一株藏红花内生真菌及其粗多糖和制备方法与用途
阅读：1发布：2020-11-17
专利汇可以提供一株藏红花内生真菌及其粗多糖和制备方法与用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 多糖制备技术领域，公开了一株藏红花内生 真菌 及其粗多糖和制备方法与用途。将其命名为Penicillium sp.#CSL-27，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M2013228，保藏时间为2013年5月21日。本发明还提供了一种基于上述菌株的粗多糖，其具有显著的抗 氧 化活性，并表现出明显的量效相关性；实验证明具有清除自由基、抑制细菌生长及抑制 肿瘤 细胞增殖 作用，是一种天然的抗 氧化剂 、 抑菌剂 和 抗肿瘤剂 ，可应用于食品和医药等领域，特别适用于制备抗氧化剂、抑菌剂和抗肿瘤药物。本发明还提供了一种基于上述粗多糖的抗氧化剂。，下面是一株藏红花内生真菌及其粗多糖和制备方法与用途专利的具体信息内容。
1.一株藏红花内生真菌，其特征在于，将其命名为Penicillium sp.#CSL-27，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M2013228，保藏时间为2013年5月21日。
2.根据权利要求1所述的藏红花内生真菌，其特征在于：所述藏红花内生真菌在PDA培养基上28℃培养7天，菌落直径20mm，质地稍厚，粉末状，中央隆起，略显龟裂；菌落颜色由外向内依次为白色、铜绿色和黄绿色；有橙黄色可溶性色素产生，菌落反面橙黄色；孢梗茎较长，具横隔，壁光滑，帚状枝单轮生，偶见双轮生；分生孢子，成串珠型，相互交联。
3.一种粗多糖，其特征在于：基于权利要求1所述藏红花内生真菌制备得到。
4.根据权利要求3所述的粗多糖，其特征在于：所述粗多糖是通过对所述藏红花内生真菌培养发酵后，从发酵液中分离得到，包含以下步骤：将藏红花内生真菌接种到PYG液体培养基中培养发酵，过滤，得到发酵液；对发酵液进行浓缩、离心、醇沉分离，冻干，得到粗多糖。
5.根据权利要求4所述的粗多糖，其特征在于：所述培养发酵的条件为：25～28℃，摇床转速为100～200rpm，发酵周期为5～10天。
6.根据权利要求4所述的粗多糖，其特征在于：所述PYG液体培养基的配方为：酵母浸膏0.5～1.5g，蛋白胨1.5～2.5g，葡萄糖8～12g，氯化钠1.5～2.5g，pH 6.8～7.2，加水至总体积1000mL。
7.根据权利要求4所述的粗多糖，其特征在于：所述醇沉分离的操作为：往发酵液离心、去掉沉淀后的上清液中加入3～5倍体积的乙醇，静置、离心，冻干，得到粗多糖。
8.根据权利要求3～7任一项所述的粗多糖在食品和医药领域中的应用。
9.根据权利要求3～7任一项所述的粗多糖在制备抗氧化剂、抑菌剂和抗肿瘤药物中的应用。
10.一种基于权利要求3所述的粗多糖的抗氧化剂，其特征在于：其抗氧化活性物质包含权利要求3所述的粗多糖。
一株藏红花内生真菌及其粗多糖和制备方法与用途
技术领域
背景技术
[0002] 藏红花(Crocus sativus L.)也称西红花、番红花，系鸢尾科(Iridaceae)番红花属(Crocus L.)多年生草本植物，是我国一种名贵传统中药材。其性味甘平，具有活血化瘀、解郁安神、增强免疫力、降低胆固醇之功效。近年来，随着现代医学、药学以及分子生物学技术的飞速发展，发现藏红花在抗肿瘤、保护神经系统及抗心血管系统疾病等方面有良好功效，几乎无毒副作用。然而，藏红花只是柱头入药，产量极低；又因为其资源极其有限，致使其价格昂贵，一直被誉为“植物黄金”，难以满足市场的需求。
[0003] 植物内生真菌(Endophytic fungus)是指生活在健康植物组织和器官内部的菌，是与宿主植物在长期共同进化过程中衍生的一类微生物。1993年美国科学家Stierle等从短叶红豆杉分离得到一株产新型抗癌物质紫杉醇的内生真菌，掀起了从植物中分离内生真菌并对其药理活性和机理研究的热潮。有研究表明，植物内生真菌可产生与宿主植物相似或相同活性成分的代谢产物。内生真菌也易于发酵培养，便于工业化生产。利用内生真菌发酵实现生物活性物质的工业化生产，可以提高产品产量、降低成本，满足市场的需求。因此，内生真菌有望代替药用植物，从而解决许多药用植物被大量采伐而引起的资源和生态危机，有利于珍稀濒危药用植物资源的保护。
