半年生马尾松苗嫩梢表皮划伤法人工接种松材线虫的方法及
其应用
技术领域
[0001] 本
发明涉及马尾松苗人工接种松材线虫技术，特别涉及一种
半年生马尾松苗嫩梢表皮划伤法人工接种松材线虫的方法及其应用。
背景技术
[0002] 马尾松是中国重要的用材林树种，用途广泛，广泛种植在中国17个省区。其中有多个省份发生松材线虫病，给林业生产带来较大的经济损失。栽种马尾松抗病品系是防治该病的根本措施。由于中国发生松材线虫面积较大，各地生态条件差别较大，根据适地适树原则和基因对基因假说(Flor,1971)，各地应该栽种适合当地的抗松材线虫病松树苗木。尽早完成生产用苗对松材线虫病的抗性评价，将节约生产成本。马尾松抗松材线虫病评价的关键技术之一是接种技术。目前“截枝
套管法”接种松材线虫技术，适合评价一年以上长出木质化侧枝的马尾松苗对松材线虫病的抗性(王玉嬿等，1985)。“皮接法”适合苗木地径大于5mm的苗木，且操作复杂，对苗木伤害较大(陈玉惠等，2006；吴小芹等，2008；贲爱玲等，
2012)。而一般一年生以上的马尾松苗才具有木质化侧枝和5mm地径。对于半年生马尾松苗松材线虫接种技术，仅见一例报道，该报道中因研究基因表达变化，只接种180min，苗木没有发病(徐亮等，2014)，因此该接种方法能否致病，还需要验证。因此到到目前，未见生产上急需的成功的半年生的马尾松苗接种松材线虫的方法报道。因此，建立一种能够成功在半年生马尾松苗木上接种松材线虫的方法，具有广阔的应用前景和重要的生产意义。
发明内容
[0003] 本发明的首要目的在于克服
现有技术的缺点与不足，提供一种半年生马尾松苗嫩梢表皮划伤法人工接种松材线虫的方法。
[0004] 本发明的另一目的在于提供所述的半年生马尾松苗嫩梢表皮划伤法人工接种松材线虫的方法的应用。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种半年生马尾松苗嫩梢表皮划伤法人工接种松材线虫的方法，包括如下步骤：
[0006] (1)将活的松材线虫配置成松材线虫悬浮液；
[0007] (2)选取半年生马尾松苗梢头下3～5cm处的嫩梢部位，拔去针叶，然后在拔去针叶的马尾松嫩梢表皮处纵划两条或以上的伤口；
[0008] (3)用
封口膜在拔去针叶的部位围成不漏
水的小漏斗；其中小漏斗的下方紧贴马尾松嫩梢处且与伤口(切口)下方齐平；
[0009] (4)将步骤(1)中配置的松材线虫悬浮液注入到步骤(3)中围成的小漏斗中，以接种松材线虫；
[0010] (5)将步骤(4)中接种松材线虫后的半年生马尾松苗放置于室外环境条件下进行培育，每隔半天在小漏斗中补加水。
[0011] 步骤(1)中所述的松材线虫为采用常规方法培养得到的松材线虫。
[0012] 步骤(1)中所述的松材线虫悬浮液的浓度为500～5000条/200微升；优选为3000～5000条/200微升；更优选为3000条/200微升。
[0013] 步骤(2)中所述的半年生马尾松苗为采用常规方法培育的健康的半年生马尾松苗。
[0014] 步骤(2)中所述的伤口的长度优选为1.5±0.2cm，伤口的深度为0.5～1mm。
[0015] 步骤(2)中所述的纵划的伤口优选为2～3条；更优选为2条。
[0016] 步骤(2)中所述的拔去针叶为通过如下步骤实现：选取马尾松苗梢头下3～5cm处的嫩梢部位，往下拔去1.5～2cm嫩梢部位的针叶。
[0017] 步骤(3)中所述的封口膜为常规市售封口膜，用封口膜围成的小漏斗保证松材线虫液能够与马尾松苗的松梢接种部位有良好的
接触。
[0018] 步骤(3)中所述的小漏斗的大小可以根据实际需要调整，小漏斗的上口直径优选为1.5cm左右。
[0019] 步骤(4)中所述的注入的松材线虫悬浮液的体积优选为200微升。
[0020] 步骤(4)中所述的松材线虫悬浮液中的松材线虫的条数为500～5000条；优选为3000～5000条；更优选为3000条。
[0021] 所述的半年生马尾松苗嫩梢表皮划伤法人工接种松材线虫的方法，在步骤(4)之后还包括如下步骤：将无菌水滴入保鲜袋中，然后套在马尾松苗上，盖过接种部位，以保持湿润环境。
