。将测序数据装配到参考基因组中，并进行分析以寻找愈合子或AAV基因组与宿主基因组之间的连接。在检测到连接的情况下，将在原始基因组DNA样品中对其进行验证，然后再通过PCR进行测序文库制备。设计引物来扩增包含连接和连接周围的区域。通过qPCR定量样品中的连接数(代表整合事件)和愈合子拷贝总数，来测定愈合子整合到宿主基因组中的频率。可以将该比率与AAV的比率进行比较。
[1043] 实例22：表达外源性微小RNA序列的愈合子的功能作用
[1044] 此实例成功说明了表达外源性微小RNA(miRNA)序列的愈合子的功能。
[1045] 生成的愈合子DNA序列在3'非编码区(NCR)中包含以下外源性微小RNA序列中的一个：
[1046] 1)miR-124
[1047] 2)miR-518
[1048] 3)miR-625
[1049] 4)非靶向加扰miRNA(miR-scr)
[1050] 这是通过将TTV-tth8的tth8-T1 miRNA的pre-miRNA序列替换为上述miRNA的pre-miRNA序列来完成的。然后将愈合子DNA分别转染到HEK293T细胞中。转染后96小时，收获转染的293T细胞以及上清液。将收获的物质在37℃下用0.5％脱氧胆酸盐(体积重量)处理，然后进行内切核酸酶处理。将含有包装的愈合子(P0愈合子原液)的该裂解物用于感染新的
293T细胞。感染后96小时收获这些细胞。然后在37℃下用0.5％脱氧胆酸盐(体积重量)处理收获的细胞，然后进行内切核酸酶处理。然后将该裂解物在PBS中的10K截止分子量透析盒中于4℃透析过夜，以去除所有脱氧胆酸盐。使用qPCR定量这些透析的裂解物(P1愈合子储备物)中的愈合子效价。然后将P1愈合子储备物与几种KRAS突变型非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系(SW900，NCI-H460和A549)在每个细胞效价为274个基因组当量下孵育3天。用Alamar蓝测定法测量细胞活力。如图17A中所示，与感染表达非靶向加扰miRNA的对照愈合子的细胞和未感染的细胞相比，表达外源性miR-625的愈合子在所有三种NSCLC细胞系中均显著抑制癌细胞系活力。
293T细胞。感染后96小时收获这些细胞。然后在37℃下用0.5％脱氧胆酸盐(体积重量)处理收获的细胞，然后进行内切核酸酶处理。然后将该裂解物在PBS中的10K截止分子量透析盒中于4℃透析过夜，以去除所有脱氧胆酸盐。使用qPCR定量这些透析的裂解物(P1愈合子储备物)中的愈合子效价。然后将P1愈合子储备物与几种KRAS突变型非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系(SW900，NCI-H460和A549)在每个细胞效价为274个基因组当量下孵育3天。用Alamar蓝测定法测量细胞活力。如图17A中所示，与感染表达非靶向加扰miRNA的对照愈合子的细胞和未感染的细胞相比，表达外源性miR-625的愈合子在所有三种NSCLC细胞系中均显著抑制癌细胞系活力。
[1051] 另外，使用YFP-报告基因测定法来测定愈合子miRNA通过与其靶标位点的位点特异性结合而对靶标的下调。产生针对miR-625具有特异性结合序列的YFP报告基因，并将其转染到HEK293T细胞中。转染后24小时，将这些HEK293T细胞用表达miR-625或非特异性
miRNA(miR-124)的愈合子在每个细胞效价为2.4个基因组当量下感染，然后使用流式细胞术测量YFP荧光。如图17B所示，表达miR-625的愈合子显著下调了YFP表达，而表达非特异性miRNA miR-124的愈合子不影响YFP表达。这些结果表明，具有miR-625的愈合子诱导了YFP蛋白靶标的中靶下调。
miRNA(miR-124)的愈合子在每个细胞效价为2.4个基因组当量下感染，然后使用流式细胞术测量YFP荧光。如图17B所示，表达miR-625的愈合子显著下调了YFP表达，而表达非特异性miRNA miR-124的愈合子不影响YFP表达。这些结果表明，具有miR-625的愈合子诱导了YFP蛋白靶标的中靶下调。
[1052] 还测试了表达外源性miRNA的愈合子调节宿主基因表达的能力。将SW-900NSCLC细胞用表达miR-518或miR-625或miR-scr的愈合子在每个细胞剂量为10个基因组当量下感染。感染后72小时，收获感染的细胞，并制备总蛋白裂解物。对这些蛋白裂解物进行了免疫印迹分析，以测定p65蛋白的水平。对于每个样品，将p65蛋白信号的强度归一化为膜上蛋白的总量(图17C)。观察到p65水平的降低，这表明愈合子可以调节宿主基因的表达。