[0004] 真菌多糖(Polysaccharides)是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离出的由10个分子以上的单糖通过糖苷键连接而成的高分子多聚物。大量的药理及临床研究证实，真菌多糖具有增强免疫、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抑菌、抗辐射、抗衰老、抗凝血等活性。
[0005] 现 有 技 术 中，Escribano 等 (Production of a cytotoxic proteoglycan using callus culture of saffron corms(Crocus sativus L.)[J].JBiotechnol,1999,73(1):53-59.)研究发现，从藏红花球茎分离出的一种蛋白多糖能显著抑制体外子宫上皮癌细胞的生长，且具有显著的细胞毒性作用。赵成刚等(西红花花瓣粗多糖提取纯化工艺及体外抗氧化研究[J].食品工业,2012,1:1-4.)对藏红花花瓣粗多糖进行了提取，表明其对羟自由基、DPPH自由基均有一定的清除作用。焉兆萍等(藏红花内生真菌的分离和代谢产物的初步研究[J].上海师范大学学报:自然科学版,2010,39(1):71-78.)从藏红花中分离得到60株内生真菌，筛选出12株内生真菌对4种病原菌有一定的抑制作用。Raj等(Biodiversity of endophytic fungi in saffron(Crocus sativus)and antimicrobial activity of their crude extract[J].Indo American Journal of Pharm Research,2013,3(4):3702-3713.)从藏红花中分离得到47株内生真菌，对6种病原菌有一定的抑制作用。上述所有研究均为藏红花或其内生菌小分子的次级代谢产物，未见对大分子初级代谢产物多糖的研究。
[0006] 目前，对于藏红花内生真菌方面的研究报道还非常少，且对于藏红花内生真菌粗多糖的开发和应用更有待人们做进一步的探索和研究。
发明内容
[0007] 为了克服上述药用植物藏红花资源稀缺、可用成分少、培养难以扩大而导致的产量低，本发明首要目的在于提供一株藏红花内生真菌。
[0008] 本发明另一目的在于提供一种基于上述藏红花内生真菌的粗多糖。本发明以藏红花内生真菌的代谢产物为新药源，研究开发新的活性物质。所得粗多糖具有显著的抗氧化活性，并表现出明显的量效相关性。
[0009] 本发明的再一目的在于提供上述藏红花内生真菌的粗多糖在食品和医药领域中的应用。
[0010] 本发明的再一目的在于提供一种基于上述粗多糖的抗氧化剂。
[0011] 本发明的目的通过下述方案实现：
[0012] 一株藏红花内生真菌，将其命名为Penicillium sp.#CSL-27，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M2013228，保藏时间为2013年5月21日。
[0013] 所述藏红花内生真菌在PDA培养基上28℃培养7天，菌落直径20mm，质地稍厚，粉末状，中央隆起，略显龟裂；菌落颜色由外向内依次为白色、铜绿色和黄绿色；有橙黄色可溶性色素产生，菌落反面橙黄色；孢梗茎较长，具横隔，壁光滑，帚状枝单轮生，偶见双轮生；分生孢子，成串珠型，相互交联。
[0014] 一种粗多糖，基于上述藏红花内生真菌制备得到。
[0015] 所述粗多糖是通过对上述藏红花内生真菌培养发酵后，从发酵液中分离得到，优选包含以下步骤：
[0016] 将本发明藏红花内生真菌接种到PYG液体培养基中培养发酵，过滤，得到发酵液；对发酵液进行浓缩、离心、醇沉分离，得到粗多糖。
