Method for collecting highly productive strain by plant tissue culture and method for producing secondary metabolite using the same
专利汇可以提供Method for collecting highly productive strain by plant tissue culture and method for producing secondary metabolite using the same专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且PURPOSE:To collect a highly productive strain useful for medicines, etc., by plant tissue culture rapidly, simply and efficiently by making shoots into calluses, dividing, culturing a strain under a condition of producing secondary metabolites and selecting a strain having a high content of the secondary metabolites. CONSTITUTION:Shoots such as one derived from a plant of the genus Digitalis are made into calluses once, returned to shoots again and the shoots are divided. Each strain is cultured under a condition of producing secondary metabolites such as digitoxin, digoxin, lanotoside C, purpurea glycoside A, digitoxigenin, digoxigenin or deacetyl lanatoside C and a strain having high content of the secondary metabolite is selected from the culture mixture to collect a highly productive strain by plant tissue culture.，下面是Method for collecting highly productive strain by plant tissue culture and method for producing secondary metabolite using the same专利的具体信息内容。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、有用な二次代謝産物を含有する植物から、植物組織培養法を用いて、高生産株を取得する方法に関するものであり、植物に含まれる医薬品、色素、甘味剤を製造する分野に利用される。
【０００２】
【従来の技術】植物を培養又は栽培することによって各種医薬、色素、甘味剤等が生産されている。 かかる場合、生産性を向上させるためには、植物が必要とする栄養源や温度、光等の環境因子を制御する技術が重要なことはいうまでもないが、更に生産性の高い株を取得する技術も同様に重要である。
【０００３】植物培養細胞の場合は、カルスを幾つかの小集塊に分けてそれぞれの生産能を比較して、それらの中から高生産株を選抜する方法が広く用いられている。
しかし、植物の生産する二次代謝産物は、葉や根、花等の分化した器官では生産されるが、カルスのような脱分化細胞（又は未分化細胞ともいう）では生産されないことが多い。 かかる場合、カルスから優良株を選抜する際に用いられる小集塊選抜法は適用できない。
【０００４】一方、分化した器官、例えば同じ一株から生じた多くの葉はそれぞれ遺伝的に均一であり、有用な二次代謝産物の含量の差が小さいので、選抜は困難である。 また近年、遺伝子操作技術を利用して、高生産株の取得が試みられているが、そのような高生産に関わる遺伝子を取得して、植物細胞内に導入するまでに熟練した技術及び多くの労力が必要である。
【０００５】更に伝統的な圃場栽培による交配によって、生産性の高い品種をつくることも行われているが、
この方法は長い年月を要する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】植物培養細胞から選抜するときの従来の問題点は、１）小集塊選抜法は、葉や根、花等の分化した器官でしか生産できない場合は適用できない、２）分化した器官は遺伝的に均一なので選抜は困難である、３）遺伝子操作技術による方法は、遺伝子の取得及び植物細胞内への遺伝子の導入に熟練と多くの労力を必要とする、４）圃場栽培における交配法は、
長い年月を要する、ことである。 即ち分化した器官（組織）で高生産株を選抜するには、遺伝的に不均一な状態を作り出す技術、及び迅速で簡便な選抜方法を創出する技術が望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の課題を解決すべく、研究を重ねた結果、組織培養で得た苗条（シュート）を、一旦カルスが生成する条件で培養を行い、引き続きそれぞれのカルスから黄化シュートを形成させた後、それらを株分けし、次にシュートの成長しやすい条件下でそれぞれの未熟な黄化シュートの培養を行い、発達したシュートにまで培養を続けた後、それぞれの株の含量を調べることによって、高生産株が得られること、及びここで得た高生産株を、再度カルスに戻すという方法を繰り返すことによって、含量が飛躍的に向上した株を取得できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】即ち、本発明は、苗条（シュート）を一旦カルス化させた後、再び苗条（シュート）に戻して株分けし、それぞれの株を二次代謝産物を生産させる条件で培養し、それらの中から該二次代謝産物の含量の高い株を選抜することを特徴とする植物組織培養による高生産株の取得方法に関するものであり、器官形成にともなって生産される有用二次代謝産物の高生産株を取得する方法を提供するものである。
