[0001] 相关申请的交叉参考

[0002] 本申请要求2012年9月14日提交的美国临时申请系列号61/701,037、2013年2月18日提交的美国临时申请系列号61/766,057和2013年3月15日提交的美国临时申请系列号61/790,404的优先权，这些申请的内容通过引用方式全文并入本文。

[0003] 关于电子提交的序列表

[0004] 通过EFS-Web电子提交序列表的正式版本，作为命名为“2912939_19973WO01_SEQLIST.txt”的ASCII格式序列表，创建于2013年9月12日，具有237kb大小，与本说明书同时提交。包含于该ASCII格式文档中的序列表是本说明书的一部分，通过引用方式全文并入本文。发明领域

[0005] 本发明涉及植物分子生物学，具体地涉及赋予增强的对HPPD抑制剂除草剂的耐受性的新型HPPD多肽。

[0006] 发明背景

[0007] 4-羟基苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)是催化其中对-羟基苯丙酮酸(在本文中缩写为HPP)(一种酪氨酸降解产物)被转化成尿黑酸(在本文中缩写为HG)(植物中生育酚和质体醌的前体)的酶(Crouch N.P.等人(1997),Tetrahedron,53,20,6993-7010,Fritze等人(2004),Plant Physiology 134:1388-1400)。生育酚用作膜结合抗氧化剂。质体醌，首先用作PSII与细胞色素b6/f复合物之间的电子载体，其次，为八氢番茄红素去饱和酶的氧化还原辅因子，其参与类胡萝卜素的生物合成。

[0008] 迄今，存在于NCBI数据库中的1000多个来自各种生物体的核酸序列被注释为编码具有HPPD结构域的假定的蛋白。但对于这些序列中的大多数，未曾证明所述蛋白在体外测定中或在植物内的方法具有HPPD酶促活性，也未证明这样的HPPD蛋白，当在植物中表达时，可赋予对HPPD抑制剂除草剂的除草剂耐受性。几种HPPD蛋白及其一级序列已在现有技术水平上进行了描述，特别是如下生物的HPPD蛋白：细菌诸如假单胞菌属(Pseudomonas)(Rüetschi等人，Eur.J.Biochem.,205,459-466,1992,WO 96/38567)、Kordia(WO2011076889)、聚球藻属(Synechococcus)(WO2011076877)和红球菌属(Rhodococcus)(WO2011076892)、原生生物诸如赭纤虫属(Blepharisma)(WO2011076882)、阔古细菌界(euryarchaeota)诸如嗜酸菌属(Picrophilus)(WO2011076885)、植物诸如拟南芥属(WO  96/38567,AF047834)、胡萝卜(WO 96/38567, 87257)、燕麦(WO 
02/046387,WO 11/068567)、小麦(WO 02/046387)、宽叶臂形草(Brachiaria platyphylla)(WO 02/046387)、蒺藜草(Cenchrus echinatus)(WO 02/046387)、硬直黑麦草(Lolium rigidum)(WO 02/046387)、高羊茅(Festuca arundinacea)(WO 02/046387)、大狗尾草(Setaria faberi)(WO 02/046387)、牛筋草(Eleusine indica)(WO 02/046387)、高粱(WO 
02/046387,WO 12/021785)、玉米(WO 12/021785)、球孢子菌属(Coccicoides)(
COITRP)的、日本黄连的(WO 06/132270)、莱茵衣藻(Chlamydomonas 
reinhardtii)(ES 2275365)/WO2011/145015或哺乳动物诸如小鼠或猪。

[0009] HPPD的抑制导致光合作用的解偶联、辅助集光色素的缺乏以及最重要地，紫外线照射和活性氧自由基(因通常由类胡萝卜素提供的光保护作用的缺乏而产生的)对叶绿素的破坏(漂白)(Norris等人(1995),Plant Cell 7:2139-2149)。光合活性组织的漂白导致生长抑制和植物死亡。

[0010] 抑制HPPD以及抑制HPP至尿黑酸的转化同时特异性结合酶的一些分子，已证明是非常有效的除草剂。

[0011] 目前，大多数商购可得的HPPD抑制剂除草剂属于这些化学家族之一：

[0012] 1)三酮，例如磺草酮[即2-[2-氯-4-(甲磺酰基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮],硝磺草酮[即2-[4-(甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰基]-1,3-环己二酮]；特波三酮[即2-[2-氯-4-(甲磺酰基)-3-[(2,2,2,-三-氟乙氧基)甲基]苯甲酰基]-1,3-环-己二酮]；特糠酯酮[即2-[2-氯-4-(甲磺酰基)-3-[[(四氢-2-呋喃基)甲氧基]甲基]苯甲酰基]-1,3-环己二酮]]；双环吡喃酮[即4-羟基-3-[[2-[(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]bi环[3.2.1]3-辛烯-2-酮]；苯并双环酮[即3-(2-氯-4-甲磺酰苯甲酰基)-2-苯基硫代双环[3.2.1]2-辛烯-4-酮]；

[0013] 2)二酮腈，例如2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙烷-1,3-二酮和2-氰基-1-[4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙烷-1,3-二酮；

[0014] 3)异噁唑类，例如异噁唑草酮[即(5-环丙基-4-异噁唑基)[2-(甲磺酰基)-4-(三氟甲基)苯基]甲酮]。在植物中，异噁唑草酮在DKN(展现HPPD抑制剂性质的二酮腈化合物)中被快速代谢；

[0015] 4)吡唑特(pyrazolinates)，例如苯吡唑草酮[即[3-(4,5-二氢-3-异噁唑基)-2-甲基-4-(甲磺酰基)苯基](5-羟基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲酮]，和磺酰草吡唑[即(5-羟基-1,3-二甲基吡唑-4-基(2-甲磺酰-4-三氟甲基苯基)甲酮]；酸苯偶氮吡胺[即2-[4-(2,4-二氯苯甲酰基)-1,3-二甲基吡唑-5-基氧]苯乙酮]；

[0016] 5)N-(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺(WO 2011/035874)；和

[0017] 6)N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基咪唑羧酰胺(WO2012/028579)。

[0018] 可对显示出代谢耐受性的作物植物例如玉米(Zea mays)、水稻(Oryza Sativa)和小麦(Triticum aestivum)的田中的草和/或阔叶杂草使用这些HPPD抑制性除草剂，在所述作物植物中它们被快速降解(Schulz等人(1993),FEBS letters,318,162-166；Mitchell等人(2001),Pest Management Science，第57卷，120-128；Garcia等人(2000),Biochem.,39,7501-7507；Pallett等人(2001),Pest Management Science，第57卷，133-142)。为了扩展这些HPPD抑制性除草剂的使用范围，已经进行了若干尝试来赋予植物，特别是不具有或具有表现不佳的代谢耐受性的植物在农艺学田间条件下可接受的耐受水平。

[0019] 除了绕开HPPD介导的尿黑酸的产生的尝试(US 6,812,010)外，还进行了过表达敏感性酶以在植物中产生大量与除草剂充分相关的目标靶(WO96/38567)。HPPD的过表达导致更好的对异噁唑草酮(IFT)的二酮腈衍生物(DKN)的出苗前耐受性，但耐受性不足以耐受出苗后处理(Matringe等人(2005),Pest Management Science 61:269-276)。

[0020] 第三策略是突变HPPD以获得目标酶，所述目标酶在保持其催化HPP转化成尿黑酸的性质时，不如突变前的天然HPPD那样对HPPD抑制剂敏感。

[0021] 该策略已被成功地用于耐受2-氰-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙烷-1,3-二酮和2-氰-1-[4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙烷-1,3-二酮(EP496630)(属于二酮腈家族的两种HPPD抑制性除草剂)的植物的产生(WO 99/24585)。Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Ile，更具体地Gly336Trp(突变的氨基酸的位置参照假单胞菌属HPPD来进行指示)被鉴定为负责增强的对利用这些二酮腈除草剂的处理的耐受性的突变。

[0022] 最近，假单胞菌属HPPD基因至烟草和大豆的质粒基因组中的引入已显示比细胞核转化更有效，从而赋予对异噁唑草酮(isoxaflutole)的出苗后施用的耐受性(Dufourmantel等人(2007),Plant Biotechnol J.5(1):118-33)。

[0023] 在WO 04/024928中，发明人寻求通过增加HPP前体至这些植物的细胞中的流入来增加植物细胞中的异戍ニ烯基醌生物合成(例如，质体醌、生育酚类的合成)。这已通过将所述前体的合成与"莽草酸"途径连接(通过PDH酶的过表达)来进行。他们还注意到，用编码PDH酶的基因和编码HPPD酶的基因转化植物使得可能增加所述植物对HPPD抑制剂的耐受性。

[0024] 在专利申请WO 2009/144079中，公开了编码在假单胞菌属荧光HPPD蛋白的位置336上具有特定突变的羟基苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的核酸及其用于获得耐受HPPD抑制剂除草剂的用途。

[0025] 在WO 2002/046387中，已鉴定了来源于植物的HPPD蛋白的几个结构域，所述结构域可能与赋予对各种HPPD抑制剂除草剂耐受性相关，但在植物和生化数据中都未显示确认所描述的结构域功能的影响。

[0026] 在WO 2008/150473中，两个不同的耐受机制的组合–编码突变HPPD酶的经修饰的燕麦基因和CYP450玉米单加氧酶(nsf1基因)-被例举来获得增强的对HPPD抑制类除草剂的抗性，但未公开显示基于两种蛋白的组合的协同作用的数据。

[0027] 此外，在US20110173718中，公开了产生耐受HPPD抑制剂的植物的方法，所述方法通过不仅过表达编码耐受性HPPD(如例如来自燕麦的)，而且还过表达与其组合的编码HST(尿黑酸呢基转移酶)蛋白的几个基因组合来产生所述植物。然而，对一些选择的HPPD抑制剂除草剂的耐受性的水平相当有限的。

[0028] 在WO2011094199和US20110185444中，评价了数百个大豆野生型品系对HPPD抑制剂异噁唑草酮的耐受性。极少数品系展现适当水平的对该除草剂的耐受性。鉴定了负责该耐受性的假定的QTL(数量性状基因座)。在基因组的该区域中，编码ABC转运蛋白的基因被鉴定为负责观察到的增强的对HPPD抑制剂除草剂的耐受性的主性状。然而，表达该鉴定的基因的转基因植物未展现对测试的HPPD抑制剂除草剂的耐受性的任何增强。

[0029] 在WO2010/085705中，公开了燕麦HPPD的几个突变体。已显示一些变体在体外展现增强的对三酮“硝磺酮”的耐受性，然而，仅极少数突变体在烟草植物中表达。此外，表达这些突变体的烟草植物都未展现相较于表达野生型燕麦HPPD基因的烟草植物的增强的对硝磺酮或异噁唑草酮的耐受性。

[0030] US 2012/0042413描述了具有HPPD活性而且还显示一定程度的对至少一种HPPD抑制剂的敏感性的多肽，并且进一步提出特定组的HPPD酶的不同位置上的突变，并且最后公开了生化数据以及含有少数这样的突变HPPD的植物的耐受性水平。

[0031] 在EP 21453012中，已描述了HPPD的个突变体；然而，描述的突变体在植物中未显示针对几种HPPD抑制剂除草剂的增强的耐受性。

[0032] 发明概述

[0033] 提供了用于赋予对HPPD抑制剂除草剂的耐受性的组合物和方法。组合物包括耐受HPPD抑制剂除草剂的HPPD多肽，以及编码这类多肽的分离的、重组的或嵌合的核酸分子、包含那些核酸分子的载体和宿主细胞。组合物还包括针对这些多肽的抗体。可将核苷酸序列用于DNA构建体或表达盒中以用于生物体(包括微生物和植物)的转化和表达。核苷酸序列可以是已被设计用来在生物体(包括但不限于微生物或植物)中表达的合成序列。

[0034] 组合物包括编码除草剂耐受性多肽的核酸分子，包括编码在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188、189、215、335、336、339和340的位置上具有一个或多个氨基酸置换的HPPD蛋白(包括SEQ ID NO:1、2、63、64或65的任一个中所示的HPPD蛋白，其中已引入了对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188、189、215、335、336、339和340的位置上的一个或多个氨基酸置换)的核酸分子，和包括编码SEQ ID NO:3-59的任一个中所示的氨基酸序列以及其变体和片段的任何核酸序列。本发明还包括由核酸分子编码的除草剂耐受HPPD蛋白，以及包含所述HPPD蛋白的组合物。

[0035] 组合物还包含通过向细菌、植物、植物细胞、组织和种子的基因组中引入本发明的核酸序列而耐受HPPD抑制剂除草剂的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。当生物体是植物时，所述序列的引入允许将HPPD抑制剂除草剂施用于植物，以选择性杀死HPPD抑制剂敏感性杂草或其它未转化的植物，但不杀死转化的生物体。序列可另外地用作用于选择在一种或多种HPPD抑制剂除草剂存在的情况下生长的植物细胞的标记。

[0036] 另外还提供了用于鉴定具有HPPD抑制剂耐受性活性的HPPD酶的方法。

[0037] 本发明的组合物和方法用于产生具有增强的对HPPD抑制剂除草剂的耐受性的生物体。这些生物体和包含所述生物体的组合物是用于农业目的所期望的。可将包含本发明的核酸序列的植物或种子种于田中，并收获以获得植物产品。本发明的组合物还用于产生具有HPPD抑制剂除草剂耐受性活性的改变的或改良的蛋白质，或用于检测产品或生物体中HPPD抑制剂除草剂耐受性蛋白或核酸的存在。

[0038] 附图概述

[0039] 图1显示来自微生物和植物物种包括荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(SEQ ID NO:1)、燕麦(Avena sativa)(SEQ ID NO:63)的HPPD、来自燕麦(SEQ ID NO:64)、玉米(SEQ ID NO:65)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)(SEQ ID NO:69)、拟南芥(SEQ ID NO:66)、大麦(Hordeum vulgare)(SEQ ID NO:67)、胡萝卜(Daucus carota)(SEQ ID NO:68)、禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)(SEQ ID NO:70)和Coccicoides immitis(SEQ ID NO:71)的HPPD的变体的氨基酸序列的比对。

[0040] 发明详述

[0041] 现在下文中参照附图更全面地描述本发明，在所述附图中显示了本发明的一些但非全部实施方案。事实上，这些发明可体现于许多不同的形式，并且不应当被解释为限制于本文中所示的实施方案；相反地，提供了这些实施方案以便本公开内容满足可适用的法律要求。相同的数字在整个说明书中表示相同的元素。

[0042] 本文中所示的本发明的许多变动和其它实施方案将使这些发明所属领域内的普通技术人员想到产述描述和相关附图中呈现的教导的益处。因此，应理解，本发明不限于所公开的具体实施方案，并且变动和其它实施方案意欲包括在所附权利要求的范围内。尽管在本文中使用了特定术语，但它们仅在一般性和描述性意义上使用，而不是为了限制目的。

[0043] 概述

[0044] 已作出若干努力来赋予植物农艺学上可接受的水平的对广泛的HPPD抑制剂除草剂的耐受性，包括绕开HPPD介导的尿黑酸的产生(US 6,812,010)、过表达敏感性酶以在植物中产生大量与除草剂充分相关的目标酶(WO96/38567)，以及突变HPPD以获得目标酶，所述目标酶保持其催化HPP至尿黑酸的转化的性质，但不如突变前的天然HPPD那样对HPPD抑制剂敏感。

[0045] 尽管对于显示对上述几种HPPD抑制剂除草剂的耐受性的植物的开发获得了这些成功，但仍然必需开发和/或增强植物对更新的或对几种不同的HPPD抑制剂(特别是属于三酮种类的HPPD抑制剂(例如磺草酮、硝磺草酮、特波三酮、双环磺草酮和双环吡喃酮)、吡唑inates(例如，苯唑草酮和磺酰草吡唑)、N-(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺(WO2011/035874)和N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基咪唑羧酰胺(WO2012/028579))的耐受性。

[0046] 因此，本发明提供了用于调节HPPD抑制剂除草剂耐受性的改进的组合物和方法。HPPD抑制剂除草剂，如N(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺、N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基咪唑羧酰胺类的那些除草剂，诸如2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺和2-氯-3-(甲氧基甲基)-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺、三酮类诸如特波三酮、磺草酮和硝磺草酮，异噁唑酮类诸如异噁唑草酮，或吡唑特类的除草剂剂，诸如磺酰草吡唑和苯唑草酮，特别是选自特波三酮、磺草酮、苯唑草酮、双环吡喃酮、特糠酯酮、异噁唑草酮和硝磺草酮，具有抗广谱经济上重要的单子叶和双子叶一年生有害植物的出色除草剂活性。活性物质也高效地作用于从根茎、木干(wood stocks)产生枝条或难以控制的其它多年生器官的多年生有害植物。在本发明的含义内，"除草剂"被理解为本身具有除莠活性的物质或与改变其效率的添加剂诸如，例如增强其活性(协同试剂)或限制其活性(安全剂)组合的这样的物质。除草剂还可包含通常用于配制技术的固体或液体佐剂或载体(例如天然或再生矿物质、溶剂、分散剂、湿润剂、增稠剂、乳化剂、生长促进剂等)，以及一种或多种另外的除草剂和/或一种或多种杀虫剂(例如，杀昆虫剂，杀病毒剂，杀微生物剂，杀变形虫剂，农药，杀真菌剂，杀菌剂，杀线虫剂，杀软体动物剂等)。