[0017] 所述培养发酵的条件为：25～28℃，摇床转速为100～200rpm，发酵周期为5～10天。
[0019] 所述PYG液体培养基的pH值不在上述范围时，可使用5wt％NaOH溶液或5v/v％HCl溶液进行调节。
[0020] 所述醇沉分离的操作为：发酵液离心、去掉沉淀，其上清液中加入3～5倍体积的乙醇，静置、离心，得到沉淀物，即为粗多糖。
[0021] 所述醇沉分离使用的乙醇优选为95v/v％的乙醇。
[0022] 所述接种的量优选为1v/v％以上，更优选为1～5v/v％。
[0023] 上述醇沉分离得到的沉淀物优选依次使用无水乙醇、丙酮洗涤。
[0025] 一种抗氧化剂，基于上述粗多糖制备得到，其抗氧化活性物质包含上述粗多糖。
[0026] 本发明的机理为：
[0027] 本发明针对药用植物藏红花资源稀缺、可用成分少、培养难以扩大而导致的产量低、价格昂贵的问题，根据植物内生真菌的共生理论，分离到一株新的藏红花内生真菌，再以其代谢产物为新药源，提供了一种藏红花内生真菌粗多糖，所得粗多糖具有显著的抗氧化活性，并表现出明显的量效相关性。
[0028] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
[0029] (1)本发明从藏红花中分离得到一株新的藏红花内生真菌，从其代谢产物中分离得到的粗多糖，具有显著的抗氧化活性，并表现出明显的量效相关性；实验证明具有清除自由基、抑制细菌生长及抑制肿瘤细胞增殖作用，是一种天然的抗氧化剂、抑菌剂和抗肿瘤剂，可应用于食品、医药和化妆品等领域。
[0031] 图1是本发明的藏红花内生真菌的显微结构(400倍)。
[0032] 图2为实施例2中不同浓度的藏红花内生真菌粗多糖对DPPH自由基清除作用的试验结果。
[0033] 图3为实施例2中不同浓度的藏红花内生真菌粗多糖对羟自由基清除作用的试验结果。
[0034] 图4为实施例2中不同浓度的藏红花内生真菌粗多糖对超氧阴离子自由基清除作用的试验结果。
[0035] 图5为实施例2中不同浓度的藏红花内生真菌粗多糖对大鼠红细胞氧化性溶血抑制作用的试验结果。
[0036] 图6为实施例2中不同浓度的藏红花内生真菌粗多糖对大鼠红细胞MDA生成的抑制作用的试验结果。
[0037] 图7为实施例3中不同浓度的藏红花内生真菌粗多糖对金黄色葡萄球菌的抑制作用，其中，培养皿中间为阴性对照，“1”处为阳性对照，“2”处为150mg/mL的粗多糖，“3”处为200mg/mL的粗多糖。
[0038] 图8为实施例4中不同浓度的藏红花内生真菌粗多糖分别对K562、HL-60、Hela和A549肿瘤细胞毒性试验结果。
具体实施方式
[0039] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0040] 实施例1：藏红花内生真菌粗多糖的制备
[0041] 1、培养基的制备：
[0042] 本发明所述的PDA培养基和PYG液体培养基为常规的培养基，可通过以下方法配得。
[0044] (2)PYG液体培养基：酵母浸膏1g，蛋白胨2g，葡萄糖10g，氯化钠2g，pH 6.8～7.2，去离子水定容至1000mL。
[0045] 使用上述培养基均在温度121℃，压力0.1MPa下灭菌20min。
[0046] 2、菌种的活化：
[0047] 所述内生真菌，通过严格的表面消毒方法，运用内生真菌分离、纯化技术，从健康的藏红花球茎分离得到。具体包括以下步骤：将藏红花球茎洗净，下述操作均在无菌条件进行。依次浸泡于75％乙醇1min、有效氯浓度为5％的次氯酸钠5min和75％乙醇1min。用蒸馏水洗涤三遍以除去球茎表面的杀菌剂，滤纸吸干表面水分。用刀片将球茎表面消毒
2