[1053] 实例23：表达外源性非编码RNA的愈合子的制备和产生
[1054] 该实例描述了表达外源性小非编码RNA的愈合子的合成和产生。
[1055] 合成了来自TTV的tth8菌株的DNA序列(Jelcic等人,Journal of Virology[病毒学杂志],2004)，并将其克隆到含有细菌复制起点和细菌抗生素抗性基因的载体中。在该载体中，编码TTV miRNA发夹的DNA序列被替换为编码外源性小非编码RNA(例如miRNA或
shRNA)的DNA序列。然后，将工程化的构建体转化到电感受态细菌中，然后根据制造商的规程使用质粒纯化试剂盒进行质粒分离。
shRNA)的DNA序列。然后，将工程化的构建体转化到电感受态细菌中，然后根据制造商的规程使用质粒纯化试剂盒进行质粒分离。
[1056] 将编码外源性小非编码RNA的愈合子DNA转染到真核生产细胞系中，以生产愈合子颗粒。在转染后的不同时间点，收获含有愈合子颗粒的转染细胞的上清液。将来自过滤的上清液或纯化后的愈合子颗粒用于下游应用，例如本文所述。
[1057] 实例24：指环病毒进化分枝中的保守性
[1058] 本实例描述了甲型细环病毒属中五个进化分枝的鉴定。每个进化分枝内的平均成对同一性通常在66％与90％之间(图18)。这些进化分枝之间的代表性序列在整个序列中显示57.2％成对同一性(图19)。在开放阅读框中，成对同一性最低(约51.4％)，在非编码区则较高(在5'NCR中为69.5％，在3'NCR中为72.6％)(图19)。这表明非编码区的DNA序列或结构在病毒复制中起重要作用。
[1059] 还比较了甲型细环病毒中推定蛋白质的氨基酸序列。DNA序列显示约49％至54％成对同一性，而氨基酸序列显示约29％至36％成对同一性(图20)。有趣的是，来自甲型细环病毒进化分枝的代表性序列能够在体内成功复制并在人群中观察到。这表明指环病毒蛋白的氨基酸序列可以广泛变化，同时保留诸如复制和包装的功能。
[1060] 发现指环病毒在非编码区中具有局部高度保守的区域。在启动子下游的区域是71-bp 5’UTR保守结构域，其在五个甲型细环病毒进化分枝中具有96.6％成对同一性(图
21)。在甲型细环病毒的3'非编码区的开放阅读框的下游，有307bp区域，其中代表性序列之间具有85.2％成对同一性(图19)。在这个3'保守非编码区的3'末端附近是成对同一性为
96.5％的高度保守的51bp序列。在此分析中研究的每一种指环病毒还包括GC富集区，其GC含量大于70％(图22)。
21)。在甲型细环病毒的3'非编码区的开放阅读框的下游，有307bp区域，其中代表性序列之间具有85.2％成对同一性(图19)。在这个3'保守非编码区的3'末端附近是成对同一性为
96.5％的高度保守的51bp序列。在此分析中研究的每一种指环病毒还包括GC富集区，其GC含量大于70％(图22)。
[1061] 实例25：从愈合子表达内源性miRNA和内源性miRNA的缺失
[1062] 在一个实例中，将基于TTV-tth8株系的愈合子用于感染培养物中的Raji B细胞。这些愈合子包含编码TTV-tth8指环病毒的内源性有效负载的序列，其是靶向编码n-myc相互作用蛋白(NMI)的mRNA的miRNA。NMI在JAK/STAT途径的下游运行，以调节各种细胞内信号的转录，包括干扰素刺激的基因、增殖和生长基因以及炎症反应的介质。如图23A所示，愈合子能够成功感染Raji B细胞。与用缺乏针对NMI的miRNA的愈合子感染的对照细胞相比，用包含针对NMI的miRNA的愈合子感染细胞成功地敲低了NMI(图23B)。与对照细胞相比，用含有针对NMI的miRNA的愈合子感染的细胞显示NMI蛋白水平降低超过75％。该实例说明具有天然指环病毒miRNA的愈合子可以敲低宿主细胞中的靶分子。
[1063] 在另一个实例中，缺失了基于指环病毒的愈合子的内源性miRNA。然后将所得的愈合子(ΔmiR)感染宿主细胞。将感染率与保留了内源性miRNA的相应愈合子的感染率进行了比较。如图24所示，缺失了内源性miRNA的愈合子仍然能够以与仍然存在内源性miRNA的愈合子所观察到的水平相当的水平感染细胞。该实例说明了基于指环病毒的愈合子的内源性miRNA可以突变或完全缺失，并且仍然产生传染性颗粒。
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