[0047] 所述方法包括用本发明的编码HPPD抑制剂耐受基因的核苷酸序列转化生物体，或另外地将这类HPPD抑制剂耐受性基因引入不含它们的生物体(例如，通过交配、细胞融合，或通过将含有引入的本发明的HPPD抑制剂基因的生物体与不含其的生物体杂交并获得含有这样的基因的后代)。本发明的核苷酸序列用于制备植物，所述植物显示增强的对HPPD抑制剂除草剂的耐受性，特别是增强的对如下种类的HPPD抑制剂除草剂的耐受性：N-(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺、N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基咪唑羧酰胺类，诸如2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺和2-氯-3-(甲氧基甲基)-
4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺，三酮类诸如特波三酮、磺草酮和硝磺草酮，异噁唑酮类诸如异噁唑草酮，吡唑特类诸如磺酰草吡唑和苯唑草酮，具体地选自特波三酮、磺草酮、苯唑草酮、双环吡喃酮、特糠酯酮、异噁唑草酮和硝磺草酮。本发明的HPPD抑制剂除草剂耐受性还显示对"香豆酮衍生杀虫剂"的耐受性(WO2009/090401、WO2009/
090402、WO2008/071918、WO2008/009908中描述的)。在这一点上，本发明的HPPD抑制剂除草剂耐受性基因的任一个也可在也表达嵌合尿黑酸法呢基转移酶(HST)基因或突变的HST基因(如WO2011/145015、WO2013/064987、WO2013/064964或WO2010/029311中描述的)的植物中表达，以获得耐受HST抑制剂类除草剂的植物。如本文中所用，"嵌合衍生除草剂"或“HST抑制剂类除草剂”包括落在5H-硫代吡喃并[4,3-b]嘧啶-8-醇、5H-硫代吡喃并[3,4-b]吡嗪-8-醇、噁噻英并[5,6-b]嘧啶-4-醇和噁噻英并[5,6-b]吡嗪-4-醇的IUPAC命名法下的化合物。

[0048] 因此，本发明的“HPPD抑制剂除草剂耐受性”基因预期为编码这样的蛋白的基因，所述蛋白赋予细胞或生物体如下能力：相较于不表达所述蛋白质的这样的细胞或生物体耐受更高浓度的HPPD抑制剂除草剂，或相较于不表达所述蛋白质的这样的细胞或生物体耐受特定浓度的HPPD抑制剂除草剂持续更长时间，或赋予细胞或生物体相较于不表达所述蛋白质的这样的细胞或生物体以观察到的更小的损伤或生长抑制进行光合作用、生长和/或生殖的能力。“HPPD抑制剂耐受性蛋白”包括这样的蛋白，所述蛋白质赋予细胞或生物体如下能力：相较于不表达所述蛋白质的这样的细胞或生物体耐受更高浓浓度的HPPD抑制剂除草剂，或相较于不表达所述蛋白质的这样的细胞或生物体耐受特定浓度的HPPD抑制剂除草剂持续更长的时间，或赋予细胞或生物体相较于不表达这样的蛋白的这样的细胞或生物体以观察到的更小的损伤或生长抑制进行光合作用、生长和/或生殖的能力。“耐受”或“耐受性”意欲指在特定HPPD抑制剂除草剂施用后存活，或以不易与未处理细胞或生物体辨别的方式进行必需的细胞功能诸如光合作用、蛋白质合成或呼吸和生殖的能力，相较于未用这样的除草剂处理的这样的植物，对于利用HPPD抑制剂除草剂处理的植物在产率上没有显著差异或甚至具有增加的产率(但其中杂草已通过除施用HPPD抑制剂除草剂外的机制，诸如WO2011/100302(其通过引用整体并入本文)中描述的方法得以除去或阻止)。

[0049] 除了赋予细胞HPPD抵制剂抗性以外，本发明的HPPD核酸序列还编码具有HPPD活性，即催化其中对-羟基苯丙酮酸(pHPP)被转化成尿黑酸的反应的多肽。优选地，本发明的HPPD蛋白的催化活性，当在体外测试时，与参照HPPD蛋白的所述活性相差不超过90％，不超过70％或不超过50％，当在相同条件下并且在上文中描述的HPPD抑制剂除草剂不存在的情况下测定时。在一些实施方案中，催化活性相对于参照HPPD蛋白得到增强。HPPD的催化活性可通过本领域公知的各种方法来确定。WO 2009/144079描述了各种适合的筛选法。

[0050] 显示增强的对HPPD抑制剂除草剂的耐受性的HPPD酶可体现在相对于参照HPPD显示：a)更高的对于天然底物4-羟基苯丙酮酸的Km值；b)更低的对于将4-羟基苯丙酮酸转化成尿黑酸的kcat值；c)更低的速度常数kon(控制酶:HPPD抑制剂除草剂复合物的形成)的值；d)增加的速度常数koff(控制酶:HPPD抑制剂除草剂复合物解离)的值；和/或e)作为c)和d)之一或两者的变化的结果，增大的平衡常数Ki(也称为Kd)(控制酶:HPPD抑制剂除草剂复合物的解离)的值。

[0051] HPPD蛋白的酶促活性可通过使得可能测量HPP或O2底物的量的减少，或测量从酶促反应产生的任何产物即尿黑酸或CO2的积累的任何方法来测量。具体地，HPPD活性可通过WO2009/144079；Garcia等人(1997),Biochem.J.325,761-769；Garcia等人(1999),Plant Physiol.119,1507-1516；或WO2012/021785中描述的方法来测量，所述参考资料通过引用并入本文。

[0052] 为了本发明的目的，“参照”HPPD蛋白(或HPPD基因)是将本发明的HPPD蛋白或HPPD核酸与之相比较的任何HPPD蛋白或核酸。该参照HPPD可以是天然的植物、细菌或动物HPPD，或可以本领域中已知的突变的HPPD。这样的参照HPPD可用于确定本发明的HPPD蛋白或核酸具有特定的目标性质(例如，增强的、相当的或减弱的HPPD抑制剂除草剂耐受性或HPPD酶活性；宿主细胞中增加的、相当的或减少的表达；增强的、相当的或降低的蛋白质稳定性等)。

[0053] 在本文中的各种实施方案中，耐受HPPD抑制剂除草剂的核酸(包括其分离的、重组的和嵌合的基因，包含所述核酸的载体、宿主细胞、植物、植物部分和种子，由所述核酸编码的HPPD多肽及其组合物，以及使用所述核酸增强植物对HPPD抑制剂除草剂的耐受性，特别是增强的对如下种类的HPPD抑制剂除草剂的耐受性的方法：N-(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺、N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基咪唑羧酰胺类，诸如2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺和2-氯-3-(甲氧基甲基)-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺，三酮类诸如特波三酮、磺草酮和硝磺草酮，异噁唑类诸如异噁唑草酮，或吡唑特类诸如磺酰草吡唑和苯唑草酮，具体地选自特波三酮、磺草酮、苯唑草酮、双环吡喃酮、特糠酯酮、异噁唑草酮和硝磺草酮)编码经修饰含有一个或多个氨基酸置换的HPPD蛋白，所述置换包括在对应于SEQ ID NO:1氨基酸位置188、189、215、335、336、339和/或340的位置上的2、3、4、5、6或7个氨基酸置换。“对应于”意欲指当使用本文中其它地方描述的标准比对算法对齐两个(或更多个)序列时相对于SEQ ID NO:1中的该位置的核苷酸或氨基酸位置。SEQ ID NO:1与来自各种微生物和植物物种的HPPD氨基酸序列的代表性比对示于图1中。例如，SEQ ID NO:1的氨基酸位置188、189、215、335、336、339和340分别对应于来自燕麦(SEQ ID NO:63)的HPPD的氨基酸位置241、242、271、412、413、416和
417；分别对应于来自大麦(SEQ ID NO:67)的HPPD的氨基酸位置235、236、265、406、407、410和411，以及分别对应于来自玉米(SEQ ID NO:65)的HPPD的氨基酸位置242、243、272、413、
414、417和418。因此，取决于关切的HPPD氨基酸序列的长度(相较于SEQ ID NO:1的序列具有额外或更少的残基)，对应的位置可位于与这样的相关的HPPD蛋白中的位置188,189,
215,335,336,339和340不同的位置上。

[0054] 在一个实施方案中，本发明的HPPD经修饰包含一个或多个氨基酸置换，所述氨基酸置换选自：

[0055] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸、甘氨酸或丝氨酸；

[0056] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置189的氨基酸位置上的丝氨酸、半胱氨酸或精氨酸；

[0057] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸,丝氨酸,组氨酸,丙氨酸,甘氨酸或谷氨酰胺；

[0058] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸或色氨酸；

[0059] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸,丙氨酸或丝氨酸；

[0060] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺,丙氨酸,缬氨酸或谷氨酸；和

[0061] (g)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置215的氨基酸位置上的亮氨酸。

[0062] 在另一个实施方案中，HPPD经修饰包含如下的氨基酸置换：

[0063] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0064] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；

[0065] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0066] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酸；

[0067] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的丙氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；或

[0068] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸。

[0069] 在具体的实施方案中，本发明的HPPD与在本文中显示为SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少53％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，其中所述HPPD经修饰包含如下的氨基酸置换：

[0070] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0071] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；

[0072] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置色氨酸；

[0073] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酸；

[0074] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的丙氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；或

[0075] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸。

[0076] 在另一个实施方案中，本发明的HPPD与本文中显示为SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少53％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，并且其中所述HPPD包含如下的氨基酸置换：

[0077] (a)氨基酸位置188上的色氨酸和氨基酸位置336上的色氨酸；或

[0078] (b)氨基酸位置335上的脯氨酸。

[0079] 在另一个实施方案中，本发明的HPPD与本文中显示为SEQ ID NO:63的氨基酸序列具有至少53％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，其中所述HPPD经修饰包含如下的氨基酸置换：

[0080] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0081] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；

[0082] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0083] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸；

[0084] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的丙氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；或

[0085] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸。

[0086] 在另一个实施方案中，本发明的HPPD与本文中显示为SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少53％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，其中所述HPPD经修饰包含如下的氨基酸置换：

[0087] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0088] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；

[0089] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0090] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸；

[0091] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的丙氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；或

[0092] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸。

[0093] 在另一个实施方案中，本发明的HPPD与本文中显示为SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少53％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或或至少99％的序列同一性，其中所述HPPD经修饰包含如下的氨基酸置换：

[0094] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0095] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸；

[0096] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0097] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酸；

[0098] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的丙氨酸；或

[0099] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸。

[0100] 在另一个实施方案中，本发明的HPPD与显示为SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少53％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，或由与在本文中显示为SEQ ID NO:60的核苷酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列编码。该实施方案的HPPD还可包含如下的氨基酸置换：

[0101] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0102] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；

[0103] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0104] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酸；

[0105] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的丙氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；或

[0106] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸。

[0107] 在另一个实施方案中，本发明的HPPD与显示为SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少53％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，或由与在本文中显示为SEQ ID NO:61的核苷酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列编码。该实施方案的HPPD还可包含如下的氨基酸置换：

[0108] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0109] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；

[0110] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0111] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酸；

[0112] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的丙氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；或

[0113] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸。

[0114] 在另一个实施方案中，本发明的HPPD与显示为SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少53％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，或由与在本文中显示为SEQ ID NO:62的核苷酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少
92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列编码。该实施方案的HPPD还可包含如下的氨基酸置换：

[0115] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0116] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；

[0117] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0118] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酸；

[0119] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的丙氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；或

[0120] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸。

[0121] 在另一个实施方案中，本发明的HPPD与本文中显示为SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性，其中所述HPPD经修饰包含如下的氨基酸置换：

[0122] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0123] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；

[0124] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0125] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酸；

[0126] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的丙氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；或

[0127] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸。

[0128] 在另一个实施方案中，本发明的HPPD与本文中显示为SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性，其中所述HPPD经修饰包含如下的氨基酸置换：

[0129] (a)氨基酸位置188上的色氨酸和氨基酸位置336上的色氨酸；或

[0130] (b)氨基酸位置335上的脯氨酸。

[0131] 在另一个实施方案中，本发明的HPPD与本文中显示为SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性。本实施方案的HPPD还可包含如下的氨基酸置换：

[0132] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0133] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；

[0134] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0135] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酸；

[0136] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的丙氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；或

[0137] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸。

[0138] 在另一个实施方案中，本发明的HPPD与本文中显示为SEQ ID NO:58的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性。本实施方案的HPPD还可包含如下的氨基酸置换：

[0139] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0140] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；

[0141] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0142] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酸；

[0143] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的丙氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；或

[0144] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸。

[0145] 在另一个实施方案中，本发明的HPPD与本文中显示为SEQ ID NO:59的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性。本实施方案的HPPD还可包含如下的氨基酸置换：

[0146] (a)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0147] (b)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的苏氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；

[0148] (c)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置188的氨基酸位置上的色氨酸和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；

[0149] (d)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的丝氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酸；

[0150] (e)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸，对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置336的氨基酸位置上的色氨酸；对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置339的氨基酸位置上的丙氨酸，和对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置340的氨基酸位置上的谷氨酰胺；或

[0151] (f)对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置335的氨基酸位置上的脯氨酸。

[0152] 可修饰任何HPPD序列以含有一个或多个本文中公开的置换。例如，本发明的HPPD还包括任何天然存在的细菌、植物或动物HPPD酶，所述HPPD酶经修饰含有一个或多个上述置换。

[0153] 在到达本发明的HPPD蛋白中，现有蛋白的起始氨基酸序列必须由人通过替代至少一个本申请中定义的氨基酸来进行修饰，这最方便地通过用编码另一个氨基酸的另一个密码子替代某个密码子修饰编码这样的蛋白质的DNA来实现。

[0154] 可根据本发明修饰的示例性HPPD序列包括来自假单胞菌属一个种的类型的细菌例如荧光假单胞菌或另外地集胞藻属的蓝蓝细菌的HPPD序列。序列还可以是植物来源的，特别是来源于双子叶植物、伞形花科植物或另外地单子叶植物。可被引用的有利实例是植物诸如烟草、拟南芥，胡萝卜(Daucus carotta)、玉米(Zea mays)，小麦，大麦，燕麦，宽叶臂形草，蒺藜草，瑞士黑麦草，高羊茅，大狗尾草，牛筋草，高粱，蒺藜草，高羊茅。编码序列以及分离和克隆其的方法在本领域是已知的或描述于本文中其他地方(例如，SEQ ID NO：63-76)。在本发明的具体实施方案中，可以根据本发明修改的HPPD来自细菌来源，特别是来自假单胞菌属的某一个种，更具体地从荧光假单胞菌，红球菌属的某一个种、日本赭纤虫、Kordia algicida或来自植物来源，包括来自拟南芥、高粱、稻、小麦、大麦、瑞士黑麦草或燕麦。

[0155] 为了本发明的目的，本发明的HPPD还可包含其它修饰例如，其中一些氨基酸(例如，1至10个氨基酸)为了克隆目的已被替代、添加或删除，以产生转运肽融合物等，其保持HPPD活性，即催化对-羟基苯丙酮酸至尿黑酸的转化的性质或可以是可被进一步改良的任何HPPD。例如，可通过本文中描述的修饰进一步改良的HPPD可以是在本文中显示为SEQ ID NO:2的来源于荧光假单胞菌的变体HPPD，在本文中显示为SEQ ID NO:64的来源于燕麦的变体HPPD，WO2012/021785(其通过引用整体并入本文)中的SEQ ID NO:3-326,383-389,393,395和397-459的任一个所示的变体HPPD序列；WO2011/068567(其通过引用整体并入本文)的SEQ ID NO:2-14和20-50的任一个中所示的HPPD序列；WO2010/085705(其通过引用整体并入本文)的SEQ ID NO:15-26的任一个中所示的HPPD序列；具有WO09/144079或美国专利
6,245,968(其每一个通过引用整体并入本文)中描述的一个或多个置换的HPPD；具有WO2010/085705的表1、2、5或6中描述的一个或多个置换的HPPD；和/或具有WO2011/068567的表1中描述的一个或多个置换的HPPD。

[0156] 在一些实施方案中，本发明的核苷酸序列(包括其分离的、重组的和嵌合的基因，包含所述核酸的载体、宿主细胞、植物、植物部分和种子，由所述核酸序列编码的氨基酸序列及其组合物，以及使用所述核酸序列增强植物对HPPD抑制剂除草剂的耐受性，特别是增强的对如下种类的HPPD抑制剂除草剂的耐受性的方法：N-(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺、N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基咪唑羧酰胺类，诸如2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺和2-氯-3-(甲氧基甲基)-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺，三酮类诸如特波三酮、磺草酮和硝磺草酮，异噁唑类诸如异噁唑草酮，或吡唑特类诸如磺酰草吡唑和苯唑草酮，具体地选自特波三酮、磺草酮、苯唑草酮、双环吡喃酮、特糠酯酮、异噁唑草酮和硝磺草酮)编码SEQ ID NO:3-59的任一项所示的氨基酸序列，及其编码HPPD抑制剂除草剂耐受性多肽的的片段和变体。因此，在本实施方案中，本发明的HPPD包含SEQ ID NO:3-59的任一项中所示的氨基酸序列及其片段和变体，所述氨基酸序列及其片段或变体赋予宿主细胞对HPPD抑制剂除草剂的耐受性的。

[0157] A.用于测定HPPD抑制剂耐受性的方法

[0158] 任何用于测定对HPPD抑制剂除草剂的耐受性的合适方法可用于评价本发明的HPPD序列。耐受性可通过监控细胞或生物体在特定HPPD抑制剂除草剂施用后存活的能力，或以不易与未处理细胞或生物体辨别的方式进行必需的细胞功能诸如光合作用、蛋白质合成或呼吸和生殖的能力，相较于未用这样的除草剂处理的这样的植物，对于利用HPPD抑制剂除草剂处理的植物在产率上没有显著差异或甚至具有增加的产率(但其中杂草已通过除施用HPPD抑制剂除草剂外的机制除去或防止)的能力来测量。在一些实施方案中，可根据利用包含编码各自HPPD蛋白的基因的核酸转化细胞或生物体的可见指标表型，或在不同浓度的各种HPPD抑制剂存在的情况下在HPPD蛋白的体外测定中测量耐受性。剂量反应和与这些指标表型(棕色物质的形成、生长抑制、漂白、除草剂效应等)相关的剂量反应的相对偏移方便地依据例如GR50(生长下降50％时的浓度)或MIC(最小抑制浓度)值来表示，其中在除草剂的一系列不同浓度上，值的增加以基于植物损伤、分生组织漂白症状等的正常方式对应于表达HPPD的固有耐受性的增强。这些数据可依据例如从剂量/反应曲线导出的GR50来表达，所述曲线将“剂量”标绘于x-轴上，并将"百分比杀死"、"除草效应"、"新出现绿色植物的数目"等标绘在y-轴上，其中增加的GR50值对应于升高的表达的HPPD的固有耐受性的水平。除草剂可被适当地用于出苗前或出苗后施用。

