一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin J及其发酵提取方法
阅读：310发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin J及其发酵提取方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于天然化合物技术领域，具体涉及一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin J及其 发酵 提取方法。本发明从海洋小单孢菌发酵液中分离得到新的Rakicidins组分Rakicidin J，该化合物结构相比于已知的Rakicidin B1，在脂肽 侧链 的长度不同，多两个亚甲基。本发明天然化合物Rakicidin J对人结肠癌细胞HCT-8和人胰腺癌细胞PANC-1具有较好的体外抑制作用，对乏 氧 培养的 肿瘤 细胞HCT-8活性较常氧的强4.93倍，对乏氧培养的肿瘤细胞PANC-1活性较常氧的强6.08倍，对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌、艰难梭菌和万古霉素耐药粪肠球菌等10株厌氧菌均具有一定的抑制活性，是一种结构新颖活性优良的 次级代谢产物 ，具有较高的药用价值。，下面是一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin J及其发酵提取方法专利的具体信息内容。
1.一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin J及其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物Rakicidin J具有如下式(Ⅰ)所示的结构：
2.一种制备权利要求1所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin J的方法，其特征在于，所述Rakicidin J是由保藏编号为CGMCC No.14822的海洋小单孢菌株Micromonospora sp.FIM-R150103经发酵及分离获得。
3.根据权利要求2所述的制备所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin J的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取保存的海洋小单孢菌株Micromonospora sp.FIM-R150103进行发酵，收集发酵液进行固液分离获得菌丝体；将所得菌丝体用甲醇或乙醇浸泡，收集浸泡液；
(2)以D3502大孔树脂吸附柱进行层析，并分别以70％和78％的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，收集78％乙醇-水洗脱液组分；
(3)将收集的洗脱液以HZ816树脂吸附柱进行层析，并分别以72％和76％的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，收集含有Rakicidin J的76％的乙醇-水洗脱液组分；
(4)以乙酸乙酯或二氯甲烷萃取所得洗脱液，浓缩获得粗品后用甲醇溶解，进行半制备液相色谱分离，并以体积比730：270的乙腈-水进行洗脱，分段收集，即得。
4.根据权利要求3所述的制备所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin J的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述D3502大孔树脂吸附柱的径高比为1：5-1：10，装柱体积2.5-
4.0L，吸附流速为30-45ml/min。
5.根据权利要求3或4所述的制备所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin J的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述HZ816树脂吸附柱径高比为1：5-1：8，装柱体积2.2-3L，吸附流速为25-35ml/min。
6.根据权利要求3-5任一项所述的制备所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin J的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述半制备液相色谱为Welch Material，5μm，250mm×
10mm，控制洗脱液流速8ml/min。
7.权利要求1所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin J及其药学上可接受的盐用于制备具有抗肿瘤活性和抗临床致病厌氧菌活性药物的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin J及其药学上可接受的盐的日服用剂量为1-5000mg/天。
