技术领域
[0001] 本
发明属于
生物化学与分子生物学领域，涉及基于蛋白组学的链霉菌次级代谢高效启动子挖掘方法及应用。
背景技术
[0002] 链霉菌是一种来自
土壤的放线菌，属于
革兰氏阳性菌，其因在次级代谢过程中能产生丰富的具有重要生物活性的天然产物而具有巨大的经济和社会价值。为了利用链霉菌
发酵大量生产各类次级代谢天然产物，需要各种用于链霉菌次级代谢天然产物生物合成的代谢工程工具。启动子是一类对生物生命活动具有
基础性调控作用的顺式元件。目前在链霉菌中，一些高效的组成型启动子被很好地表征，例如ermE*p,kasO*p以及SF14p。另外，还有一些诱导型启动子也被广泛应用。但总体来说，由于生产中使用的工业链霉菌需满足各种要求，能广泛应用于链霉菌工业菌株改造的启动子仍然缺乏。
[0003] 众所周知，
次级代谢产物是由乙酰辅酶A等前体物质生物合成产生的。这些前体主要来自初级代谢，且在菌体生长过程中是细胞结构的必要组成单位。由组成型启动子控制下的次级代谢天然产物生物合成在链霉菌最初的生长期开始，这将不可避免地过度消耗上述初级代谢产物，进而影响菌体在最初的生长期的正常生长。同时一些有着特定生物活性的万古霉素等次级代谢产物，经常有抑制菌
体细胞生长的生理学效应。上述这些因素都会对细胞的生长繁殖有毒害作用，尤其是在工业化扩大生产的过程中。这些负面作用可能最终将会抵消高效的组成型启动子的积极作用。另一方面，由于化学诱导剂的使用，诱导型启动子在菌体生理上也有一些负面的作用。同时在工业生产中，额外添加的诱导剂可能会影响后续目标产物的分离纯化，同时也会增加额外的生产成本。
[0004] 因此，与次级代谢天然产物生物合成基因簇表达模式相近的强启动子将会更适用于基因簇的过表达。为了这一目标，就要设法寻找在初级代谢阶段沉默，而在细胞进入次级代谢后高效表达的启动子。在这样的情况下，由于启动子的活性依赖于生理
开关，所以不需要诱导剂。
[0005] 工业生产菌Streptomyces chattanoogensis L10能产生大环内酯类抗生素，纳他霉素。纳他霉素的生物合成需要大量的乙酰辅酶A和海藻糖等前体物质，其中一些代谢产物对于菌体有毒害作用。基于Streptomyces chattanoogensis L10的
蛋白质二维
电泳结果，经筛选得到了一个启动子。报告基因egfp在上述启动子调控下，在次级代谢中表达量是ermE*p的2至6倍。除此之外，使用这个启动子高表达纳他霉素正调控因子显示出比ermE*p高20％的纳他霉素产量。这是一种筛选在次级代谢中自动诱导的启动子元件的新方法。这种方法筛选的启动子将可以用于链霉菌中天然产物的发现与高产改造。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种基于蛋白组学的链霉菌次级代谢高效启动子挖掘方法，针对的是为链霉菌次级代谢高效调控强启动子的挖掘，提供一种基于蛋白组学的方法。这是一种基于链霉菌蛋白质二维电泳及质谱鉴定，快速分析挖掘链霉菌次级代谢高效调控强启动子的新技术。该方法高效，准确，操作方便，为寻找内源的链霉菌次级代谢高效调控强启动子提供了一种新的方法。
[0007] 本发明方法通过以下步骤实现：
[0008] (1)取保存的链霉菌野生型菌株发酵。在数个
选定的时间点，对链霉菌发酵液取样，离心收取菌体，超声
破碎细胞获得菌体总蛋白，进行二维电泳；
[0009] (2)根据链霉菌蛋白质二维电泳结果，初步筛选链霉菌次级代谢中表达
水平相对提高明显的蛋白点。
[0010] (3)将步骤(2)中确定的蛋白点中蛋白分别酶解后用于质谱分析，得到各个蛋白的一系列肽段信息，然后利用相关菌株全基因组数据及由此获得的蛋白质
氨基酸残基序列建立
数据库，利用质谱分析获得的肽段信息与数据库对比，鉴定蛋白质二维胶图中上述蛋白点中蛋白质的种类并找到对应基因，剔除其中肽段
覆盖率较低的基因后得到若干个基因，取这些基因的启动子区域作为备选启动子；
[0011] (4)扩增出步骤(3)中选定的启动子，插入pIJ8660载体中，使得egfp基因的上游为各启动子，测序验证目标质粒序列正确性后，即得到若干分别依次带有一段特定的启动子序列和egfp基因的pIJ8660重组质粒，同时将扩增出的ermE*p启动子插入pIJ8660载体的相同位点，得到依次带有ermE*p启动子和egfp基因的pIJ8660重组质粒；