[0159] 在各种实施方案中，编码根据本发明的HPPD蛋白的核酸或基因或本发明的HPPD蛋白的耐受性水平可通过测试植物诸如烟草或作物植物诸如大豆或棉花的转基因术、再生、培育和喷雾测试来进行筛选。与通过这样的筛选获得的结果一致，这样的植物相较于不含任何编码HPPD蛋白的外源基因的这样的植物或相较于含有包含在与编码本发明的HPPD蛋白的核酸相同的启动子控制下的参照HPPD编码DNA(例如，编码拟南芥HPPD编码DNA)的基因的植物，对HPPD抑制剂(例如，如下种类的HPPD抑制剂除草剂：N-(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺、N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基咪唑羧酰胺类，诸如2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺和2-氯-3-(甲氧基甲基)-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺，三酮类诸如特波三酮、磺草酮和硝磺草酮，异噁唑酮的类诸如异噁唑草酮或吡唑特类的HPPD抑制剂除草剂诸如磺酰草吡唑和苯唑草酮，具体地选自特波三酮、磺草酮、苯唑草酮、双环吡喃酮、特糠酯酮、异噁唑草酮和硝磺草酮)更具耐受性，期望地耐受至少2倍的推荐用于田间施用的正常剂量，更优选地耐受高至4倍的推荐用于田间施用的正常剂量。因此，术语“能够增强植物对至少一种作用于HPPD的除草剂的耐受性”表示由表达本发明的HPPD的植物具有的耐受性相较于仅表达其内源HPPD的植物，或表达参照HPPD酶的植物达到至少2倍或3倍或4倍或更多倍的HPPD抑制剂除草剂的正常田间剂量。在这一点上，术语“作用于HPPD的除草剂”不限于称为除草剂和/或用作除草剂的物质，而限于抑制HPPD蛋白的催化活性的任何物质。

[0160] 或者，在定量水平上，可获得本发明的HPPD蛋白的数据如pI50(pI50值意指抑制50％的酶活性所必需的以摩尔浓度表示的抑制剂的浓度的对数值)，将该数据与在任何各自的HPPD抑制剂除草剂存在或不存在的情况下的参照HPPD序列相比较。

[0161] 可用于评价本发明的HPPD序列的特定(尽管非限定性地)类型的测定是比色测定法。在该测定中，将含有1％琼脂糖、5mM L-酪氨酸和42mM琥珀酸盐的YT肉汤型培养基(其含有针对载体pSE420(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)或pSE420的改良形式(pSE420(RI)NX)的选择剂)倾倒入深孔板。将处于指数生长期的含有载体pSE420-HPPDx(HPPDx意指编码假定的HPPD酶/蛋白的任何基因)的大肠杆菌(E.coli)培养物施加至每一个孔。在37℃进行16小时后，不含培养基的孔、已用含空载体pSE420的大肠杆菌培养物接种的那些孔或已用含载体pSE420-HPPDx(含有编码失活HPPD的基因)的大肠杆菌培养物接种的那些孔是透明的，然而用含有编码活性HPPD的载体pSE420-HPPDx的大肠杆菌培养物接种的细胞是棕色的。先前已表明该测试反映HPPD活性(无论该活性的来源是什么)，并且允许鉴定(即在定性水平上)HPPD活性(US 6,768,044)。

[0162] B.将突变引入HPPD序列的方法

[0163] 在由本发明的核酸编码的突变的HPPD蛋白中，至少一个氨基酸已如上定义地被替代。

[0164] 可通过任何方法在编码如上定义的参照HPPD的核酸序列中实现替代，所述方法适合用于利用对应于将替代待替代的氨基酸的氨基酸的密码子替代所述序列中编码所述待替代的氨基酸的密码子，所述密码子广泛地描述于文献中，并且对于本领域普通技术人员来说是公知的。

[0165] 几个分子生物学方法可用于实现该替代。用于制备根据本发明的突变的核酸序列和对应的蛋白质的有用方法包括对编码一个或多个预先选择的氨基酸的密码子进行定点诱变。用于获得这些定点突变的方法对于本领域普通技术人员是公知的，并且广泛地描述于文献(特别是：Directed Mutagenesis:A Practical Approach,1991，由M.J.McPHERSON,IRL PRESS编辑的)中或为对于其可能使用商业试剂盒(例如来自Qiagen的QUIKCHANGETM lightening mutagenesis试剂盒)的方法。在定点诱变后，有用地通过使用适当的筛选辅助性技术选择含有对HPPD抑制剂不太敏感的突变的HPPD。实现该筛选的适当的筛选方法已在上文中进行了描述。

[0166] 或者，可在芯片上修饰编码参照HPPD的DNA序列以编码具有本文中描述的一个或多个置换的HPPD蛋白，随后从头合成。可将编码突变的HPPD蛋白的核苷酸序列引入本文中其它地方描述的宿主细胞。

[0167] A.分离的多核苷酸及其变体和片段

[0168] 在一些实施方案中，本发明包含分离的或重组的多核苷酸。“分离的”或“重组的”多核苷酸或多肽/蛋白质或其生物活性部分，如本文中所定义，不再存在于其原始天然的生物体中，诸如当包含于异源宿主细胞或转基因植物细胞、种子或植物中时。在一个实施方案中，“分离的”多核苷酸不含所述多核苷酸所源自的生物体的基因组DNA中天然地侧翼连接所述核酸(即，位于所述核酸的5′和3′末端的序列)的序列(例如，蛋白质编码或调控序列)。术语“重组体”包括已针对天然多核苷酸或多肽进行了操作，以便所述多核苷酸或多肽与天然存在的多核苷酸或多肽不同(例如，在化学组成或结构上)的多核苷酸或多肽。在另一个实施方案中，“分离的”或“重组的”多核苷酸不含天然地存在于所述多核苷酸所源自的生物体的基因组DNA中的内部序列(即内含子)。这样的多核苷酸的典型实例是所谓的互补DNA(cDNA)。例如，在各种实施方案中，分离的HPPD抑制剂除草剂耐受性-编码多核苷酸可包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然地侧翼连接所述多核苷酸所源自的细胞的基因组DNA中的多核苷酸。本发明的核酸分子包括编码本发明的HPPD的那些核酸分子，包括例如SEQ ID NO:60-62的任一项中所示的核苷酸序列。

[0169] 本发明还包括编码SEQ ID NO:3-59的任一项中所示的氨基酸序列的任何核酸序列的变体和片段。多核苷酸的“片段”可编码多肽的生物活性部分或其可以是可用作使用本文中其它地方公开的方法的杂交探针或PCR引物。作为多核苷酸的片段的多核苷酸，取决于所需用途(例如，本文中描述的HPPD核酸)，包含至少约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150个连续的核苷酸或高达存在于本文中公开的全长多核苷酸中的核苷酸的数目。“连续的”核苷酸意欲指彼此紧密相邻的核苷酸残基。

[0170] 本发明的多核苷酸的片段通常编码保持全长HPPD抑制剂除草剂耐受性蛋白的生物活性，即除草剂耐受性活性。“保持除草剂耐受性活性”意欲指所述片段具有至少约30％、至少约50％、至少约70％、至少约80％、85％、90％、95％、100％、110％、125％、150％、175％、200％、250％、至少约300％或更大的本文中公开为SEQ ID NO:2的全长HPPD抑制剂除草剂耐受性蛋白的除草剂耐受性活性。用于测量除草剂耐受性活性的方法在本领域中是公知的，并且本文中描述了示例性方法。在非限定性实例中，本发明的片段耐受相同剂量的HPPD抑制剂除草剂或耐受2倍、3倍、4倍或更高剂量的HPPD抑制剂除草剂，或所述片段基于片段与SEQ ID NO:2之间的pI50或Ki具有同样的耐受性或更高的耐受性。

[0171] 编码本发明的多肽的生物活性部分的片段或多核苷酸可编码至少约150,175,200,250,300,350个连续的氨基酸或高达本发明的全长多肽中存在的总的氨基酸数目。在非限定性实施方案中，编码本发明的生物活性部分的多核苷酸的片段包含SEQ ID NO:2的氨基酸位置188,189,215,335,336,339和340中的一个或多个位置。

[0172] 本发明还包括上述变异的多核苷酸。多核苷酸的“变体”还包括编码本发明的HPPD但因遗传密码的简并性而保守地相异的那些序列，以及充分同一的那些序列。本发明的变体可保持HPPD酶活性和HPPD除草剂类抑制剂耐受性。术语“充分同一的”意欲指与参照序列相比具有至少约60％或65％的序列同一性，约70％或75％的序列同一性，约80％或85％的序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(通过使用标准参数，使用比对程序之一获得的)的多肽或多核苷酸序列。本领域普通技术人员将理解，可适当地调整这些值以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框架定位等来测定由两个多核苷酸编码的多肽的对应同一性。

[0173] 细菌基因经常具有多个与开放阅读框架的起始点相邻的甲硫氨酸起始密码子。通常地，在这些起始密码子的一个或多个上的翻译起始将导致功能性蛋白的产生。这些密码子可包括ATG密码子。然而，细菌诸如芽孢杆菌属的某一个种(Bacillus sp.)也将密码子GTG识别为起始密码子，在GTG密码子上起始翻译的蛋白质在第一氨基酸上含有甲硫氨酸。此外，通常不先验地确定这些密码子中哪一个天然地用于细菌中。因此，应理解，替代甲硫氨酸密码子之一的使用可导致赋予除草剂耐受性的变体的产生。这些除草剂耐受性蛋白包括在本发明中，并且可用于本发明的方法。天然存在的等位基因变体可通过使用公知的分子生物学技术，诸如下文中概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术来鉴定。变异的多核苷酸还包括合成产生的多核苷酸，所述多核苷酸已例如通过使用定点诱变或其它诱变策略产生，但仍然编码具有所需生物活性的多肽。

[0174] 本领域普通技术人员将进一步理解，可通过本发明的多核苷酸的进一步突变来引入变化，从而导致编码的多肽的氨基酸序列的进一步变化，而不改变多核苷酸的生物活性。因此，变异的分离的多核苷酸可通过向编码本发明的HPPD的对应多核苷酸中引入一个或多个额外的核苷酸置换、添中或缺失(以便1-5、1-10或1-15个氨基酸置换、添加或缺失，或1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸置换、添加或缺失被引入编码的多肽)来产生。可通过标准技术诸如定点诱变和PCR介导的诱变或基因改组技术来引入。这样的变异的多核苷酸也包括在本发明中。

[0175] 变异的多核苷酸可通过沿编码序列的全部或部分随机引入突变(诸如通过饱和诱变或置换诱变(permutational mutagenesis)来产生，可就赋予除草剂耐受性活性的能力筛选所得的突变体以鉴定保持活性的突变体。

[0176] 用于产生变体的另外方法包括将表达本文中公开的蛋白质(或其文库)的细胞轻历对蛋白质的活性产生胁迫的特定条件。特定条件可包括(但不限于)温度的变化、pH的变化以及底物或抑制剂浓度的变化。可在蛋白质表达(例如，在在大肠杆菌(E.coli)或其它宿主中)的时间过程中或在蛋白质提取物产生后或在蛋白质纯化后将所述蛋白质经历这些条件。

[0177] 随后可将已经历应激条件的蛋白质文库的功能或酶促活性与参照蛋白比较，以鉴定具有改善的性质的蛋白质。可将该活性比较作为生长筛选的部分或可选择地作为定量蛋白质的活性的酶促测定的部分来进行。可被鉴定为被改善的性质可包括HPPD抑制剂除草剂耐受性、动力学常数的变化(包括Km、Ki、Vmax)、蛋白质稳定性、蛋白质热稳定性或蛋白质最适温度。

[0178] C.分离的蛋白质及其变化和片段

[0179] 除草剂耐受性多肽也包括在本发明内。除草剂耐受性多肽包括具有低于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的非除草剂耐受性多肽(在本文中也称为“污染性蛋白”)的多肽的制剂。在本发明中，“除草剂耐受性蛋白”意欲指本文中公开的HPPD多肽。本文中还提供了生物活性部分及其变体，其可用于实施本发明的方法。

[0180] “片段”或“生物活性部分”包括包含编码除草剂耐受性蛋白的氨基酸序列的部分并且保持除草剂耐受性活性的多肽片段。除草剂耐受性蛋白的生物活性部分可以是在长度上为例如10,25,50,100或更多个氨基酸的多肽。此类生物活性部分可通过重组技术来制备，并评价其除草剂耐受性活性。

[0181] “变体”意欲指具有与SEQ ID NO:3-59的任一项具有至少约60％、65％、约70％、75％、约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列的蛋白质或多肽，其中所述变体具有HPPD酶活性和HPPD抑制剂除草剂耐受性。
本领域普通技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框架定位等，可将这些值进行适当地调整来测定由两个多核苷酸编码的多肽的对应同一性。

[0182] 例如，可在一个或多个非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸置换。“非必需”氨基酸残基是可从多肽的参照序列改变而不改变生物活性的残基，然而“必需”氨基酸残基是生物活性所需要的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷冬氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可在保持功能的保守区域中进行氨基酸置换。一般而言，不会对保守氨基酸残基或对保守基序中的氨基酸残基(其中这样的残基是多肽活性所必需的)进行这样的置换。然而，本领域普通技术人员将理解，功能性变体可在具有少量保守残基的保守或非保守改变。

[0183] 还包括了针对本发明的HPPD的抗体或其变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法在本领域是公知的(参见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY；美国专利No.4,196,265)。

[0184] 因此，本发明的一个方面涉及特异性结合本发明的一种或多种蛋白质或肽分子及其同源物、融合物或片段的抗体、单链抗原结合分子或其它蛋白质。在特别优选实施方案中，所述抗体特异性结合具有SEQ ID NO:3-59中所示的氨基酸序列或其片段的蛋白质。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合包含选自SEQ ID NO:3-59中所示的氨基酸序列的氨基酸序列或其片段的融合蛋白。

[0185] 本发明的抗体可用于定量或定性地检测本发明的蛋白质或肽分子或检测蛋白质的翻译后修饰。如本文中所用，如果这样的结合不因非相关分子的存在而被竞争性抑制，则抗体或肽被认为是"特异性结合"本发明的蛋白质或肽分子的。

[0186] D.基因叠加

[0187] 在作物的商业生产中，期望在可靠的杀虫管理下从作物植物的田中消除不想要的植物(即，"杂草")。理想的处理是可用于整个田间但仅消除不想要的植物同时使作物植物不受影响的处理。一个这样的处理系统可包括对除草剂耐受的作物的使用，以便当对耐受除草剂的作物植物的田间喷施除草剂时，所述作物可以继续旺盛生长而非除草剂耐受性杂草被杀死或严重破坏。理想地，这样的处理系统可利用不同的除草剂性质，以便杂草控制可提供最佳可能的灵活性与经济性的组合。例如，个别除草剂在田间具有不同的寿命，并且一些除草剂在它们施用于田间后保持相对长的时间并且继续有效，然而其它除草剂很快分解成其它化合物和/或非活性化合物。理想的处理系统可允许使用不同的除草剂，以便种植者可针对特定情况定制除草剂的选择。

[0188] 虽然许多耐受除草剂的作物植物目前是商购可得的，但对于许多商业除草剂和除草剂/作物组合已产生的问题是单一除草剂通常具有不完全的抗常见杂草种类的活性谱。对于大多数已使用了一段时间的单一除草剂，抗除草剂杂草种类和生物型的群体已变得更加普遍(参见，例如，Tranel和Wright(2002)Weed Science 50:700-712；Owen和Zelaya(2005)Pest Manag.Sci.61:301-311)。已描述了抗超过一种除草剂的转基因植物(参见，例如，W02005/012515)。然而，作物生产的每一个方面的改善、杂草控制选择、残留杂草控制的扩展以及作物产率的提高是一直需要的。

[0189] 有利地将本发明的HPPD蛋白或核苷酸序列与具有其它基因的植物组合，所述其它基因编码赋予这样的植物有用的农艺学性状的蛋白质或RNA。在编码赋予转化的植物有用的农艺学性状的蛋白质或RNA的基因之间，可提及编码赋予对两种或更多种除草剂(所述除草剂根据它们的化学结构，与HPPD抑制剂除草剂不同)的耐受性的蛋白质，和赋予对某些昆虫的耐受性的其它蛋白，赋予对某些疾病的耐受性的那些蛋白的DNA序列，编码提供线虫或昆虫控制的RNA的DNA等。

[0190] 这类基因具体地描述于公开的PCT专利申请WO 91/02071和WO95/06128中以及美国专利7,923,602和美国专利申请公开No.20100166723中，所述专利和专利申请的每一个通过引用整体并入本文。

[0191] 在编码赋予转化的植物细胞和植物对某些除草剂的耐受性的蛋白的DNA序列之间，可提及WO2009/152359中描述的bar或PAT基因或天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)基因(所述基因赋予对草铵膦除草剂的耐受性)、编码赋予对以EPSPS为靶的除草剂诸如草甘膦及其盐的耐受性的适当的EPSPS的基因(US 4,535,060、US 4,769,061、US 5,094,945、US 4,940,835、US 5,188,642、US 4,971,908、US 5,145,783、US 5,310,667、US 
5,312,910、US 5,627,061、US 5,633,435)、编码草甘膦-n-乙酰基转移酶的基因(例如，US 
8,222,489、US 8,088,972、US 8,044,261、US 8,021,857、US 8,008,547、US 7,999,152、US 
7,998,703、US 7,863,503、US 7,714,188、US 7,709,702、US 7,666,644、US 7,666,643、US 
7,531,339、US 7,527,955和US 7,405,074)或编码草甘膦氧化还原酶的基因(例如，US 5,
463,175)。

[0192] 在编码赋予对以EPSPS为靶的除草剂的耐受性的适当的EPSPS的DNA序列之间，可更特别地提及编码植物EPSPS，特别是玉米EPSPS，特别地包含两个突变(特别地氨基酸位置102上的突变和氨基酸位置106上的突变(WO 2004/074443))的玉米EPSPS(其描述于专利申请US 6566587中，在下文中命名为双突变玉米EPSPS或2mEPSPS)的基因，或编码从农杆菌属(Agrobacterium)分离的并通过专利5,633,435的序列ID No.2和序列ID No.3描述的EPSPS(也称为CP4)的基因。

[0193] 在编码赋予对以EPSP为靶的除草剂的耐受性的适当的EPSPS的DNA序列之间，将更特别地提及编码来自球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)EPSPS GRG23，还有突变体GRG23ACE1、GRG23ACE2或GRG23ACE3，特别地、WO2008/100353中描述的GRG23的突变体或变体，诸如WO2008/100353中的SEQ ID No.29的GRG23(ace3)R173K的基因。