【０００９】本発明の取得方法の対象となる植物体としては、有用二次代謝産物を生産するする植物体であれば特に制限はなく、例えば、 Digitalis purpurea , Digita
lislanata等のジギタリス属植物； Strophanthus gratu
s , Strophanthus kombe等のストロファンサス属植物； S
tevia rebaudiana等のステビア属植物； Atropa bellado
nna等のアトロパ属植物；などの植物体が挙げられる。
【００１０】また、前記有用二次代謝産物としては、例えばジギトキシン、ジゴキシン、ラナトシドＣ、プルプレアグリコシドＡ、ジギトキシゲニン、ジゴキシゲニン、デアセチルラナトシドＣが挙げられる。 シュートをカルス化するには、植物ホルモンであるオーキシン、好ましくはインドール酢酸と、サイトカイニン、好ましくはベンジルアデニンを、それぞれ０．０５〜１ｐｐｍ、
０．１〜５ppm の濃度で添加したムラシゲ−スクーグ寒天培地上で、５００ルクス以下、好ましくは暗黒下で、
７〜１４日間培養を行う。 この間に寒天に継代したシュートの基部付近からカルスが誘導形成するのが観察できる。 更に７〜１４日間、引き続き同じ条件で培養を行うと、カルスの各部からシュート原基（苗条原基）が形成された後、黄色の細い茎を持ったいわゆる黄化シュートが形成される。 この段階で、１０〜２０の株に分けて、
サイトカイニン、好ましくはカイネチンを添加したニッチ＆ニッチの寒天培地に継代し、光照射を行いながら、
更に２〜４週間培養を続ける。 カイネチンの濃度は０．
１〜１０μＭの範囲が好ましい。
【００１１】次いで、有用な二次代謝産物を含むシュートを70％アセトニトリル中で超音波処理を行いながら二次代謝産物を抽出し、その抽出液を液体クロマトグラフィーや酵素免疫法によって含量を測定することにより、
二次代謝産物の含量の高い株を選抜することができる。
なお、酵素免疫法では、上記のジギトキシンやジゴキシンなどのカルデノライドと総称する構造のよく似た化合物を同時に定量できる。 そこで、ジギトキシン抗体を用いた場合はジギトキシン相当のカルデノライド量として、またジゴキシン抗体を用いた場合はジゴキシン相当のカルデノライド量として表した。
【００１２】以上のようにして得られる高生産株を用いて、これから二次代謝産物を取得することにより効率よく有用な二次代謝産物を得ることができる。
【００１３】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 実施例１ (1) 無菌苗条の誘導 圃場で二年間栽培したジギタリス・プルプレア（ Digita
lis purpurea ) （国立試験所）の葉を８０％エタノールで洗浄後、１％次亜塩素酸ナトリウムで滅菌して無菌化処理を行い、約１cm×１cmに刻んで、カイネチン１０μ
Ｍを含むニッチ＆ニッチの寒天培地に移植し、暗黒下で培養することによって無菌苗条を誘導した。 (2) 緑化シュートの誘導 (1)で得た無菌苗条を、カイネチン１μＭを含むニッチ＆ニッチの寒天培地に移植して、３０００ルクスの光照射下、２５℃で３週間培養を行い、０．５〜１．５cmの葉長をもつ緑化シュートを得た。 (3) 緑化シュートのカルス誘導 (2)で得たシュートをインドール酢酸０．１ｐｐｍ及びベンジルアデニン１ｐｐｍを含むムラシゲ−スクーグの寒天培地に移植し、暗黒下で１週間培養を行った。 寒天培地に植え込んだ基部付近に淡黄色のカルスの形成が観察された。 更に同じ培地上で２週間、暗黒下で培養を行うと、カルスの数カ所から１〜２cmの黄色の茎と未発達の白色葉を持った黄化シュートが形成した。 (4) 高生産株の選抜 (a) (3)で得た黄化シュートを、下胚軸を含むように１
６個の株に分けた。 それらをカイネチン１μＭを含むニッチ＆ニッチの寒天培地に継代して３０００ルクスの光照射下２５℃で３週間培養を行った。 それぞれの株は葉身０．５〜１．５cmの緑化シュートを形成した。 各株から葉を３枚ずつ取り、７０％アセトニトリルを加えて超音波処理を３時間行いカルデノライドを抽出した。 それらの抽出液中のジギトキシン相当のカルデノライドは酵素免疫法を用いて測定した。 表１に１６株の乾燥重量当りのジギトキシン相当のカルデノライド含量を示す。 含量はppm 、即ちジギトキシン相当のカルデノライド−μ
g ／乾燥重量-gで表した。
【００１４】
【表１】
(b) (a)で得た高含量株ＫＳ−１−１４−９株及びＫＳ
−１−１４−３株を (3)と同様の操作によって培養を行い、カルスから黄化したシュートを形成させた。 次に
(a)と同様にしてシュートを少なくとも２葉をもつ42のシュートに分けて、光照射下で３週間培養を行った緑色シュートを用いて、７０％アセトニトリルでカルデノライドを抽出後、含量を測定した。 表２に高含量株（上位から５株）の乾燥重量当りのカルデノライド含量を示す。
【００１５】なお、カルデノライドはジギトキシン抗体及びペルオキシダーゼ標識抗原を用いて酵素免疫法で測定した。 また、表２において、含量はppm 、即ちジギトキシン相当のカルデノライド−μg ／乾燥重量-gで表した。
【００１６】
【表２】
実施例２及び３ 実施例１の(4)(b)と同様の操作を、繰り返し１回行った結果（上位５株）を表３に、繰り返し２回行った結果（上位５株）を表４に示す。 【００１７】なお、カルデノライドはジギトキシン抗体及びペルオキシダーゼ標識抗原を用いて酵素免疫法で測定した。 また、表３及び４において、含量はppm 、即ちジギトキシン相当のカルデノライド−μg ／乾燥重量-g
で表した。
【００１８】
【表３】
【００１９】
【表４】
実施例４ ジギタリス・ラナータを用いて実施例１〜３と同様な操作を行った。 ただし、酵素免疫法ではジゴキシン抗体を用いた。 含量はジゴキシン相当のカルデノライド含量として表した。【００２０】表５に各選抜時に得られた株の最高含量を示した。 ５回の選抜で2500ppm のジゴキシン相当のカルデノライドを含む株が得られることを示している。
【００２１】
【表５】
以上の結果は、本選抜方法を繰り返すことによって含量の高い株が取得できることを示している。【００２２】
【発明の効果】本発明は、植物の特定の器官の発達に伴い生産される二次代謝産物の高生産株を取得する場合、
細胞小集塊選抜法又は遺伝子操作や交配による株の改良法よりも迅速にかつ簡便に高生産株を選抜できる。 出願人 株式会社 ピーシーシーテクノロジー代理人
弁理士 平木 祐輔同 弁理士 石井 貞次同 弁理士 早川 康
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