[0012] (5)将步骤(4)中的所有重组质粒分别接合转导进入链霉菌中，挑选经验证改造成功的链霉菌突变株若干，进行发酵。选取24、48、72以及96小时的各突变株发酵液，离心收取菌体，超声破碎细胞获得菌体总蛋白；
[0013] (6)取步骤(5)中等量的各样品进行菌体总蛋白Western blot实验，检测eGFP在24、48、72以及96小时的表达水平同时利用等量的各样品进行蛋白胶电泳后考
马斯亮蓝
染色，确定各样品总蛋白上样量一致；
[0014] (7)根据步骤(6)中Western blot实验相对定量检测eGFP的结果，进一步确认在链霉菌中次级代谢高效调控强启动子，其特点为在初级代谢中低活性并且在次级代谢中高活性。
[0015] 本发明的另一个目的是提供所述方法在链霉菌天然产物高产改造中的应用，是针对链霉菌次级代谢基因表达调控。
[0016] 1.本发明方法是根据链霉菌蛋白质二维电泳结果，经质谱鉴定分析，筛选链霉菌次级代谢中相对于初级代谢具有明显较高活性的启动子。
[0017] 2.本发明方法是将备选启动子插入egfp基因上游，利用eGFP蛋白的表达水平来表征备选启动子活性，从而便于后续的检测。
[0018] 3.本发明方法筛选得到的启动子是经蛋白质二维电泳分析，质谱鉴定以及报告基因egfp筛选后确认的链霉菌次级代谢高效调控强启动子，其特征是在初级代谢中低活性并且在次级代谢中高活性，从而能够保证使用该启动子时，链霉菌初级代谢中不受影响而在次级代谢中保证相关次级代谢产物高效产出。
[0019] 本发明具有的明显优点：1)本发明能够利用通用步骤快速筛选出链霉菌次级代谢高效调控强启动子。2)本发明为链霉菌各种天然产物的生物合成以及隐性基因簇的激活提供了寻找强启动子元件的方法工具。3)本发明在天然产物的生物合成中应用广泛，所有可以进行遗传操作的宿主都可以使用本发明进行启动子挖掘。
[0020] 基于以上考虑，我们发明了基于蛋白组学的链霉菌次级代谢高效启动子挖掘方法。该方法高效，准确，操作方便，为寻找内源的链霉菌次级代谢高效调控强启动子提供了一种新的方法。
附图说明
[0021] 图1为Streptomyces chattanoogensis L10蛋白质二维电泳数据，6个蛋白点在次级代谢中相对表达强度提高明显(72小时/24小时)。a:发酵24小时样品蛋白质二维电泳胶图，b：发酵72小时样品蛋白质二维电泳胶图，c：次级代谢上调蛋白
[0022] 图2为测定Streptomyces chattanoogensis L10中，4325p调控下的报告基因egfp的表达水平的Western blot实验结果，实验以ermE*p调控下egfp在第3天时的表达水平为对照。检测eGFP在第1、2、3以及4天的表达水平同时利用等量的蛋白进行蛋白胶电泳后考马斯亮蓝染色，确定各样品上样量一致。
[0023] 图3为以4325p和ermE*p高表达scnRII后，Streptomyces chattanoogensis L10的纳他霉素的产量曲线。
具体实施方式
[0024] 下面结合附图和具体
实施例作进一步详细描述。
[0025] 实施例1以使用本方法挖掘Streptomyces chattanoogensis L10次级代谢高效调控强启动子为例，详细描述本发明。具体实施步骤如下：
[0026] 1)根据Streptomyces chattanoogensis L10蛋白质二维电泳结果，经质谱鉴定分析，初步筛选出Streptomyces chattanoogensis L10次级代谢中表达水平相对提高明显(72小时/24小时)的基因，得到6个基因。(见表1与附图1)所述Streptomyces chattanoogensis L10，分类命名为：Streptomyces chattanoogensis L10，保藏于中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC 2644，保藏日：2008年8月27日，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，邮编：100101；