[0194] 在编码EPSPS，特别地编码上述基因的DNA序列的情况下，编码这些酶的序列有利地置于编码转运肽，特别地美国专利5,510,471或5,633,448中描述的“最优化的转运肽”的序列之后。

[0195] 可与本发明的核酸序列组合的示例性除草剂耐受性性状还包括至少一种ALS(乙酰乳酸合酶)抑制剂(WO 2007/024782)；突变的拟南芥ALS/AHAS基因(美国专利6,855,533)；编码通过代谢赋予对2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)的耐受性的2,4-D-单加氧酶的基因(美国专利6,153,401)；和，编码通过代谢赋予对麦草畏(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)的耐受性的麦草畏单加氧酶的基因(US 2008/0119361和US 2008/0120739)。

[0196] 在各种实施方案中，将本发明的HPPD与一个或多个耐受除草剂的基因(包括一个或多个另外的HPPD抑制剂除草剂耐受性基因)和/或一个或多个耐受草甘膦和/或草铵膦的基因叠加。在一个实施方案中，将本发明的HPPD与2mEPSPS和bar组合。

[0197] 在编码关于对昆虫的耐受性的性质的蛋白质的DNA序列之间，更特别地提及在文献中广泛描述的和本领域技术人员公知的Bt蛋白。还提及了从细菌例如发光杆菌(Photorhabdus)提取的蛋白(WO 97/17432和WO 98/08932)。

[0198] 在编码赋予对昆虫的耐受性的新型性质的目标蛋白的这样的DNA序列之间，更特别地提及在文献中广泛描述的和本领域普通技术人员公知的Bt Cry或VIP蛋白。这些蛋白包括Cry1F蛋白或来源于Cry1F蛋白的杂交蛋白(例如，US 6,326,169；US 6,281,016；US 6,218,188中描述的杂交Cry1A-Cry1F蛋白或其毒性片段)、Cry1A型蛋白或其毒性片段，优选Cry1Ac蛋白或来源于Cry1Ac蛋白的杂交蛋白(例如，US 5,880,275中描述的杂交Cry1Ab-Cry1Ac蛋白)，或EP451878中描述的Cry1Ab或Bt2蛋白或其杀昆虫片段，WO02/057664中描述的Cry2Ae、Cry2Af或Cry2Ag蛋白或其毒性片段，WO 2007/140256中描述的Cry1A.105蛋白(SEQ ID No.7)或其毒性片段，NCBI登录号ABG20428的VIP3Aa19蛋白，NCBI登录号ABG20429的VIP3Aa20蛋白(WO 2007/142840中的SEQ ID No.2)，COT202或COT203棉花事件中产生的VIP3A蛋白(分别地WO 2005/054479和WO 2005/054480)，WO01/47952中描述的Cry蛋白，Estruch等人(1996),Proc Natl Acad Sci U S A.28；93(11):5389-94和US 6,291,156中描述的VIP3Aa蛋白或其毒性片段，来自致病杆菌(Xenorhabdus)(如WO98/50427中描述的)，沙雷菌属(Serratia)(特别地来自嗜虫沙雷菌(S.entomophila))或发光杆菌种类菌株的杀昆虫蛋白，诸如来自WO98/08932(例如，Waterfield等人,2001,Appl Environ 
Microbiol.67(11):5017-24；Ffrench-Constant和Bowen,2000,Cell Mol Life Sci.；57(5):828-33)中描述的发光杆菌的Tc-蛋白。本文中还包括在一些(1-10，优选1-5个)氨基酸上与上述序列的任一序列，尤其是它们的毒性片段的序列或融合于转运肽(诸如质体转运肽)或另一蛋白质或肽的片段的序列不同的这些蛋白质的任一种的任何变体或突变体。

[0199] 在各种实施方案中，可将本发明的HPPD序列在植物中与一个或多个基因组合，所述基因赋予所需性状，诸如除草剂耐受性、昆虫耐受性、干旱耐受性、线虫控制、水使用效率、氮使用效率、增加的营养值、疾病抗性、改善的光合作用、提高的纤维质量、应激耐受性、改善的生值等。

[0200] 可与本发明的基因在相同物种的植物中组合(例如，通过杂交或通过用本发明的嵌合基因再转化含有另一个转基因事件的植物)的特别有用的转基因事件包括事件531/PV-GHBK04(棉花，昆虫控制，WO2002/040677中描述的)、事件1143-14A(棉花，昆虫控制，未保藏的，WO 06/128569中描述的)；事件1143-51B(棉花，昆虫控制，未保藏的，WO 06/128570中描述的)；事件1445(棉花，除草剂耐受性，未保藏的，US-A 2002-120964或WO 02/034946中描述的)、事件17053(水稻，除草剂耐受性，保藏为PTA-9843，WO 10/117737中描述的)；事件17314(水稻，除草剂耐受性，保藏为PTA-9844，WO 10/117735中描述的)；事件281-24-236(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-6233，WO 05/103266或US-A 2005-216969中描述的)；事件3006-210-23(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-6233，US-A 2007-143876或WO 05/103266中描述的)；事件3272(玉米，质量性状，保藏为PTA-9972，WO 06/
098952或US-A 2006-230473中描述的)；事件33391(小麦，除草剂耐受性，保藏为PTA-2347，WO2002/027004中描述的)、事件40416(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-
11508，WO 11/075593中描述的)；事件43A47(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-11509，WO 11/075595中描述的)；事件5307(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-9561，WO 
10/077816中描述的)；事件ASR-368(剪股颖，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-4816，US-A 
2006-162007或WO 04/053062中描述的)；事件B16(玉米，除草剂耐受性，未保藏的，US-A 
2003-126634中描述的)；事件BPS-CV127-9(大豆，除草剂耐受性，保藏为NCIMB No.41603，WO 10/080829中描述的)；事件BLR1(油菜，雄性不育的恢复，保藏为NCIMB 41193，WO2005/
074671中描述的)、事件CE43-67B(棉花，昆虫控制，保藏为DSM ACC2724，US-A 2009-217423或WO 06/128573中描述的)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，未保藏的，US-A 2010-0024077中描述的)；事件CE44-69D(棉花，昆虫控制，未保藏的，WO 06/128571中描述的)；事件CE46-
02A(棉花，昆虫控制，未保藏的，WO 06/128572中描述的)；事件COT102(棉花，昆虫控制，未保藏的，US-A 2006-130175或WO 04/039986中描述的)；事件COT202(棉花，昆虫控制，未保藏的，US-A 2007-067868或WO 05/054479中描述的)；事件COT203(棉花，昆虫控制，未保藏的，WO 05/054480中描述的)；事件DAS21606-3/1606(大豆，除草剂耐受性，保藏为PTA-
11028，WO2012/033794中描述的)、事件DAS40278(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-
10244，WO 11/022469中描述的)；事件DAS-44406-6/pDAB8264.44.06.1(大豆，除草剂耐受性，保藏为PTA-11336，WO2012/075426中描述的)、事件DAS-14536-7/pDAB8291.45.36.2(大豆，除草剂耐受性，保藏为PTA-11335，WO2012/075429中描述的)、事件DAS-59122-7(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA 11384，US-A 2006-070139中描述的)；事件DAS-
59132(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，未保藏的，WO 09/100188中描述的)；事件DAS68416(大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-10442，WO 11/066384或WO 11/066360中描述的)；
事件DP-098140-6(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8296，US-A 2009-137395或WO 
08/112019中描述的)；事件DP-305423-1(大豆，质量性状，未保藏的，US-A 2008-312082或WO 08/054747中描述的)；事件DP-32138-1(玉米，杂交系统，保藏为ATCC PTA-9158，US-A 
2009-0210970或WO 09/103049中描述的)；事件DP-356043-5(大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8287，US-A 2010-0184079或WO 08/002872中描述的)；事件EE-1(brinjal,昆虫控制，未保藏的，WO 07/091277中描述的)；事件FI117(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC 
209031，US-A 2006-059581或WO 98/044140中描述的)；事件FG72(大豆，除草剂耐受性，保藏为PTA-11041，WO2011/063413中描述的)、事件GA21(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC 
209033，US-A 2005-086719或WO 98/044140中描述的)；事件GG25(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC 209032，US-A 2005-188434或WO 98/044140中描述的)；事件GHB119(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8398，WO 08/151780中描述的)；事件GHB614(棉花，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-6878，US-A 2010-050282或WO 07/017186中描述的)；事件GJ11(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC 209030，US-A 2005-188434或WO 98/044140中描述的)；事件GM RZ13(甜菜，病毒抗性，保藏为NCIMB-41601，WO 10/076212中描述的)；事件H7-
1(甜菜，除草剂耐受性，保藏为NCIMB 41158或NCIMB 41159，US-A 2004-172669或WO 04/
074492中描述的)；事件JOPLIN1(小麦，疾病耐受性，未保藏的，US-A 2008-064032中描述的)；事件LL27(大豆，除草剂耐受性，保藏为NCIMB41658，WO 06/108674或US-A 2008-
320616中描述的)；事件LL55(大豆，除草剂耐受性，保藏为NCIMB 41660，WO 06/108675或US-A 2008-196127中描述的)；事件LL棉花25(棉花，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-3343，WO 03/013224或US-A 2003-097687中描述的)；事件LLRICE06(水稻，除草剂耐受性，保藏为ATCC 203353，US 6,468,747或WO 00/026345中描述的)；事件LLRice62(水稻，除草剂耐受性，保藏为ATCC 203352，WO2000/026345中描述的)、事件LLRICE601(水稻，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-2600，US-A 2008-2289060或WO 00/026356中描述的)；事件LY038(玉米，质量性状，保藏为ATCC PTA-5623，US-A 2007-028322或WO 05/061720中描述的)；事件MIR162(玉米，昆虫控制，保藏为PTA-8166，US-A 2009-300784或WO 07/142840中描述的)；
事件MIR604(玉米，昆虫控制，未保藏的，US-A 2008-167456或WO 05/103301中描述的)；事件MON15985(棉花，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-2516，US-A 2004-250317或WO 02/100163中描述的)；事件MON810(玉米，昆虫控制，未保藏的，中描述的US-A 2002-102582)；事件MON863(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-2605，WO 04/011601或US-A 2006-095986中描述的)；事件MON87427(玉米，授粉控制，保藏为ATCC PTA-7899，WO 11/062904中描述的)；事件MON87460(玉米，胁迫耐受性，保藏为ATCC PTA-8910，WO 09/111263或US-A 2011-0138504中描述的)；事件MON87701(大豆，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-8194，US-A 2009-130071或WO 
09/064652中描述的)；事件MON87705(大豆，质量性状-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-
9241，US-A 2010-0080887或WO 10/037016中描述的)；事件MON87708(大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-9670，WO 11/034704中描述的)；事件MON87712(大豆，产率，保藏为PTA-
10296，WO2012/051199中描述的)、事件MON87754(大豆，质量性状，保藏为ATCC PTA-9385，WO 10/024976中描述的)；事件MON87769(大豆，质量性状，保藏为ATCC PTA-8911，US-A 
2011-0067141或WO 09/102873中描述的)；事件MON88017(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-5582，US-A 2008-028482或WO 05/059103中描述的)；事件MON88913(棉花，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-4854，WO 04/072235或US-A 2006-059590中描述的)；
事件MON88302(油菜，除草剂耐受性，保藏为PTA-10955，WO2011/153186中描述的)、事件MON88701(棉花，除草剂耐受性，保藏为PTA-11754，WO2012/134808中描述的)、事件MON89034(玉米，昆虫控制，保藏为ATCC PTA-7455，WO 07/140256或US-A 2008-260932中描述的)；事件MON89788(大豆，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-6708，US-A 2006-282915或WO 
06/130436中描述的)；事件MS11(油菜，授粉控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-850或PTA-2485，WO 01/031042中描述的)；事件MS8(油菜，授粉控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-730，WO 01/041558或US-A 2003-188347中描述的)；事件NK603(玉米，除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-2478，US-A 2007-292854中描述的)；事件PE-7(水稻，昆虫控制，未保藏的，WO 08/114282中描述的)；事件RF3(油菜，授粉控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-
730，WO 01/041558或US-A 2003-188347中描述的)；事件RT73(油菜，除草剂耐受性，未保藏的，中描述的WO 02/036831或US-A 2008-070260)；事件SYHT0H2/SYN-000H2-5(大豆，除草剂耐受性，保藏为PTA-11226，中描述的WO2012/082548)、事件T227-1(甜菜，除草剂耐受性，未保藏的，WO 02/44407或US-A 2009-265817中描述的)；事件T25(玉米，除草剂耐受性，未保藏的，US-A 2001-029014或WO 01/051654中描述的)；事件T304-40(棉花，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-8171，US-A 2010-077501或WO 08/122406中描述的)；事件T342-142(棉花，昆虫控制，未保藏的，WO 06/128568中描述的)；事件TC1507(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，未保藏的，如US-A 2005-039226或WO 04/099447中描述的)；事件VIP1034(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为ATCC PTA-3925.，如WO 03/052073中描述的)、事件32316(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-11507，如WO 11/084632中描述的)、事件4114(玉米，昆虫控制-除草剂耐受性，保藏为PTA-11506，如WO 11/084621中描述的)、事件EE-GM3/FG72(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号N°PTA-11041、WO2011/063413A2)、事件DAS-68416-4(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号N°PTA-10442，WO2011/066360A1)、事件DAS-68416-4(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号N°PTA-10442，WO2011/066384A1)、事件DP-
040416-8(玉米，昆虫控制，ATCC登录号N°PTA-11508，WO2011/075593A1)、事件DP-043A47-3(玉米，昆虫控制，ATCC登录号N°PTA-11509，WO2011/075595A1)、事件DP-004114-3(玉米，昆虫控制，ATCC登录号N°PTA-11506，WO2011/084621A1)、事件DP-032316-8(玉米，昆虫控制，ATCC登录号N°PTA-11507，WO2011/084632A1)、事件MON-88302-9(油菜，除草剂耐受性，ATCC登录号N°PTA-10955，WO2011/153186A1)、事件DAS-21606-3(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号No.PTA-11028，WO2012/033794A2)、事件MON-87712-4(大豆，质量性状，ATCC登录号N°.PTA-10296，WO2012/051199A2)、事件DAS-44406-6(大豆，叠加的除草剂耐受性，ATCC登录号N°.PTA-11336，WO2012/075426A1)、事件DAS-14536-7(大豆，叠加的除草剂耐受性，ATCC登录号N°.PTA-11335，WO2012/075429A1)、事件SYN-000H2-5(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号N°.PTA-11226，WO2012/082548A2)、事件DP-061061-7(油菜，除草剂耐受性，无保藏号可用，WO2012071039A1)、事件DP-073496-4(油菜，除草剂耐受性，无保藏号可用，US2012131692)、事件8264.44.06.1(大豆，叠加的除草剂耐受性,登录号N°PTA-11336，WO2012075426A2)、事件8291.45.36.2(大豆，叠加的除草剂耐受性，登录号N°.PTA-11335，WO2012075429A2)、事件SYHT0H2(大豆，ATCC登录号N°.PTA-11226，WO2012/082548A2)、事件MON88701(棉花，ATCC登录号N°PTA-11754，WO2012/134808A1)、事件KK179-2(alfalfa，ATCC登录号N°PTA-11833，WO2013003558A1)、事件pDAB8264.42.32.1(大豆，叠加的除草剂耐受性，ATCC登录号N°PTA-11993，WO2013010094A1)、事件MZDT09Y(玉米，ATCC登录号N°PTA-
13025，WO2013012775A1)。

[0201] E.多核苷酸构建体

[0202] 可修饰编码本发明的HPPD多肽的多核苷酸以获得或增强植物细胞中的表达。可在用于在目标植物中表达的表达盒中提供编码本文中鉴定的多肽的多核苷酸。“植物表达盒”包括能够导致多核苷酸在植物细胞中表达的DNA构建体，包括重组DNA构建体。表达盒可以以5′-3′的转录方向包括有效地连接于一个或多个目标多核苷酸的转录起始区(即，启动子，特别地异源启动子)，和/或在植物中具有功能的翻译和转录终止区(即，终止区)。表达盒可额外地包含至少一个待引入生物体的附加多核苷酸，诸如可选择标记基因。或者，可在多个表达盒上提供所述附加多核苷酸。提供了这样的表达盒，其具有多个用于将多核苷酸插入在调控区的转录调控之下的限制位点。

[0203] 在其它实施方案中，本发明涉及嵌合基因，其包含含有有效地连接于植物可表达启动子的本发明的异源核酸的编码序列和任选地转录终止和多腺苷酸化区域。“异源的”通常是指对于细胞不是内源的或对于其存在于其中的天然基因组中的位置不是内源的并且已通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微注射等添加至细胞的多核苷酸或多肽。“有效连接的”意欲指两个多核苷酸之间的功能性连接。例如，当启动子任选地连接于DNA序列时，启动子序列起始并介导DNA序列的转录。应承认，有效连接的多核苷酸可以是或可以不是连续的并且，当用于指两个多肽编码区的联接时，所述多肽在相同的阅读框架内表达。

[0204] 启动子可以是在选择的植物细胞、植物部分或植物中显示转录活性的任何多核苷酸序列。启动子对于植物宿主和/或本发明的DNA序列可以是天然的或类似的或外源的或异源的。当启动子对于植物宿主是是“天然的”或“类似的”的时候，意指所述启动子是在向其中引入所述启动子的天然植物中发现的。当启动子对于本发明的DNA序列是“外来的”或“异源的”的时候，意指所述启动子对于有效连接的本发明的DNA序列不是天然的或天然地存在的启动子。启动子可以是诱导型的或组成型的。其可以是天然存在的，可由不同的天然存在的启动子的部分组成或可以是部分或完全合成的。通过启动子结构的研究，诸如Harley和Reynolds(1987)Nucleic Acids Res.15:2343-2361的研究，提供了关于启动子的设计的指导方针。同样地，可最优化启动子相对于转录起始的位置。参见，例如，Roberts等人(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:760-764。许多用于植物的合适的启动子在本领域中是公知的。

