首页 / 专利库 / 农用化学品和农药 / 农用化学品 / 肥料 / 硫包衣尿素 / 具有修饰的性状的植物

具有修饰的性状的植物

阅读:741发布:2020-05-13

专利汇可以提供具有修饰的性状的植物专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 尤其涉及营养性 植物 部分,例如来自 高粱 属和/或玉米植物的植物部分,所述营养性植物部分包含以下的总 脂肪酸 (TFA)含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含大量增加的TFA 水 平,例如TFA含量约为5%(w/w干重)。本发明还涉及营养性植物部分作为 饲料 (feedstuff)和/或用于生产动物饲料的用途,所述饲料用于动物消耗。,下面是具有修饰的性状的植物专利的具体信息内容。

1.一种产生用于动物的饲料的方法,该方法包括以下步骤:
(i)从高粱属(Sorghum sp.)和/或玉米(Zea mays)植物收获营养性植物部分,所述营养性植物部分包含总脂肪酸(TFA)含量,所述总脂肪酸含量包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含约5%(w/w干重)的TFA含量,并且优选具有0.01至0.60之间、或在0.60至0.84之间、或在0.84至0.95之间的TAG/TFA商(TTQ),以及一个或多个步骤
(ii)将收获的植物部分与至少一种其他饲料成分混合,
(iii)打所述收获的植物部分,
(iv)将所述收获的植物部分加工为适合于由动物消耗的形式,所述加工优选通过劈砍(chopping)、切割、干燥、压榨(pressing)或造粒(pelleting)所述植物部分,和(v)将所述收获的植物部分在减条件下储存一段时间,使得所述植物部分中的至少一些化合物发酵有机酸
2.权利要求1的方法,其中以下特征中的一个或多个或全部适用:
(i)在植物的第一开花时间和种子的第一成熟期之间从植物中收获所述营养性植物部分,
(ii)所述高粱属植物是两色高粱(Sorghum bicolor)植物,
(iii)所述营养性植物部分包括叶和茎或其部分,
(iv)所述营养性植物部分包含约6%、或约8%、或约9%、或约10%(w/w干重)的平均TFA含量,
(v)所述营养性植物部分的TFA含量包含相对于相应的野生型营养性植物部分的油酸含量增加至少2%或至少3%的油酸含量,
(vi)所述营养性植物部分的TFA含量包含相对于相应的野生型营养性植物部分的棕榈酸含量增加至少2%或至少3%的棕榈酸含量,
(vii)所述营养性植物部分的TFA含量包含相对于相应的野生型营养性植物部分的ALA含量减少至少2%或至少3%的α-亚油酸(ALA)含量,
(viii)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的可溶性蛋白质含量,
(ix)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的氮含量,(x)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分减少的碳:氮比,(xi)所述高粱属和/或玉米植物的叶包含相对于相应的野生型叶增加的光合能,(xii)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分减少的总膳食纤维(TDF)含量,
(xiii)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的碳含量,(xiv)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的转录因子多肽含量,其中所述转录因子多肽选自由Wrinkled 1(WRI1)、Leafy Cotyledon 1(LEC1)、LEC1样、Leafy Cotyledon 2(LEC2)、BABY BOOM(BBM)、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4、Dof11组成的组,或者由MYB73、bZIP53、AGL15、MYB115、MYB118、TANMEI、WUS、GFR2a1、GFR2a2和PHR1组成的组,
(xv)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的脂肪酸酰基转移酶多肽含量,其中酰基转移酶是二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)和/或磷脂:二酰甘油酰基转移酶(PDAT),
(xvi)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分减少的TAG脂肪酶多肽含量,
(xvii)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分减少的三半乳糖基二酰基甘油(TGD)多肽含量,
(xviii)所述营养性植物部分包括相对于相应的野生型营养性植物部分增加的油体包衣(oil body coating,OBC)多肽或脂滴相关多肽(LDAP)的含量,
(xix)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的总蛋白质含量,
(xx)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的叶绿素含量,
(xxi)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的在重量基础上的能量含量,
(xxii)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的磷脂和/或半乳糖脂质含量,优选为增加的MDGD和/或增加的DGDG含量,
(xxiii)所述TTQ为约0.1、或约0.2或约0.3、或约0.4或约0.5、或约0.6、或约0.65、或约
0.7、或约0.75、或约0.8、或约0.81、或约0.82、或约0.83、或约0.84、或约0.85、或约8.6、或约8.7、或约8.8、或约8.9、或约0.9、或约0.91、或约0.92、或约0.93、或约0.94、或约0.95,(xxiv)所述至少一种其它饲料成分包含以下的一种或多种或全部:食用大量营养素、维生素、矿物质(如、磷、镁和硫)、干草如苜蓿干草、啤酒糟、籽粕(油菜籽或大豆)、籽、糖蜜、额外的基酸(如赖氨酸和蛋氨酸)、非蛋白质氮供应(如尿素),
(xxv)所述一段时间为一周至52周之间,
(xxvi)所述有机酸包括乙酸、丙酸或丁酸、或其任意组合,
(xxvii)所述饲料为青贮饲料、颗粒饲料或干草饲料,和
(xxviii)在与所述至少一种其他饲料成分混合之前,将所述营养性植物部分保存一段时间,
在每种情况下,所述相应的野生型植物部分在同一生长阶段从野生型高粱属植物或玉米植物收获。
3.权利要求1或权利要求2的方法,其中以下特征中的一个或多个或全部适用:
(i)所述营养性植物部分是包含以下的一种或多种的叶和/或茎或其部分:增加的碳含量、增加的能量含量、增加的可溶性蛋白质含量、减少的淀粉含量、减少的总膳食纤维(TDF)含量和增加的氮含量,各自都是在重量基础上相对于来自在同一生长阶段的野生型高粱属或玉米植物的相应野生型叶或茎或其部分,
(ii)所述营养性植物部分的TFA含量为至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、8%至75%之间、6%至20%之间、10%至75%之间之间、11%和75%之间、约
15%至75%之间、约20%至75%之间、约30%至75%之间、约40%至75%之间、约50%至
75%之间、约60%至75%之间、或约25%至50%之间(w/w干重)的TFA,
(iii)在所述营养性植物部分中以TAG形式酯化的脂肪酸为至少约1%、至少约2%、至少约3%、至少约4%、至少约5%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约
9%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约
30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约
65%、至少约70%、6%至20%之间、8%至75%之间、10%至75%之间、11%至75%之间、约
15%至75%之间、约20%至75%之间、约30%至75%之间、约40%至75%之间、约50%至
75%之间、约60%至75%之间、或约25%至50%之间(w/w干重),
(iv)所述营养性植物部分包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和减少的SDP1多肽含量,各自都是相对于相应的野生型营养性植物部分,
(v)所述营养性植物部分包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和增加的LEC2多肽含量,各自都是相对于相应的野生型营养性植物部分,
(vi)所述营养性植物部分包含增加的PDAT或DGAT多肽含量、减少的TGD多肽含量和减少的SDP1多肽含量,各自都是相对于相应的野生型营养性植物部分,
(vii)所述营养性植物部分包含减少的TAG脂肪酶含量、减少的TGD多肽的含量、以及任选地减少的TST多肽的含量,各自减少都是相对于相应的野生型营养性植物部分,所述TAG脂肪酶例如是SDP1 TAG脂肪酶,所述TGD多肽例如TGD5多肽,所述TST多肽例如是TST1多肽。
4.一种饲养动物的方法,所述方法包括将来自高粱属和/或玉米植物的营养性植物部分提供给所述动物,所述营养性植物部分包含总脂肪酸(TFA)含量,所述总脂肪酸含量包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含约5%(w/w干重),优选在约6%至约20%之间的TFA含量,并且优选具有0.01至0.60之间、或在0.60至0.84之间、或在0.84至0.95之间的TAG/TFA商(TTQ)。
5.权利要求4的方法,其中
(i)所述营养性植物部分包含于在田间生长的高粱属和/或玉米植物中,
(ii)所述营养性植物部分收获自高粱属和/或玉米植物和/或与至少一种其他饲料成分混合,
(iii)所述营养性植物部分在收获后加工为适合于由动物消耗的形式,所述加工优选通过劈砍、切割、干燥、压榨或造粒所述植物部分,
(iv)所述收获的植物部分在减氧条件下储存一段时间,使得所述植物部分中的至少一些碳水化合物在提供给动物前发酵成有机酸,和
(v)将所述收获的植物部分在收获和提供给动物之间储存一段时间。
6.权利要求4或权利要求5的方法,其中相对于当动物摄入以干重基础相同量的使用等量野生型高粱属和/或玉米植物或其部分产生的相应饲料时,所述动物摄入增加量的氮、蛋白质、碳和/或能量潜力,或减少量的淀粉或TDF。
7.权利要求4-6任一项的方法,其中适用权利要求2或权利要求3的一个或多个或全部特征。
8.一种用于动物的饲料,所述饲料包括来自高粱属和/或玉米植物的收获的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含总脂肪酸(TFA)含量,所述总脂肪酸含量包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含约5%(w/w干重),优选在约6%至约20%之间的TFA含量,并且优选具有0.01至0.60之间、或在0.60至0.84之间、或在0.84至0.95之间的TAG/TFA商(TTQ),其中
(i)所述收获的植物部分与至少一种其他饲料成分混合,
(ii)所述收获的植物部分在收获后被打捆,
(iii)所述收获的植物部分被加工为适合于由动物消耗的形式,所述加工优选通过劈砍、切割、干燥、压榨或造粒所述植物部分,和
(iv)所述收获的植物部分在减氧条件下储存一段时间,使得所述植物部分中的至少一些碳水化合物发酵成有机酸。
9.权利要求8的饲料,所述饲料是青贮饲料、颗粒饲料或干草饲料。
10.权利要求8或9的饲料,其中适用权利要求2或权利要求3的一个或多个或全部特征。
11.一种除了种子细胞之外的细胞,优选高粱属或者玉米细胞,所述细胞包含总脂肪酸(TFA)含量,所述总脂肪酸含量包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述细胞包含约5%(w/w干重)、优选约6%至约20%之间的TFA含量,并且优选具有0.01至0.60之间、或在0.60至0.84之间、或在0.84至0.95之间的TAG/TFA商(TTQ)。
12.一种细胞,优选高粱属或者玉米细胞,所述细胞包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和减少的SDP1多肽含量,各自都是相对于相应的野生型细胞。
13.一种细胞,优选高粱属或者玉米细胞,所述细胞包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和增加的LEC2多肽含量,各自都是相对于相应的野生型细胞。
14.一种细胞,优选高粱属或者玉米细胞,所述细胞包含增加的PDAT或DGAT多肽含量、减少的TGD多肽含量和减少的SDP1多肽含量,各自都是相对于相应的野生型细胞,所述TGD多肽优选TGD5多肽。
15.一种细胞,优选高粱属或者玉米细胞,所述细胞包含减少的TAG脂肪酶含量、减少的TGD多肽的含量、以及任选地减少的TST多肽的含量,各自减少都是相对于相应的野生型细胞,所述TAG脂肪酶例如是SDP1 TAG脂肪酶,所述TGD多肽例如TGD5多肽,所述TST多肽例如是TST1多肽。
16.权利要求11-15任一项的细胞,其中适用以下特征中的一个或多个或全部:
(i)所述细胞是在营养性植物部分中,所述营养性植物部分在植物的第一开花时间和种子的第一成熟期之间从植物中收获,
(ii)所述细胞是两色高粱植物细胞,
(iii)所述细胞是在叶和/或茎或其部分中,
(iv)所述细胞包含在重量基础上约8%、或约9%或约10%的总脂质含量,
(v)相对于相应野生型细胞的油酸含量,所述细胞的TFA含量包含增加至少2%或至少
3%的油酸含量,
(vi)相对于相应野生型细胞的棕榈酸含量,所述细胞的TFA含量包含增加至少2%或至少3%的棕榈酸含量,
(vii)相对于相应野生型细胞的ALA含量,所述细胞的TFA含量包含减少至少2%或至少
3%的α-亚油酸(ALA)含量,
(viii)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含增加的可溶性蛋白质含量,
(ix)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含增加的氮含量,
(x)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含减少的碳:氮比,
(xi)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含增加的光合能力,
(xii)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含减少的淀粉和/或总膳食纤维(TDF)含量,
(xiii)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含增加的碳含量,
(xiv)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含增加的转录因子多肽含量,其中所述转录因子多肽选自由Wrinkled 1(WRI1)、Leafy Cotyledon 1(LEC1)、LEC1样、Leafy Cotyledon 2(LEC2)、BABY BOOM(BBM)、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4、Dof11组成的组,或者由MYB73、bZIP53、AGL15、MYB115、MYB118、TANMEI、WUS、GFR2a1、GFR2a2和PHR1组成的组,(xv)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含增加的脂肪酸酰基转移酶多肽含量,其中所述酰基转移酶是二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)和/或磷脂:二酰甘油酰基转移酶(PDAT),
(xvi)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含减少的TAG脂肪酶多肽含量,
(xvii)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含减少的三半乳糖基二酰基甘油(TGD)多肽含量,