[0022] 步骤(4)中所述的室外环境的
温度优选为20～40℃。
[0023] 步骤(5)中所述的水为双蒸水或无菌水。
[0024] 步骤(5)中所述的补加水的次数优选为3～4次；每次补加的水约为所述松材线虫悬浮液体积的2倍。
[0025] 步骤(5)中所述的培育的时间为7～21天；可按马尾松常规水肥管理方法进行，适量浇水。
[0026] 所述的半年生马尾松苗嫩梢表皮划伤法人工接种松材线虫的方法，在步骤(5)之后还包括如下步骤：每天观察发病症状，统计发病率，并用贝曼漏斗法分离松材线虫，记录发病马尾松体内的松材线虫数量。
[0027] 所述的半年生马尾松苗嫩梢表皮划伤法人工接种松材线虫的方法在半年生马尾松苗接种松材线虫，筛选抗性松树苗木，或马尾松苗抗性评价中的应用。
[0028] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0029] (1)本发明的方法属于
植物病原线虫接种寄主植物技术领域，是针对半年生马尾苗缺乏木质化侧枝和地径小于5mm特点，攻克已经发表的接种方法无法运用的难题，设计并筛选出适合半年生马尾松松材线虫接种的方法，从而成功建立了半年生马尾松嫩梢划伤法人工接种松材线虫方法。
[0030] (2)本发明中为了提高接种效率，将活的松材线虫悬浮液浓度配置为3000～5000条/200微升，用移液枪一次注射一次即可满足接种要求；半年生马尾松苗地径细嫩，接种地茎部位不易操作，为了便于接种，将接种部位选在松苗嫩梢头下约3cm～5cm处的部位，克服了半年生马尾松无接种松材线虫用侧枝的难题；将每棵接种松材线虫数量定为3000条，有效节约松材线虫的培养成本。
[0031] (3)一年生以下的马尾松苗木，因缺乏侧枝，无法用“截枝套管法”接种。而半年生马尾苗嫩梢细嫩，已经发表的人工皮接法中的“T”型伤口，“皮接法”创伤面大，伤口不易愈合；本发明改成表皮划伤“1”型伤口，创伤面小，易于愈合，利于马尾松苗后期生长。
[0032] (4)为了提高接种效率，本发明设“拔去针叶划伤表皮”、“拔去针叶非划伤表皮”、和“不拔去针叶无伤”三个接种伤口制作处理。实验结果表明，“拔去针叶划伤表皮”，接种效果最好，因此本发明选用“拔去针叶划伤表皮”做接种伤口制作方法。
[0033] (5)本发明还采用省工的保湿方法，直接用封口膜在接种部位的部位围成一小漏斗，保证不会漏水，注意漏斗下方紧贴接种部位处与切口下方大约齐平，保证松材线虫液能够与松苗接种部位有良好的接触。
[0034] (6)本发明通过技术创新，实现了大量接种半年生马尾松苗木松材线虫的技术突破，适用于人工接种松材线虫于半年生的马尾松苗木，适用于生产用马尾松苗的抗性评价。本发明的方法将降低生产成本，具有广阔的应用前景和重要的生产意义。
附图说明
[0035] 图1是嫩梢表皮划伤接种法接种半年生马尾松苗接种松材线虫病发病症状照片图；其中，图a为嫩梢表皮划伤接种法接种松材线虫10d后的症状(图中，A：实验组，ck：对照组)；图b嫩梢表皮划伤接种法接种松材线虫18d症状(图中B：实验组，ck：对照组)。
[0036] 图2是不同数量松材线虫接种半年生马尾松发病结果统计图。
[0037] 图3是高感桐
棉马尾松松材线虫病症状发展过程图；其中，图A：接种松材线虫8d症状(发病1d后)；图B：接种松材线虫10d症状(发病3d后)；图C：接种松材线虫12d症状(发病5d后)。
具体实施方式
[0038] 下面结合
实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的
试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均可通过市售获得。
[0039] 本发明中涉及的松材线虫可以从马尾松中分离得到，或通过松材线虫卵培养获得，实施例涉及的松材线虫来源于华南农业大学农学院植物线虫研究室保存种群，参考文献(朱孝伟.松墨天
牛携带的松材线虫分子检测技术[D].华南农业大学，2007.)对松材线虫进行培养与扩繁。采用贝尔曼漏斗法分离线虫(冯士明.简介松材线虫的分离方法[j].