[0205] 例如，用于植物的合适的组成型启动子包括：来自植物病毒的启动子，诸如花生褪绿条死病花椰菜花叶病毒(PClSV)启动子(美国专利No.5,850,019)；来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(Odell等人(1985)Nature 313:810-812)；小球藻病毒甲基转移酶基因的启动子(美国专利No.5,563,328)和来自玄参花叶病毒的全长转录物启动子(FMV)(美国专利No.5,378,619)；来自如下蛋白的这样的基因的启动：水稻肌动蛋白子(McElroy等人(1990)Plant Cell 2:163-171和美国专利5,641,876)；遍在蛋白(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten 等人(1984)EMBO J.3:2723-2730和美国专利5,510,474)；玉米H3组蛋白(Lepetit等人(1992)
Mol.Gen.Genet.231:276-285和Atanassova等人(1992)Plant J.2(3):291-300)；欧洲油菜ALS3(PCT申请WO 97/41228)；植物核酮糖-二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亚单位基因；环状病毒(AU 689311)或木薯脉花叶病毒(CsVMV,US 7,053,205)；和各种农杆菌基因的启动子(参见美国专利No.4,771,002；5,102,796；5,182,200和5,428,147)。

[0206] 用于植物的合适的诱导型启动子包括：来自响应铜的ACE1系统的启动子(Mett等人(1993)PNAS 90:4567-4571)；响应苯磺酰胺除草剂安全剂的玉米In2基因的启动子(Hershey等人(1991)Mol.Gen.Genetics  227:229-237和Gatz等人(1994)Mol.Gen.Genetics 243:32-38)；和来自Tn10的Tet阻遏物的启动子(Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237)。用于植物的另一诱导型启动子是响应植物通常不响应的诱导剂的启动子。该类型的示例性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性由糖皮质类固醇激素诱导(Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:
10421)或用于由雌二醇激活的基于雌激素受体的诱导型植物表达系统的嵌合转录激活物XVE的最近应用(Zuo等人(2000)Plant J.,24:265-273)。用于植物的其它诱导型启动子描述于EP 332104、PCT WO 93/21334和PCT WO 97/06269(其通过引用整体并入本文)中。还可使用由其它启动子的部分和部分组成的启动子或完全合成的启动子。参见，例如，描述这类用于植物的启动子的Ni等人(1995)Plant J.7:661-676和PCT WO 95/14098。

[0207] 在本发明的一个实施方案中，对于植物的特定区域或组织是特异性的启动子序列可用于表达本发明的HPPD蛋白，诸如特异于种子的启动子(Datla,R.等人,1997,Biotechnology Ann.Rev.3,269-296)，尤其是napin启动子(EP 255 378 A1)、菜豆球蛋白启动子、麦谷蛋白启动子、helianthinin启动子(WO 92/17580)、白蛋白启动子(WO 98/
45460)、油质蛋白启动子(WO 98/45461)、SAT1启动子或SAT3启动子(PCT/US98/06978)。

[0208] 还可使用有利地选自苯丙氨酸解氨酶(PAL)、HMG-CoA还原酶(HMG)、壳多糖酶、葡聚糖酶、解蛋白酶抑制剂(PI)、PR1家族基因、胭脂碱合酶(nos)和vspB启动子(US 5 670 349，表3)、HMG2启动子(US 5 670 349)、苹果β-半乳糖苷酶(ABG1)启动子以及苹果氨基环丙烷羧酸合酶(ACC合酶)启动子(WO 98/45445)的诱导型启动子。可将多个启动子用于本发明的构建体，包括连续地使用。

[0209] 启动子可包括或经修饰包括一个或多个增强子元件。在一些实施方案中，启动子可包括多个增强子元件。相较于不包括它们的启动子，含有增强子元件的启动子提供更高水平的转录。用于植物的合适的增强子元件包括PClSV增强子元件(美国专利No.5,850,019)、CaMV 35S增强子元件(美国专利No.5,106,739和5,164,316)以及FMV增强子元件(Maiti等人(1997)Transgenic Res.6:143-156)；例如，申请WO 87/07644中描述的烟草花叶病毒(TMV)或由Carrington&Freed 1990,J.Virol.64:1590-1597描述的烟草蚀纹病毒(TEV)的翻译激活物，或内含子诸如玉米的adh1内含子或水稻肌动蛋白的内含子1。也参见PCT WO 96/23898、WO2012/021794、WO2012/021797、WO2011/084370和WO2011/028914。

[0210] 通常地，这类构建体可包含5′和3′非翻译区。这类构建体可包含“信号序列”或“前导序列”以帮助目标肽的共翻译或至某些细胞内结构诸如叶绿体(或其它质体)、内质网或高尔基体的翻译后转运或分泌。例如，所述构建体可经工程化以含有促进肽至内质网的转移的信号肽。“信号序列”意指已知或怀疑导致穿过细胞膜的共翻译或翻译后肽转运。在真核细胞中，这通常包括至高尔基体内的分泌，一些蛋白质发生糖基化。“前导序列”意指当翻译时，导致足以触发肽链至亚细胞细胞器的共翻译转运的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括靶向运输和/或糖基化(通过进入内质网、进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体等))的前导序列。还可优选地工程化植物表达盒以包含内含子，以便内含子的mRNA加工是表达所需的。

[0211] “3′非翻译区”意指位于编码序列下游的多核苷酸。多腺苷酸化信号序列和编码能够实现多腺苷酸区段至mRNA前体的3′末端的添加的调控信号的其它序列是3′非翻译区域。“5′非翻译区”意指位于编码序列上游的多核苷酸。

[0212] 其它上游或下游非翻译元件包括增强子。增强子是和于增强启动子区域的表达的多核苷酸。增强子在本领域中是公知的，包括但不限于SV40增强子区域和35S增强子元件。

[0213] 终止区对于转录起始区可以是天然的，对于本发明的序列可以是天然的或可来源于另一个来源。方便的终止区可获自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，诸如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2:1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91:151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-
9639；以及欧洲专利申请EP 0 633 317 A1。

[0214] 在本发明的一个方面，针对给定的多肽，诸如本发明的多肽设计合成DNA序列。细胞中合成DNA序列的开放阅读框架的表达导致本发明的多肽产生。合成DNA序列可用于仅除去不想要的限制性内切核酸酶位点，帮助DNA克隆策略，改变或除去任何潜在的密码子偏爱性，或改变或增加GC含量，除去或改变交替阅读框架，和/或改变或除去内含子/外显子剪接识别位点、多腺苷酸化位点、Shine-Delgarno序列、不想要的启动子元件等，所述序列或元件可存在于天然DNA序列中。合成DNA序列还可能可用于将其它改进引入DNA序列，诸如内含子序列的引入、表达为融合于细胞器靶向序列诸如叶绿体转运肽、非原质体/液泡靶向肽或导致所得的肽在内网质中保留的肽序列的蛋白质的DNA序列的产生。合成基因还可使用宿主细胞偏爱的密码子来合成以改善表达或可以以宿主偏爱的密码子选择频率使用密码子来合成。参见，例如，Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11；美国专利No.6,320,100；6,075,185；5,380,831和5,436,391，美国公开申请No.20040005600和
20010003849，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498，通过引用并入本文。

[0215] 在一个实施方案中，将目标多核苷酸靶向叶绿体以进行表达。这样，当目标多核苷酸被直接插入叶绿体时，表达盒可额外地包含编码转运肽的多核苷酸以指导目标核苷酸至叶绿体。这类转运肽在本领域中是已知的。参见，例如，Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264:17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant  Physiol.84:965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233:478-481。

[0216] 被靶向叶绿体的目标多核苷酸可被最优化以用于在叶绿体中表达，以补偿植物细胞核与该细胞器之间的密码子选择的差异。这样，可使用叶绿体偏爱的密码子合成目标多核苷酸。参见，例如，美国专利No.5,380,831，通过引用并入本文。

[0217] 可将该植物表达盒插入植物转化载体。“转化载体”意指允许细胞转化的DNA分子。这样的分子可由一个或多个表达盒组成，并且可被组织至超过一个载体DNA分子中。例如，二元载体是利用两个非连续DNA载体编码所有必需顺式-和反式-作用功能，用于转化植物细胞的植物转化载体(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5:446-
451)。“载体”是指被设计用于不同宿主细胞之间的转移的多核苷酸构建体。“表达载体”是指具有将异原DNA序列或片段掺入、整合入外源细胞并于其中表达的能力的载体。

[0218] 植物转化载体包含一个或多个DNA载体以实现植物转化。例如，本领域中常用实践是利用包含超过一个连续DNA区段的植物转化载体。这些载体在本领域中通常称为二元载体。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常见地用于农杆菌介导的转化，其中实现高效转化所需的DNA区段的大小和复杂度相当大，有利地将功能分开置于单独的DNA分子上。二元载体通常含有质粒载体，所述质粒载体含有T-DNA转移所需的顺式作用序列(诸如左边界和右边界)、经工程化能够在植物细胞中表达的可选择标记和“目标多核苷酸”(经工程化能够在对于其期望产生转基因植物的植物细胞中表达的多核苷酸)。还存在于该质粒载体上的是细菌复制所需的序列。顺式作用序列以允许至植物细胞内高效转移并在其中表达的方式排列。例如，可选择标记序列和目标序列位于左边界与右边界之间。通常第二质粒载体包含介导T-DNA从农杆菌转移至植物细胞的反式作用因子。该质粒通常含有毒力功能(Vir基因)，该功能允许农杆菌感染植物细胞，以及通过在边界序列上的切割和Vir介导的DNA转移来转移DNA，这在本领域中是为人理解的(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science,5:446-451)。几个类型农杆菌菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。第二质粒载体不是通过其它方法诸如显微注射、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等将多核苷酸引入植物所必需的。

[0219] F.植物转化

[0220] 本发明的方法包括将核苷酸构建体引入植物。“引入”意欲指以所述构建体进入植物细胞内部的方式向植物呈递核苷酸构建体。本发明的方法不需要使用用于将核苷酸构建体引入植物的特殊方法，仅需核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部。用于将核苷酸构建体引入植物的方法在本领域是已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导的方法。参见，例如，US 4,459,355、US 4,536,475、US 5,464,763、US 5,177,010、US 5,187,073、EP 267,159 A1、EP 604 662 A1、EP 672 752 A1、US 4,945,050、US 5,036,
006、US 5,100,792、US 5,371,014、US 5,478,744、US 5,179,022、US 5,565,346、US 5,
484,956、US 5,508,468、US 5,538,877、US 5,554,798、US 5,489,520、US 5,510,318、US 
5,204,253、US 5,405,765、EP 442 174 A1、EP 486 233 A1、EP 486 234 A1、EP 539 563 A1、EP 674 725 A1、WO 91/02071、WO 95/06128和WO2011/095460(其每一个通过引用并入本文)中描述的用于转化植物细胞和再生植物的方法，特别地关于本文中描述的转化法。

[0221] 一般而言，植物转化法包括将异源DNA转移进靶植物细胞(例如未成熟或成熟胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)中，随后施用最高阈值水平的适当选择(取决于可选择标记基因)以从一团未转化细胞团块回收转化的植物细胞。通常将外植体转移至新鲜提供的相同培养基中，进行常规培养。随后，转化细胞在置于补充有最大阈值水平的选择剂的再生培养基上后分化成芽。随后将芽转移至选择性生根培养基以回收生根的苗或幼苗。随后将转基因幼苗生长成成熟植物并产生能育种子(例如Hiei等人(1994)The Plant Journal 6:271-282；Ishida等人(1996)Nature Biotechnology 14:745-750)。通常将外植体转移至新鲜提供的相同培养基中，进行常规培养。用于产生转基因植物的技术和方法的一般描述见于Ayres和Park(1994)Critical Reviews in Plant Science 13:219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42:107-120中。由于转化的材料包含许多细胞；因此转化的和非转化细胞存在于受试靶愈伤块或组织或细胞团的任何小块中。杀死非转化细胞并允许转化细胞增殖的能力导致转化的植物培养。通常地，除去非转化细胞的能力是对转化植物细胞的快速回收和转基因植物的成功再生的限制。分子和生物化学法可用于确认整合的目标异源基因在转基因植物的基因组中的存在。

[0222] 转基因植物的再生可通过几个方法中的一种来进行，所述方法包括但不限于通过农杆菌进行的异源DNA至植物细胞的引入(农杆菌介导的转化)、利用附连于颗粒的异源外来DNA进行的植物细胞的微粒轰击，以及各种其它转移DNA的非颗粒定向介导的方法(non-particle direct-mediated method)(例如Hiei等人(1994)The Plant Journal 6:271-282；Ishida等人(1996)Nature Biotechnology 14:745-750；Ayres and Park(1994)Critical Reviews in Plant Science 13:219-239；Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 
42:107-120)。

[0223] 用于转化叶绿体的方法在本领域中是已知的。参见，例如，Svab等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  87:8526-8530；Svab  and  Maliga  (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:913-917；Svab and Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。所述方法依赖于含有可选择标记并且通过同源重组将DNA靶向质体基因组的DNA的基因枪递送。
此外，质粒转化可通过沉默的质体携带的转基因(silent plastid-borne transgene)的反式激活(通过核编码的质体导向的RNA聚合酶(nuclear-encoded and plastid-directed RNA  polymerase)的组织优选表达)来实现。在McBride等人(1994)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7301-7305中已报导了这样的系统。

[0224] 可按照常规方法将已转化的细胞生长成植物。参见，例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。随后可生长这些植物，并且用相同的转化品系或不同品系对其授粉，并鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得杂合体。可生长2代或更多代，以确保所需表型特征的表达得以稳定地保持和遗传，随后收获种子以确保所需表型特征的表达已经实现。这样，本发明提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，其具有稳定地整合进它们的基因组中的本发明的核苷酸构建体，例如本发明的表达盒。在各种实施方案中，种子可涂覆有至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀虫剂，至少一种除草剂，和/或至少一种安全剂或其任意组合。

[0225] G植物转化的评价

[0226] 在将异源外源DNA引入植物细胞后，通过各种方法诸如与整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢的分析来确认异源基因的转化和在植物基因组中的整合。

[0227] PCR分析是在移植至土壤中之前在早期就整合的基因的存在筛选转化的细胞、组织或芽的快速方法(Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY))。使用特异于目标基因的寡核苷酸引物或农杆菌载体背景等进行PCR。

[0228] 植物转化可以通过基因组DNA的Southern印迹分析来确认(Sambrook和Russell(2001)同上)。一般而言，从转化体提取总DNA，用适当的限制性酶进行消化，在琼脂糖凝胶中分级分离，随后转移至硝基纤维素或尼龙膜上。随后可按照标准技术(Sambrook和Russell,2001，同上)，用例如放射性标记的32P靶DNA片段探测该膜或“印迹”以确认引入的基因在植物基因组中的整合。

[0229] 在Northern分析中，从转化体的特定组织分离RNA，在甲醛琼脂糖凝胶上进行分级分离，随后按照本领域中常规使用的标准方法将其印渍在尼龙滤膜上(Sambrook和Russell(2001)，同上)。随后利用本领域已知的方法(Sambrook和Russell(2001)，同上)，通过将滤膜与来源于GDC的放射性探针杂交来测试由本发明的核苷酸序列编码的RNA的表达。

[0230] 可使用结合存在于除草剂耐受性蛋白上的一个或多个表位的抗体，通过标准方法(Sambrook和Russell(2001)，同上)对转基因植物进行Western印迹、ELISA、侧流测试和生物化学测定等，以确定由除草剂耐受性基因编码的蛋白质的存在。

[0231] 在本发明的一个方面，本文中描述的HPPD基因用作评估细菌或植物细胞的转化的标记。

[0232] H.用作转化的标记

[0233] 本发明还涉及编码根据本发明的HPPD的核酸在用于转化植物的方法中用作标记基因，或用作使得可能赋予植物对作为HPPD抑制剂的除草剂的耐受性的编码序列的用途，以及一种或多种HPPD抑制剂对包含编码根据本发明的HPPD的核酸序列的植物的使用。参见，例如，美国专利6,791,014，其通过引用整体并入本文。

[0234] 在本实施方案中，可将HPPD抑制剂引入感受态植物细胞的培养基以在进行转化步骤之前漂白所述细胞。随后利用编码对HPPD抑制剂的耐受性的基因作为选择标记转化漂白的感受态细胞，已将所述选择标记整合进它们的基因组中的转化细胞变绿，从而使得它们能够被选择。这样的方法使得可能减少选择所述转化细胞所需的时间。

[0235] 因此，本发明的一个实施方案由通过将异源基因引入所述植物来转化植物细胞，利用编码对HPPD抑制剂的耐受性的基因作为选择标记的方法组成，其中所述方法包括在适当的培养基中制备和培养能够接受异源基因的感受态植物细胞，和将适当量的HPPD抑制剂引入感受态植物细胞的适当的培养基。随后用异源基因和选择标记转化感受态细胞，将包含异源基因的转化细胞生长在适当的培养基中，从其选择转化体。随后将转化细胞再生成能育的转化植物。

[0236] I.植物和植物部分

[0237] “植物”意欲指整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其后代。植物细胞可以分化或未分化(例如、愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。本发明可被用于将多核苷酸引入任何植物物种，包括但不限于于单子叶植物和双子叶植物。目标植物的实例包括但不限于玉米(Zea mays)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜、芸苔属的一个种、紫花苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏仁、燕麦、蔬菜、观赏植物及松柏类。

[0238] 蔬菜包括但不限于番茄、莴苣、四季豆、利马豆、豌豆、以及黄瓜属的成员诸如黄瓜、香瓜和甜瓜。观赏植物包括但不限于杜鹃花、绣球、木槿、玫瑰、郁金香、水仙花、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。作物植物也具有吸引力，包括例如玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等。

[0239] 本发明适合用于单子叶植物家族的任何成员，包括但不限于玉米、水稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、山药、洋葱、香蕉、椰子和棕枣。

[0240] J.用于增加植物产率的方法

[0241] 提供了用于增加植物产率的方法。所述方法包括提供包含含有编码本发明的HPPD的核苷酸序列的多核苷酸的植物，或将所述多核苷酸引入植物或植物细胞，在田间生长植物或其种子，以及从所述植物或种子产生收获物。如本文中所定义的，植物的“产率”是指由植物产生的生物量的性质和/或量。“生物质”意欲指任何测量的植物产品。生物质产量的增加是测量的植物产品的产率的任何提高。增加植物产率具有几个商业应用。例如，增加植物叶生物量可增加用于人或动物消费的叶用蔬菜的产率。此外，增加叶用蔬菜生物量可用于增加植物来源的药物或工业产品的产量。产率的增加可包括任何统计上显著的增加，包括但不限于至少1％的增加、至少3％的增加、至少5％的增加、至少10％的增加、至少20％的增加、至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。