(xviii)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包括增加的油体包衣(oil  body coating,OBC)多肽或脂滴相关多肽(LDAP)的含量,
(xix)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含增加的总蛋白质含量,
(xx)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含增加的叶绿素含量,
(xxi)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含增加的在重量基础上的能量含量,(xxii)相对于相应的野生型细胞,所述细胞包含增加的磷脂和/或半乳糖脂质含量,优选为增加的MDGD含量和/或增加的DGDG含量,
(xxiii)TTQ为约0.1、或约0.2或约0.3、或约0.4或约0.5、或约0.6、或约0.65、或约0.7、或约0.75、或约0.8、或约0.81、或约0.82、或约0.83、或约0.84、约0.85、或约8.6、或约8.7、或约8.8、或约8.9、或约0.9、或约0.91、或约0.92、或约0.93、或约0.94、或约0.95,和(xxiv)以TAG形式酯化的脂肪酸与除TAG以外的脂质形式的脂肪酸的比例为20:1至
1.5:1,或5:1至2:1、或约4、约3.5、约3、或约2.5。
17.权利要求11-16任一项的细胞,其包括以下的一种或两种:
a)第一外源多核苷酸,其编码增加所述细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽,优选WRI1多肽,以及
b)第二外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽,优选DGAT和/或PDAT,以及在每种情况中以下任何一种或两种或三种或全部四种,c)第一遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应细胞相比时,其下调参与所述细胞中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽的内源生成和/或活性,所述多肽优选SDP1 TAG脂肪酶,d)第三外源多核苷酸,其编码这样的多肽,当与缺少第三外源多核苷酸的相应细胞相比时,所述多肽增加脂肪酸由所述细胞的质体输出,所述多肽优选酰基-ACP硫酯酶多肽,e)第四外源多核苷酸,其编码增加所述细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的第二转录因子多肽,优选LEC2多肽,以及
f)第二遗传修饰,当与缺少所述第二遗传修饰的相应细胞相比时,其下调参与将脂肪酸输入所述细胞的质体的多肽的内源生成和/或活性,所述多肽优选TGD多肽,其中每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述细胞中的表达的启动子。
18.权利要求11-17任一项的细胞,其进一步包含以下一种或两种:
a)第五多核苷酸,其编码油体包衣(OBC)多肽或脂滴相关蛋白(LDAP),以及
b)第三遗传修饰,当与缺少所述第三遗传修饰的相应细胞相比时,其下调参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性。
19.权利要求11-18任一项的细胞,其包含编码WRI1多肽的第一外源多核苷酸、编码DGAT多肽的第二外源多核苷酸、和相对于相应的野生型细胞减少的TAG脂肪酶多肽的含量和/或减少的TGD多肽的含量,其中每个外源多核苷酸与能够指导所述多核苷酸在所述细胞中表达的启动子可操作地连接。
20.权利要求11-18任一项的细胞,其包含编码PDAT或DGAT多肽的外源多核苷酸、增加的PDAT或DGAT多肽的含量、减少的TGD多肽含量和减少的TAG脂肪酶多肽含量,各自相对于相应的野生型细胞,其中所述外源多核苷酸与能够指导所述多核苷酸在所述细胞中表达的启动子可操作地连接。
21.权利要求11-18任一项的细胞,其包含降低的TAG脂肪酶含量、降低的TGD多肽含量、以及任选地降低的TST多肽含量,各自减少是相对于相应的野生型细胞,所述TAG脂肪酶例如是SDP1 TAG脂肪酶,所述TGD多肽例如TGD5多肽,所述TST多肽例如是TST1多肽。
22.权利要求11-21任一项的细胞,其中所述细胞来自植物的营养性部分或在植物的营养性部分中,所述植物优选高粱属或玉米植物。
23.根据权利要求11-22任一项的细胞,其中适用以下特征中的一种或多种或全部;
i)所述细胞相对于缺少第一外源多核苷酸的相应细胞具有增加的总脂肪酸合成,或者相对于缺少第一外源多核苷酸的相应细胞具有减少的总脂肪酸分解代谢,或者两者,从而相对于缺少第一外源多核苷酸的相应细胞其具有升高水平的总脂肪酸,
ii)相对于具有第一外源多核苷酸且缺少编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽的外源多核苷酸的相应细胞,所述细胞具有增加的脂肪酰基酰基转移酶表达和/或活性,所述脂肪酰基酰基转移酶催化TAG、DAG或MAG,优选TAG的合成,
iii)相对于具有第一外源多核苷酸且缺少下调参与细胞质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性的遗传修饰的相应细胞,所述细胞在其质体中具有减少的从酰基-ACP和G3P至溶血磷脂酸(LPA)的生成,
iv)相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应细胞,所述细胞在其TFA含量和/或其半乳糖脂质含量中具有改变的C16:3-C18:3脂肪酸比例,优选降低的比例,v)所述细胞在植物的营养性部分中,并且包含至少约8%、至少约9%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、
8%-75%、6%-20%、10%-75%、11%-75%、约15%-75%、约20%-75%、约30%-75%、约
40%-75%、约50%-75%、约60%-75%或约25%-50%(w/w干重)的总非极性脂质含量,vi)所述细胞在植物的营养性部分中,并且包含至少约1%、至少约2%、至少约3%、至少约4%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约10%、至少约11%、至少约
12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约
45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、6%-20%、8%-
75%、10%-75%、11%-75%、约15%-75%、约20%-75%、约30%-75%、约40%-75%、约
50%-75%、约60%-75%或约25%-50%(w/w干重)的TAG含量,
vii)所述转录因子多肽选自由Wrinkled 1(WRI1)、Leafy Cotyledon 1(LEC1)、LEC1样、Leafy Cotyledon 2(LEC2)、BABY BOOM(BBM)、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4和Dof11组成的组,
viii)油酸占细胞中的TFA含量的至少20%(mol%)、至少22%(mol%)、至少30%(mol%)、至少40%(mol%)、至少50%(mol%)或至少60%(mol%),优选约65%(mol%)或
20%-约65%,
ix)所述细胞中的非极性脂质包含一种或多种多不饱和脂肪酸,其选自二十碳二烯酸(EDA)、花生四烯酸(ARA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、或者它们中两种或更多种的组合,
x)一种或多种或全部启动子选自组成型启动子如泛素基因启动子或肌动蛋白启动子,组织特异性启动子如叶和/或茎特异性启动子,发育调节启动子如衰老特异性启动子如SAG12启动子,诱导型启动子,或者昼夜节律调节启动子,
xi)所述细胞包含这样的TFA含量,相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应细胞,其油酸水平升高至少2%或至少3%,和/或相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应细胞,其α-亚麻酸(ALA)水平降低至少2%或至少3%,
xii)相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应细胞中的非极性脂质,所述细胞中的非极性脂质包含修改水平的总固醇,优选游离(非酯化的)固醇、硬脂酰酯、硬脂酰糖苷,
xiii)在重量基础上,所述细胞的一种或多种非极性脂质和/或总非极性脂质含量的水平比包含编码拟南芥(Arabidopsis thaliana)WRI1(SEQ ID NO:21)和拟南芥DGAT1(SEQ ID NO:1)的外源多核苷酸的相应细胞高至少2%。
24.根据权利要求16-23任一项的细胞,其中以下特征中的一个或多个或全部应用于相关的地方;
i)参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽是参与细胞中的TAG、DAG或单酰甘油(MAG)生物合成的脂肪酰基酰基转移酶,例如DGAT、PDAT、LPAAT、GPAT或MGAT,优选DGAT或PDAT,或为PDCT或CPT多肽,或PLC或PLD多肽,
ii)参与细胞中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽是SDP1脂肪酶、Cgi58多肽、酰基-CoA氧化酶如ACX1或ACX2、或者参与细胞中脂肪酸的β-氧化的多肽如PXA1过氧化物酶体ATP-结合盒转运蛋白,优选SDP1脂肪酶,
iii)所述油体包衣(OBC)多肽是油质蛋白,如聚油质蛋白(polyoleosin)或油体钙蛋白(caleosin),或者脂滴相关蛋白(LDAP),
iv)增加脂肪酸由所述细胞的质体输出的多肽是C16或C18脂肪酸硫酯酶如FATA多肽或FATB多肽、脂肪酸转运蛋白如ABCA9多肽或长链酰基-CoA合成酶(LACS),
v)参与将脂肪酸输入所述细胞的质体的多肽是脂肪酸转运蛋白或其亚基或其调节多肽,优选TGD多肽,更优选TGD5多肽,以及
vi)参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽是质体GPAT、质体LPAAT或质体PAP。
25.根据权利要求11-23任一项的细胞,其来自植物开花之前的植物叶或茎或在植物开花之前的植物叶或茎中,并且所述细胞包含在重量基础上至少约6%、至少约7%、至少约
8%、至少约10%、至少约11%、在8%至15%之间、或在9%至12%之间,优选在约8%至约
20%之间的TFA含量和/或总非极性脂肪酸含量。
26.根据权利要求17-25任一项的细胞,其中每个遗传修饰独立地是内源基因的部分或完全地使所述基因失活的突变,例如点突变、插入或缺失,或所述遗传修饰是编码降低所述内源基因表达的RNA分子的外源多核苷酸,其中所述外源多核苷酸与能够指导多核苷酸在所述细胞中表达的启动子可操作地连接。
27.一种植物或其部分,所述植物优选为高粱属或者玉米植物,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分的总脂肪酸(TFA)含量包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含约5%(w/w干重)、优选约6%至约20%之间的TFA含量,并且优选具有0.01至0.60之间、或在0.60至0.84之间、或在0.84至0.95之间的TAG/TFA商(TTQ)。
28.一种植物或其部分,所述植物优选为高粱属或者玉米植物,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和减少的SDP1多肽含量,各自都是相对于相应的野生型营养性植物部分。
29.一种植物或其部分,所述植物优选为高粱属或者玉米植物,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和增加的LEC2多肽含量,各自都是相对于相应的野生型营养性植物部分。
30.一种植物或其部分,所述植物优选为高粱属或者玉米植物,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含增加的PDAT或DGAT多肽含量、减少的TGD多肽含量和减少的SDP1多肽含量,所述TGD多肽优选TGD5多肽,各自都是相对于相应的野生型营养性植物部分。
31.一种植物或其部分,所述植物优选为高粱属或者玉米植物,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含减少的TAG脂肪酶含量、减少的TGD多肽含量、以及任选地减少的TST多肽含量,所述TAG脂肪酶例如是SDP1 TAG脂肪酶,所述TGD多肽例如TGD5多肽,所述TST多肽例如是TST1多肽,各自减少都是相对于相应的野生型营养性植物部分。
32.权利要求27-31任一项的植物或其部分,其包括以下的一种或两种:
a)第一外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽,优选WRI1多肽,以及
b)第二外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽,优选DGAT和/或PDAT,以及在每种情况中以下任何一种或两种或三种或全部四种,c)遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分相比时,其下调参与所述植物或其部分中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽的内源生成和/或活性,所述多肽优选SDP1 TAG脂肪酶,
d)第三外源多核苷酸,其编码这样的多肽,当与缺少第四外源多核苷酸的相应细胞相比时,所述多肽增加脂肪酸由所述植物或其部分中的细胞的质体输出,多肽优选酰基-ACP硫酯酶多肽,
e)第四外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的第二转录因子多肽,优选LEC2多肽,以及
f)第二遗传修饰,当与缺少所述第二遗传修饰的相应细胞相比时,其下调参与将脂肪酸输入所述细胞的质体的多肽的内源生成和/或活性,
其中每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物或其部分中的表达的启动子。
33.权利要求32的植物或其部分,其进一步包含以下一种或两种:
a)第五多核苷酸,其编码油体包衣(OBC)多肽或脂滴相关蛋白(LDAP),以及
b)第三遗传修饰,当与缺少所述第三遗传修饰的相应植物或其部分相比时,其下调参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性。
34.权利要求32或权利要求33的植物或其部分,其中所述部分是营养性植物部分,并且相对于植物的种子,一个或多个或多个或所有的启动子在所述营养性植物部分中以较高水平表达。
35.根据权利要求27-34任一项的植物或其部分,其包含权利要求19-26任一项定义的多个特征之一。
36.一个至少约1000株植物的群体,每株植物是根据权利要求27-35任一项的植物,在田地中生长,或至少约1000个营养性植物部分的集合,每个部分是根据权利要求27-35任一项的营养性植物部分,其中所述营养性植物部分是从田间生长的植物中收获的。
37.权利要求27-35任一项的植物的种子或从权利要求27-35任一项的植物获得的种子。
38.鉴定、选择和/或获得具有所需的表型的植物或其部分的方法,所述植物优选高粱属或玉米植物,该方法包括
i)获得多个候选植物或其部分,每个候选植物或其部分包含以下一个或两个
a)第一外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽,优选WRI1多肽,以及
b)第二外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽,优选DGAT和/或PDAT,以及每种情况中以下任何一种或两种或三种或全部四种
c)遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分相比时,其下调参与所述植物或其部分中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽的内源生成和/或活性,所述多肽优选SDP1 TAG脂肪酶,