后的藏红花，分割成约0.5×0.5cm大小的组织块，将组织块置于含有氯霉素(0.1g/L)的PDA培养基上。最后一次清洗的蒸馏水作为阴性对照。以上培养皿分别置于恒温恒湿培养箱中，28℃、80％湿度中培养。待组织块有菌丝体长出，则通过菌丝尖端纯化法将菌丝接入新的PDA培养基上，反复纯化，得单一菌落，4℃保藏于PDA斜面培养基上。所用藏红花球茎购自河南农业大学。所得的菌株经ITS序列分析，其序列(如下所示)与GenBank中登陆号为EU833215.1的Penicillium commune菌株同源性为99％，证实其分类命名为青霉菌(Penicillium sp.)，将其命名为Penicillium sp.#CSL-27，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2013年5月21日，保藏编号CCTCC No：M2013228。
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后的藏红花，分割成约0.5×0.5cm大小的组织块，将组织块置于含有氯霉素(0.1g/L)的PDA培养基上。最后一次清洗的蒸馏水作为阴性对照。以上培养皿分别置于恒温恒湿培养箱中，28℃、80％湿度中培养。待组织块有菌丝体长出，则通过菌丝尖端纯化法将菌丝接入新的PDA培养基上，反复纯化，得单一菌落，4℃保藏于PDA斜面培养基上。所用藏红花球茎购自河南农业大学。所得的菌株经ITS序列分析，其序列(如下所示)与GenBank中登陆号为EU833215.1的Penicillium commune菌株同源性为99％，证实其分类命名为青霉菌(Penicillium sp.)，将其命名为Penicillium sp.#CSL-27，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2013年5月21日，保藏编号CCTCC No：M2013228。
[0048] 本发明所述内生真菌的内转录间隔区序列(ITS)如下：
[0049] AGGGCATCTACTGATCGAGGTCACCTGGAAAAAGATTGATGTGTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTGCAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGAAGGAGGACGGAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAAGTTATTTAACTAATTGCTCAGACTGCAATCTTCAGACAGCGTTCAATGGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCAGAGGGCAGATGCCCCCCGGCGGCCTTGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGATTTTTTACTTCC
[0050] 在无菌条件下，用接种环挑取少许培养于PDA斜面培养基的藏红花内生真菌(Penicillium sp.#CSL-27)，转接于装有PDA培养基的培养皿中，置恒温恒湿箱内，湿度为80％，温度为28℃，活化培养5天，得到活化菌种。
[0051] 所述内生真菌，在PDA培养基上生长缓慢，28℃培养7天，菌落直径20mm，质地稍厚，粉末状，中央隆起，略显龟裂；菌落颜色由外向内依次为白色、铜绿色和黄绿色；有橙黄色可溶性色素产生，菌落反面橙黄色。用光学显微镜观察到孢梗茎较长，具横隔，壁光滑，帚状枝单轮生，偶见双轮生；分生孢子，成串珠型，相互交联(参见图1)。
[0053] 用打孔器在无菌条件下将活化菌种打成直径为6mm的菌块，将2块菌块接种于装有250mL PYG液体培养基的500mL三角瓶内，摇床培养，转速120rpm，28℃培养3天，得种子培养液。
[0054] 4、发酵培养：
[0055] 将种子培养液接种到装有250mL PYG液体培养基的500mL三角瓶内，摇床培养，接种量2v/v％，转速120rpm，28℃培养7天，纱布过滤菌体，得发酵液。
[0056] 5、醇沉、洗涤、干燥
[0057] 将上述发酵液，低温浓缩至原体积的1/4，离心弃沉淀，取上清液。在搅拌下向上清液缓慢加入4倍体积量95v/v％乙醇，4℃静置12h，4000rpm离心15min，得沉淀物。沉淀物依次用无水乙醇、丙酮洗涤，各洗涤三遍。冻干，即得棕褐色粗多糖。