[0242] 在具体方法中，利用有效浓度的HPPD除草剂处理包含本发明的HPPD序列的植物，所述除草剂是诸如一种或多种选自如下除草剂的HPPD抑制剂除草剂：N-(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺、N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基咪唑羧酰胺种类的HPPD抑制剂除草剂，诸如2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺和2-氯-3-(甲氧基甲基)-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺，三酮类诸如特波三酮、磺草酮和硝磺草酮，异噁唑种类诸如异噁唑草酮，或吡唑特种类诸如磺酰草吡唑和苯唑草酮，具体地选自特波三酮、磺草酮、苯唑草酮、双环吡喃酮、特糠酯酮、异噁唑草酮和硝磺草酮，其中所述除草剂应用导致增加的植物产率。

[0243] 还提供了用于赋予植物或植物部分的除草剂耐受性的方法。在这类方法中，将编码本发明的HPPD的核苷酸序列引入植物，其中所述多核苷酸的表达导致HPPD抑制剂除草剂耐受性。通过该方法产生的植物可用有效浓度的除草剂(诸如一种或多种选自如下种类的HPPD除草剂的HPPD抑制剂除草剂：N-(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺、N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基咪唑羧酰胺种类，诸如2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺和2-氯-3-(甲氧基甲基)-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺，三酮类诸如特波三酮、磺草酮和硝磺草酮，异噁唑种类诸如异噁唑草酮，或吡唑特种类诸如磺酰草吡唑和苯唑草酮，具体地选自特波三酮、磺草酮、苯唑草酮、双环吡喃酮、特糠酯酮、异噁唑草酮和硝磺草酮)进行处理，并且展现增加的对所述除草剂的耐受性。本申请中除草剂的“有效浓度”是足以减缓或停止对除草剂天然不耐受的或使得对其耐受的植物或植物部分的生长的量。

[0244] K.控制田中杂草的方法

[0245] 本发明从而还涉及用于控制不想要的植物或用于调节包含编码根据本发明的HPPD的核苷酸序列的作物植物的植物生长的方法，其中将一种或多种HPPD抑制剂除草剂，例如一种或多种选自如下种类的HPPD抑制剂除草剂(N-(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺、N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基咪唑羧酰胺类，诸如2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺和2-氯-3-(甲氧基甲基)-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺，三酮类诸如特波三酮、磺草酮和硝磺草酮，异噁唑类诸如异噁唑草酮或吡唑特诸如磺酰草吡唑和苯唑草酮，具体地选自特波三酮、磺草酮、苯唑草酮、双环吡喃酮、特糠酯酮、异噁唑草酮或硝磺草酮)用于植物(例如有害植物诸如单子叶或双子叶杂草或不想要的作物植物)，用于种子(例如谷物、种子或无性繁殖体诸如根茎或具有芽的枝条部分)或用于植物在其上生长的区域(例如栽培下的区域)。在本说明书中，一种或多种HPPD抑制剂除草剂(例如，一种或多种选自如下种类的HPPD抑制剂除草剂的HPPD抑制剂除草剂：N-(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺、N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基咪唑羧酰胺类，诸如2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺和2-氯-3-(甲氧基甲基)-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺，三酮类诸如特波三酮、磺草酮和硝磺草酮，异噁唑类诸如异噁唑草酮或吡唑特诸如磺酰草吡唑和苯唑草酮，具体地选自特波三酮、磺草酮、苯唑草酮、双环吡喃酮、特糠酯酮、异噁唑草酮或硝磺草酮)的有效浓度可用于例如种植前(适当时还可通过掺入土壤)、出苗前或出苗后，并且可与作物天然地耐受其的或作为通过表达一个或多个其它除草剂抗性基因来耐受其的其它除草剂的施用组合。参见，例如，美国申请公开No.2004/0058427和PCT申请公开No.WO 98/
20144。“有效浓度”意欲指控制杂草或其它未转化的植物的生长而不显著影响耐受HPPD抑制剂的植物或植物种子的浓度。本领域普通技术人员理解，除草剂的施用可采取许多不同的形式，并且可在种子种植前的许多不同时间上和/或整个种子种植和生长过程中进行。"出苗前"施用是指在植物从土壤中可见地冒出前向目标区域(例如，栽培的田间或区域)施用的除草剂。"出苗后"施用是指在植物从土壤中可见地冒出后向区域施用的除草剂。在一些情况下，参照目标区域中的杂草使用术语"出苗前"和"出苗后"，在一些情况下，参照目标区域中的作物植物使用这些术语。当参照杂交使用时，这些术语可用于存在于或据信存在于目标区域中的特定类型的杂草或特定种类的杂草。除草剂的"种植前掺入"包括在种植前将化合物掺入土壤。

[0246] 因此，本发明包括控制田中杂交的方法，包括在田中种植包含本发明的HPPD的植物或其种子和对所述植物或围绕所述植物的区域施用有效浓度的一种或多种HPPD抑制剂除草剂。

[0247] 在本发明的一个实施方案中，待种植含有本发明的核苷酸序列的植物(例如，诸如大豆、棉花、棉花或小麦植物)的田可在种植所述植物或播种所述种子之前，用HPPD抑制剂除草剂诸如异噁唑草酮(IFT)进行处理，这清除田中被HPPD抑制剂杀死的杂草，从而允许免耕实践，随后在以后在该预处理的田中种植或播种植物(使用HPPD抑制剂除草剂的燃尽施用(burndown application))。IFT的残留活性还将在早期生长阶段保护正在出苗和生长的植物免受杂草的竞争。当植物具有一定的尺寸并且杂草倾向于再出现时，当这类植物耐受所述除草剂时，可将草铵膦或草甘胱或HPPD抑制剂或HPPD抑制剂与另一种除草剂诸如草甘膦的混合物作为出苗后除草剂在植物顶部上方施用。

[0248] 在本发明的另一个实施方案中，在植物出苗前但在播种后(可在播种前使用其它方式，通常地常规耕地实践诸如耕犁、凿式耕犁或苗床制备来使田不含杂草)，在其中播种含本发明的HPPD核苷酸序列的种子的田可用HPPD抑制剂除草剂诸如IFT进行处理，其中残留活性使田保持不含被除草剂杀死的杂草，以便正在出苗和生长的植物不受杂草竞争(HPPD抑制剂除草剂的出苗前施用)。一旦植物具有一定的尺寸，并且杂草倾向于再出现，当这类植物耐受所述除草剂时，可将草铵膦或草甘胱或HPPD抑制剂或HPPD抑制剂与另一种除草剂诸如草甘膦的混合物作为出苗后除草剂在植物顶部上方施用。

[0249] 在本发明的另一个实施方案中，可在已从播种的种子出苗的植物的顶部上方用HPPD抑制剂除草剂处理含有本发明的HPPD核苷酸序列的植物，这清除田中被HPPD抑制剂杀死的杂草，当这类植物耐受这样的除草剂时，可在植物顶部上方与利用草甘膦或草铵膦(作为出苗后除草剂)的处理一起(例如，在喷雾桶混合物中)，在其之前或之后进行该施用(HPPD抑制剂除草剂(具有或不具有草甘膦)的出苗后施)，当这类植物耐受这样的除草剂时。

[0250] 可用HPPD抑制剂除草剂控制的单子叶和双子叶杂草的个体代表的实例包括：

[0251] 如下属的单子叶有害植物：山羊草属、冰草属、剪股颖属、看麦娘属、Apera属、燕麦属、臂形草属、无芒雀麦属、蒺藜草属、鸭跖草属、狗牙根属、香附属、龙爪茅属属、马唐属、稗属、荸荠属、牛筋草属、画眉草属、野黍属属、羊茅属、飘拂属、异蕊花属、白茅属、鸭嘴属、千金子属、黑麦草属、鸭舌属、黍属、雀稗属、虉属、梯牧草属、早熟禾属、筒轴茅属属、慈姑属、藨草属、狗尾草属、高粱属。

[0252] 如下属的双子叶杂草：苘麻属、苋属、豚草属、单花葵属属、春黄菊属、蔷薇属属、蒿属、榆钱属、贝利斯属、鬼针草属、荠菜属、飞廉属、草决明属、矢车菊属、藜属、刺儿属、空心菜属、曼陀罗属、山蚂蝗属、电博会属、糖芥属、大戟属、鼬瓣花属、辣子属、猪属、木槿属、五爪属、地肤属、野属、独行菜属、陌上属、洋甘菊属、薄荷属、山靛属属、粟米草属、勿忘我属、罂粟属、牵牛属、车前子属、蓼属、马齿苋属、毛茛属、萝卜属、蔊菜属、节节菜属、鲁梅克斯属、猪毛菜属、千里光属、田菁属、拔毒属、白芥属、龙属、苦苣菜属、尖瓣花属、繁缕属、蒲公英属、遏蓝属、红车轴属、荨麻属、婆婆纳属、中提琴属、苍耳子属。

[0253] 取决于盛行的生物学和/或物理化学参数，可以以水同方式配制用于本发明的HPPD抑制剂除草剂，包括但不限于如下种类的HPPD抑制剂除草剂：N-(1,2,5-噁二唑-3-基)苯甲酰胺、N-(四唑-4-基)-或N-(三唑-3-基)芳基咪唑羧酰胺类，诸如2-氯-3-乙氧基-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺和2-氯-3-(甲氧基甲基)-4-(甲磺酰基)-N-(1-甲基-1H-四唑基-5-基)苯甲酰胺，三酮类诸如特波三酮、磺草酮和硝磺草酮，异噁唑类诸如异噁唑草酮或吡唑特诸如磺酰草吡唑和苯唑草酮，具体地选自特波三酮、磺草酮、苯唑草酮、双环吡喃酮、特糠酯酮、异噁唑草酮或硝磺草酮。可能的制剂的实例为：可湿性粉剂(WP)、水溶性粉剂(SP)、水溶性浓缩物、乳油(EC)、乳液(EW)诸如水包油和油包水乳剂、可喷雾溶液、悬浮液浓缩物(SC)、油或水基分散体、油可混溶的溶液、胶囊悬浮剂(CS)、粉剂(DP)、拌种产品、通过撒施在土壤上施用的颗粒、以微粒形式存在的颗粒(GR)、喷雾颗粒剂、包衣颗粒剂和吸附颗粒剂、水分散性粒剂(WG)、水溶性颗粒(SG)、ULV制剂、微胶囊和蜡。

[0254] 这些个别类型的制剂在原理上是已知的并且描述于例如Winnacker-Küchler,"Chemische Technologie"[Chemical technology]，第7卷，C.Hanser Verlag Munich,第4版1986；Wade van Valkenburg,"Pesticide Formulations",Marcel Dekker,N.Y.,1973；K.Martens,"Spray Drying"Handbook，第3版1979,G.Goodwin Ltd.London中。

[0255] 所需的制剂助剂诸如惰性材料、表面活性剂、溶剂和其它添加剂也都是已知的，并且描述于例如Watkins,"Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers"，第2版，Darland Books,Caldwell N.J.,H.v.Olphen,"Introduction to Clay Colloid Chemistry"；第2版，J.Wiley&Sons,N.Y.；C.Marsden,"Solvents Guide"；第2版，Interscience,N.Y.1963；McCutcheon's"Detergents and Emulsifiers Annual",MC Publ.Corp.,Ridgewood N.J.；Sisley和Wood,"Encyclopedia of Surface Active Agents",Chem.Publ.Co.Inc.,N.Y.1964；[Interface-
active ethylene oxide adducts],Wiss.Verlagsgesell.,Stuttgart 1976；Winnacker-Küchler,"Chemische Technologie"[Chemical technology]，第7卷，C.Hanser Verlag Munich，第4版1986中。

[0256] 基于这些制剂，还可能制备与其它农药活性物质诸如，例如杀虫剂、杀螨剂、除草剂、杀真菌剂组合，以及与安全剂、肥料和/或生长调节剂的组合(例如以预拌混合物或桶混制剂的形式存在)。

[0257] L.将本发明的基因引入另一植物的方法

[0258] 本文中还提供了将本发明的HPPD核苷酸序列引入另一植物的方法。可通过重复选择、回交、谱系育种、混合选择、突变育种和/或遗传标记增强选择将本发明的HPPD核苷酸序列或其片段引入第二植物。

[0259] 因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括将包含本发明的HPPD核苷酸序列的第一植物与第二个植物杂交以产生F1后代植物，并选择耐受HPPD抑制剂除草剂或包含本发明的HPPD核苷酸序列的F1后代植物。该方法还可包括将选择的后代植物与包含本发明的HPPD核苷酸序列的所述第一植物杂交，以产生回交后代植物，并选择耐受HPPD抑制剂除草剂或包含本发明的HPPD核苷酸序列的回交子代植物。在本文中其它地方提供用于评估HPPD抑制剂除草剂耐受性的方法。该方法还可以包括连续重复这些步骤之1次或更多次以产生耐受HPPD抑制剂除草剂或包含本发明的HPPD核苷酸序列的选择的第二或更高的回交后代植物。

[0260] 任何涉及就所需表型选择植物的育种方法可用于本发明的方法。在一些实施方案中，F1植物可以自花授粉，以产生分离的F2代。随后可在每一代(F3、F4、F5等)中将选择代表所需表型(例如，HPPD抑制剂除草剂耐受性)的个体植物，直至性状是纯合的或在育种种群内固定。

[0261] 所述第二植物可以是具有所需性状诸如除草剂耐受性、昆虫耐受性、干旱耐受性、线虫控制、水分利用效率、氮使用效率、提高的营养价值、抗病性、增强的光合作用、提高的纤维质量、胁迫耐受性、改进的再现等的植物。第二植物可以是如本文其它地方所述的良种事件。

[0262] 在各种实施方案中，可从所得的杂交植物收获植物部分(整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚等)，将其用于繁殖或收集用于下游应用(诸如食品、饲料、生物燃料、油、面粉、膳食等)。

[0263] M.获得植物产品的方法

[0264] 本发明还涉及用于获得商品产品的方法，其包括从包含本发明的HPPD序列的作物收获谷物和/或研磨所述谷物来获得商品产品。农艺学上和商业上重要的产品和/或物质的组合物，包括但不限于动物饲料、商品以及拟用作人消费的食品或用于拟用于人消费的组合物和商品的植物产品或副产品，尤其是失活的种子/谷物产品，包括由这种谷物/种子产生的(半)加工产品，其中所述产品是或包含完整或加工的种子或谷物、动物饲料、玉米或大豆粗粉、玉米或大豆粉、玉米、玉米淀粉、大豆粗粉、大豆粉、薄片、大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、组织化大豆蛋白浓缩物、化妆品、护发产品、大豆果仁酱、纳豆、豆豉、水解大豆蛋白、植脂奶油、起酥油、卵磷脂、可食用整粒大豆(生的、烤的或作为毛豆)、大豆酸奶、大豆奶酪、豆腐、腐竹以及熟的、抛光的、蒸的、烘烤的或煮成半熟的谷物等，旨在为在本范围之内发明，如果这些产品和物质的组合物含有可检测量的本文中所示的核苷酸和/或氨基酸序列作为含有这类核苷酸序列的诊断的话。

[0265] 下列实施例通过举例说明而非限制的方式提供。实施例

[0266] 实施例1.荧光假单胞菌HPPD突变体G336W(PfG336W)的制备和HPPD酶的动力学表征

[0267] 首先将天然荧光假单胞菌HPPD核苷酸序列(PfHPPD,1077bp，如WO2009144079中描述的)(其编码本文中列为SEQ ID NO:1的氨基酸序列，以及如WO2009144079、WO 96/38567中和Rüetschi等人(Eur.J.Biochem.,205,459-466,1992)中描述的氨基酸序列)克隆进提供起始密码子的表达载体pKK233-2(Pharmacia)的唯一NcoI位点。

[0268] 在5’末端，紧接ATG的下游，插入编码丙氨酸的核酸序列和编码N末端HIS6-Tag(6x HIS，由cat cac cat cac cat cac(SEQ ID NO:77编码的)的核酸序列。在ATG上游，添加两个额外的半胱氨酸碱基对以获得对应于限制性内切酶NcoI的识别位点的序列，并且在终止密码子的下游添加对应于限制性内切酶XbaI的识别位点。用限制性内切酶NcoI和XbaI切割对应于该基因(包括编码HIS-TAG的序列)的DNA序列，随后将其克隆进经修饰的表达载体pSE420(RI)NX(5261bp)。

[0269] 克隆性和表达载体pSE420(RI)NX(5261bp)基于由Invitrogen(Karlsruhe,Germany)提供的质粒pSE420。该载体的修饰包括添加赋予对抗生素卡那霉素的耐受性并且在大多数超级接头区域(superlinker region)(多克隆位点)中丢失的nptII基因(新霉素磷酸转移酶；Sambrook和Russell,2001,Molecular Cloning:a laboratory manual(第3版))。

[0270] 该质粒具有trp-lac(trc)启动子和在每一个大肠杆菌宿主菌株中提供lac阻遏物的lacIq基因。Lac阻遏物结合lac操纵子(lacO)并限制目标基因的表达；该抑制可通过利用异丙基β-D-1-半乳糖硫吡喃糖苷(IPTG)的诱导来缓解。

[0271] 所得的载体称为pSE420(RI)NX-PfHPPD，并且其用于转化大肠杆菌BL21细胞(Merck,Darmstadt,Germany)。

[0272] 将质粒pSE420(RI)NX-PfHPPD经历PCR介导的定点诱变以改变PfHPPD基因的对应位置上的确定的密码子。用编码色氨酸(W)的密码子替代编码位置336上的甘氨酸(G)的密码子。所得的突变体称为PfG336W，并且所得载体为pSE420(RI)NX-PfG336W。

[0273] 在含有pSE420(RI)NX-PfHPPD或pSE420(RI)NX-PfG336W的大肠杆菌K-12BL21中进行HPPD的表达。让细胞生长直至OD达到0.5，随后通过用1mM IPTG诱导从trp-lac(trc)启动子起始表达，所述IPTG结合至lac阻遏物并使其从lac操纵子解离。在28℃进行表达超过15h。