d)第三外源多核苷酸,其编码这样的多肽,当与缺少第四外源多核苷酸的相应细胞相比时,所述多肽增加脂肪酸由所述植物中的细胞的质体输出,所述多肽优选酰基-ACP硫酯酶多肽,
e)第四外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的第二转录因子多肽,优选LEC2多肽,以及
f)第二遗传修饰,当与缺少所述第二遗传修饰的相应细胞相比时,其下调参与将脂肪酸输入所述细胞的质体的多肽的内源生成和/或活性,
其中每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物中的表达的启动子,
ii)分析来自步骤i)的多个部分,或来自步骤i)的所述多个候选植物中的每个植物的至少一部分中的脂质,以及
iii)鉴定、选择和/或获得植物或其部分,其包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分的总脂肪酸(TFA)含量包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,并且其具有这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含约5%(w/w干重)、优选约6%至约20%之间的TFA含量,并且优选所述营养性植物部分具有0.01至
0.60之间、或在0.60至0.84之间、或在0.84至0.95之间的TAG/TFA商(TTQ)。
39.一种用于鉴定、选择和/或获得在其总脂肪酸含量中具有增加的TTQ的植物或其部分的方法,所述植物优选高粱属或玉米植物,所述方法包括:
i)获得多个候选植物或其部分,所述多个候选植物或其部分各自包括一个或多个遗传修饰,其中所述遗传修饰提供(a)减少的TAG脂肪酶多肽含量或活性,优选减少的SDP1TAG脂肪酶含量或活性,(b)减少的TGD多肽含量或活性,优选减少的TGD5多肽含量或活性,(c)增加的OBC多肽或LDAP含量,(d)增加的增加脂质酸从质体中输出的多肽含量或活性,所述增加脂质酸从质体中输出的多肽优选酰基-ACP硫酯酶,(e)减少的TST多肽含量或活性,优选减少的TST1多肽含量或活性,(f)修饰的PDCT多肽水平,和(g)修饰的CPT多肽水平或活性,(h)增加的PLC多肽含量或活性,(i)增加的PLD多肽含量或活性,(j)增加的PDAT多肽含量或活性,和(k)增加的两种DGAT多肽含量或活性,
ii)分析来自步骤i)的多个部分,或来自步骤i)的所述多个候选植物中的每个植物的至少一部分中的脂质,
iii)鉴定、选择和/或获得植物或其部分,其相对于缺乏遗传修饰的相应植物或植物部分,在总脂肪酸含量中包含增加的TTQ。
40.权利要求39的方法,其进一步包括在步骤ii)之后计算候选植物或部分的TTQ的步骤。
41.获得根据权利要求11-26任一项的细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
i)将权利要求11-26任一项定义的至少一种外源多核苷酸和/或至少一种遗传修饰引入细胞,优选高粱属或玉米细胞。
ii)在所述细胞或其后代细胞中表达所述外源多核苷酸和/或遗传修饰,
ii)分析所述细胞或后代细胞的脂质含量,以及
iii)选择或鉴定根据权利要求11-26任一项的细胞。
42.一种产生植物,优选高粱属或玉米植物的方法,所述植物的基因组中整合有权利要求32-35任一项所定义的一组外源多核苷酸和/或遗传修饰,所述方法包括以下步骤:
i)杂交两种亲本植物,其中一种植物包含权利要求32-35任一项定义的至少一种外源多核苷酸和/或至少一种遗传修饰,并且另一种植物包含权利要求32-35任一项定义的至少一种外源多核苷酸和/或至少一种遗传修饰,并且其中在两者之间两种亲本植物包含一组权利要求32-35任一项定义的外源多核苷酸和/或遗传修饰,
ii)针对是否存在权利要求32-35任一项定义的一组外源多核苷酸和/或遗传修饰来选择来自杂交的一种或多种后代植物,以及
iii)选择包含权利要求32-35任一项定义的一组外源多核苷酸和/或遗传修饰的后代植物,
从而产生所述植物。
43.一种生产油产品的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)在反应器中处理组合物,所述组合物包含
(a)营养性植物部分,优选高粱属或玉米营养性植物部分,所述营养性植物部分的总脂肪酸(TFA)含量包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,并且所述营养性植物部分包含约5%(w/w干重)、优选至少10%的TFA含量,并且优选具有0.01至0.60之间、或在0.60至0.84之间、或在0.84至0.95之间的TAG/TFA商(TTQ),(b)溶剂,其包含水、醇或两者,以及
(c)任选存在的催化剂,
其中所述处理包括在氧化、还原或惰性环境中于约50℃-约450℃的温度和5-350巴的压力下加热所述组合物1-120分钟,
(ii)以相对于所述营养性植物部分的干重至少35重量%的收率从所述反应器回收油产品,
从而生产所述油产品。
44.权利要求43的方法,其特征在于以下的一种或多种或全部:
(i)所述营养性植物部分具有至少1kg的干重,
(ii)在干重基础上,所述营养性植物部分具有至少10%、至少15%、至少20%、约25%、约30%、约35%或30%-75%的TFA含量和/或总非极性脂质含量,
(iii)所述组合物具有5%-90%的固体浓度,
(iv)所述催化剂包含NaOH或KOH或两者,优选浓度为0.1M-2M,
(v)所述处理时间为1-60分钟,优选10-60分钟,更优选15-30分钟,
(vi)如果所述溶剂为水,则所述方法产生相对于所述营养性植物部分的干重最小36重量%、37重量%、38重量%、39重量%或40重量%,以及最大55重量%或60重量%之间的油产品收率,
(vii)如果所述溶剂包含醇,则所述方法产生相对于所述营养性植物部分的干重最小
36重量%、37重量%、38重量%、39重量%或40重量%,以及最大65重量%或70重量%之间的油产品收率,
(viii)如果所述溶剂包含约80%水,则所述油产品包含约30%的C13-C22碳氢化合物,(ix)如果所述溶剂包含约50%甲醇,则所述油产品包含约50%脂肪酸甲基酯(FAME),(x)回收的油产品具有少于约15重量%的水含量,
(xi)相对于利用相应的在干重基础上其非极性脂质含量少于2%的营养性植物部分的相应方法,油产品的收率大至少2重量%,以及
(xii)已通过干燥、劈砍(chopping)、切碎(shredding)、磨制(milling)、辗压(rolling)、压榨(pressing)、破碎(crushing)或研磨(grinding)中的一种或多种物理加工步骤(i)(a)中的营养性植物部分。
45.权利要求43或权利要求44的方法,其进一步包括以下一个或多个:
(i)回收的油产品的加氢脱氧,
(ii)用氢处理回收的油产品以降低所述油产品中的或糖水平,
(iii)从回收的油产品生产合成气,以及
(iv)分级分离回收的油产品以生产燃料油、柴油、油或汽油中的一种或多种。
46.根据权利要求43-45任一项的方法,所述营养性植物部分包含植物叶、茎或两者。
47.一种生产工业产品的方法,所述方法包括以下步骤:
i)获得根据权利要求11-26任一项的细胞、权利要求27-35任一项的植物或其部分、或权利要求37的种子,以及
ii)以下任一种:
a)通过在所述细胞、植物或其部分或种子中原位向脂质施用热、化学或酶促方式,或者它们的任何组合,将步骤i)的所述细胞、植物或其部分或种子中的至少一些脂质转化为工业产品,或
b)物理加工步骤i)的所述细胞、植物或其部分或种子,并随后或同时通过在加工的细胞、植物或其部分或种子中向脂质施用热、化学或酶促方式,或者它们的任何组合,将所述细胞、植物或其部分或种子中的至少一些脂质转化为工业产品,以及
iii)回收所述工业产品,
从而生产所述工业产品。
48.权利要求47的方法,其中所述植物部分是营养性植物部分。
49.权利要求47或权利要求48的方法,所述方法还包括以下步骤:
(a)提取所述细胞、植物或其部分或种子的至少一些非极性脂质内含物为非极性脂质,以及
(b)回收提取的非极性脂质,
其中在将所述细胞、植物或其部分或种子中的至少一些脂质转化为工业产品的步骤之前进行步骤(a)和(b)。
50.一种生产提取的脂质的方法,所述方法包括以下步骤:
i)获得根据权利要求11-26任一项的细胞、权利要求27-35任一项的植物或其部分、或权利要求37的种子,
ii)从所述细胞、植物或其部分或种子提取脂质,以及
iii)回收提取的脂质,
从而生产提取的脂质。
51.权利要求50的方法,其包括通过以下一种或多种提取脂质:干燥、辗压、压榨、破碎或研磨所述植物或其部分或种子,和/或纯化所述提取的脂质或种子油。
52.权利要求51的方法,其包括在提取方法中使用有机溶剂以提取油。
53.权利要求50-52任一项的方法,其包括通过在容器中收集来回收提取的脂质和/或脱胶、除臭、脱色、干燥、分级分离提取的脂质中的一种或多种,从提取的脂质去除至少一些蜡和/或蜡酯,或者分析提取的脂质的脂肪酸组成。
54.权利要求50-53任一项的方法,其中提取的脂质或油的体积为至少1升。
55.权利要求50-54任一项的方法,其中适用以下特性中的一种或多种或全部:
(i)提取的脂质或油包含三酰甘油,其中所述三酰甘油占提取的脂质或油的至少90%,优选至少95%或至少96%,
(ii)提取的脂质或油包含游离的固醇、硬脂酰酯、硬脂酰糖苷、蜡或蜡酯,或者它们的任何组合,以及
(iii)提取的脂质或油的总固醇含量和/或组成显著不同于产生自相应的植物或其部分或者种子的提取的脂质或油的固醇含量和/或组成。
56.根据权利要求50-55任一项的方法,其中所述方法进一步包括将提取的脂质转化为工业产品。
57.根据权利要求47-49或56任一项的方法,其中所述工业产品是类产品如脂肪酸酯,优选脂肪酸甲基酯和/或脂肪酸乙基酯,烷如甲烷、乙烷或较长链烷,较长链烷的混合物,烯,生物燃料一氧化碳和/或氢气,生物醇如乙醇、丙醇或丁醇,生物炭,或者一氧化碳、氢和生物炭的组合。
58.权利要求47-57任一项的方法,其中所述植物部分是地表植物部分或绿色植物部分,优选营养性植物部分如植物叶或茎。
59.权利要求47-58任一项的方法,其中所述获得所述植物或其部分的步骤包括用机械收割机收获所述植物或其部分的步骤。
60.权利要求47-59任一项的方法,其中所述植物或其部分或者种子和/或提取的脂质或油中的脂质水平可通过利用制备自提取的脂质或油的脂肪酸甲基酯的气相色谱分析确定。
61.权利要求47-60任一项的方法,其中所述植物部分是营养性植物部分,其包含至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、6%-
20%、8%-75%、10%-75%、11%-75%、约15%-75%、约20%-75%、约30%-75%、约40%-
75%、约50%-75%、约60%-75%或约25%-50%(w/w干重)的总TAG含量。
62.一种产生种子的方法,该方法包括:
i)生长根据权利要求27-35任一项的植物,以及
ii)从所述植物收获种子。
63.权利要求62的方法,其包括生长至少约1500株、至少约3000株或至少约5000株植物的群体,并且从所述植物的群体中收获种子。
64.从根据权利要求11-26任一项的细胞、权利要求27-35任一项的植物或其部分、权利要求37的种子可获得的或通过权利要求50-61任一项的方法可获得的回收的或提取的脂质或可溶性蛋白质。
65.根据权利要求47-49、56-61任一项的方法生产的工业产品,其是烃类产品如脂肪酸酯,优选脂肪酸甲基酯和/或脂肪酸乙基酯,烷如甲烷、乙烷或较长链烷,较长链烷的混合物,烯,生物燃料,一氧化碳和/或氢气,生物醇如乙醇、丙醇或丁醇,生物炭,或者一氧化碳、氢和生物炭的组合。
66.根据权利要求11-26任一项的细胞、权利要求27-35任一项的植物或其部分、权利要求37的种子或权利要求65的回收的或提取的脂质用于制造工业产品的用途。
67.一种生产燃料的方法,所述方法包括:
i)使权利要求64的脂质与醇反应,任选地在催化剂的存在下与醇反应,以便产生烷基酯,以及
ii)任选地,混合所述烷基酯与基于石油的燃料。
68.一种生产合成柴油燃料的方法,所述方法包括:
i)将根据权利要求11-26任一项的细胞、权利要求27-35任一项的植物或其部分、权利要求37的种子中的脂质通过包括热解或水热处理的方法转化为生物油,或者通过气化转化为合成气,以及
ii)通过包括分级分离的方法将所述生物油转化为合成柴油燃料,优选选择在约150℃-约200℃或约200℃-约300℃下凝聚(condense)的碳氢化合物,或者利用金属催化剂或微生物催化剂将合成气转化为生物燃料。
69.一种生产生物燃料的方法,所述方法包括将根据权利要求11-26任一项的细胞、权利要求27-35任一项的植物或其部分、权利要求37的种子中的脂质通过热解转化为生物油,通过发酵转化为生物醇,或者通过气化或厌氧消化转化为沼气。
70.权利要求68或权利要求69的方法,其中所述部分是营养性植物部分。

说明书全文

具有修饰的性状的植物

技术领域

[0001] 本发明尤其涉及营养性植物部分,例如来自高粱属和/或玉米植物的植物部分,所述营养性植物部分包含以下的总脂肪酸(TFA)含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含大量增加的TFA平,例如TFA含量约为5%(w/w干重)。本发明还涉及营养性植物部分作为饲料(feedstuff)和/或用于生产动物饲料的用途,所述饲料用于动物消耗。
[0002] 发明背景
[0003] 满足牲畜产品(例如肉、奶、鸡蛋)的消费者需求是依赖于安全、划算的动物饲料的常规供应的可用性,特别是具有高能量(如高水平脂肪酸)的饲料。作为对这样的牲畜产品的消费者需求在增加(特别是在发展中国家中),例如预期肉制品的全球需求在1995和2020之间增长58%(FAO Animal Production and Health Proceedings,2002),需要增加饲料蛋白质供应。
[0004] 需要具有高的总脂肪酸含量的营养性植物部分,特别是来自重要动物饲料作物(诸如高粱和玉米)中的具有高的总脂肪酸含量的营养性植物部分。

发明内容

[0005] 本发明涉及具有增强的总脂肪酸含量的植物和营养性植物部分,优选来自高粱属和/或玉米的具有增强的总脂肪酸含量的植物和营养性植物部分,以及它们的用途。
[0006] 因此,在第一方面中,本发明提供了一种产生用于动物的饲料的方法,所述方法包括以下步骤:
[0007] (i)从高粱属(Sorghum sp.)和/或玉米(Zea mays)植物中收获营养性植物部分,所述营养性植物部分包含总脂肪酸(TFA)含量,所述总脂肪酸(TFA)含量包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含大约为5%(w/w干重)的TFA含量,以及一个或多个步骤
[0008] (ii)将收获的植物部分与至少一种其他饲料成分混合,
[0009] (iii)打(baling)所述收获的植物部分,
[0010] (iv)将所述收获的植物部分加工为适合于由动物消耗的形式,所述加工优选通过劈砍(chopping)、切割、干燥、压榨(pressing)或造粒(pelleting)所述植物部分,和[0011] (v)将所述收获的植物部分在减条件下储存一段时间,使得所述植物部分中的至少一些水化合物发酵有机酸
[0012] 在一个实施方案中,所述营养性植物部分具有0.01至0.6之间的TAG/TFA商(TTQ)。在一个实施方案中,所述营养性植物部分的TTQ在0.01至0.55之间、或0.01至0.5之间、或为约0.1、或为约0.2、或为约0.3、或为约0.4、或为约0.5。优选地,TTQ在0.60至0.84之间,其对应于TAG:TFA比率在1.5:1至5:1之间、或者在0.84至0.95之间,其对应于TAG:TFA比率在5:1和20:1之间。
[0013] 在一个实施方案中,所述营养性植物部分包含约6%、或约8%、或约9%或约10%(w/w干重)的平均TFA含量。
[0014] 在一个实施方案中,所述营养性植物部分的TFA含量包含以下油酸含量:相对于相应的野生型营养性植物部分的油酸含量增加至少2%或至少3%。
[0015] 在一个实施方案中,所述营养性植物部分的TFA含量包含以下棕榈酸含量:相对于相应的野生型营养性植物部分的棕榈酸含量增加至少2%或至少3%。
[0016] 在一个实施方案中,所述营养性植物部分的TFA含量包含以下α-亚油酸(ALA)含量:相对于相应的野生型营养性植物部分的ALA含量降低至少2%或至少3%。
[0017] 在一个实施例中,以下特征中的一个或多个或全部适用:
[0018] (i)所述营养性植物部分是包含以下的一种或多种的叶和/或茎或其部分:增加的碳含量、增加的能量含量、增加的可溶性蛋白质含量、减少的淀粉含量、减少的总膳食纤维中(TDF)和增加的氮含量,每个都是在重量基础上相对于来自野生型高粱属或玉米植物在同一生长阶段的相应野生型叶或茎或其部分,
