技术领域
[0001] 本
发明涉及化合物领域，具体涉及一种化合物及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 白腐
真菌在自然界
生态系统中发挥重要作用，是一种宝贵的
生物资源，是环境治理的工具和研究模式对象。白腐真菌在降解难降解污染物前不需经过特定污染物的预条件化，能够降解大量结构不同的污染物，并且对营养条件要求低，能够节省成本。白腐真菌Phanerochaete sordida YK-624(以下简称YK-624)对黄曲霉毒素等众多难降解污染物的能
力都有高于模式菌株黄孢原毛平革菌。白腐真菌在处理有机污染物中显示了广阔的前景，充分利用白腐真菌对环境修复的现实意义。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于提供一种化合物及其制备方法和应用。
[0004] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种化合物，所述化合物的结构式如式(Ⅰ)所示：
[0005] 分子式C7H12N4O3，分子量200，命名为：N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺，英文命名为：N-((4aS,7aS,E)-
1-methylhexahydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2(1H)-ylidene)nitramide(PHPF)。
[0006] 本发明还提供一种N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0007] (1)将白腐真菌(YK-624)进行液体培养；
[0008] (2)将液体培养后的白腐真菌及液体培养基与呋虫胺混合，24～30℃静置20天以上；
[0009] (3)将静置后的液体培养基与白腐真菌分离，向分离后的液体中加入辛醇/
水分配系数的对数值范围在0.70-0.80的
有机溶剂萃取，得到上清液；
[0010] (4)浓缩上清液，并用
硅胶色谱法进行梯度洗脱，薄层色谱法进行代谢产物的
跟踪；
[0011] (5)硅胶色谱分离得到的产物通过制备液相色谱进一步分离纯化，得到高纯度的N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺。
[0012] 所述液体培养的液体培养基包括以下重量份的组分：9-11份
葡萄糖，0.2-0.3份
酒石酸铵，1.5-1.7份无水乙酸钠和95-105份Kirk盐溶液。
[0013] 其中，所述Kirk盐溶液包括以下重量百分比的组分：1.8-2.2％
磷酸二氢
钾，0.4-0.6％七水合
硫酸镁，0.11-0.15％二水合氯化
钙，0.0009-0.0011％
盐酸硫胺，1.5-1.8％Kirk微量元素溶液。
[0014] 所述Kirk微量元素溶液包括以下重量比组分：0.8-1％次氮基三酶酸酯(Nitrilotriacetate)，0.30.2-0.4％七水合
硫酸镁，0.3-0.5％一水硫酸锰，0.5-0.7％
氯化钠，0.04-0.07％七水合硫酸亚
铁，0.09-0.12％七水合硫酸钴，0.09-0.12％七水合硫酸锌，0.05-0.07％二水合
氯化钙，0.005-0.007％五水合硫酸
铜，0.009-0.012％十二水合硫酸
铝钾，0.005-0.007％
硼酸，0.006-0.008％二水合钼酸钠。
[0015] 优选地，所述液体培养的液体培养基包括以下重量份的组分：10份葡萄糖，0.221份酒石酸铵，1.64份无水乙酸钠和100份Kirk盐溶液。
[0016] 优选地，所述Kirk盐溶液包括以下重量百分比的组分：2％磷酸二氢钾，0.5％七水合硫酸镁，0.13％二水合氯化钙，0.001％盐酸硫胺，1.67％Kirk微量元素溶液。
[0017] 所述Kirk微量元素溶液包括以下重量比组分：0.9％Nitrilotriacetate，0.3％七水合硫酸镁，0.42％一水硫酸锰，0.6％氯化钠，0.06％七水合硫酸亚铁，0.11％七水合硫酸钴，0.11％七水合硫酸锌，0.06％二水合氯化钙，0.006％五水合硫酸铜，0.011％十二水合硫酸铝钾，0.006％硼酸，0.007％二水合钼酸钠。
[0018] 优选地，所述白腐真菌(YK-624)进行液体培养方法是：取在土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)上活化的白腐真菌菌丝片接种在所述液体培养基，24～30℃进行液体培养。
[0019] 优选地，所述活化的方法为：在土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)上活化，土豆葡萄糖琼脂培养基包括以下组分：土豆20％，葡萄糖2％，琼脂2％。
[0020] 优选地，步骤(2)中所述静置
温度为30℃。
[0021] 优选地，步骤(1)中培养的时间为3～5天。
[0022] 优选地，步骤(1)中液体培养的温度为24-30℃。
[0023] 优选地，所述呋虫胺在液体培养基中的浓度为0.05-0.15mmol/L。
[0024] 优选地，所述呋虫胺在液体培养基中的浓度为0.1mmol/L。
[0026] 优选地，所述萃取的方法包括步骤：用0.5-2倍所述分离后的液体体积的乙酸乙酯萃取2-3次得到的上清液。
[0027] 优选地，所述制备色谱的色谱柱的型号为：Inertsil C30 S-Select 5m 20x 250mm。
[0028] 优选地，步骤(3)中液体培养基与白腐真菌分离的方式选自离心或过滤。
[0029] 优选地，所述浓缩上清液的方法选自旋转
蒸发或
冷冻干燥。
[0030] 本发明还提供一种N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺在制备用于抑制人骨髓神经母细胞瘤细胞存活的药物的用途。
[0031] 本发明还提供一种N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺在制备用于
预防和
治疗腹部
肿瘤、胸部肿瘤、椎旁肿瘤、副肿瘤综合征或转移性肿瘤
疾病的药物的用途。