[0274] 为了制备预起始子培养物(pre-starter culture)，用50μL大肠杆菌K-12BL21甘油原液接种2mL的TB培养基(100μg*mL-1羧苄西林)。在140rpm摇动的条件下将预起始子培养物于37℃温育15h。将200μl的预起始子培养物用于启动起始子培养(5mL补充有100μg*L-1的TB)，将其在37℃温育3h。

[0275] 为了制备主培养物，用4mL起始子培养物接种400mL的TB培养基(100μg*mL-1羧苄西林)。在摇动的条件下将该起始子培养物在37℃以140rpm温育直至达到OD6000.5。随后用400μl的1M IPTG溶液诱导重组蛋白表达。让细胞在这些条件下再生长另外1小时，随后将温度降至28℃，以140rpm摇动培养物15h。通过在4℃以6000x g离心15分钟来收获细胞。随后将细胞沉淀于-80℃贮存。

[0276] 以天然形式存在的His6-PfHPPD和His6-PfG336W的分离和纯化

[0277] 细胞的裂解

[0278] 使用溶菌酶(切割形成细菌细胞壁的肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸与N-乙酰基-D-葡糖胺残基之间的1,4-β-连接的酶)裂解细胞。随后通过细胞细胞的内部压力破坏细胞膜。此外，裂解缓冲液含有 核酸酶，水解DNA和RNA的所有形式而不破坏蛋白质，从而大大降低了细胞裂解物的粘性。在冰上于天然条件下进行裂解。

[0279] 为了纯化His6-标记的蛋白质，按照用户手册说明书使用 Ni-NTA Fast Start试剂盒。

[0280] 通过固定化金属离子亲和层析(IMAC)进行His6-标记的蛋白质的纯化

[0281] 将裂解反应物离心后获得的澄清的细胞裂解液(10mL)上样至来自Ni-NTA Fast Start试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)的Ni-NTA 
Fast Start柱，并按照说明书手册进行纯化。用2.5mL的洗脱缓冲液洗脱His6标记的蛋白质。

[0282] 通过凝胶过滤进行的HPPD溶液的脱盐

[0283] 按照用户手册指令，将利用2.5mL洗脱缓冲液从Ni-NTA Fast Start柱洗脱的HPPD溶液施加至Sephadex G-25 PD-10柱(GE Healthcare,Freiburg,Germany)。在整个样品已经进入凝胶床后，利用3.5mL储存缓冲液进行洗脱。

[0284] 将从脱盐柱洗脱的HPPD溶液于以1mL等分于-80℃冷冻。

[0285] 使用Bradford蛋白质测定进行的HPPD蛋白浓度的测定

[0286] 使用标准Bradford测定(Bradford,(1976),Anal Biochem 72:248-254)测定蛋白质浓度。

[0287] 使用SDS-PAGE进行的HPPD溶液的纯度的测定

[0288] 使用凝胶 Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)，通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳检查洗脱的蛋白质的完整性，加载约10μg的蛋白质。
将10μL Laemmli样品缓冲液添加至1-10μL的蛋白质溶液中，将混合物在90℃温育10分钟。
在短暂离心步骤后，将整个混合物上样至一块先前在充满 MOPS SDS电泳缓冲
TM
液(用ddH2O从20x溶液稀释的)的XCELL SURELOCK  Novex Mini-Cell胶室中固定的SDS凝胶。随后将150的电压施加于胶室，进行1h。为了进行蛋白质条带的染色，将凝胶浸没于考马斯亮蓝R-250染色液中。为了对聚丙烯酰胺凝胶脱色，将其浸没于考马斯亮蓝R-250脱色液中直至蛋白质条带在白色凝胶上显示蓝色。

[0289] 实施例2.对HPPD酶PfHPPD和PfG336W的HPPD抑制剂的耐受性的动力学表征和评价[0290] 通过标准分光光度计测量测定法(其描述于WO 2009/144079，通过引用整体并入本文)检测HPPD活性。

[0291] HPPD体外动力学性质的测定

[0292] 使用或可使用用于HPPD活性的测量的HPLC测定来测定不同HPPD酶制剂的Km、Vmax和kcat值，以及不同HPPD抑制剂的Ki、K1＝Kon和K-1＝Koff。测定混合物在1ml的体积中含有150mMTris-HCl缓冲液，pH 7.8,10mM抗坏血酸钠，650个单位的牛过氧化氢酶(Sigma C30(Sigma-Aldrich,Munich,Germany)，34mg蛋白质/ml，23,000个单位/mg)和适当量的HPP，纯化的HPPD酶和HPPD抑制剂。对于Km、Vmax和kcat值的测定，测定混合物中的HPP浓度可在10与
400μM之间变化。对于Ki、K1＝Kon和K-1＝Koff值的测定，使用或可使用2mM HPP。通过将HPPD酶添加至测定混合物中开始所有测定，在0与240s之间的一系列时间上通过将200μl的反应混合物添加至含有20μl 10％高氯酸的反应测定管来终止反应。通过以10,000g离心5分钟沉淀析出的蛋白质。将100μl的上清液上样至利用10％甲醇，0.1％三氟醋酸(缓冲液A)平衡的
250x 4mm Knauer(Berlin,Germany)Eurospher 100-5 C18柱。还使用缓冲液A洗涤4分钟，随后用95％甲醇洗涤3分钟和用缓冲液A进一步洗涤2分钟来以1.5ml/分钟洗脱柱子。在
292nm监测HGA(尿黑酸)和HPP(羟基苯丙酮酸)的洗脱。HGA在5分钟左右洗脱，随后HPP洗脱。
将一个标准组的HGA浓度用于提供标准曲线以校准HGA峰对HGA浓度的292nm吸光度。

[0293] 对于Km和Vmax值测定，从形成的HGA对时间的曲线测定不同底物浓度上HPPD反应的初始速率，使用ID Business Solutions Ltd.(www.idbs.com)XLfit软件套件将其与unireactant酶的米曼氏方程拟合。对于Ki、K1＝Kon和K-1＝Koff值的测定，使用ID Business Solutions Ltd.XLfit软件套件，将不同抑制剂浓度上进行的HPPD反应的时间过程与机制A(紧密结合抑制剂的竞争性抑制)的方程拟合(Cha,S.(1975)Tight-binding inhibitors–I.Kinetic behaviour.Biochemical Pharmacology 24,2177-2185)。

[0294] 表1：HPPD酶(Pf HPPD和PfG336W)的动力学表征

[0295] 在下文给定的表1中，“Km”(米-曼氏常数)意指用于表征酶的动力学参数，其被定义为允许反应的半最大速率的底物的浓度。Km被进一步定义为反应速率达到其最大值的一半(Vmax/2)时的底物浓度，其中Vmax具有为反应的最大速率的含义。

[0296] Kon＝K1等于酶-底物结合的结合速率常数，Koff＝K-1等于酶-抑制剂复合物解离的速率常数。Ki定义抑制常数。对于酶的比活性的测定，温育样品，24分钟后终止反应。以μg的蛋白质评估比活性。

[0297] 表1

[0298]

[0299] 表1显示野生型细菌HPPD(PfHPPD)和突变型HPPD(PfG336W)的动力学参数Km和Kcat未显示显著的差异。然而，比活性在突变体中相较于野生型蛋白显著减小。

[0300] 在几种HPPD抑制剂存在的情况下HPPD活性的测定

[0301] 在本说明书中，pI50-值意指以摩尔浓度表示的抑制50％的酶活性所必需的抑制剂的浓度的对数值。

[0302] 使用在WO 2009/144079中详尽描述的测定在2mM固定的HPP浓度上和使用ID Business Solutions Ltd.XLfit软件套件以3分钟的固定温育时间从HPPD活性对抑制剂浓度的剂量-反应曲线测定HPPD抑制剂的pI50-值。

[0303] 使用基于分光光度计测量的方法测量的PfHPPD和PfG336W酶的pI50。对下文中所列的几种HPPD抑制剂特波三酮、二酮腈、硝磺草酮的耐受性。符号“>”意指值远高于所示的-6 -5 -5 -5 -5值但不能在测试的抑制剂的浓度范围内(5.0x10 、1.0x10 、2.5x10 、4.0x10 、7.0x10 、
1.0x10-4、2.0x10-4和5.0x10-4M)被精确地计算。在本实验中，在实验开始后24分钟进行读出。结果示于表2中。

[0304] 表2

[0305]  特波三酮 二酮腈 硝磺草酮
PfHPPD >5.6 >5.6 >5.6
PfG336W >5.6 4.9 5.3

[0306] 还使用基于HPLC的方法测量HPPD酶的pI50。测量对HPPD抑制剂特波三酮、二酮腈和硝磺草酮的耐受性。在本实验中，在实验开始后3分钟进行测量。结果示于表3中。

[0307] 表3

[0308]  特波三酮 二酮腈 硝磺草酮
PfHPPD 4.9 4.7 4.7
PfG336W 4.6 4.2 4.3

[0309] 在测量HPPD活性和对HPPD抑制剂的耐受性的替代方法中，通过将适当量的HPPD添加至1ml的总体积中的200mM Tris-HCl pH 7.6,10mM抗坏血酸盐,20μM FeSO4,650个单位的过氧化氢酶,8μg HGA二加氧酶(HGA:尿黑酸)和10-100μM HPP的溶液来在室温测量HPPD活性。从318nm处的吸光度的增加(因马来酰基乙酰乙酸盐(ε318＝11,900M-1cm-1)的形成而导致的)测定初始反应速率。使用ID Business Solutions Ltd Xlfit 5.1.0.0版软件套件的Model 350，通过将在不同HPP浓度上测定的HPP周转的初始速率与米曼氏方程拟合来测定Km和Vmax值。该方法称为HGD测定。

[0310] 还使用HPPD偶联测定(HGD；PfHPPD和PfG336W)及其各自对HPPD抑制剂特波三酮、二酮腈和硝磺草酮的耐受性来测量HPPD酶的pI50。结果示于表4中。

[0311] 表4

[0312]  特波三酮 二酮腈 硝磺草酮
PfHPPD 6.4 5.8 5.8
PfG336W 6.0 5.3 5.3

[0313] 在表2、3和4中，可清楚地看到来自荧光假单胞菌的HPPD的位置336上的突变显著增强HPPD对几种HPPD抑制剂的耐受性。

[0314] 实施例3.第一代点突变文库

[0315] 在16个位置上进一步诱变PfG336W突变体。使用lightning试剂盒进行这些位置的随机化。文库的理论多样性为约300。将突变体汇合，转化进DH5α大肠杆菌细胞中。就对HPPD抑制剂特波三酮(TBT)的耐受性筛选600个单个克隆。在摇床中将所述克隆在37℃于LB培养基+卡那霉素中生长，直至达到0.3的OD600nm。随后将培养物转换至30℃，再温育另外17小时。将培养物离心沉淀，将细胞沉淀重悬浮于10mM Hepes/KOH pH 7.6,4mM MgCl2,1mM DTT中。通过玻珠击打法裂解细胞，离心后获得可溶性细胞提取物。

[0316] 使用棕色测定分析突变体。具体地，通过点渍在含有LB-琼脂、卡那霉素、5mM酪氨酸、42mM琥珀酸盐和HPPD抑制剂的固体培养基上以96孔格式测定HPPD提取物的HPPD抑制剂耐受性。在初步筛选中，以一式三份将20ul提取物点渍在含有250uM特波三酮的板上。用透气胶带覆盖板，在37℃温育。24小时后，相较于含有PfG336W的样品可视地观察到棕色色素形成。针对异噁唑草酮(IFT)的250uM TBT和250uM二酮腈(DKN)活性化合物，再测定在TBT存在的情况下显示增加的色素形成的变体。再次显示增强的抑制剂耐受性的那些变体再次被表达，针对250uM TBT和250uM DKN滴定提取物，以测定增强的程度。还通过SDS-PAGE分析提取物样品，发现提取物包含等量的HPPD蛋白。

[0317] 滴定显示变体PfHPPDEvo33(SEQ ID NO:6)相较于PfG336W具有4倍的对TBT和DKN的耐受性的增强。该变体相对于PfG336W在位置335上具有脯氨酸对谷氨酸的置换。该突变位于用作至活性部位的门的c-末端α螺旋上。

[0318] 实施例4.第二代置换文库筛选(permutational library screening)

[0319] 分析表现最佳的第一代变体的序列，在组合位置335、336、339、340的区域中产生了第二代置换文库。该文库的理论多样性为640。如实施3中所述进行筛选。产生了靶向位置188、189和190的另一个第二代置换文库，使用棕色测定来测量所述文库。

[0320] 滴定数据显示变体PfHPPDEvo36(SEQ ID NO:7)相较于PfG336W具有16倍的增强的对TBT和DKN的耐受性。其相对于PfHPPDEvo33具有4倍增强的耐受性。再次地通过SDS-PAGE分析蛋白质表达，发现变体表达等量的HPPD蛋白。PfHPPDEvo36相对于PfG336W在位置335上具有丝氨酸对谷氨酸的置换，在位置336上具有丝氨酸对色氨酸的置换，在位置339上具有苏氨酸对赖氨酸的置换，和位置340上具有谷氨酰胺对丙氨酸的置换。

[0321] 滴定数据显示变体PfHPPDEvo37(SEQ ID NO:3)相较于PfG336W具有增强的对TBT和DKN的耐受性。PfHPPDEvo37相对于PfG336W在位置188上具有色氨酸对丙氨酸的置换。进行SDS-PAGE分析，所述分析显示变体之间的HPPD表达水平无差异。

[0322] 滴定数据显示变体PfHPPDEvo40(SEQ ID NO:8)相较于PfG336W具有增强的对TBT和DKN的耐受性。进行SDS-PAGE分析，所述分析显示变体之间的HPPD表达水平无差异。

[0323] 还通过将表达HPPD的完整大肠杆菌细胞涂板在含有各种HPPD抑制剂的培养基上来测试变体。对于这些实验，将含有HPPD表达质粒的DH5α生长在LB培养基+卡那霉素中直至达到OD600nm＝0.5。在对应于0.016,0.008,0.004和0.002的OD600值的LB培养基+卡那霉素中制备细胞的系列稀释物。将各自10微升的稀释物以一式三份涂板在不含HPPD抑制剂，含有250uM TBT，250uM DKN和250uM硝磺草酮(MST)的板上。将板在37℃温育18小时。进行SDS-PAGE分析，所述分析显示变体之间的HPPD表达水平无差异。

[0324] PfHPPDEvo40和PfHPPDEvo41(SEQ ID NO:16)在该测定中相较于PfG336W显示增强的对TBT和MST的耐受性。

[0325] 实施例5.置换突变体的酶促分析

[0326] 将PfHPPD酶的动力学活性与几个置换突变体相比较，结果示于下文表5中。“Km”(米曼氏常数)意指用于表征酶的动力学参数，其被定义为允许反应的半最大速率的底物的浓度。Km被进一步定义为反应速率达到其最大值的一半(Vmax/2)时的底物浓度，其中Vmax具有为反应的最大速率的含义。

[0327] 对于酶的比活性的测定，温育样品，24分钟后终止反应。以μg的蛋白质评估比活性。

[0328] 表5

[0329]   HPP HPP SEQ ID NO:  Km(μM) Kcat(s-1)  
PfHPPD 187 4.4 1
PfG336W 141 5.4 2
PfHPPDEvo37 220 3.0 3
C023E6 424 6.9 4
C024H11 188 0.8 5
PfHPPDEvo33 581 2.3 6
PfHPPDEvo36 602 3.3 7
PfHPPDEvo40 509 3.2 8
CO210d10 1181 1.4 9
CO212f3 297 0.9 10
C644 232 0.5 11
C645 156 0.8 12
c0216C6 1541 1.2 14
c0213H10 489 2.6 15
PfHPPDEvo41 336 1.1 16

[0330] 使用分光光度计测量法获得来自荧光假单胞菌HPPD(PfHPPD)的HPPD及其突变体的比活性。温育样品，24分钟后终止反应。以μg的蛋白质评估比活性。

[0331] 表6

[0332]HPPD 比活性(Δ吸光度/24min/μg的蛋白) SEQ ID NO:
PfHPPD 0.76 1
PfG336W 0.4 2
PfHPPDEvo37 0.36 3
C023E6 0.38 4
C024H11 0.07 5
PfHPPDEvo33 0.25 6
PfHPPDEvo36 0.82 7
PfHPPDEvo40 0.42 8
CO210d10 0.43 9
CO212f3 0.42 10
C644 0.38 11
C645 0.36 12
c0218A5 0.13 13
c0216C6 0.50 14
c0213H10 0.51 15
PfHPPDEvo41 0.44 16
C0228G9 0.17 17
C0232D2 0.06 18
C0234A4 0.33 19
C0235F6 0.53 20
C0235E2 0.34 21
C0236H7 0.36 22
C0236F8 0.47 23

[0333]C0240D2 0.32 24
C0240D12 0.29 25
C0242D4 0.21 26
C0244A2 0.25 27
C0244F5 0.22 28
C0247B6 0.37 29
C0247H7 0.28 30
C0252F11 0.26 31
C0255B12 0.21 32
C0255C1 0.17 33
C0255C3 0.19 34
C0255E6 0.15 35
C0255E10 0.24 36
C0256B1 0.31 37
C0256G11 0.33 38
C0256H4 0.19 39
C0257C5 0.3 40
C0260E11 0.79 41
C0260C6 0.51 42
C0262C4 0.81 43
C0262F11 0.76 44
C0263B7 0.43 45
C0263G12 0.77 46
C0261H2 0.42 47
C0264G5 0.71 48
C0264G7 0.35 49
C0266A11 0.33 50

[0334] 例如表6中显示的，在酶的野生型与大多数突变体之间的活性不存在显著差异。因此，观察到的耐受性可能归因于酶的固有性质而非归因于功能障碍或更慢的将4-羟基苯丙酮酸转化成尿黑酸的活性。

[0335] 还使用分光光度计测量测定法测量对二酮腈(异噁唑草酮的活性形式)和硝磺草酮的耐受性。值代表pI50。“>”表示值在该测定的测量范围外(例如，酶比下文中所示值更敏感)。