[0019] (ii)所述营养性植物部分的TFA含量为至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约
30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约
65%、至少约70%、约6%至约20%之间、8%至75%之间、10%至75%之间之间、11%和75%之间、约15%至75%之间、约20%至75%之间、约30%至75%之间、约40%至75%之间、约
50%至75%之间、约60%至75%之间、或约25%至50%之间(w/w干重)的TFA,
[0020] (iii)在所述营养性植物部分中以TAG形式酯化的脂肪酸为至少约1%、至少约2%、至少约3%、至少约4%、至少约5%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、约6%至约20%之间、8%至75%之间、10%至75%之间、11%至75%之间、约15%至75%之间、约20%至75%之间、约30%至75%之间、约40%至75%之间、约
50%至75%之间、约60%至75%之间、或约25%至50%之间(w/w干重),
[0021] (iv)所述营养性植物部分包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和减少的SDP1多肽含量,每个都是相对于相应的野生型营养性植物部分,
[0022] (v)所述营养性植物部分包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和增加的LEC2多肽含量,每个都是相对于相应的野生型营养性植物部分,
[0023] (vi)所述营养性植物部分包含增加的PDAT或DGAT多肽含量、减少的TGD多肽含量和减少的SDP1多肽含量,每个都是相对于相应的野生型营养性植物部分,和
[0024] (vii)所述营养性植物部分包含减少的TAG脂肪酶(例如SDP1 TAG脂肪酶)含量、减少的TGD多肽(例如TGD5多肽)的含量、以及任选地减少的TST多肽(例如TST1多肽)的含量,每个减少都是相对于相应的野生型营养性植物部分。
[0025] 在第二方面,本发明提供了一种产生用于动物的饲料的方法,该方法包括以下步骤:
[0026] (i)从高粱属和/或玉米植物植物中收获营养性植物部分,所述营养性植物部分包含以下总脂肪酸含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含约6%(w/w干重)的总TAG含量,并且优选具有以TAG形式酯化的脂肪酸与除TAG之外的脂质形式的脂肪酸的比例为20:1至1.5:1之间或5:1和2:1之间,以及一个或多个步骤
[0027] (ii)将收获的植物部分与至少一种其他饲料成分混合,
[0028] (iii)打捆所述收获的植物部分,
[0029] (iv)将所述收获的植物部分加工为适合于由动物消耗的形式,所述加工优选通过劈砍(chopping)、切割、干燥、压榨(pressing)或造粒(pelleting)所述植物部分,和[0030] (v)将所述收获的植物部分在减氧条件下储存一段时间,使得所述植物部分中的至少一些碳水化合物发酵成有机酸。
[0031] 在上述两个方面的一个实施方式中,应用以下特征中的一个或多个或全部:
[0032] (i)从植物的第一开花时间和种子的第一成熟期之间的植物中收获所述营养性植物部分,
[0033] (ii)所述高粱属植物是两色高粱(Sorghum bicolor)植物,
[0034] (iii)所述营养性植物部分包括叶和/或茎或其部分,
[0035] (iv)所述营养性植物部分包含约8%或约10%(w/w干重)的平均总脂肪酸含量,[0036] (v)所述营养性植物部分的总脂肪酸含量包含相对于相应的野生型营养性植物部分的油酸含量增加至少2%或至少3%的油酸含量,
[0037] (vi)所述营养性植物部分的总脂肪酸含量包含相对于相应的野生型营养性植物部分的棕榈酸含量增加至少2%或至少3%的棕榈酸含量,
[0038] (vii)所述营养性植物部分的总脂肪酸含量包含相对于相应的野生型营养性植物部分的ALA含量减少至少2%或至少3%的α-亚油酸(ALA)含量,
[0039] (viii)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的可溶性蛋白质含量,
[0040] (ix)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的氮含量,
[0041] (x)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分减少的碳:氮比,
[0042] (xi)高粱属和/或玉米植物的叶包含相对于相应的野生型叶增加的光合能,[0043] (xii)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分减少的总膳食纤维(TDF)含量,
[0044] (xiii)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的碳含量,
[0045] (xiv)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的转录因子多肽含量,其中所述转录因子多肽选自由Wrinkled 1(WRI1)、Leafy Cotyledon 1(LEC1)、LEC1样、Leafy Cotyledon 2(LEC2)、BABY BOOM(BBM)、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4、Dof11组成的组,或者由MYB73、bZIP53、AGL15、MYB115、MYB118、TANMEI、WUS、GFR2a1、GFR2a2和PHR1组成的组。
[0046] (xv)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的脂肪酸酰基转移酶多肽含量,其中酰基转移酶是二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)和/或磷脂:二酰甘油酰基转移酶(PDAT),
[0047] (xvi)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分减少的TAG脂肪酶多肽含量,
[0048] (xvii)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分减少的三半乳糖基二酰基甘油(TGD)多肽含量,
[0049] (xviii)所述营养性植物部分包括相对于相应的野生型营养性植物部分增加的油体包衣(oil body coating,OBC)多肽或脂滴相关多肽(LDAP)的含量,
[0050] (xix)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的总蛋白质含量,
[0051] (xx)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的叶绿素含量,
[0052] (xxi)所述营养性植物部分包含在重量基础上相对于相应的野生型营养性植物部分增加的能量含量,
[0053] (xxii)所述营养性植物部分包含相对于相应的野生型营养性植物部分增加的磷脂和/或半乳糖脂质含量,优选为增加的单半乳糖基-二甘油酯(MDGD)和/或高辛糖酰基-二甘油酯(DGDG)含量,
[0054] (xxiii)以TAG形式酯化的脂肪酸与TAG以外的脂质形式的脂肪酸的比例为约4、约3.5、约3、或约2.5,
[0055] (xxiv)所述至少一种其它饲料成分包含以下的一种或多种或全部:食用大量营养素、维生素、矿物质(如、磷、镁和硫)、干草如苜蓿干草、啤酒糟、籽粕(油菜籽或大豆)、籽、糖蜜、额外的基酸(如赖氨酸和蛋氨酸)、非蛋白质氮供应(如尿素),
[0056] (xxv)所述一段时间为一周至52周之间,
[0057] (xxvi)所述有机酸包括乙酸、丙酸或丁酸、或其任意组合,
[0058] (xxvii)所述饲料为青贮饲料、颗粒饲料或干草饲料,
[0059] (xxviii)在与所述至少一种其他饲料成分混合之前,将所述营养性植物部分保存一段时间,
[0060] (xxiv)TTQ为约0.1、或约0.2或约0.3、或约0.4或约0.5、或约0.6、或约0.65、或约0.7、或约0.75、或约0.8、或约0.81、或约0.82、或约0.83、或约0.84或约0.85、或约8.6、或约
8.7、或约8.8、或约8.9、或约0.9、或约0.91、或约0.92、或约0.93、或约0.94、或约0.95,[0061] 在每种情况下,从同一生长阶段的野生型高粱属植物或玉米植物收获相应的野生型植物部分。
[0062] 在以上方面的又一实施方式中,以下特征中的一个或多个或全部适用:
[0063] (i)所述营养性植物部分是包含以下的一种或多种的叶和/或茎或其部分:增加的碳含量、增加的能量含量、增加的可溶性蛋白质含量和增加的氮含量,每个都是在重量基础上相对于来自野生型高粱属或玉米植物在同一生长阶段的相应野生型叶或茎或其部分,[0064] (ii)所述营养性植物部分的总脂肪酸含量为至少约8%、至少约9%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、约6%至约20%之间、8%至75%之间、10%至75%之间之间、11%和75%之间、约15%至75%之间、约20%至75%之间、约30%至75%之间、约40%至75%之间、约50%至75%之间、约60%至75%之间、或约25%至50%之间(w/w干重),
[0065] (iii)在所述营养性植物部分中以TAG形式酯化的脂肪酸为至少约1%、至少约2%、至少约3%、至少约4%、至少约5%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、约6%至约20%之间、8%至75%之间、10%至75%之间、11%至75%之间、约15%至75%之间、约20%至75%之间、约30%至75%之间、约40%至75%之间、约
50%至75%之间、约60%至75%之间、或约25%至50%之间(w/w干重),
[0066] (iv)所述营养性植物部分包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和减少的SDP1多肽含量,每个都是相对于相应的野生型营养性植物部分,
[0067] (v)所述营养性植物部分包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和增加的LEC2多肽含量,每个都是相对于相应的野生型营养性植物部分,
[0068] (vi)所述营养性植物部分包含增加的PDAT或DGAT多肽含量、减少的TGD多肽含量和减少的SDP1多肽含量,每个都是相对于相应的野生型营养性植物部分,和
[0069] (vii)所述营养性植物部分包含减少的TAG脂肪酶(例如SDP1多肽)含量、减少的TGD多肽(例如TGD5多肽)的含量、以及任选地减少的TST多肽(例如TST1多肽)的含量,每个减少都是相对于相应的野生型营养性植物部分。
[0070] 在一个实施方案中,所述营养性植物部分包含增加的一个或多个蔗糖代谢多肽的含量,所述蔗糖代谢多肽选自由转化酶和蔗糖转运多肽组成的组。所述转化酶可以是液泡转化酶或胞质转化酶,并且所述蔗糖转运多肽可以是例如天然位于所述液泡膜上的SUS4或SUT2。
[0071] 另一方面,本发明提供了一种饲养动物的方法,所述方法包括将来自高粱属和/或玉米植物营养性植物部分提供给所述动物,所述营养性植物部分包含以下总脂肪酸含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含约5%(w/w干重),优选在约6%至约20%之间的TFA含量。
[0072] 在一个实施方案中,所述营养性植物部分具有0.01至0.6之间的TTQ。在一个实施方案中,所述营养性植物部分的TTQ在0.01至0.55之间、或0.01至0.5之间、或为约0.1、或为约0.2、或为约0.3、或为约0.4、或为约0.5。优选地,TTQ在0.60至0.84之间或0.84至0.95之间。
[0073] 另一方面,本发明提供了一种饲养动物的方法,所述方法包括将来自高粱属和/或玉米植物营养性植物部分提供给所述动物,所述营养性植物部分包含以下总脂肪酸含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含约6%(w/w干重)、优选约6%至约20%之间的总TAG含量,并且优选具有以TAG形式酯化的脂肪酸与除TAG之外的脂质形式的脂肪酸的比例为20:1至1.5:1之间或5:
1和2:1之间。
[0074] 在以上两个方面的实施方式中,以下特征中的一个或多个或全部适用:
[0075] (i)所述营养性植物部分包含在在田间生长的高粱属和/或玉米植物中,
[0076] (ii)从高粱属和/或玉米植物中收获营养性植物部分,和/或将所述营养性植物部分与至少一种其他饲料成分混合,
[0077] (iii)将所述营养性植物部分在收获后加工为适合于由动物消耗的形式,所述加工优选通过劈砍、切割、干燥、压榨或造粒所述植物部分,和
[0078] (iv)将所述收获的植物部分在减氧条件下储存一段时间,使得所述植物部分中的至少一些碳水化合物在提供给动物前发酵成有机酸,和
[0079] (v)将所述收获的植物部分在收获和提供给动物之间储存一段时间。
[0080] 在上述两个方面的另一个实施方案中,相对于当动物摄入相同量的以干重基础的使用等量的野生型高粱属和/或玉米植物或其部分产生的相应饲料时,动物摄入增加量的氮、蛋白质、碳和/或能量潜力。
[0081] 在上述两个方面的另一个实施方案中,所述方法的特征还在于在本发明第一或第二方面的上下文中描述的一个或多个特征。
[0082] 描述了关于高粱属和/或玉米植物的上述两个方面。然而,并不意味着将所描述的方法限制为仅对高粱属或玉米植物的用途。意味的是在该方法中可以使用任何合适的植物。
[0083] 在另一个方面,本发明提供了一种用于动物的饲料,所述饲料包括来自高粱属和/或玉米植物的收获的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含以下总脂肪酸含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含约5%(w/w干重),优选在约6%至约20%之间的TFA含量。
[0084] (i)将收获的植物部分与至少一种其他饲料成分混合,
[0085] (ii)在收获后打捆所述收获的植物部分,
[0086] (iii)将所述收获的植物部分加工为适合于由动物消耗的形式,所述加工优选通过劈砍、切割、干燥、压榨或造粒所述植物部分,和
[0087] (iv)将所述收获的植物部分在减氧条件下储存一段时间,使得所述植物部分中的至少一些碳水化合物发酵成有机酸。
[0088] 在一个实施方案中,所述营养性植物部分具有0.01至0.6之间的TTQ。在一个实施方案中,所述营养性植物部分的TTQ在0.01至0.55之间、或0.01至0.5之间、或为约0.1、或为约0.2、或为约0.3、或为约0.4、或为约0.5。优选地,TTQ在0.60至0.84之间或0.84至0.95之间。
[0089] 另一方面,本发明提供了一种用于动物的饲料,所述饲料包括来自高粱属和/或玉米植物的收获的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含以下总脂肪酸含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含约6%(w/w干重)、优选约6%至约20%之间的总TAG含量,并且优选具有以TAG形式酯化的脂肪酸与除TAG之外的脂质形式的脂肪酸的比例为20:1至1.5:1之间或5:1和2:1之间,其中
[0090] (i)将收获的植物部分与至少一种其他饲料成分混合,
[0091] (ii)在收获后打捆所述收获的植物部分,
[0092] (iii)将所述收获的植物部分加工为适合于由动物消耗的形式,所述加工优选通过劈砍、切割、干燥、压榨或造粒所述植物部分,和
[0093] (iv)将所述收获的植物部分在减氧条件下储存一段时间,使得所述植物部分中的至少一些碳水化合物发酵成有机酸。
[0094] 在上述两个方面的一个实施方案中,所述饲料是青贮饲料、颗粒饲料或干草饲料。
[0095] 在上述两个方面的另一个实施方案中,所述饲料的特征在于本发明第一或第二方面的上下文中所述的一个或多个特征。
[0096] 描述了关于高粱属和/或玉米植物的上述两个方面。然而,并不意味着将所描述的方法限制为仅对高粱属或玉米植物的用途。意味的是在该方法中可以使用任何合适的植物。