[0032] 本发明的有益效果在于：本发明提供了一种化合物及制备方法，发明的制备方法利用白腐真菌(YK-624)对呋虫胺进行作用，对作用的产物进行了定性分析，制备了一种新的化合物，N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺，制备得到的化合物能够抑制骨髓神经母细胞瘤细胞存活，所述制备方法利用
微生物，白腐真菌繁殖快，能够广泛应用，生产成本低，而且可以同时用于降解呋虫胺。
附图说明
[0033] 图1为N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺的结构式图。
[0034] 图2为N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺的质谱图。
[0035] 图3为N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺的1H-NMR(CD3OD)图。
[0036] 图4为N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺的13C-NMR(CD3OD)图。
[0037] 图5为N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺抑制人骨髓神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y的效果图。
具体实施方式
[0038] 下面结合
实施例对本发明进行具体说明，但不限于此。
[0039] 实施例1
[0040] 1.实验材料
[0041] 白腐真菌YK-624用土豆葡萄糖琼脂培养基(PDA，成分：土豆20％，葡萄糖2％，琼脂2％)进行传代扩大培养，4℃
冰箱内保存备用。
[0042] 2.本发明的一种N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0043] (1)取在PDA培养基上活化的两片直径10mm的白腐真菌(YK-624)菌丝片30℃下进行液体培养；
[0044] (2)将液体培养后的白腐真菌及液体培养基与呋虫胺混合，30℃静置20天以上；
[0045] (3)将静置后液体培养基与白腐真菌分离，向分离后的液体中加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并上清液；
[0046] (4)选装蒸发浓缩上清液，并用硅胶色谱法进行梯度洗脱，薄层色谱法进行代谢产物的跟踪；
[0047] (5)硅胶色谱分离得到的产物通过制备液相色谱进一步分离纯化。
[0048] 所述制备色谱的色谱柱的型号为：Inertsil C30 S-Select 5m 20x 250mm。
[0049] 所述液体培养的液体培养基包括以下重量份的组分：10份葡萄糖，0.221份酒石酸铵，1.64份无水乙酸钠和100份Kirk盐溶液。
[0050] 所述Kirk盐溶液包括以下重量百分比的组分：2％磷酸二氢钾，0.5％七水合硫酸镁，0.13％二水合氯化钙，0.001％盐酸硫胺，1.67％Kirk微量元素溶液。
[0051] 所述Kirk微量元素溶液包括以下重量比组分：0.9％Nitrilotriacetate，0.3％七水合硫酸镁，0.42％一水硫酸锰，0.6％氯化钠，0.06％七水合硫酸亚铁，0.11％七水合硫酸钴，0.11％七水合硫酸锌，0.06％二水合氯化钙，0.006％五水合硫酸铜，0.011％十二水合硫酸铝钾，0.006％硼酸，0.007％二水合钼酸钠。
[0052] 3.纯化后化合物的定性分析
[0053] (1)通过ESI-TOF-MS分析，其质谱图[M-H]-如图2所示，[M-H]-＝199.02知化合物的分子量为200。
[0054] (2)通过
核磁共振波谱分析，其在CD3OD中的氢谱图如图3所示，其在CD3OD中的
碳谱图如图4所示。对氢谱图位移响应的分析和对碳谱图位移响应的分析，结果如表1所示。
[0055] 表1
[0056]
[0057] 通过对化合物1H-NMR(CD3OD)谱图和13C-NMR(CD3OD)谱图及质谱图的分析，确认制备得到的化合物的结构式如下：
[0058] 分子式C7H12N4O3，分子量200，命名为：N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺，英文命名为：N-((4aS,7aS,E)-1-methylhexahydrofuro[2,3-d]pyrimidin-2(1H)-ylidene)nitramide(PHPF)。
[0059] 实施例3
[0060] 一种N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺在制备用于抑制人骨髓神经母细胞瘤细胞存活的药物的用途的实施例。
[0061] 向人骨髓神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y中添加0.3mM的N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺，对照组添加不含有硝酰胺的DMSO溶剂，发现与对照组相比，相对有69.3％的细胞存活，说明N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺能够抑制人骨髓神经母细胞瘤细胞存活。
[0062] 因此，N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺能够用于制备用于抑制人骨髓神经母细胞瘤细胞存活的药物，N-((4aS，7aS，E)-1-甲基六氢呋喃[2,3-d]嘧啶-2(1H)-亚基)硝酰胺能够用于制备治疗和预防人骨髓神经母细胞瘤细胞引起的疾病的药物，人骨髓神经母细胞瘤细胞引起的疾病包括腹部肿瘤、胸部肿瘤、椎旁肿瘤、副肿瘤综合征或转移性肿瘤疾病。
[0063] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行
修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