[0336] 表7

[0337]HPPD pI50二酮腈 pI50硝磺草酮
  OD OD
PfHPPD >5.6 >5.6
PfG336W 4.9 5.3
PfHPPDEvo37 4.7 5.3
C023E6 4.4 5.5
C024H11 4.1 4.6
PfHPPDEvo33 4.3 5.1
PfHPPDEvo36 4.5 n.d.
PfHPPDEvo40 3.5 4.9
CO210d10 4.3 5.7
CO212f3 4.7 5.4
C644 5.3 >5.6
C645 >5.6 >5.6
c0218A5 4.4 5.1
c0216C6 4.0 4.9
c0213H10 4.9 5.2
PfHPPDEvo41 3.4 4.7
C0228G9 5.4 5.7
C0232D2 5.1 5.5
C0234A4 4.9 >5.6
C0235F6 4.7 5.5
C0235E2 4.7 5.4

[0338] C0236H7 4.7 5.3C0236F8 4.9 >5.6
C0240D2 4.9 5.4
C0240D12 4.5 5.0
C0242D4 3.6 4.5
C0244A2 4.7 5.6
C0244F5 4.3 5.3
C0247B6 5.1 >5.6
C0247H7 4.4 5.2
C0252F11 3.7 4.6
C0255B12 4.0 5.0
C0255C1 3.6 4.7
C0255C3 4.8 5.5
C0255E6 3.7 4.4
C0255E10 4.8 >5.6
C0256B1 5.0 >5.6
C0256G11 4.9 5.5
C0256H4 3.6 4.8
C0257C5 3.8 4.6
C0260E11 4.7 5.4
C0260C6 4.6 5.3
C0262C4 4.8 5.3
C0262F11 5.0 5.5
C0263B7 4.1 4.6
C0263G12 4.9 5.6
C0261H2 4.5 5.3
C0264G5 4.9 5.6
C0264G7 4.1 4.8
C0266A11 4.0 4.9

[0339] 还使用基于HPLC的测定来测量对特波三酮、二酮腈(异噁唑草酮的活性形式)和硝磺草酮的耐受性。值代表pI50。“>”意指值在该测定的测量范围外(例如，酶比下文中所示值更敏感)。

[0340] 表8

[0341]

[0342]

[0343] 如表8中显示的，几个HPPD突变体展现增强的对特波三酮、二酮腈(异噁唑草酮)和硝磺草酮的每一种的耐受性。

[0344] 还使用HPPD偶联测定(实施例2中描述的)测量选择的HPPD突变体对特波三酮、二酮腈和硝磺草酮的耐受性。值代表pI50。

[0345] 表9

[0346]

[0347] 如表9中显示的，HPPD突变体比野生型HPPD酶更加耐受测试的任何HPPD抑制剂。因此，本发明包括突变的HPPD酶，其同时对几种HPPD抑制剂显示增强的耐受性。

[0348] 还测量了表10中所列的HPPD酶的对来自WO2012/028579(其通过引用整体并入本文，但特别地关于本文表10中描述的化合物)中描述的的种类的其它HPPD抑制剂的耐受性。使用上述HPPD偶联测定(HGD)体外评估耐受性。值为pI50。

[0349] 表10

[0350]

[0351] 因此，选择的突变体展现对广泛的HPPD抑制剂除草剂的耐受性。

[0352] 实施例6.植物中的HPPD抑制剂耐受性的分析

[0353] 测试表达本发明的HPPD抑制剂耐受性酶，连同赋予对草甘膦的耐受性的基因和赋予对草铵膦的耐受性的基因的大豆植物对特波三酮的耐受性。在每一次喷雾前校准DeVries Tracker喷雾器。用于特波三酮测试的化学制剂是 SC制剂。使用184克/公顷；34.5％TBT进行喷雾测试。在喷洒后一周评价耐受性。将“+”的评级分配给在活跃生长组织中被完全漂白的植物。将“++”的评级分配具有轻微耐受性的植物，即，最新的植物组织具有一些绿色，并且未被完全漂白。将“+++”的评级分配给显示极少受喷雾影响的植物，即，存在一定的萎黄病或极轻微的漂白。这些测试的结果示于表11。

[0354] 表11

[0355] HPPD 处理的植物的数目 + ++或+++ 百分比++或+++PfG336W 2248 811 160 7.12
PfHPPDEvo37 35 17 3 8.57
PfHPPDEvo33 151 50 54 35.76
PfHPPDEvo40 207 60 65 31.4
PfHPPDEvo41 852 412 279 32.75
PfHPPDEvo36 88 47 18 20.45

[0356] 在田间试验评价了表达PfG336W和PfHPPDEvo41的T1事件(每一事件也表达赋予对草甘膦的耐受性的基因和赋予对草铵膦的耐受性的基因)。在V2-V3阶段用1X草铵膦对所述植物进行喷雾。利用草铵膦处理后5天，用2x特波三酮、2x硝磺草酮或2x异噁唑草酮进行喷雾，7天后评价植物毒性。18个表达PfHPPDEvo41的事件中有9个以及18个表达PfG336W的事件中没有一个显示低于或等于20％的来自以200g ai/ha进行的特波三酮出苗后施用的平均植物毒性。

[0357] 在阿根延的田间试验中，10个T2PfHPPDEvo41事件中的5个和3个PfGW336事件中的1个显示低于或等于18％的来自以210g ai/ha进行的异噁唑草酮出苗后施用的最大植物毒性。

[0358] 在美国(明尼苏达)进行的田间试验中，7个T2PfHPPDEvo41事件中的7个和11个PfGW336事件中的1个显示低于或等于25％的来自以200g ai/ha进行的特波三酮出苗后施用的最大植物毒性。

[0359] 实施例7:其它HPPD酶的突变体的产生

[0360] 使用将HPPD活性与可目视检测的粉红/橙色产生偶联的测定来鉴定菌株ATX22717和ATX1974。醌淬灭剂的掺入用于提高体外测定的灵敏度。使用的醌是MBTH或3-甲基-2-苯并噻唑酮腙。酚氧化酶和HPPD都是产生醌化合物作为中间产物的二加氧酶；这些醌随后迅速和自发地经历导致更加稳定的下游产品诸如黑色素(在酚氧化酶的情况下)或尿黑酸(在HPPD的情况下)形成的电子重排(在的情况下酚氧化酶)，并且是不溶性的。当与醌络合，该MBTH-醌产物产生粉红/橙色。MBTH淬火剂的添加使测定的灵敏度增加约5倍。

[0361] 将菌株于LB琼脂中生长约24小时。通过离心沉淀细胞，重新悬浮在1/2体积的20mM HEPES缓冲液，pH值7.1，通过玻珠击打法裂解菌株。将50ul的菌株提取物添加至锥形底部96孔块中的150ulMBTH测定混合物。终测定混合物含有10mM MBTH、0或1mM的羟基苯丙酮酸(HPP)、20mM HEPES缓冲液，pH值7.1和0、10μM或1mM特波三酮(TBT)。随后在评分之前，将96孔测定块在30℃于落地式摇床中以200rpm摇动约22小时。菌株ATX22717和ATX1974被证明耐受TBT。

[0362] 菌株ATX22717为从在North Carolina,United States收集的土壤样品分离的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株。

[0363] 菌株ATX1974为从在North Carolina,United States收集的土壤样品分离的伞菊假单胞菌(Pseudomonas agarici)菌株。

[0364] 使用下列步骤从所述菌株鉴定HPPD基因：

[0365] ·从菌株制备总DNA。总DNA包含基因组DNA和染色体外DNA。染色体外DNA包含一些或所有下列物质的混合物：具有不同大小的质粒；噬菌体染色体；其他未表征的染色体外分子。

[0366] ·DNA的测序。通过新一代测序方法对总DNA进行测序。

[0367] ·通过各种软件程序，通过各种软件程序，包括Newbler、phredPhrapm和CLC装置DNA序列。

[0368] ·通过DNA和蛋白质同源性算法鉴定HPPD基因。

[0369] 从菌株ATX22717鉴定Axmi305H。编码Axmi305H的核苷酸序列示于SEQ ID NO：60中，氨基酸序列示于SEQ ID NO：57中。Axmi305H与在美国专利申请公开No.20070020624中的SEQ ID NO:29696共有99.7％的同一性。

[0370] 从菌株ATX1974鉴定Axmi309H。编码Axmi309H的核苷酸序列示于SEQ ID NO：61中，氨基酸序列示于SEQ ID NO：58中。Axmi309H与 登录号No.YP_348648共有99.7％的同一性。

[0371] 菌株睾丸酮丛毛平胞菌(Comamonas testosteroni)被选定为酶促有利的HPPD的潜在来源，因为据报道其产生黑脓素，一种为HPPD活性的产物的尿黑酸的衍生物(Turick等人,2005,Microbial Metabolite Field Deployment Report.WSRC-TR-2005-00455)。

[0372] BLAST公共数据库的检索表明，在细菌物种睾丸酮丛毛平胞菌中存在2种截然不同的HPPD，一种在长度上为362个氨基酸，另一种在长度上为373个氨基酸。利用基于报导的睾丸酮丛毛平胞菌菌株CNB-2、KF-1和S44的核苷酸序列(如在BLAST数据库中发现的)设计用于两个HPPD基因的每一个的引物对睾丸酮丛毛平胞菌基因组DNA( 目录号700441)进行PCR扩增。

[0373] 用BspHI和Xba I消化PCR产物，随后将其克隆进利用NcoI和XbaI切割的pSE420中。

[0374] 373个氨基酸长的HPPD的核苷酸和推导的氨基酸序列与如BLAST搜索中所示的睾丸酮丛毛平胞菌HPPD的任何报导的序列不相同。其与睾丸酮丛毛平胞菌S44具有99％的相似性。该新型序列现称为Axmi428H。编码Axmi428H的核苷酸序列示于SEQ ID NO：62中，氨基酸序列示于SEQ ID NO：59中。

[0375] 活性HPPD酶将产生棕色色素黑脓素，因为其将羟基苯丙酮酸转化成尿黑酸。该色素的生产可被可视化。将表达Axmi428H蛋白的DH5α细胞在LB培养基中生长至饱和，然后将10μl饱和培养物点样至含有0、0.5、1.0和2.0mm特波三酮的100μl LB琼脂平板上。在于37℃再另外生长约16小时后对细胞进行拍照。

[0376] 还使用体外动力学测定表征Axmi428H，所述测定将尿黑酸的产生与尿黑酸1,2-二加氧酶(HGO)偶联。HGO将尿黑酸转化成被监测的马来酰基乙酰乙酸盐，因为其在321nm强烈地吸收。在不同浓度(从有限至饱和)的底物存在的情况下在96孔分光光度计中连续监测产物的实时产生，这使得有可能使用标准米曼氏动力学来测定酶的Km。Ki可通过将在不同量的抑制剂特波三酮存在的情况下将该Km的变化作图来测定。

[0377] 对于该测定，通过在以250rpm摇动的情况下在37℃生长转化DH5α细胞直至培养物达到0.6–0.7的OD600来制备Axmi428H酶。随后将温度降至30℃，将培养物继续摇动约20小时。将细胞培养物通过离心沉淀，并重新悬浮于1/20体积的20mM HEPES，pH为7.0，50mM NaCl缓冲液中。通过添加LYSONASETM(Novagen)，在室温进行45分钟来裂解细胞，将其在-20℃冷冻至少1小时。在即将测定前，将细胞提取物解冻，通过离心澄清，并在不同底物和抑制剂水平(使HGO酶过量)存在的情况下测定其活性。动力学数据的分析产生下表中指示的动力学常数。Axmi428H具有与突变的PfG336W基因相似水平的对特波三酮的耐受性，两者都显示比天然大豆HPPD更高的耐受性。

[0378] 表12

[0379] 基因 Km HPP(μM) Vmax Ki TBT(μM)Soy HPPD 32.5 79 0.04
W336 152 35 2.49
Axmi428H 52 22.6 1.37

[0380] 在其它天然HPPD酶(包括Axmi305H、Axmi309H和Axmi428H)的对应位置上引入存在于本文中描述的一些突变HPPD酶中的突变，以试图增强这些酶的耐受性。

[0381] 表13显示不同HPPD蛋白之间的序列同一性。利用AlignX进行比对。

[0382] 表13

[0383]  PfG336W Axmi309H Axmi428H Axmi305H
PfG336W 100 94 56 53
Axmi309H 94 100 56 54
Axmi428H 56 56 100 54
Axmi305H 53 54 54 100

[0384] Lightning定点诱变试剂盒用于载体pSE420中的基因的定点诱变。将通过该方法产生的突变体转化进Bl21-DE3*细胞中，在LB培养基中生长至饱和。随后将等分点样在含有不同量的特波三酮的LB琼脂糖板上。通过该方法，在于板上生长约24小时后活性HPPD酶将产生棕色色素。通过使用该测定，已显示所有产生的突变体具有高度抗特波三酮产生的抑制的HPPD活性。

[0385] 使用HPPD偶联法测量突变体对特波三酮、二酮腈(异噁唑草酮)和硝磺草酮的耐受性。结果示于表14中。“>>”意指在测量范围之外但高度优于下文中列出的数目。

[0386] 表14

[0387]

[0388] 表14的数据显示本文中鉴定的突变或突变的组合有效地负责增强的对HPPD抑制剂的耐受性，无论它们被引入其中的HPPD蛋白的性质如何。

[0389] 实施例8.HPPD基因至植物表达盒中的克隆

[0390] 对于本文中描述的HPPD基因的每一个基因，开放阅读框架(ORF)通过PCR从全长DNA模板扩增。在PCR过程中可将Hind III限制性位点添加至ORF的每一个末端。此外，可将核苷酸序列ACC直接添加在基因的起始密码子的5′以增加翻译效率(Kozak(1987)Nucleic Acids Research 15:8125-8148；Joshi(1987)Nucleic Acids Research 15:6643-6653)。可克隆PCR产生，使用本领域公知的技术对其进行测序以确保在PCR期间未引入突变。

[0391] 可用Hind III消化含有PCR产物的质粒，可分离含有完整ORF的片段。可将该片段克隆进质粒诸如pAX200(一个含有水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人(1991)Molec.Gen.Genet.231:150-160)和PinII终止子(An等人(1989)The Plant Cell 1:115-
122)的植物表达载体)的Hind III位点。随后可将来自该中间质粒的启动子–基因–终止子片段亚克隆进质粒pSB11(Japan Tobacco,Inc.)中以形成最终基于pSB11的质粒。通常这样组织这些基于pSB11的质粒以便可利用限制性内切酶诸如Kpn I和Pme I通过双重消化来切割含有启动子-基因-终止子构建体的DNA片段，随后通过气溶胶束注射将其用于转化进植物中。所得的基于pSB11的克隆的结构可通过限制性内切酶消化和凝胶电泳，以及通过跨各个克隆接合处测序来验证。

[0392] 可使用本领域熟知的三亲融合程序，将质粒动员至还具有质粒pSB1的根癌农杆菌菌株LBA4404(Japan Tobacco,Inc.)中，随后将其涂板在含有壮观霉素的培养基上。基于pSB11的质粒克隆携带壮观霉素抗性但为窄宿主范围质粒并且不能在农杆菌中复制。当基于pSB11的质粒通过重源重组整合进宽范宿主范围质粒pSB1中时，抗壮观霉素菌落产生。pSB1和基于pSB11的质粒的共整合产物可通过Southern杂交来验证。具有共合体的农杆菌菌株可用于通过本领域已知的方法诸如，例如PureIntro法(Japan Tobacco)来转化玉米。

[0393] 实施例9.大豆转化

[0394] 使用本领域公知的方法，诸如描述的使用根癌农杆菌介导的转化大豆半种子外植体(使用基本上由Paz等人(2006),Plant cell Rep.25:206描述的方法)的方法来实现大豆转化。使用异噁唑草酮或特波三酮作为选择标记来鉴定转化体。观察到绿芽的出现，将其记录为对除草剂异噁唑草酮或特波三酮的耐受性的指示。耐受性转基因芽将显示可与未用异噁唑草酮或特波三酮处理的野生型大豆芽相比较的正常转绿，然而用相同量的异噁唑草酮或特波三酮处理的野生型大豆芽将完全被漂白。这表明HPPD蛋白的存在使得能够产生对HPPD抑制剂除草剂例如异噁唑草酮或特波三酮的耐受性。

[0395] 将耐受性绿芽转移至生根培养基或进行移植。适应环境一段时间后，将生根的幼苗转移至温室。随后用HPPD抑制剂除草剂如例如用特波三酮以100g AI/ha的比率对含有转基因的植物进行喷雾。施用后10天，评价因除草剂的施用而导致的症状，并将其与对在相同条件下的野生型植物观察到的症状相比较。

[0396] 实施例10：棉花T0植物的建立和选择

[0397] 使用本领域公知的方法，尤其是PCT专利公开WO 00/71733中描述的方法中的优选方法来实现棉花转化。将再生植物转移至温室。在适应环境一段时间后，用等于100gAI/ha的补充以硫酸铵和甲酯菜油的特波三酮对充分生长的植物进行HPPD抑制剂除草剂喷雾。喷雾施用7天后，评价因利用除草剂处理而导致的症状，将其与对在相同条件下经历相同处理的野生型棉花植物观察到的症状相比较。

[0398] 实施例11.通过农杆菌介导的转化进行的玉米植物细胞的转化

[0399] 在授粉后8-12天最好地收集穗。从穗分离胚，那些在尺寸上为0.8-1.5mm的胚对于用于转化是优选的。将胚胚鳞朝上地涂板在适当的温育培养基上，并在黑暗中于25℃温育过夜。

[0400] 然而，不必本身过夜温育胚胎。将胚与含有具有本发明的核苷酸序列的适当载体的农杆菌菌株接触，以进行Ti质粒介导的转移，持续5-10分钟，随后将其涂板在共培养培养基上，进行约3天(在黑暗中25℃)。共培养后，将外植体转移至恢复期培养基中进行约5天(在黑暗中，于25℃)。取决于利用的特定选择的性质和特征，将外植体在选择培养中温育多达8周。在选择周期后，将所得愈伤组织转移至胚成熟培养基，直至观察到成熟的体细胞胚形成。随后将所得成熟体细胞胚置于弱光下，如本领域中已知的，起始再生过程。让所得的芽在生根培养基上生根，随后将所得的植物转移至育苗盆并作为转基因植物进行繁殖。

[0401] 本说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域内普通技术人员的技能水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其引用程度就如同每一个单独的出版物或专利申请被明确地和单独地通过引用并入一样。

[0402] 尽管上述发明已通过举例说明和实施例(为了清楚地理解)的方式在一定程度上详细地进行了描述，但显而易见的是可在所附权利要求的范围内施用某些变化和变动。