[0097] 在另一方面,本发明提供了一种除了种子细胞之外的细胞,优选为高粱属或者玉米植物细胞,所述细胞包含以下总脂肪酸(TFA)含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述细胞包含约5%(w/w干重)、优选约6%至约20%之间的TFA含量。
[0098] 在一个实施方案中,所述细胞的总脂肪酸含量具有0.01至0.6之间的TTQ。在一个实施方案中,所述细胞的总脂肪酸含量的TTQ在0.01至0.55之间、或0.01至0.5之间、或为约0.1、或为约0.2、或为约0.3、或为约0.4、或为约0.5。优选地,TTQ在0.60至0.84之间或0.84至0.95之间。
[0099] 在一个实施方案中,所述细胞的TFA含量包含以下油酸含量:相对于相应的野生型细胞的油酸含量增加至少2%或至少3%。
[0100] 在一个实施方案中,所述细胞的TFA含量包含以下棕榈酸含量:相对于相应的野生型细胞的棕榈酸含量增加至少2%或至少3%。
[0101] 在一个实施方案中,所述细胞的TFA含量包含以下α-亚油酸(ALA)含量:相对于相应的野生型细胞的ALA含量降低至少2%或至少3%。
[0102] 在一个实施方案中,所述细胞在植物的营养性部分中和包含TAG含量为至少约1%、至少约2%、至少约3%、至少约4%、至少约5%、至少约5%、至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约9%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、约6%至约20%之间、8%至75%之间、10%至75%之间、
11%至75%之间、约15%至75%之间、约20%至75%之间、约30%至75%之间、约40%至
75%之间、约50%至75%之间、约60%至75%之间、或约25%至50%之间(w/w干重)。
[0103] 在另一个实施方案中,所述细胞来自植物开花之前的植物的叶或茎或在植物开花之前的植物的叶或茎中,并且所述细胞包含的TFA含量和/或总非极性脂肪酸含量为在重量基础上至少约6%、至少约7%、至少约8%、至少约10%、至少约11%、在8%至15%之间、或在9%至12%之间,优选在约6%至约20%之间。
[0104] 在另一方面,本发明提供了一种除了种子细胞之外的细胞,优选为高粱属或者玉米植物细胞,所述细胞包含以下总脂肪酸(TFA)含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述细胞包含约6%(w/w干重)、优选约6%至约20%之间的总TAG含量,并且具有以TAG形式酯化的脂肪酸与除TAG之外的脂质形式的脂肪酸的比例为20:1至1.5:1之间或5:1和2:1之间。
[0105] 在另一方面,本发明提供了一种细胞,优选为高粱属或者玉米植物细胞,所述细胞包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和减少的SDP1多肽含量,每个都是相对于相应的野生型细胞,
[0106] 在另一方面,本发明提供了一种细胞,优选为高粱属或者玉米植物细胞,所述细胞包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和增加的LEC2多肽含量,每个都是相对于相应的野生型细胞,
[0107] 在另一方面,本发明提供了一种细胞,优选为高粱属或者玉米植物细胞,所述细胞包含增加的PDAT或DGAT多肽含量、减少的TGD多肽含量和减少的SDP1多肽含量,每个都是相对于相应的野生型细胞,和
[0108] 在另一方面,本发明提供了一种细胞,优选为高粱属或者玉米植物细胞,所述细胞包含减少的TAG脂肪酶(例如SDP1 TAG脂肪酶)含量、减少的TGD多肽(例如TGD5多肽)的含量、以及任选地减少的TST多肽(例如TST1多肽)的含量,每个减少都是相对于相应的野生型细胞。
[0109] 在与本发明的细胞相关的上述方面的实施方案中,应用以下特征中的一个或多个或全部:
[0110] (i)所述细胞在营养性植物部分中,所述营养性植物部分在植物的第一开花时间和种子的第一成熟期之间从植物中收获,
[0111] (ii)所述细胞是两色高粱植物细胞,
[0112] (iii)所述细胞在叶和/或茎或其部分中,
[0113] (iv)所述细胞包含在重量基础上约8%或约10%的总脂肪酸含量,
[0114] (v)所述细胞的总脂肪酸含量包含相对于相应野生型细胞的油酸含量增加至少2%或至少3%的油酸含量,
[0115] (vi)所述细胞的总脂肪酸含量包含相对于相应野生型细胞的棕榈酸含量增加至少2%或至少3%的棕榈酸含量,
[0116] (vii)所述细胞的总脂肪酸含量包含相对于相应野生型细胞的ALA含量减少至少2%或至少3%的α-亚油酸(ALA)含量,
[0117] (viii)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞增加的可溶性蛋白质含量,[0118] (ix)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞增加的氮含量,
[0119] (x)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞减少的碳:氮比,
[0120] (xi)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞增加的光合能力,
[0121] (xii)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞减少的淀粉和/或总膳食纤维(TDF)含量,
[0122] (xiii)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞增加的碳含量,
[0123] (xiv)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞增加的转录因子多肽含量,其中所述转录因子多肽选自由Wrinkled 1(WRI1)、Leafy Cotyledon 1(LEC1)、LEC1样、Leafy Cotyledon 2(LEC2)、BABY BOOM(BBM)、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4、Dof11组成的组,或者由MYB73、bZIP53、AGL15、MYB115、MYB118、TANMEI、WUS、GFR2a1、GFR2a2和PHR1组成的组。
[0124] (xv)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞增加的脂肪酸酰基转移酶多肽含量,其中所述酰基转移酶是二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)和/或磷脂:二酰甘油酰基转移酶(PDAT),
[0125] (xvi)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞减少的TAG脂肪酶多肽含量,[0126] (xvii)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞减少的三半乳糖基二酰基甘油(TGD)多肽含量,
[0127] (xviii)所述细胞包括相对于相应的野生型细胞增加的油体包衣(oil body coating,OBC)多肽或脂滴相关多肽(LDAP)的含量,
[0128] (xix)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞增加的总蛋白质含量,
[0129] (xx)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞增加的叶绿素含量,
[0130] (xxi)所述细胞包含在重量基础上相对于相应的野生型细胞增加的能量含量,[0131] (xxii)所述细胞包含相对于相应的野生型细胞增加的磷脂和/或半乳糖脂质含量,优选为增加的MDGD含量和/或增加的DGDG含量,
[0132] (xxiii)TTQ为约0.1、或约0.2或约0.3、或约0.4或约0.5、或约0.6、或约0.65、或约0.7、或约0.75、或约0.8、或约0.81、或约0.82、或约0.83、或约0.84或约0.85、或约8.6、或约
8.7、或约8.8、或约8.9、或约0.9、或约0.91、或约0.92、或约0.93、或约0.94、或约0.95,和[0133] (xxiv)以TAG形式酯化的脂肪酸与TAG以外的脂质形式的脂肪酸的比例为在20:1至1.5:1之间,或在5:1至2:1之间、或约4、约3.5、约3、或约2.5。
[0134] 在上述方面的实施方案中,本发明的营养性植物部分或细胞包括以下的一种或两种:
[0135] a)第一外源多核苷酸,其编码增加所述营养性植物部分或细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽(优选WRI1多肽),以及
[0136] b)第二外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽(优选DGAT和/或PDAT),以及以下任何一种或两种或三种或全部四种
[0137] c)第一遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应营养性植物部分或细胞相比时,其下调参与所述营养性植物部分或细胞中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽(优选SDP1TAG脂肪酶)的内源生成和/或活性,
[0138] d)第三外源多核苷酸,其编码这样的多肽,当与缺少第三外源多核苷酸的相应营养性植物部分或细胞相比时,所述多肽(优选酰基-ACP硫酯酶多肽)增加脂肪酸输出所述营养性植物部分或细胞的质体,
[0139] e)第四外源多核苷酸,其编码增加所述营养性植物部分或细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的第二转录因子多肽(优选LEC2多肽),以及
[0140] f)第二遗传修饰,当与缺少所述第二遗传修饰的相应营养性植物部分或细胞相比时,其下调参与将脂肪酸输入所述营养性植物部分或细胞的质体的多肽的内源生成和/或活性,
[0141] 其中每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述营养性植物部分或细胞中的表达的启动子。
[0142] 在上述方面的一实施方案中,所述营养性植物部分或细胞进一步包含以下一种或两种:
[0143] a)第五多核苷酸,其编码油体包衣(OBC)多肽或脂滴相关蛋白(LDAP),以及[0144] b)第三遗传修饰,当与缺少所述第三遗传修饰的相应营养性植物部分或细胞相比时,其下调参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性。
[0145] 在上述方面的可选实施方案中,所述营养性植物部分或细胞包括:
[0146] a)第一外源多核苷酸,其编码增加所述营养性植物部分或细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽(优选WRI1多肽),以及
[0147] b)第二外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽(优选DGAT和/或PDAT),以及以下任何一种或两种或全部三种
[0148] c)第一遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应营养性植物部分或细胞相比时,其下调参与所述营养性植物部分或细胞中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽(优选SDP1TAG脂肪酶)的内源生成和/或活性,
[0149] d)第三外源多核苷酸,其编码这样的多肽,当与缺少第三外源多核苷酸的相应营养性植物部分或细胞相比时,所述多肽(优选酰基-ACP硫酯酶多肽)增加脂肪酸输出所述营养性植物部分或细胞的质体,
[0150] e)第四外源多核苷酸,其编码增加所述营养性植物部分或细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的第二转录因子多肽(优选LEC2多肽),以及
[0151] 其中每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述营养性植物部分或细胞中的表达的启动子。
[0152] 在上述方面的一实施方案中,所述营养性植物部分或细胞进一步包含以下一种或多种或全部:
[0153] a)第五多核苷酸,其编码油体包衣(OBC)多肽或脂滴相关蛋白(LDAP),以及[0154] b)第二遗传修饰,当与缺少所述第二遗传修饰的相应营养性植物部分或细胞相比时,其下调参与将脂肪酸输入所述营养性植物部分或细胞的质体的多肽的内源生成和/或活性,
[0155] c)第三遗传修饰,当与缺少所述第三遗传修饰的相应营养性植物部分或细胞相比时,其下调参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性。
[0156] 在上述方面的又一个实施方案中,所述营养性植物部分或细胞包含编码WRI1多肽的第一外源多核苷酸、编码DGAT多肽的第二外源多核苷酸、和减少的TAG脂肪酶多肽的含量和/或减少的TGD多肽的含量(相对于相应的野生型营养性植物部分或细胞),其中每个外源多核苷酸与能够指导所述多核苷酸在所述营养性植物部分或细胞中表达的启动子可操作地连接。
[0157] 在上述方面的另一个实施方案中,所述营养性植物部分或细胞包含编码PDAT或DGAT多肽的外源多核苷酸、增加的PDAT或DGAT多肽的含量、减少的TGD多肽含量和减少的TAG脂肪酶多肽含量(各自相对于相应的野生型营养性植物部分或细胞),其中所述外源多核苷酸与能够指导所述多核苷酸在所述营养性植物部分或细胞中表达的启动子可操作地连接。
[0158] 在上述方面的另一个实施方案中,所述营养性植物部分或细胞包含降低的TAG脂肪酶(例如SDP1 TAG脂肪酶)含量、降低的TGD多肽(例如TGD5多肽)含量、以及任选地降低的TST多肽(如TST1多肽)含量(各个减少是相对于相应的野生型营养性植物部分或细胞)。
[0159] 在上述方面的另一个实施方案中,所述细胞来自高粱属或玉米植物的营养性部分或在高粱属或玉米植物的营养性部分中。
[0160] 在一实施方案中,适用以下特征中的一种或多种或全部;
[0161] i)所述营养性植物部分或细胞相对于缺少第一外源多核苷酸的相应营养性植物部分或细胞具有增加的总脂肪酸合成,或者相对于缺少第一外源多核苷酸的相应营养性植物部分或细胞具有减少的总脂肪酸分解代谢,或者两者,从而相对于缺少第一外源多核苷酸的相应营养性植物部分或细胞,其具有升高水平的总脂肪酸,
[0162] ii)相对于具有第一外源多核苷酸且缺少编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽的外源多核苷酸的相应营养性植物部分或细胞,所述营养性植物部分或细胞具有增加的脂肪酰基酰基转移酶表达和/或活性,所述脂肪酰基酰基转移酶催化TAG、DAG或MAG的合成,优选TAG,
[0163] iii)相对于具有第一外源多核苷酸且缺少下调参与细胞质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性的遗传修饰的相应营养性植物部分或细胞,所述营养性植物部分或细胞在其质体中具有减少的从酰基-ACP和G3P生成溶血磷脂酸(LPA),
[0164] iv)相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应营养性植物部分或细胞,所述营养性植物部分或细胞在其总脂肪酸含量和/或其半乳糖脂含量中具有改变的C16:3-C18:3脂肪酸比例,优选减少的比例,
[0165] v)所述细胞在植物的营养性部分中,并且包含至少约8%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约
40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、8%-
75%、10%-75%、11%-75%、约15%-75%、约20%-75%、约30%-75%、约40%-75%、约
50%-75%、约60%-75%或约25%-50%(w/w干重)的总非极性脂质含量,
[0166] vi)所述细胞在植物的营养性部分中,并且包含至少约8%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约