9.一种治疗致病厌氧菌感染疾病的药物，其特征在于，以权利要求1所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin J及其药学上可接受的盐为活性成分，并添加药学上可接受的载体。
10.海洋小单孢菌株Micromonospora sp.FIM-R150103用于发酵制备天然Rakicidins类化合物Rakicidin J的用途，其特征在于，所述海洋小单孢菌株Micromonospora sp.FIM-R150103已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.14822。
一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin J及其发酵提取
方法
技术领域
[0001] 本发明属于天然化合物技术领域，具体涉及一种天然Rakicidins类化 合物Rakicidin J及其发酵提取方法。
背景技术
[0003] Rakicidins化合物即是其中一类重要的化合物，目前已报道从小单孢菌和链 霉菌中发现了一系列具有抗肿瘤活性或抑菌活性的Rakicidins化合物。
[0004] 近年来，文献已报道海洋小单孢菌Micromonospora sp.FIM 02-523能够 代谢产生包括Rakicidin A、B、B1等在内的一系列具有抗肿瘤活性的脂肽类 化合物。2006年，本课题组在国内首先报道从该株小单孢菌中分离到化合 物Rakicidin A和B。研究发现，Rakicidin A具有卓越的乏氧选择性抗肿瘤细 胞活性，在乏氧条件下抗结肠癌HCT-8细胞活性是常氧条件下的17.5倍，被 许多同行认为是一个极富开发前景的抗乏氧肿瘤细胞及抗CSC药物；而 Rakicidin B的体外抗肿瘤活性考察也显示，其对肿瘤细胞株K562、L929的 生长有明显抑制作用。2016年本课题组又得到一种新的化合物Rakicidin B1， 实验采用移植人结肠癌HCT-8肿瘤斑马鱼模型测试了Rakicidin A、B、B1的 体内抑瘤活性，结果表明，Rakicidin A、B、B1均对斑马鱼体内的HCT-8细 胞移植瘤均有抑制活性，且初步试验表明，其抗乏氧肿瘤细胞是基于其能 有效抑制HIF-1(乏氧诱导因子-1)的表达。在先研究进一步测定了Rakicidin A、B、B1化合物对HCT-8、MGC803、A549、A375、HepG2和CASKI五种 人肿瘤细胞株的细胞毒活性，结果显示，已分离的三个化合物对这些肿瘤 细胞株均具有显著的抑制活性。2018年，本课题组又从海洋Micromonospora sp.FIM 02-523菌株的代谢物中分离纯化到另外三个新化合物Rakicidin G、 H、I，活性实验结果显示，Rakicidin G、H、I化合物均对人结肠癌细胞HCT-8 和人胰腺癌细胞PANC-1有较强的细胞毒活性，且在乏氧条件下更强，并且 三个化合物对多种革兰氏阳性厌氧菌也有较好的抑制活性。可见，Rakicidins 化合物具有极好的临床应用前景。
发明内容
[0005] 为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种天然Rakicidins类化 合物Rakicidin J，并进一步公开其发酵提取方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所述的一种天然Rakicidins类化合物 Rakicidin J及其药学上可接受的盐，所述化合物Rakicidin J具有如下式(Ⅰ) 所示的结构：
[0007]
[0008] 本发明还公开了一种制备所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin J的方 法，其特征在于，所述Rakicidin J是由保藏编号为CGMCC No.14822的海 洋小单孢菌株Micromonospora sp.FIM-R150103经发酵及分离获得。
[0009] 具体的，本发明所述海洋小单孢菌株Micromonospora sp.FIM-R150103 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.14822，保藏日期 为2017年10月16日。
[0010] 优选的，所述的制备所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin J的方法， 包括如下步骤：
[0011] (1)取保存的海洋小单孢菌株Micromonospora sp.FIM-R150103进行 发酵，收集发酵液进行固液分离获得菌丝体；将所得菌丝体用甲醇或乙醇 浸泡，收集浸泡液；