[0058] 实施例2：藏红花内生真菌粗多糖的活性
[0059] 本实施例是对实施例1中制备得到的藏红花内生真菌粗多糖进行的系列体外抗氧化试验，所得试验结果如图2～图6所示。
[0060] 1、试验方法
[0061] (1)对DPPH自由基的清除试验
[0062] 样品管中加入0.5mL不同浓度的粗多糖溶液与3.5mL的0.1mmol/L溶于80v/v％乙醇的DPPH溶液，粗多糖终浓度分别为0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL；对照组中为80v/v％乙醇；空白组中用0.5mL蒸馏水代替粗多糖溶液与3.5mL的0.1mmol/L溶于80v/v％乙醇的DPPH溶液。以上各实验组溶液混匀后，置黑暗处，室温放置30min。用0.5mL蒸馏水和3.5mL 80v/v％乙醇调零，于517nm处，1cm光径，测各管吸光度。维生素C(Vc)为阳性对照。按下公式计算粗多糖对DPPH自由基清除率：
[0063] DPPH清除率％＝[A空白–(A样-A对)]/A空白×100％
[0064] (2)对羟自由基的清除试验
[0065] 该试验方法是按羟自由基测试盒方法进行，具体试验方法参见羟自由基测试盒说明书(南京建成生物工程研究所，货号A018)。根据Fenton反应原理，取粗多糖溶液0.2mL，依次加入反应试剂，混匀，粗多糖终浓度分别为0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4和0.8mg/mL，37℃恒温水浴反应1min，立即加入显色剂终止反应，混匀，室温放置20min。
1cm光径，550nm，双蒸水调零，测各管吸光度值。对照管中用等体积的蒸馏水代替粗多糖溶液。Vc为阳性对照。按下公式计算粗多糖对羟自由基的清除率。
1cm光径，550nm，双蒸水调零，测各管吸光度值。对照管中用等体积的蒸馏水代替粗多糖溶液。Vc为阳性对照。按下公式计算粗多糖对羟自由基的清除率。
[0066] 羟自由基的清除率％＝(A对-A样)/A对×100％
[0067] (3)对超氧阴离子自由基的清除试验
[0068] 该试验方法是按抑制与产生超氧阴离子自由基试剂盒进行，具体试验方法参见抑制与产生超氧阴离子自由基试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所，货号A052)。模拟机体中黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应系统，取粗多糖溶液50μL，依次加入反应试剂，粗多糖终浓度分别为0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0和2.0mg/mL，37℃恒温水浴反应40min，加入显色剂显色，混匀，10min后在550nm处测定吸光度。对照管中用等体积的蒸馏水代替粗多糖溶液。Vc为阳性对照。按下公式计算粗多糖对超氧阴离子自由基的清除率。
[0069] 超氧阴离子自由基的清除率％＝(A对-A样)/A对×100％
[0070] (4)抑制H2O2诱导大鼠红细胞溶血及丙二醛(MDA)生成试验
[0071] SD大鼠眼眶采血，肝素钠抗凝，以3000rpm的转速离心10min，除去上清液，分离红细胞，生理盐水洗涤三次后，制成体积百分比浓度为1％的大鼠红细胞悬浮液。样品测定组为0.5mL不同浓度的粗多糖溶液，加1mL 1％大鼠红细胞悬浮液，0.2mL H2O2(终浓度为100mmol/L)，粗多糖终浓度分别为0.05、0.1、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0mg/mL；对照组用等体积生理盐水代替1％大鼠红细胞悬浮液；正常组用等体积生理盐水代替粗多糖溶液和H2O2；
模型组用等体积的生理盐水代替粗多糖溶液。摇匀，37℃孵育1h后，3000rpm，离心10min。