40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、8%-
75%、10%-75%、11%-75%、约15%-75%、约20%-75%、约30%-75%、约40%-75%、约
50%-75%、约60%-75%或约25%-50%(w/w干重)的TAG含量,
[0167] vii)所述转录因子多肽选自由Wrinkled 1(WRI1)、Leafy Cotyledon 1(LEC1)、LEC1样、Leafy Cotyledon 2(LEC2)、BABY BOOM(BBM)、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4和Dof11组成的组,
[0168] viii)油酸占营养性植物部分或细胞中的总脂肪酸含量的至少20%(mol%)、至少22%(mol%)、至少30%(mol%)、至少40%(mol%)、至少50%(mol%)或至少60%(mol%),优选约65%(mol%)或20%-约65%,
[0169] ix)所述营养性植物部分或细胞中的非极性脂质包含一种或多种多不饱和脂肪酸,其选自二十碳二烯酸(EDA)、花生四烯酸(ARA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、或者它们中两种或更多种的组合,
[0170] x)一种或多种或全部启动子选自组成型启动子例如泛素基因启动子或肌动蛋白基因启动子,组织特异性启动子如叶和/或茎特异性启动子、发育调节启动子如衰老特异性启动子如SAG12启动子、诱导型启动子、或者昼夜节律调节启动子,
[0171] xi)所述营养性植物部分或细胞包含这样的总脂肪酸含量,相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应营养性植物部分或细胞,其油酸水平升高至少2%或至少3%,和/或相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应营养性植物部分或细胞,其α-亚麻酸(ALA)水平降低至少2%或至少3%,
[0172] xii)相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应营养性植物部分或细胞中的非极性脂质,所述营养性植物部分或细胞中的非极性脂质包含修改水平的总固醇,优选游离(非酯化的)固醇、硬脂酰酯、硬脂酰糖苷,
[0173] xiii)在重量基础上,所述营养性植物部分或细胞的一种或多种非极性脂质和/或总非极性脂质含量的水平比包含编码拟南芥(Arabidopsis thaliana)WRI1(SEQ ID NO:21)和拟南芥DGAT1(SEQ ID NO:1)的外源多核苷酸的相应营养性植物部分或细胞高至少
2%。
[0174] 在上述方面的另一实施例中,以下特征中的一个或多个或全部应用于相关的地方;
[0175] i)参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽是参与细胞中的TAG、DAG或单酰甘油(MAG)生物合成的脂肪酰基酰基转移酶,例如DGAT、PDAT、LPAAT、GPAT或MGAT,优选DGAT或PDAT,或为PDCT或CPT多肽,或PLC或PLD多肽,
[0176] ii)参与营养性植物部分或细胞中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽是SDP1脂肪酶、Cgi58多肽、酰基-CoA氧化酶如ACX1或ACX2、或者参与细胞中脂肪酸的β-氧化的多肽如PXA1过氧化物酶体ATP-结合盒转运蛋白,优选SDP1脂肪酶。
[0177] iii)所述油体包衣(OBC)多肽是油质蛋白,如聚油质蛋白(polyoleosin)或油体钙蛋白(caleosin),或者脂滴相关蛋白(LDAP)。
[0178] iv)增加脂肪酸输出所述营养性植物部分或细胞的质体的多肽是C16或C18脂肪酸硫酯酶如FATA多肽或FATB多肽、脂肪酸转运蛋白如ABCA9多肽或长链酰基-CoA合成酶(LACS)。
[0179] v)参与将脂肪酸输入所述营养性植物部分或细胞的质体的多肽是脂肪酸转运蛋白或其亚基或其调节多肽,优选TGD多肽,更优选TGD5多肽,以及
[0180] vi)参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽是质体GPAT、质体LPAAT或质体PAP。
[0181] 在上述方面的一个实施方案中,相对于野生型,在本发明的营养性植物部分、种子或细胞中PDCT或CPT或PDCT和CPT的水平或活性增加。在优选的实施方案中,本发明的营养性植物部分、种子或细胞包含一种或多种编码PDCT和/或CPT多肽的外源多核苷酸。所述PDCT和/或CPT多肽可以对于营养性植物部分、种子或细胞是内源性的,即是相同物种的,但相对于野生型具有增加的水平或活性,或对植物物种是异源的。每种外源多核苷酸与在营养性植物部分、种子或细胞中表达的启动子可操作地连接,以提供PDCT和/或CPT的增加的水平或活性。在一个优选的实施方案中,PDCT和/或CPT的水平或活性的增加提供了DAG向磷脂酰胆(PC)的转化的增加,或从PC到DAG的转化的增加,或更优选这两者的转化的增加。因此营养性植物部分、种子或细胞具有增加的由PC产生的DAG的产生,该DAG可通过DGAT的活性产生TAG。在更优选的实施方案中,相对于缺乏外源多核苷酸的相应部分或细胞,所述营养性植物部分、种子或细胞中TAG的水平增加。
[0182] 可选地,相对于野生型,本发明的营养性植物部分、种子或细胞中PDCT或CPT的水平或活性降低,或PDCT和CPT的水平或活性降低,例如通过突变编码酶的内源基因中或通过由减少其表达的RNA分子下调编码酶的基因。在该实施方案中,通过减少Kennedy途径(从头DAG)产生的DAG向PC的转化,导致可用于在营养性植物部分、种子或细胞中合成TAG的从头DAG水平增加。
[0183] 在上述方面的一个实施方案中,相对于野生型,本发明的营养性植物部分、种子或细胞中磷脂酶-C(PLC)或磷脂酶-D(PLD)或PLC和PLD的水平或活性增加。在优选的实施方案中,本发明的营养性植物部分、种子或细胞包含一种或多种编码PLC和/或PLD多肽的外源多核苷酸。所述PLC和/或PLD多肽对于营养性植物部分或细胞可以是内源性的,但相对于野生型具有增加的水平或活性,或者对植物物种是异源的。外源多核苷酸与在所述营养性植物部分或细胞中表达的启动子可操作地连接,以提供PLC和/或PLD的增加的水平或活性。在一个优选的实施方案中,PLC和/或PLD的水平或活性的增加提供了在PLC的情况下PC向DAG和磷酸胆碱的转化的增加,或在PLD的情况下PC向磷脂酸(PA)和胆碱的转化的增加。随后通过PAP的作用将PA转化为DAG。因此,所述营养性植物部分或细胞具有增加量的DAG,其可通过DGAT的活性产生TAG。在更优选的实施方案中,相对于缺少编码PLC和/或PLD的外源多核苷酸的相应部分或细胞,所述营养性植物部分或细胞中TAG的水平或活性增加。在一个优选的实施方案中,如上所述,PLC和/或PLD的水平或活性的增加与PDCT和/或CPT的水平或活性的增加相结合。
[0184] 在上述方面的一个实施方案中,相对于野生型,本发明的营养性植物部分或细胞中PDAT的水平或活性增加。在优选的实施方案中,所述营养性植物部分或细胞包含一种或多种编码PDAT多肽的外源多核苷酸。所述PDAT多肽对于营养性植物部分或细胞可以是内源的,但相对于野生型其水平或活性增加,或对植物物种是异源的。所述外源多核苷酸与在营养性植物部分或细胞中表达的启动子可操作地连接,以提供增加的PDAT水平或活性。期望PDAT的水平或活性增加以提供来自DAG和PC的增加的TAG产生。在一个优选的实施方案中,如上所述,PDAT的水平或活性的增加与PDCT和/或CPT的水平或活性的增加,或与PLC和/或PLD的水平或活性的增加相结合。
[0185] 在上述方面的一个实施方案中,相对于野生型,本发明的营养性植物部分或细胞中两种不同DGAT的水平或活性增加。在优选的实施方案中,本发明的营养植物部分或细胞包含两种外源多核苷酸,每种都编码DGAT多肽,所述多肽是不同的。DGAT多肽之一可以对于所述营养性植物部分或细胞是内源性的,但相对于野生型其水平或活性增加,而另一种是异源的,或两种DGAT对植物物种都是异源的。所述外源多核苷酸各自与在营养性植物部分或细胞中表达的启动子可操作地连接,以提供两种DGAT的增加的表达。期望两种DGAT的增加的水平或活性提供由从头DAG和PC衍生的DAG产生的TAG的产生的增加。在一个优选的实施方案中,DGAT之一(第一DGAT)在从头DAG上比PC衍生的DAG更具活性,而另一种DGAT(第二DGAT)在PC衍生的DAG上比从头DAG更具活性。DGAT活性的这种差异可以通过细胞内质网(ER)中两种DGAT的不同区室化或定位而发生。在一个实施方案中,DGAT之一衍生自单细胞生物,例如细菌DGAT或单细胞藻类DGAT(例如衣藻(Chlamydomonas)DGAT)或其变体。在一个优选的实施方案中,第一DGAT衍生自天然产生油的植物物种,所述油具有低水平的多不饱和脂肪酸(PUFA)(例如少于20%的PUFA),或具有其氨基酸序列至少95%相同性的DGAT同源物,并且第二DGAT衍生自产生相对较高水平的PUFA(例如至少40%PUFA)的油籽物种,或具有其氨基酸序列至少95%相同性的DGAT同源物。例如,所述第一DGAT可以来自橄榄、椰子、棕榈或山竹,并且所述第二DGAT可以来自芸苔、大豆、棉花或亚麻籽。通常,所述第一DGAT在从头DAG上更活跃并且所述第二DGAT在PC衍生的DAG上更活跃。在一个优选的实施方案中,如上所述,两种DGAT的活性的增加与PDCT和/或CPT的水平或活性的增加、或PLC和/或PLD的水平或活性的增加、或PDAT的水平或活性的增加相结合。
[0186] 在上述实施方案中,水平或活性增加的程度优选为至少10%或至少20%至最大100%或200%增加。水平或活性减少的程度优选为至少10%或20%,最大减少90%或95%、或甚至100%减少。
[0187] 在上述实施方案中,所述水平或活性的增加导致相对于缺少各自外源性多核苷酸的相应营养性植物部分或细胞,本发明的营养性植物部分或细胞的总脂质中的TTQ增加和/或TAG水平增加。在上述方面的另一个实施方案中,本发明的细胞来自植物开花之前的植物的叶或茎或在植物开花之前的植物的叶或茎中,并且所述细胞包含的TFA含量和/或总非极性脂肪酸含量为在重量基础上至少约6%、至少约8%、至少约10%、至少约11%、在8%至15%之间、或在9%至12%之间,优选在约8%至约20%之间。
[0188] 在上述方面的另一个实施方案中,每个遗传修饰独立地是内源基因的突变,所述突变部分或完全地使基因失活,例如点突变、插入或缺失,或所述遗传修饰是编码降低内源基因表达的RNA分子的外源多核苷酸,其中所述外源多核苷酸与能够指导多核苷酸在所述营养性植物部分或细胞中表达的启动子可操作地连接。
[0189] 在另一方面,本发明提供了一种植物或其部分,优选为高粱属或者玉米植物,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分的总脂肪酸(TFA)含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含约5%(w/w干重)、优选约6%至约20%之间的TFA含量。在一个实施方式中,所述植物部分为获自所述植物的一个或多个种子,或当播种时可以得到这样的植物的一个或多个种子。
[0190] 在另一方面,本发明提供了一种植物或其部分,优选为高粱属或者玉米植物或其部分,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分的总脂肪酸含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其中所述营养性植物部分包含约6%(w/w干重)、优选约6%至约20%之间的总TAG含量,并且优选具有以TAG形式酯化的脂肪酸与除TAG之外的脂质形式的脂肪酸的比例为20:1至1.5:1之间或5:1和2:1之间。
[0191] 在另一方面,本发明提供了一种植物或其部分,优选为高粱属或者玉米植物植物或其部分,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和减少的SDP1多肽含量,每个都是相对于相应的野生型营养性植物部分。
[0192] 在另一方面,本发明提供了一种植物或其部分,优选为高粱属或者玉米植物植物或其部分,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和增加的LEC2多肽含量,每个都是相对于相应的野生型营养性植物部分。
[0193] 在另一方面,本发明提供了一种植物或其部分,优选为高粱属或者玉米植物植物或其部分,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含增加的PDAT或DGAT多肽含量、减少的TGD多肽(优选TGD5多肽)含量和减少的SDP1多肽含量,每个都是相对于相应的野生型营养性植物部分。
[0194] 在另一方面,本发明提供了一种植物或其部分,优选为高粱属或者玉米植物植物或其部分,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含减少的TAG脂肪酶(例如SDP1 TAG脂肪酶)含量、减少的TGD多肽(例如TGD5多肽)的含量、以及任选地减少的TST多肽(例如TST1多肽)的含量,每个减少都是相对于相应的野生型营养性植物部分。
[0195] 在另一方面,本发明提供了一种植物或其部分,优选为高粱属或者玉米植物植物或其部分,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含相对于所述野生型增加的PDCT和/或CPT的水平或活性。在一个实施方案中,所述植物或部分包含编码PDCT和/或CPT多肽的一个或多个外源多核苷酸。所述PDCT和/或CPT多肽可以对于植物或部分是内源性的,但相对于野生型其存在的水平增加,或对于所述植物物种是异源的。每个外源多核苷酸可操作地连接至在所述营养性植物部分中表达的启动子,以提供提高的PDCT和/或CPT的水平或活性。在一个优选的实施方案中,PDCT和/或CPT的水平或活性的增加提供了DAG向PC的转化的增加,或从PC到DAG的转化的增加,或更优选这两者的转化的增加。因此所述营养性植物部分具有增加的DAG的量,该DAG可通过DGAT的活性产生TAG。在更优选的实施方案中,相对于缺乏外源多核苷酸的相应部分,所述营养性植物部分中TAG的水平增加。
[0196] 在另一方面,本发明提供了一种植物或其部分,优选为高粱属或者玉米植物植物或其部分,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含相对于野生型减少的PDCT或CPT的水平或活性。在一个实施方案中,所述植物或部分包括编码所述酶的内源基因中的突变或一个或多个外源多核苷酸,所述外源多核苷酸各自编码RNA分子,所述RNA分子减少编码所述酶的内源基因中的一种或两种的表达。
[0197] 在另一方面,本发明提供了一种植物或其部分,优选为高粱属或者玉米植物植物或其部分,所述植物包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分包含增加的PLC或PLD的水平或活性,或两者。在优选的实施方案中,所述植物或部分包括编码PLC和/或PLD多肽的一个或多个外源多核苷酸。所述PLC和/或PLD多肽可以对于所述植物或部分是内源性的,但其水平或活性相对于野生型增加,或对于所述植物物种是异源的。每个外源多核苷酸与在所述营养性植物部分中表达的启动子可操作地连接,以提供PLC和/或PLD的增加的水平或活动。在优选实施例中,PLC和/或PLD的水平或活性的增加提供了在PLC的情况下PC向DAG和磷酸胆碱的转化的增加,或在PLD的情况下PC向PA和胆碱的转化的增加。因此,所述营养性植物部分或细胞具有增加量的DAG,其可通过DGAT的活性产生TAG。在更优选的实施方案中,相对于缺少编码PLC和/或PLD的外源多核苷酸的相应部分,所述营养性植物部分中TAG的水平增加。
[0198] 在另一方面,本发明提供了一种植物或其部分,优选为高粱属或者玉米植物植物或其部分,相对于野生型,所述植物包含在营养性植物部分中的PDAT的水平或活性增加。在优选的实施方案中,所述营养性植物部分包括编码PDAT多肽的一个或多个外源多核苷酸。所述PDAT多肽可以对于所述营养性部分是内源性的,但是相对于所述野生型具有增加的水平或活性,或对于植物物种是异源的。所述外源多核苷酸与在营养性植物部分中表达的启动子可操作地连接,以提供PDAT的增加的水平或活性。期望PDAT的水平或活性增加以提供来自DAG和PC的增加的TAG产生。在一个优选的实施方案中,如上所述,PDAT的水平或活性的增加与PDCT和/或CPT的水平或活性的增加,或与PLC和/或PLD的水平或活性的增加相结合。