[0013] (3)将收集的洗脱液以HZ816树脂吸附柱进行层析，并分别以72％ 和76％的乙醇-水溶液进行梯度洗脱，收集含有Rakicidin J的76％的乙醇- 水洗脱液组分；
[0014] (4)以乙酸乙酯或二氯甲烷萃取所得洗脱液，浓缩获得粗品后用甲醇 溶解，进行半制备液相色谱分离，并以体积比730：270的乙腈-水进行洗脱， 分段收集，即得。
[0015] 具体的，所述步骤(2)中，所述D3502大孔树脂吸附柱的径高比为1： 5-1：10，装柱体积2.5-4.0L，吸附流速为30-45ml/min。
[0016] 具体的，所述步骤(3)中，所述HZ816树脂吸附柱径高比为1：5-1： 8，装柱体积2.2-3L，吸附流速为25-35ml/min。
[0017] 具体的，所述步骤(4)中，所述半制备液相色谱为Welch Material，5μm， 250mm×10mm，控制洗脱液流速8ml/min。
[0018] 本发明还公开了所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin J及其药学上可 接受的盐用于制备具有抗肿瘤活性和抗临床致病厌氧菌活性药物的用途。
[0019] 具体的，所述肿瘤包括人结肠癌、人胰腺癌；所述致病厌氧菌包括艰 难梭菌、消化链球菌、牙龈卟啉单胞菌和痤疮丙酸杆菌。
[0020] 具体的，所述天然Rakicidins类化合物Rakicidin J及其药学上可接受的 盐的日服用剂量为1-5000mg/天，也可根据剂型的不同和疾病严重程度，使 用剂量超出该范围。
[0021] 本发明还公开了一种治疗致病厌氧菌感染疾病的药物，以所述天然 Rakicidins类化合物Rakicidin J及其药学上可接受的盐为活性成分，并添加 药学上可接受的载体。
[0022] 所述药物可以是普通片剂或胶囊、缓释片剂或胶囊、控释片剂或胶囊、 口服液、注射剂等制剂学上常规的制剂形式。
[0023] 本发明还公开了海洋小单孢菌株Micromonospora sp.FIM-R150103用 于发酵制备天然Rakicidins类化合物Rakicidin J的用途，所述海洋小单孢菌 株Micromonospora sp.FIM-R150103已保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.14822。
[0024] 本发明从海洋小单孢菌发酵液中分离得到新的Rakicidins组分 Rakicidin J，该化合物结构相比于已知的Rakicidin B1，在脂肽侧链的长度 不同，多两个亚甲基。本发明天然化合物Rakicidin J对人结肠癌细胞HCT-8 和人胰腺癌细胞PANC-1具有较好的体外抑制作用，对乏氧培养的肿瘤细 胞HCT-8活性较常氧的强4.93倍，对乏氧培养的肿瘤细胞PANC-1活性较 常氧的强6.08倍，对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌、艰难梭菌和万古霉素 耐药粪肠球菌等10株厌氧菌均具有一定的抑制活性，是一种结构新颖活性 优良的次级代谢产物，具有较高的药用价值。
[0025] 实验例
[0026] 1、抗肿瘤活性测试
[0027] 将提取的Rakicidin J样品溶解在DMSO中使得溶度达到1ug/ml，再分别稀 释使得终浓度为0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.0625ug/ml、 0.03125ug/ml、0.015625ug/ml。
[0028] 普通培养：取处于指数增长期的人结肠癌细胞HCT-8、人胰腺癌细胞 PANC-1分别种在96孔板里(细胞浓度为HCT-8 5.0×104个/ml，PANC-1 4.0×104个/ml，100ul/孔)，培养24hr使其贴壁，加100ul/孔带药新鲜培 养基，每个浓度设3个复孔，并设空白对照孔(只加培养基)作为阴性对 照，同样设3个复孔。继续培养至48hr，终止培养。
[0029] 分别将Rakicidin J样品溶解在DMSO中使得溶度达到1ug/ml，再分别 稀释使得终浓度为0.4444ug/ml、0.148148ug/ml、0.0493827ug/ml、 0.0164609ug/ml、0.00548697ug/ml、0.00182899ug/ml。
[0030] 乏氧培养：取处于指数增长期的人肠癌细胞HCT-8、人胰腺癌细胞 PANC-1分别种在96孔板里(细胞浓度为HCT-8 5.0×104个/ml，PANC-1 4.0×104个/ml，100ul/孔)，乏氧通气30分钟，关闭通气阀门，放入培养 箱37℃，培养24hr使其贴壁，加100ul/孔带药新鲜培养基，每个浓度设3 个复孔，并设空白对照孔(只加培养基)作为阴性对照，同样设3个复孔。 乏氧通气30分钟，关闭通气阀门，放入培养箱37℃，继续培养至48hr，终 止培养。