取上清液1mL，用3mL生理盐水稀释后，在415nm处，1cm光径，生理盐水调零，测定各管吸光度。再取上清液0.2mL，按照丙二醛(MDA)试盒的方法(南京建成生物工程研究所，货号A003-1)测定各管中MDA含量。Vc为阳性对照。用以下公式据计算粗多糖抑制率。(SD大鼠购于广州中医药大学实验动物中心)
模型组用等体积的生理盐水代替粗多糖溶液。摇匀，37℃孵育1h后，3000rpm，离心10min。
取上清液1mL，用3mL生理盐水稀释后，在415nm处，1cm光径，生理盐水调零，测定各管吸光度。再取上清液0.2mL，按照丙二醛(MDA)试盒的方法(南京建成生物工程研究所，货号A003-1)测定各管中MDA含量。Vc为阳性对照。用以下公式据计算粗多糖抑制率。(SD大鼠购于广州中医药大学实验动物中心)
[0072] 溶血率％＝(A样-A对)/A模型×100％
[0073] 溶血抑制率％＝(模型组溶血率-样品组溶血率)/(模型组溶血率-正常组溶血率)×100％
[0074] MDA含量(nmol/mL)＝[(A样-A对)/(A标准-A空白)]×标准品浓度(10nmol/mL)[0075] MDA生成抑制率％＝(模型组MDA含量-样品组MDA含量)/(模型组MDA含量-正常组MDA含量)×100％
[0076] 2、试验结果
[0077] (1)粗多糖对DPPH自由基的清除能力以清除率表示，清除率越高，说明粗多糖抗氧化作用越强。由图2可知，本发明的藏红花内生真菌粗多糖对DPPH自由基有显著的清除能力，清除作用随着浓度的增大而显著增强。在浓度为0.025～0.5mg/mL的浓度范围内，它的清除率可高达95.50±0.36％。
[0078] (2)由图3可知，粗多糖对羟自由基的清除作用较强，其清除作用在0.0125～0.8mg/mL剂量范围内显示正相关量效关系。所述粗多糖在浓度为0.4mg/mL时，清除率已高达94.39±0.15％。说明粗多糖对羟自由基有很强的清除活性。
[0079] (3)由图4可知，随着粗多糖浓度的增加，粗多糖对超氧阴离子自由基的清除活性也逐步增高，在浓度为2.0mg/mL时，所述粗多糖的清除率为76.64±0.51％。说明该粗多糖对超氧阴离子自由基具有显著的清除活性。
[0080] (4)由图5、6可知，粗多糖能够有效地抑制大鼠红细胞溶血和MDA的生成。随着粗多糖浓度的增加，溶血抑制率增强，体系中MDA的含量也逐渐减少。在浓度为2.0mg/mL时，所述粗多糖抑制红细胞溶血率为93.54±0.59％，对MDA生成抑制率为89.02±3.21％。说明粗多糖具有显著的抑制H2O2诱导大鼠血红细胞溶血和MDA生成的活性。
[0081] 实施例3：藏红花内生真菌粗多糖体外抑菌试验
[0082] 1、试验方法
[0083] (1)试验菌种：金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、产气大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、肺炎克雷氏菌(伤寒杆菌购于中国药品生物制品检定所，其余均购于中国武汉菌种保藏库)。
[0084] (2)菌悬液的配制：在37℃条件下，用LB平板培养基分别将试验菌种活化培养24h。活化菌种与无菌生理盐水混匀，得到一定浓度的菌悬液(约0.5麦氏标准液)。
[0085] (3)含样纸片的制备：将普通定性滤纸用打孔器打成若干圆形纸片，直径为6.0mm，作为空白纸片，灭菌，烘干。粗多糖溶液(150mg/mL和200mg/mL)经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，将无菌空白滤纸片放入上述不同浓度粗多糖溶液中浸润20min，30个平行样，取出自然晾干，得到含样纸片，备用；硫酸链霉素作为阳性对照，无菌生理盐水作为阴性对照。
[0086] (4)分别取上述步骤(2)的菌悬液，用无菌棉棒均匀涂于LB培养基上，再用无菌镊子将晾干的含样纸片、阳性对照纸片和阴性对照纸片均匀间隔贴于各琼脂培养基表面，将培养皿放入37℃恒温培养箱培养24h。用十字交叉法测量并记录抑菌圈的大小，结果取三次实验的平均值，见表1。(5)判断标准：不敏感(≦6mm，-)，低度敏感(≦9mm，+)，中度敏感(＞9mm，++)，高度敏感(≧15mm，+++)。