[0199] 在另一方面,本发明提供了一种植物或其部分,优选为高粱属或者玉米植物植物或其部分,相对于野生型,所述植物包含在营养性部分中的两种不同DGAT的水平或活性增加。在优选的实施方案中,本发明的营养植物部分或细胞包含两种外源多核苷酸,每种都编码DGAT多肽,所述多肽是不同的。DGAT多肽之一可以对于所述植物或部分是内源性的,但相对于野生型其水平或活性增加,而另一种是异源的,或两种DGAT对植物物种都是异源的。所述外源多核苷酸各自与在营养性植物部分中表达的启动子可操作地连接,以提供每种DGAT的增加的表达。期望两种DGAT的增加的水平或活性提供(i)由从头DAG产生的TAG的产生的增加和(ii)由PC产生的DGA(PC衍生的DAG)产生的TAG的产生的增加。在一个实施方案中,第一DGAT在从头DAG上比PC衍生的DAG更具活性,而第二DGAT在PC衍生的DAG上比从头DAG更具活性。DGAT活性的这种差异可以通过细胞内质网(ER)中两种DGAT的不同区室化或定位而发生。在一个实施方案中,DGAT之一衍生自单细胞生物,例如细菌DGAT或单细胞藻类DGAT(例如衣藻(Chlamydomonas)DGAT)或其变体。在一个优选的实施方案中,第一DGAT衍生自产生油的植物物种,所述油具有低水平的多不饱和脂肪酸(PUFA)(例如少于20%的PUFA),而第二DGAT衍生自产生相对较高水平的PUFA(例如至少40%PUFA)的油籽物种。通常,所述第一DGAT在从头DAG上更活跃并且所述第二DGAT在PC衍生的DAG上更活跃。在一个优选的实施方案中,如上所述,两种DGAT的活性的增加与PDCT和/或CPT的水平或活性的增加、或PLC和/或PLD的水平或活性的增加、或PDAT的水平或活性的增加相结合。
[0200] 上述方面的特征的组合对于本发明的植物、植物部分和细胞,以及在产生和使用它们的方法中是显而易见的。
[0201] 在上述方面的一个实施方案中,本发明的植物一般是表型正常的。在一个实施方案中,本发明的植物相对于相应的野生型植物具有至少为80%的地上生物质。优选地,所述植物相对于相应的野生型植物具有至少为80%的植物高度,并且是雄性和雌性可育的。在一个实施方案中,所述植物为杂种玉米植物。
[0202] 在一个实施方案中,本发明的植物的营养性植物部分具有这样的总脂肪酸含量,其特征在于其TTQ在0.01至0.6之间。在一个实施方案中,所述营养性植物部分的TTQ在0.01至0.55之间、或0.01至0.5之间、或为约0.1、或为约0.2、或为约0.3、或为约0.4、或为约0.5。优选地,TTQ在0.60至0.84之间,或者在0.84至0.95之间。
[0203] 在上述方面的优选实施方案中,本发明的细胞或营养性植物部分包含一种或多种外源多核苷酸或遗传修饰,相对于缺乏外源多核苷酸或遗传修饰的相应细胞或营养性植物部分,所述外源多核苷酸或遗传修饰各自或组合地增加细胞或营养性植物部分的总脂肪酸含量的TTQ,其中所述外源多核苷酸或遗传修饰提供(i)减少的TAG脂肪酶多肽含量,优选减少的SDP1多肽含量,(ii)减少的TGD多肽含量,优选减少的TGD5多肽含量,(iii)增加的OBC多肽或LDAP含量,(iv)增加的增加脂质酸从质体中输出的多肽含量,所述多肽优选酰基-ACP硫酯酶,(v)减少的TST多肽含量,优选减少的TST1多肽含量,(vi)修饰的PDCT多肽水平,(vii)修饰的CPT多肽水平,(viii)增加的PLC多肽水平或活性,(ix)增加的PLD多肽水平或活性,(x)增加的PDAT多肽水平或活性,和(xi)增加的两种DGAT多肽水平或活性。更优选地,所述TTQ在0.60和0.84之间或在0.84和0.95之间,和/或所述细胞或营养性植物部分包含约6%(w/w干重),优选在约6%至20%之间的TAG含量。
[0204] 在上述方面的实施方案中,所述植物或其部分包括以下的一种或两种:
[0205] a)第一外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽(优选WRI1多肽),以及
[0206] b)第二外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽(优选DGAT和/或PDAT),以及以下任何一种或两种或三种或全部四种
[0207] c)遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分相比时,其下调参与所述植物或其部分中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽(优选SDP1 TAG脂肪酶)的内源生成和/或活性,
[0208] d)第三外源多核苷酸,其编码这样的多肽,当与缺少第三外源多核苷酸的相应细胞相比时,所述多肽(优选酰基-ACP硫酯酶多肽)增加脂肪酸输出所述植物或其部分中的细胞的质体,
[0209] e)第四外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的第二转录因子多肽(优选LEC2多肽),以及
[0210] f)第二遗传修饰,当与缺少所述第二遗传修饰的相应细胞相比时,其下调参与将脂肪酸输入所述细胞的质体的多肽的内源生成和/或活性,
[0211] 其中将每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物或其部分中的表达的启动子。
[0212] 在上述方面的一实施方案中,所述植物或其部分进一步包含以下一种或两种:
[0213] a)第五多核苷酸,其编码油体包衣(OBC)多肽或脂滴相关蛋白(LDAP),以及[0214] b)第三遗传修饰,当与缺少所述第三遗传修饰的相应植物或其部分相比时,其下调参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性。
[0215] 可选地,在另一实施方案中,所述植物或其部分包括:
[0216] a)第一外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽(优选WRI1多肽),以及
[0217] b)第二外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽(优选DGAT和/或PDAT),以及以下任何一种或两种或全部三种
[0218] c)遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分相比时,其下调参与所述植物或其部分中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽(优选SDP1 TAG脂肪酶)的内源生成和/或活性,
[0219] d)第三外源多核苷酸,其编码这样的多肽,当与缺少第三外源多核苷酸的相应细胞相比时,所述多肽(优选酰基-ACP硫酯酶多肽)增加脂肪酸输出所述植物中的细胞的质体,
[0220] e)第四外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的第二转录因子多肽(优选LEC2多肽),
[0221] 其中每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物或其部分中的表达的启动子。
[0222] 在上述方面的一实施方案中,所述植物或其部分进一步包含以下一种或多种或全部:
[0223] a)第五多核苷酸,其编码油体包衣(OBC)多肽或脂滴相关蛋白(LDAP),
[0224] b)第二遗传修饰,当与缺少所述第二遗传修饰的相应植物相比时,其下调参与将脂肪酸输入所述植物的质体的多肽的内源生成和/或活性,以及
[0225] c)第三遗传修饰,当与缺少所述第三遗传修饰的相应植物相比时,其下调参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性。
[0226] 在上述方面的另一个实施方案中,所述植物部分是营养性植物部分并且相对于植物的种子,一个或多个或多个或所有的启动子在所述营养性植物部分中以较高水平表达。例如,优选的启动子是泛素基因启动子或SSU启动子。可选地,一个或多个或全部启动子均不是SSU启动子。
[0227] 在另一个实施方案中,所述植物或其部分的进一步的特征在于一个或多个如本发明的细胞或上述各方面的方法的上下文中所述的特征。
[0228] 在上述方面的一个实施方案中,本发明的高粱属或玉米植物或用于本发明方法或本文另外所述的植物或其部分,已经在每天至少13小时的光周期下生长至少1周、或在至少2周、或至少3周、或至少4周的时间,所述生长优选直至收获所述植物以从所述植物获得营养性部分。在这样的条件下,所述植物的地上生物质相对于相应的野生型植物为优选至少
80%。在这样的条件下生长后,可以从植物中收获所述植物的种子。
[0229] 在上述方面的另一个实施方案中,本发明的高粱属或玉米植物或用于本发明方法或本文另外所述的植物或其部分,正在或已在至少400ppm的CO2浓度下生长。
[0230] 在进一步的实施方案中,本发明的高粱属或玉米植物或用于本发明方法或本文另外所述的植物或其部分,包含一种或多种编码一种或多种蛋白质的外源多核苷酸,其增加营养植物部分中的总蛋白质含量。
[0231] 另一方面,本发明提供至少约1000株植物的群体,每株植物是根据本发明的植物,在田地中生长,或至少约1000个营养性植物部分的集合,每个部分是本发明的营养性植物部分,其中所述营养性植物部分是从田间生长的植物中收获的。优选地,所述植物在上述光周期和/或CO2条件下生长。
[0232] 另一方面,本发明提供了根据本发明的植物的种子或从其获得的种子、或者当播种时产生本发明的植物。可选地,所述种子可能已被处理,因此它不再能够发芽,和/或被研磨(ground)、碾压(milled)、抛光(polished)、破裂(cracked)或热处理
[0233] 在另一方面,本发明提供了鉴定、选择和/或获得具有所需的表型的本发明植物或其部分的方法,优选具有所需的表型的高粱属或玉米植物或其部分,该方法包括
[0234] i)获得多个候选植物或其部分,每个候选植物或其部分包含以下一个或两个[0235] a)第一外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽(优选WRI1多肽),以及
[0236] b)第二外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽(优选DGAT和/或PDAT),以及以下任何一种或两种或三种或全部四种
[0237] c)遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分相比时,其下调参与所述植物或其部分中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽(优选SDP1 TAG脂肪酶)的内源生成和/或活性,
[0238] d)第三外源多核苷酸,其编码这样的多肽,当与缺少第三外源多核苷酸的相应细胞相比时,所述多肽(优选酰基-ACP硫酯酶多肽)增加脂肪酸输出所述植物或其部分中的细胞的质体,
[0239] e)第四外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的第二转录因子多肽(优选LEC2多肽),以及
[0240] f)第二遗传修饰,当与缺少所述第二遗传修饰的相应细胞相比时,其下调参与将脂肪酸输入所述细胞的质体的多肽的内源生成和/或活性,
[0241] 其中每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物中的表达的启动子;
[0242] ii)分析来自步骤i)的多个部分,或来自步骤i)的所述多个候选植物中的每个植物的至少一部分中的脂质,以及
[0243] iii)鉴定、选择和/或获得植物或其部分,其包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分的总脂肪酸(TFA)含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,并且其具有所述营养性植物部分包含约5%(w/w干重)、优选约6%至约20%之间的TFA含量。
[0244] 在一个实施方案中,选择的植物或其部分包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分具有这样的总脂肪酸含量,其特征在于其TTQ在0.01至0.6之间。在一个实施方案中,所述营养性植物部分的TTQ在0.01至0.55之间、或0.01至0.5之间、或为约0.1、或为约0.2、或为约0.3、或为约0.4、或为约0.5。优选地,TTQ在0.60至0.84之间,或者在0.84至0.95之间。
[0245] 在另一方面,本发明提供了鉴定、选择和/或获得具有所需的表型的本发明植物或其部分的方法,优选具有所需的表型的高粱属或玉米植物或其部分,该方法包括
[0246] i)获得多个候选植物或其部分,每个候选植物或其部分包含以下一个或两个[0247] a)第一外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽(优选WRI1多肽),以及
[0248] b)第二外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽(优选DGAT和/或PDAT),以及以下任何一种或两种或三种或全部四种
[0249] c)遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分相比时,其下调参与所述植物或其部分中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽(优选SDP1 TAG脂肪酶)的内源生成和/或活性,
[0250] d)第三外源多核苷酸,其编码这样的多肽,当与缺少第三外源多核苷酸的相应细胞相比时,所述多肽(优选酰基-ACP硫酯酶多肽)增加脂肪酸输出所述植物或其部分中的细胞的质体,以及
[0251] e)第四外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的第二转录因子多肽(优选LEC2多肽),
[0252] 其中每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物或其部分中的表达的启动子;
[0253] ii)分析来自步骤i)的多个部分,或来自步骤i)的所述多个候选植物中的每个植物的至少一部分中的脂质,
[0254] iii)鉴定、选择和/或获得植物或其部分,其中包含这样的营养性植物部分,所述营养性植物部分的总脂肪酸含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其具有所述营养性植物部分包含约6%(w/w干重)、优选约6%至约20%之间的总TAG含量,并且优选具有以TAG形式酯化的脂肪酸与除TAG之外的脂质形式的脂肪酸的比例为20:1至1.5:1之间或5:1和2:1之间。
[0255] 在另一方面,本发明提供了一种用于鉴定和/或获得在其总脂肪酸含量中具有增加的TTQ的植物(优选高粱属或玉米植物)或其部分的方法,所述方法包括:
[0256] i)获得多个候选植物或其部分,所述多个候选植物或其部分各自包括一个或多个遗传修饰,其中所述遗传修饰提供(a)减少的TAG脂肪酶多肽含量或活性,优选减少的SDP1TAG脂肪酶含量或活性,(b)减少的TGD多肽含量或活性,优选减少的TGD5多肽含量或活性,(c)增加的OBC多肽或LDAP含量,(d)增加的增加脂质酸从质体中输出的多肽含量或活性,所述多肽优选酰基-ACP硫酯酶,(e)减少的TST多肽含量或活性,优选减少的TST1多肽含量或活性,(f)修饰的PDCT多肽水平或活性,(g)修饰的CPT多肽水平或活性,(h)增加的PLC多肽含量或活性,(i)增加的PLD多肽含量或活性,(j)增加的PDAT多肽含量或活性,和(k)增加的两种DGAT多肽含量或活性,
[0257] ii)分析来自步骤i)的多个部分,或来自步骤i)的所述多个候选植物中的每个植物的至少一部分中的脂质,
[0258] iii)鉴定、选择和/或获得植物或其部分,其包含相对于缺乏遗传修饰的相应植物或植物部分或相对于来自多个候选植物或其部分的另一植物或植物部分,其总脂肪酸含量中的TTQ增加。
[0259] 在上述方面的一个实施方案中,TTQ的增加为增加至少0.05,优选在0.5至0.80之间。当在候选植物或其部分中表达时,一种或多种遗传修饰中的每一种导致根据(a)、(b)或(e)的多肽含量或活性减少,根据(c)、(d)、(h)、(i)、(j)或(k)的含量或活性增加,以及(f)或(g)的含量和/或活性的增加或减少。在多肽含量或活性降低的情况下,每个遗传修饰独立地是编码部分或完全使基因失活的多肽的内源基因的突变,例如点突变、插入或优选缺失,或所述遗传修饰包括整合到外源多核苷酸的基因组中,所述外源多核苷酸编码抑制所述内源基因表达的RNA分子,其中所述外源多核苷酸与能够指导所述多核苷酸在植物或其部分中表达的启动子可操作地连接。