[0031] MTT法检测：将终止培养的细胞，每孔加CCK-810ul，在培养箱继续 培养2小时，弃上清，每孔加入150ul DMSO溶液，摇床10分钟轻轻地混 匀，在450nm波长下酶标仪读出每孔的OD值，并计算抑制率。通过对抑 制率的换算，使用SPSS软件计算出IC50值，结果见下表1和表2。
[0032] 抑制率(％)＝(阴性对照组OD值-实验组OD值)/阴性对照组OD值×100％。
[0033] 表1 Rakicidin J乏氧状态下对人结肠癌细胞HCT-8的抑制活性
[0034]
[0035] 表2 RakicidinJ乏氧状态下对人胰腺癌细胞PANC-1的抑制活性
[0036]
[0037] 上述结果表明，本发明化合物Rakicidin J具有强效抗肿瘤活性特别是 抗乏氧肿瘤细胞活性，对乏氧培养的肿瘤细胞HCT-8活性较常氧的强4.93 倍，对乏氧培养的肿瘤细胞PANC-1活性较常氧的强6.08倍。
[0038] 2、抗致病厌氧菌活性测试
[0039] (1)葡萄球菌及肠球菌的体外抗菌试验方法
[0040] 样品的配制：取化合物Rakicidin B1-1在DMSO中溶解，使其测试终 浓度为：16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015、0.008ug/ml。
[0041] 接种物的配制：制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的混悬液，用肉 汤稀释备用(葡萄球菌：MH肉汤；肠球菌：脑心浸液肉汤)，再于各孔内 加入100μl的受试菌液(每孔容量200μl)，菌液最终浓度约为105CFU/ml。 密封后置于35-37℃培养箱内培养18-24h。
[0042] MIC测定：以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为其最低抑 菌浓度，测试结果见下表3所示。
[0043] (2)艰难梭菌的体外抗菌活性测试方法
[0044] 接种物制备与接种：制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的混悬液，以 多点接种器吸取制备好菌液(1-2μl)[使用添加5％(V/V)脱纤维羊血、氯 化血红素(5mg/L)和维生素K1(1mg/L)的布氏培养基]接种于琼脂平板 表面(将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已高压溶解灭菌，并 在60℃水浴中平衡的强化布氏肉汤琼脂中，充分混匀，倾倒平板，琼脂厚 度3-4mm。按1：9比例配制药物琼脂平板，设置0.008-16mg/L 12个药物 浓度梯5
度)，每点接种菌量约为10CFU，形成直径为5-8mm的菌斑。接 种后置于厌氧环境中35℃孵育48h，观察结果。
度)，每点接种菌量约为10CFU，形成直径为5-8mm的菌斑。接 种后置于厌氧环境中35℃孵育48h，观察结果。
[0045] MIC测定：将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑 制细菌生长的最低药物浓度为MIC。与生长对照比较抑制80％以上细菌生 长的最低药物浓度作为终点浓度，测试结果见下表3所示。
[0046] 表3Rakicidin J抗菌活性
[0047]
[0048]
[0049] 上述抗菌测试结果表明，化合物Rakicidin J对甲氧西林耐药金黄色葡 萄球菌、艰难梭菌和万古霉素耐药粪肠球菌等10株厌氧菌均具有一定的抑 制活性。
具体实施方式
[0050] 实施例1Rakicidin J的制备
[0051] 取保存的海洋小单孢菌菌株Micromonospora sp.FIM-R150103(保藏编 号为CGMCC No.14822)进行发酵，具体发酵条件参照中国专利 CN108130284B公开的发酵方法，具体包括：取新鲜培养的海洋小单孢菌 Micromonospora sp.FIM-R150103斜面孢子刮取后制成菌悬液接种到摇瓶种 子培养中，在32℃、250rpm培养48小时，后按5％接种量接种到摇瓶发酵 培养基中，30℃、250rpm培养120小时后放瓶，HPLC测定发酵产物。
[0052] 种子培养基配方(质量分数)：可溶性淀粉2.0％，葡萄糖1.0％，酵母 粉2.0％，蛋白胨1.0％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4·7H2O 0.005％， CuSO4·5H2O 0.005％，CoCl2·6H2O 0.0005％，CaCO3 0.2％，自来水配制，调 pH值7.0-7.5。
[0053] 发酵培养基配方(质量分数)：可溶性淀粉4.0％，蔗糖1.0％，黄豆饼 粉3.0％，硫酸铵0.5％，缬氨酸0.1％，MgSO4·7H2O 0.04％，FeSO4·7H2O 0.005％，CuSO4·5H2O 0.005％，CoCl2·6H2O 0.0005％，CaCO3 0.5％，自来水 配制，调pH值7.5。