[0087] 2、试验结果
[0088] 由表1可见，试验结果表明藏红花内生真菌粗多糖在试验浓度的条件下，对所试验的细菌均具有显著的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌高度敏感，在200mg/mL时，抑菌圈直径高达18.6mm(见图7)。根据实验的抑菌结果，该藏红花内生真菌多糖有望开发成抑菌剂，应用在食品和医药领域。
[0089] 表1藏红花内生真菌粗多糖体外抑菌性能
[0090]
[0091]
[0092] 注：不敏感(≦6mm，-)，低度敏感(≦9mm，+)，中度敏感(＞9mm，++)，高度敏感(≧15mm，+++)。
[0093] 实施例4：藏红花内生真菌粗多糖的体外抗肿瘤试验
[0094] 1、试验方法
[0095] (1)(人类)肿瘤细胞株：慢性粒细胞白血病K562细胞，白血病骨髓HL-60细胞，宫颈癌Hela细胞和肺癌A549细胞(购于广州暨南生物医药研究开发基地有限公司)。
[0096] (2)采用CCK-8法体外检测粗多糖对K562、HL-60细胞增殖的影响
[0097] 分别取对数生长期的K562、HL-60细胞，调整细胞悬液至8000个/孔，往96孔细胞培养板中各孔加入100μL混匀的细胞悬液，于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育24h，加入梯度浓度的粗多糖溶液，每孔100μL。使粗多糖的最终浓度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5和10mg/mL，加等体积的DMEM培养基为空白对照，每个浓度做三个平行。在37℃含5％CO2的细胞培养箱孵育48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养4h。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的OD值。
[0098] (3)采用MTT法体外检测粗多糖对Hela、A549细胞增殖的影响
[0099] 分别取对数生长期的Hela、A549细胞，调整细胞悬液至8000个/孔。往96孔细胞培养板中各孔加入100μL混匀的细胞悬液，于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育24h，加入梯度浓度的粗多糖溶液，每孔100μL，使粗多糖的最终浓度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5和10mg/mL。加等体积的DMEM培养基为空白对照，每个浓度做三个平行。在37℃含5％CO2的细胞培养箱孵育48h后，每孔加20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。
小心吸去各孔中溶液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的OD值。
小心吸去各孔中溶液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的OD值。
[0100] (4)细胞存活率％＝样品组OD值/空白组OD值×100％
[0101] 2、试验结果
[0102] 粗多糖抗肿瘤试验结果见图8。试验结果表明，粗多糖对所试验的肿瘤细胞株增殖均具有显著的抑制作用，在10mg/mL剂量时对K562、HL-60、Hela和A549细胞增殖抑制率分别达到46.16％、44.95％、33.10％和44.95％。
[0103] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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