云南林业，2005(2):29-29)。根据参考文献(张玉焕.马尾松苗抗松材线虫病评价及失活线虫分离新技术研究[D].华南农业大学,2016.)得出12h后分离出的松材线虫活性比24h高，故12h后，打开止水夹，取下离心管或小试管，静止半小时，在体视
显微镜观察、计数，配成相应浓度的松材线虫混合虫态悬浮液用于接种。
[0040] 本发明实施例中涉及的半年生马尾松苗为采用本领域常规方法(常规水肥管理)培育半年的马尾松苗；实施例中的马尾松均为桐棉马尾松。
[0041] 实施例1嫩梢表皮划伤接种法对半年生马尾松接种松材线虫
[0042] (1)采用常规方法，大量培养活的松材线虫；
[0043] (2)配制活的松材线虫的悬浮液，浓度为3000条/200微升；
[0044] (3)选取16株长势较好的半年生马尾松苗，其中10株接种3000条松材线虫，6株作为空白对照接种双蒸水，试验期间，同时做好水肥管理工作；选取健康松苗梢头下约3～5cm处的嫩梢部位，往下拔去针叶1.5～2cm；
[0045] (4)用锋利的解剖刀在拔去针叶的松嫩稍表皮部处，纵划两条约1.5cm长的伤口，深度0.5～1mm；
[0046] (5)用封口膜在拔去针叶的部位围成一小漏斗，漏斗上口直径约1.5cm，保证不会漏水，注意漏斗下方紧贴松梢处与切口下方大约齐平，保证松材线虫液能够与松梢接种部位有良好的接触；
[0047] (6)用移液器注入线虫悬浮液；
[0048] (7)按照上述方法，接种松材线虫液到10株马尾松苗作为实验组；6株用作对照的马尾松苗按照上述方法接种无菌水；
[0049] (8)用洗瓶将无菌水滴入保鲜袋中，然后将16株马尾松苗套袋，盖过接种部位保湿，保持湿润环境；
[0050] (9)接种后，每隔半天观察漏斗内的松材线虫
混合液，用移液器加入400μl双蒸水，保湿两天；
[0051] (10)将接种松材线虫后的马尾松苗放置于室外环境条件下(温度20～40℃)，用树木签和铅笔对其进行编号，标明接种方法、接种日期、树苗编号等，并定时适量浇水；
[0052] (11)每天观察发病症状，统计发病株率，用常规贝曼漏斗方法分离松材线虫，计数发病松树体内的松材线虫数量。
[0053] (12)结果：嫩梢表皮划伤接种法对半年生马尾松接种3000条松材线虫，嫩梢表皮划伤接种法接种松材线虫可以使马尾松植株发病，接种21d发病率为80％(10株马尾松接种松材线虫后，21天后，8株发病)。接种10d开始表现症状，接种处周围针叶下垂、内部针叶发黄，(如图1a)，18d(天)后观察，100％整株死亡(如图1b)，对照无发病症状。植株枯死后，随机取3棵马尾松用贝曼漏斗法分离，每株马尾松都能分离到松材线虫，其体内松材线虫平均含量为271条/g，表明接种成功。因此，嫩梢表皮划伤接种法可用于马尾松苗期接种。
[0054] 实施例2不同浓度的松材线虫接种半年生马尾松
[0055] 按照实施例1的方法，接种不同浓度的松材线虫，与实施例1的区别在于：接种的松材线虫为200、500、1000、2000、3000、4000、5000条，共7个处理。每个处理10个重复，设6株接种无菌水的马尾松苗为对照。接种后观察发病症状，接种7、10、13、16、18、21天后统计发病株总数。
[0056] 结果如图2所示，研究结果显示，接种7d后，接种2000条、3000条、4000条、5000条松材线虫的马尾松苗开始发病；接种半年生马尾松13d后，接种500条、1000条松材线虫的植株开始发病；接种200条松材线虫植株一直未发病。随着接种天数增加，发病株数越来越多，接种16d后，接种5000条松材线虫的马尾松有9棵发病，1棵健康，后期观察发病株数无增长。接种21d后，接种4000条松材线虫植株有9棵发病，1棵健康，达到最大值。此时，接种3000条松材线虫植株有8棵发病，2棵健康。通过SPSS分析，接种3000条松材线虫发病株树与接种4000条、5000条松材线虫发病株树之间并无显著差异。因此，3000条松材线虫可作为苗期最适接种数量。便于节约松材线虫的培养成本，提高工作效率。
[0057] 实施例3高感马尾松松材线虫病症状发展过程观察
[0058] 半年生马尾松一旦发病，可能由于自身抵抗
力较小，后期就会死亡，因此可根据发病时间和死亡时间将其定为高抗马尾松植株(不发病)、抗性马尾松植株(发病慢)和高感马尾松植株(发病快)；具体为：高抗马尾松不发病；抗性植株一般接种10天以上，甚至更长时间开始发病，出现症状6～10天后甚至更久才会死亡；高感植株一般接种8～10天开始发病，大多出现症状3～5天后死亡。
[0059] 按照实施例1的方法，采用嫩梢表皮划伤接种法对67株半年生马尾松苗，67株半年生马尾松苗包括不同抗性的马尾松苗；接种后，每天进行观察记录。接种3000条松材线虫，其中，高感马尾松植株发病快，出现症状后3～5d整株出现青枯、死亡现象：刚开始接种时，无症状；接种8天后，马尾松接种处内部针叶1/4以下褪绿(如图3A)；然后松苗3/4左右针叶失水、褪绿、卷曲(如图3B)；最后松苗整株针叶死亡、青枯(如图3C)。
[0060] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