[0027] 2)根据步骤1)中确定的6个基因，剔除其中肽段覆盖率较低的基因后得到3个备选基因，取这些基因的启动子区域作为备选启动子。(见表1)表1质谱鉴定得到的6个基因的相关信息
[0028] 3)由引物对1+2；3+4；5+6；(见表2)扩增出步骤2)中的3个备选启动子，克隆插入pIJ8660载体的BamHI/NdeI位点，使得3个备选启动子分别位于egfp基因的上游，测序检验序列正确性后，即得到3个分别依次带有一段备选启动子和egfp基因的pIJ8660重组质粒，命名为pIJ8660-P1～P3。同时由引物对7+8(见表2)扩增出ermE*p启动子，克隆插入pIJ8660载体的BamHI/NdeI位点，得到依次带有ermE*p启动子和egfp基因的pIJ8660重组质粒，命名为pIJ8660-P4。表2构建报告质粒所用引物
[0029] 4)将步骤3)中的4个重组质粒分别接合转导进入Streptomyces chattanoogensis L10中，得到相应4株突变株。
[0030] 5)将步骤4)中的4株Streptomyces chattanoogensis L10突变株进行发酵。
[0031] 6)取步骤5)中24、48、72以及96小时的各突变株发酵液，离心收取菌体，超声破碎细胞获得菌体总蛋白。
[0032] 7)取步骤6)中各样品20μg进行菌体总蛋白Western blot实验，检测eGFP在24、48、72以及96小时的表达水平同时利用等量的各样品进行蛋白胶电泳后考马斯亮蓝染色，确定各样品总蛋白上样量一致。
[0033] 8)根据步骤7)中Western blot实验相对定量检测eGFP的结果，进一步确认了在Streptomyces chattanoogensis L10中次级代谢高效调控强启动子4325p(见附图2)，其特点为在初级代谢中低活性并且在次级代谢中高活性。
[0034] 4325p序列:GTGACGACCGCCAGCTCCAAGGTTGCCATCAAGCCGCTCGAGGACCGCATCGTGGTCCAGCCGCTCGACGCCGAGCAGACCACGGCTTCGGGCCTGGTCATTCCGGACACCGCGAAGGAGAAGCCCCAGGAGGGCGTCGTCCTGGCCGTGGGTCCGGGCCGCTTCGAGGACGGCAACCGTCTTCCGCTCGACGTCAGCGTTGGCGACGTCGTGCTCTACAGCAAGTACGGCGGCACC。
[0035] 实施例21)选取Streptomyces chattanoogensis L10中纳他霉素合成途径特异性正调控基因scnRII作为靶基因，利用引物对9+10(见表3)扩增4325p启动子，同时利用引物对11+12(见表3)扩增scnRII基因，将4325p启动子和scnRII基因以无缝克隆的方法插入pIJ8660载体的BamHI/NotI位点，即得到依次带有4325p启动子和scnRII基因的pIJ8660重组质粒，命名为pIJ8660-4325p-scnRII。另外，利用引物对13+14(见表3)扩增ermE*p启动子，同时利用引物对15+16(见表3)扩增scnRII基因，将ermE*p启动子和scnRII基因以无缝克隆的方法插入pIJ8660载体的BamHI/NotI位点，即得到依次带有ermE*p启动子和scnRII基因的pIJ8660重组质粒，命名为pIJ8660-ermE*p-scnRII。
表3构建高表达质粒所用引物
[0036] 2)将步骤1)中的2个重组质粒分别接合转导进入Streptomyces chattanoogensis L10中，得到相应2株高表达scnRII的突变株。
[0037] 3)将步骤2)中的2株Streptomyces chattanoogensis L10突变株进行发酵。4)取步骤3)中24、48、72、96以及120小时的各突变株发酵液，甲醇提取后HPLC测定纳他霉素产量。经检测4325p高表达scnRII的Streptomyces chattanoogensis L10突变株纳他霉素的产量比ermE*p高表达scnRII的恰塔努加链霉菌L10突变株高20％(见附图3)。thlM4p序列同实施例1所示。