[0054] 发酵结束后收集发酵液并于4500rpm离心15min后，获得菌丝渣，把 获得的菌丝渣用2倍体积的90％的乙醇过夜浸泡2次，将含有酒精的菌丝 渣再次于4500rpm离心15min后将上清液合并，得到发酵提取液。
[0055] 取发酵提取液45L，并稀释至乙醇浓度为55％，随后以D3502大孔树 脂吸附柱层析(径高比为1：8，装柱体积3.0L)，吸附流速为35ml/min， 分别用70％和78％的乙醇水洗脱3BV、8.5BV(倍柱体积)，用HPLC(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm)检测洗脱液(乙腈-水
700：300，柱温 40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin J的78％的乙醇 洗脱液(23.6L)。
700：300，柱温 40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin J的78％的乙醇 洗脱液(23.6L)。
[0056] 将上述收集的洗脱液稀释至乙醇浓度为60％，以HZ816树脂吸附柱进 行层析(径高比为1：6，装柱体积2.5L)，控制吸附流速为30ml/min，用 72％和76％的乙醇-水溶液进行洗脱，分别洗脱2.5BV和6.5BV，以HPLC (YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm)跟踪检测洗脱液(乙腈-水700： 300，柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin J的 76％的乙醇水溶液(13.2L)。
[0057] 取收集的洗脱液浓缩至约1/3体积，用等体积二氯甲烷萃取三次，减压 浓缩，得粗品，并将所得粗品，用甲醇溶解，使用半制备液相色谱(5μm， 250mm×10mm，Welch Material)，以体积比730：270的乙腈-水进行洗脱， 控制流速8ml/min，HPLC检测收集液，得到样品Rakicidin J。
[0058] 经观察及检测，本实施例制得的所述化合物Rakicidin J为白色无定型 粉末，可溶于氯仿、甲醇、DMSO，不溶于水。
[0059] 经高分辨质谱(HR-ESI-MS)检测结果显示，其分子离子峰[M+H]+为 649.4528，[M+Na]+为671.4335，推断其分子式为C35H60N4O8(UN＝8)。
[0060] 1HNMR检测结果显示，该化合物有4个双键质子[δH 6.87(1H,d,J＝ 15.0Hz),6.17(1H,d,J＝15.0Hz),5.44(1H,s),5.33(1H,s)],5个可交换质子[δH 8.89(1H,s),8.05(1H,d,J＝10.0Hz),7.31(1H,s),7.29(1H,s),5.67(1H, s)],5个甲基质子[δH 2.96(3H,s),1.07(3H,d,J＝6.8Hz),0.94(3H,d,J＝ 6.0Hz),0.83(3H,t,J＝6.6Hz),0.82(3H,d,J＝
6.6Hz)]。
6.6Hz)]。
[0061] 13CNMR和DEPT135检测结果显示，该分子含有35个碳信号，包括5 个季碳(δC 173.4,172.9,169.4,167.2,166.5)，4个双键碳[包含一个sp2亚甲 基碳，两个sp2次甲基碳(δC 138.9,119.3)]，6个sp3次甲基碳[包含两个连 氧碳原子(δC 78.6,72.9)]，15个sp3亚甲基碳和5个甲基碳原子(δC 36.5, 19.6,15.9,13.7,11.7)。
[0062] 所有的氢质子通过HSQC谱1H-13C相关进行指认。1H–1H COSY相 关谱和质子的耦合常数显示该化合物含有4个独立的自旋耦合体系： NH-2–C-2–C-3–OH-3,C-9–C-10, C-33–C-14–C-15–C-16(C-34)–C-17–C-18和C-28–C-29–C-30 (C-35)–C-31–C-32。结合1H–1H COSY和HMBC可知，H-2与C-1/C-5 相关，H-3与C-4相关，OH-3与C-2/C-3相关，Ha-6与C-5/C-7相关，H3-7 与C-6/C-8相关，H-9与C-8/C-11相关，H-10与C-8/C-11相关，Hb-12与 C-10/C-11相关，H-15与C-1相关，H3-32与C-30/C-31相关，H3-33与 C-13/C-14/C-15相关，H3-34与C-15/C-16/C-17相关，以及H3-35与 C-29/C-30/C-31相关，氢和碳的化学位移列于表4。
[0063] 表4氢和碳的化学位移
[0064]
[0065]
[0066] 通过对上述核磁数据、不饱和度、分子式和化学位移的分析，得出化 合物1的化学结构如式(Ⅰ)所示。可见，本实施例制得化合物Rakicidin J 结构正确。
[0067] 实施例2 Rakicidin J的制备
[0068] 取保存的小单孢菌菌株Micromonospora sp.FIM-R150103进行发酵，发 酵过程同实施例1，收集发酵液并于4500rpm离心15min后，获得菌丝渣， 把获得的菌丝渣用2倍体积的90％的乙醇过夜浸泡2次，将含有酒精的菌 丝渣再次于4500rpm离心15min后将上清液合并，得到发酵提取液。
[0069] 取发酵提取液30L，并稀释至乙醇浓度为50％，随后以进行D3502大 孔树脂吸附柱层析(径高比为1：5，装柱体积2.5L)，吸附流速为45ml/min， 分别用70％和78％的乙醇水洗脱3BV、6.5BV，用HPLC(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm)检测洗脱液(乙腈-水700：300，柱温40℃， 流速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin J的78％的乙醇洗脱液 (13L)。
[0070] 将上述收集的洗脱液稀释至乙醇浓度为55％，以HZ816树脂吸附柱进 行层析(径高比为1：8，装柱体积3.0L)，控制吸附流速为35ml/min，用 72％和76％的乙醇-水溶液进行洗脱，分别洗脱2.5BV和5BV，以HPLC (YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm)跟踪检测洗脱液(乙腈-水700： 300，柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin J的 76％的乙醇水溶液(11.5L)。
[0071] 取收集的洗脱液浓缩至约1/3体积，用等体积乙酸乙酯萃取三次，减压 浓缩，得粗品，并将所得粗品，用甲醇溶解，使用半制备液相制备(5μm， 250mm×10mm，Welch Material)，以体积比730：270的乙腈-水进行洗脱， 控制流速8ml/min，HPLC(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm)检测 收集液，得到样品Rakicidin J。
[0072] 经检测，本实施例方案制得产物结构正确。
[0073] 实施例3 Rakicidin J的制备
[0074] 取保存的小单孢菌菌株Micromonospora sp.FIM-R150103进行发酵，发 酵过程同实施例1，收集发酵液并于4500rpm离心15min后，获得菌丝渣， 把获得的菌丝渣用2倍体积的90％的乙醇过夜浸泡2次，将含有酒精的菌 丝渣再次于4500rpm离心15min后将上清液合并，得到发酵提取液。
[0075] 取发酵提取液55L，并稀释至乙醇浓度为60％，随后以进行D3502大 孔树脂吸附柱层析(径高比为1：8，装柱体积4.0L)，吸附流速为30ml/min， 分别用70％和78％的乙醇水洗脱3.5BV、8.5BV，用HPLC检测(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm)洗脱液(乙腈-水700：300，柱温40℃，流 速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin J的78％的乙醇洗脱液 (31.5L)。
[0076] 将上述收集的洗脱液稀释至乙醇浓度为60％，以HZ816树脂吸附柱进 行层析(径高比为1：5，装柱体积2.2L)，控制吸附流速为25ml/min，用 72％和76％的乙醇-水溶液进行洗脱，分别洗脱3BV和7BV，以HPLC(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm)跟踪检测洗脱液(乙腈-水700：300， 柱温40℃，流速1.0mL/min，波长262nm)，收集含有Rakicidin J的76％的 乙醇水溶液(14.8L)。
[0077] 取收集的洗脱液浓缩至约1/3体积，用等体积二氯甲烷萃取三次，减压 浓缩，得粗品，并将所得粗品，用甲醇溶解，使用半制备液相制备(5μm， 250mm×10mm，Welch Material)，以体积比730：270的乙腈-水进行洗脱， 控制流速8ml/min，HPLC(YMC ODS C18柱，5μm,250mm×4.6mm)检测 收集液，得到样品Rakicidin J。
[0078] 经检测，本实施例方案制得产物结构正确。
[0079] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方 式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予 以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保 护范围之中。
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