[0260] 在一个实施方案中,上述方面的方法的步骤(ii)包括从候选植物或其部分中提取脂质,和以下的一种或多种:(a)将植物或其部分中的TAG与非TAG脂质分离,(b)确定提取的脂质中TAG和非TAG脂质的相对量。在一个实施方案中,该方法包括在步骤ii)之后计算候选植物或部分的TTQ的步骤。可以基于TTQ和/或其TAG或TFA含量来鉴定或选择所鉴定或选择的植物。在一个优选的实施方案中,鉴定的选定植物包含营养性植物部分,所述营养性植物部分具有在0.60和0.84之间或在0.84和0.95之间的TTQ,和/或所述营养性植物部分包含约6%(w/w干重),优选约6%至约20%之间的TAG含量。
[0261] 在上述方面的方法的一个实施方案中,该方法进一步包括繁殖本发明的植物或其部分以获得后代植物或其部分的步骤,例如从植物的种子或营养性部分,或进一步包括将植物与具有不同遗传组成的植物杂交以将遗传修饰引入不同的遗传背景中的步骤。本发明清楚地包括所述后代植物及其部分,其包含所述遗传修饰和总脂肪酸含量中增加的TTQ。
[0262] 在上述方面的方法的更优选的实施方案中,多种候选植物或其部分各自包含第一外源多核苷酸,所述第一外源多核苷酸编码增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽(优选WRI1多肽),以及第二外源多核苷酸,所述第二外源多核苷酸编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽(优选DGAT和/或PDAT)。在该优选实施方案中,所述遗传修饰是额外于第一和第二外源多核苷酸的并且相对于具有第一和第二外源多核苷酸并且缺少所述遗传修饰的相应职务或营养性部分增加了TTQ,所述遗传修饰导致根据(a)至(k)的减少的、增加的或修饰的多肽含量或活性。
[0263] 在上述方面的方法的一个实施方案中,鉴定、选择和/或获得的植物或其部分的特征进一步在于在本发明的植物、本发明的高粱属或玉米植物、或上述方面的方法的上下文中定义的一个或多个特征。
[0264] 鉴定、选择和/或获得本发明植物的方法也可用于鉴定,选择和/或获得在植物茎中具有增加的TTQ或TAG含量的植物,其优选伴随有植物叶片中的TTQ或TAG含量增加,虽然植物叶片中的TTQ和TAG含量可能根本不增加或不与茎中增加的含量一样多。
[0265] 另一方面,本发明提供了获得根据本发明的细胞或植物的方法,优选高粱属或玉米细胞或植物,该方法包括将如上定义的至少一种外源多核苷酸和/或至少一种遗传修饰引入细胞或植物的步骤,优选高粱属或玉米细胞或植物。
[0266] 在一个实施方案中,所述方法包括以下一个或多个或全部步骤:
[0267] i)在细胞或植物或后代细胞或由此而来的植物中表达所述外源多核苷酸和/或遗传修饰,
[0268] ii)分析所述细胞或植物或后代细胞或植物的脂质含量,以及
[0269] iii)选择或鉴定根据本发明的细胞或植物。
[0270] 获得的细胞可以是高粱属或玉米植物或优选其营养性部分。
[0271] 在该优选实施方案中,所述外源多核苷酸和/或遗传修饰提供修饰的特征:包括根据上述(a)至(k)的减少的、增加的或修饰的多肽含量。在一个实施方案中,该方法包括在步骤ii)之后计算候选植物或部分的TTQ的步骤。在一个优选实施方案中,可以基于其TTQ和/或其TAG含量来鉴定或选择所鉴定或选择的细胞或植物,更优选TTQ在0.60和0.84之间或在0.84和0.95之间,和/或所述营养性植物部分包含约6%(w/w干重),优选约6%至约20%之间的TAG含量。
[0272] 在另一方面,本发明提供了一种产生植物的方法,优选高粱属或玉米植物,所述植物的基因组中整合有本文所定义的一组外源多核苷酸和/或遗传修饰,所述方法包括以下步骤:
[0273] i)杂交两种亲本植物,其中一种植物包含如上定义的至少一种外源多核苷酸和/或至少一种遗传修饰,并且另一种植物包含如上定义的至少一种外源多核苷酸和/或至少一种遗传修饰,并且其中在两者之间两个亲本植物包含一组如上定义的外源多核苷酸和/或遗传修饰,
[0274] ii)针对是否存在如上定义的一组外源多核苷酸和/或遗传修饰选择来自杂交中的一种或多种后代植物,以及
[0275] iii)选择包含如上定义的一组外源多核苷酸和/或遗传修饰的后代植物,
[0276] 从而产生所述植物。
[0277] 在一个实施方案中,产生的植物或其部分的特征进一步在于在本发明的细胞或植物、优选高粱属或玉米细胞或植物、或上述方面的方法的上下文中定义的一个或多个特征。
[0278] 另一方面,本发明提供了一种生产油产品的方法,所述方法包括以下步骤:
[0279] (i)在反应器中处理组合物,所述组合物包含
[0280] (a)营养性植物部分,优选高粱属或玉米营养性植物部分,所述营养性植物部分的总脂肪酸(TFA)含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,并且所述营养性植物部分包含约5%(w/w干重)、优选至少10%的TFA含量,[0281] (b)溶剂,其包含水、醇或两者,以及
[0282] (c)任选存在的催化剂,
[0283] 其中所述处理包括在氧化、还原或惰性环境中于约50℃-约450℃的温度和5-350巴的压力下加热所述组合物1-120分钟,
[0284] (ii)以相对于所述营养性植物部分的干重至少35重量%的收率从所述反应器回收油产品,
[0285] 从而生产所述油产品。
[0286] 在一个实施方案中,所述营养性植物部分具有0.01至0.6之间的TTQ。在一个实施方案中,所述营养性植物部分的TTQ在0.01至0.55之间、或0.01至0.5之间、或为约0.1、或为约0.2、或为约0.3、或为约0.4、或为约0.5。优选地,TTQ在0.60至0.84之间或0.84至0.95之间。
[0287] 另一方面,本发明提供了一种生产油产品的方法,所述方法包括以下步骤:
[0288] (i)在反应器中处理组合物,所述组合物包含
[0289] (a)营养性植物部分,优选高粱属或玉米营养性植物部分,所述营养性植物部分的总脂肪酸含量:包含以三酰基甘油(TAG)形式酯化的脂肪酸和除TAG之外的脂质形式的脂肪酸,其具有所述营养性植物部分包含约6%(w/w干重)并且优选具有以TAG形式酯化的脂肪酸与除TAG之外的脂质形式的脂肪酸的比例为20:1至1.5:1之间或5:1和2:1之间,
[0290] (b)溶剂,其包含水、醇或两者,以及
[0291] (c)任选存在的催化剂,
[0292] 其中所述处理包括在氧化、还原或惰性环境中于约50℃-约450℃的温度和5-350巴的压力下加热所述组合物1-120分钟,
[0293] (ii)以相对于所述营养性植物部分的干重至少35重量%的收率从所述反应器回收油产品,
[0294] 从而生产所述油产品。
[0295] 在上述两个方面的一个实施方案中,应用以下的一种或多种或全部:
[0296] (i)所述营养性植物部分具有至少1kg的干重,
[0297] (ii)在干重基础上,所述营养性植物部分具有至少10%、至少15%、至少20%、约25%、约30%、约35%或30%-75%的总TFA含量和/或非极性脂质含量,
[0298] (iii)所述组合物具有5%-90%的固体浓度,
[0299] (iv)所述催化剂包含NaOH或KOH或两者,优选浓度为0.1M-2M,
[0300] (v)所述处理时间为1-60分钟,优选10-60分钟,更优选15-30分钟,
[0301] (vi)如果所述溶剂为水,则所述方法产生最小36重量%、37重量%、38重量%、39重量%或40重量%,以及最大55重量%或60重量%(相对于所述营养性植物部分的干重)之间的油产品收率,
[0302] (vii)如果所述溶剂包含醇,则所述方法产生最小36重量%、37重量%、38重量%、39重量%或40重量%,以及最大65重量%或70重量%(相对于所述营养性植物部分的干重)之间的油产品收率,
[0303] (viii)如果所述溶剂包含约80%水,则所述油产品包含约30%的C13-C22碳氢化合物,
[0304] (ix)如果所述溶剂包含约50%甲醇,则所述油产品包含约50%脂肪酸甲基酯(FAME),
[0305] (x)回收的油产品具有少于约15重量%的水含量。
[0306] (xi)相对于利用相应营养性植物部分(在干重基础上其非极性脂质含量少于2%)的相应方法,油产品的收率大至少2重量%,以及
[0307] (xii)已通过干燥、劈砍(chopping)、切碎(shredding)、磨制(milling)、辗压(rolling)、压榨(pressing)、破碎(crashing)或研磨(grinding)中的一种或多种物理加工步骤(i)(a)中的营养性植物部分。
[0308] 在上述两方面的另一实施方案中,所述方法进一步包括以下一个或多个:
[0309] (i)回收的油产品的加氢脱氧,
[0310] (ii)用氢处理回收的油产品以降低所述油产品中的或糖水平,
[0311] (iii)从回收的油产品生产合成气,以及
[0312] (iv)分级分离回收的油产品以生产燃料油、柴油、油或汽油中的一种或多种。
[0313] 在上述两方面的另一实施方案中,所述营养性植物部分包含植物叶、茎或两者。
[0314] 在上述两个方面的实施方案中,所处理的营养性植物部分的特征还在于在本发明的高粱属或玉米植物部分或细胞的上下文中定义的一个或多个特征。
[0315] 另一方面,本发明提供了一种生产工业产品的方法,所述方法包括以下步骤:
[0316] i)获得本发明的细胞,优选高粱属或玉米细胞,本发明的植物或其部分、优选高粱属或玉米植物或其部分,或本发明的种子,以及
[0317] ii)以下任一种:
[0318] a)通过在所述细胞、植物或其部分或种子中原位向脂质施用热、化学或酶促方式,或者它们的任何组合,将步骤i)的所述细胞、植物或其部分或种子中的至少一些脂质转化为工业产品,或
[0319] b)物理加工步骤i)的所述细胞、植物或其部分或种子,并随后或同时通过在加工的细胞、植物或其部分或种子中向脂质施用热、化学或酶促方式,或者它们的任何组合,将所述细胞、植物或其部分或种子中的至少一些脂质转化为工业产品,以及
[0320] iii)回收所述工业产品,
[0321] 从而生产所述工业产品。
[0322] 在上述两个方面的一实施方案中,所述植物部分是营养性植物部分。
[0323] 在一个实施方案中,所述物理加工所述细胞、植物或其部分或种子的步骤包括碾压、压榨、破碎或研磨所述细胞、植物或其部分或种子中的一种或多种。所述工业产品如本文所述。
[0324] 在另一个实施方案中,所述方法还包括以下步骤:
[0325] (a)提取所述细胞、植物或其部分或种子的至少一些非极性脂质内含物为非极性脂质,以及
[0326] (b)回收提取的非极性脂质,
[0327] 其中在将所述细胞、植物或其部分或种子中的至少一些脂质转化为工业产品的步骤之前进行步骤(a)和(b)。
[0328] 所述提取的非极性脂质包含三酰甘油,其中所述三酰甘油占提取的脂质的至少90%,优选至少95%。
[0329] 在另一方面,本发明提供一种生产提取的脂质的方法,所述方法包括以下步骤:
[0330] i)获得本发明的细胞,优选高粱属或玉米细胞,本发明的植物或其部分、优选高粱属或玉米植物或其部分,或本发明的种子,
[0331] ii)从所述细胞、植物或其部分或种子提取脂质,以及
[0332] iii)回收提取的脂质,
[0333] 从而生产提取的脂质。
[0334] 在一个实施方案中,所述提取步骤包括干燥、辗压(rolling)、压榨、破碎或研磨所述细胞、植物或其部分或种子中的一种或多种,和/或纯化所述提取的脂质或种子油。在一实施方案中,所述方法在提取方法中使用有机溶剂以提取油。
[0335] 在一个实施方案中,所述方法包括通过在容器中收集来回收提取的脂质和/或脱胶、除臭、脱色、干燥、分级分离提取的脂质中的一种或多种,从提取的脂质去除至少一些蜡和/或蜡酯,或者分析提取的脂质的脂肪酸组成。
[0336] 在一个实施方案中,提取的脂质或油的体积为至少1升。
[0337] 在另一实施方案中,应用以下特性中的一种或多种或全部:
[0338] (i)提取的脂质或油包含三酰甘油,其中所述三酰甘油占提取的脂质或油的至少90%,优选至少95%或至少96%,
[0339] (ii)提取的脂质或油包含游离的固醇、硬脂酰酯、硬脂酰糖苷、蜡或蜡酯,或者它们的任何组合,以及
[0340] (iii)提取的脂质或油的总固醇含量和/或组成显著不同于产生自相应的植物或其部分或者种子的提取的脂质或油的固醇含量和/或组成。
[0341] 在另一实施方案中,所述方法进一步包括将提取的脂质转化为工业产品。
[0342] 在另一实施方案中,所述工业产品是类产品如脂肪酸酯,优选脂肪酸甲基酯和/或脂肪酸乙基酯,烷如甲烷、乙烷或较长链烷,较长链烷的混合物,烯,生物燃料一氧化碳和/或氢气,生物醇如乙醇、丙醇或丁醇,生物炭,或者一氧化碳、氢和生物炭的组合。
[0343] 在另一实施方案中,所述植物部分是地表植物部分或绿色植物部分,优选营养性植物部分如植物叶或茎。
[0344] 在另一实施方案中,所述收获所述植物或其部分的步骤包括用机械收割机收获所述植物或其部分的步骤。
[0345] 在另一实施方案中,所述植物或其部分或者种子和/或提取的脂质或油中的脂质水平可通过利用制备自提取的脂质或油的脂肪酸甲基酯的气相色谱分析确定。
[0346] 在另一实施方案中,所述植物部分是营养性植物部分,其包含至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约
45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、8%-75%、10%-
75%、11%-75%、约15%-75%、约20%-75%、约30%-75%、约40%-75%、约50%-75%、约
60%-75%或约25%-50%(w/w干重)的总TAG含量。
[0347] 在上述方面的实施方案中,所使用的细胞、植物或其部分或者种子的特征还在于在本发明的植物部分或细胞,优选高粱属或玉米植物部分或细胞的上下文中定义的一个或多个特征。
[0348] 另一方面,本发明提供了一种产生种子的方法,该方法包括:
[0349] i)生长根据本发明植物,以及
[0350] ii)从所述植物收获种子。
[0351] 在一个实施方案中,所述方法包括生长至少约1,500株、至少约3,000株或至少约5,000株植物的群体,每株都是本发明的植物,并且从所述植物的群体中收获种子。
[0352] 在另一方面,本发明提供可从本发明的细胞(优选为本发明的高粱属或玉米细胞)、植物或其部分(优选为本发明的高粱属或玉米植物或其部分)、种子获得的或可通过本发明的方法获得回收的或提取的脂质或可溶性蛋白质。
[0353] 另一方面,本发明提供了由本发明方法生产的工业产品,其烃类产品如脂肪酸酯,优选脂肪酸甲基酯和/或脂肪酸乙基酯,烷如甲烷、乙烷或较长链烷,较长链烷的混合物,烯,生物燃料,一氧化碳和/或氢气,生物醇如乙醇、丙醇或丁醇,生物炭,或者一氧化碳、氢和生物炭的组合。
[0354] 在另一方面,本发明提供了根据本发明的细胞(优选为本发明的高粱属或玉米细胞)、植物或其部分(优选为本发明的高粱属或玉米植物或其部分)、种子或回收的或提取的本发明的脂质用于制造工业产品的用途。本发明的工业产品的实例包括在前一方面中描述的那些。
[0355] 在另一方面,本发明提供一种生产燃料的方法,所述方法包括:
[0356] i)使本发明的脂质任选地在催化剂的存在下与醇反应,以便产生烷基酯,以及[0357] ii)任选地,混合所述烷基酯与基于石油的燃料。
[0358] 在上述方法的一实施方案中,所述烷基酯是甲基酯。
[0359] 在另一方面,本发明提供一种生产合成柴油燃料的方法,所述方法包括:
[0360] i)通过包括热解或水热处理的方法将本发明的细胞(优选为本发明的高粱属或玉米细胞)、植物或其部分(优选为本发明的高粱属或玉米植物或其部分)、种子中的脂质转化为生物油,或者通过气化将其转化为合成气,以及
[0361] ii)通过包括分级分离的方法将所述生物油转化为合成柴油燃料,优选选择在约150℃-约200℃或约200℃-约300℃下凝聚(condense)的碳氢化合物,或者利用金属催化剂或微生物催化剂将合成气转化为生物燃料。
[0362] 在另一方面,本发明提供一种生产生物燃料的方法,所述方法包括通过热解将本发明的细胞(优选为本发明的高粱属或玉米细胞)、植物或其部分(优选为本发明的高粱属或玉米植物或其部分)、种子中的脂质转化为生物油,通过发酵将其转化为生物醇,或者通过气化或厌氧消化将其转化为沼气。
[0363] 在上述方法的一实施方案中,所述部分是营养性植物部分。
[0364] 本发明人还证实通过操纵脂质途径,转基因植物或其部分(例如营养性部分)中性状的显著修饰。
[0365] 因此,在另一方面,本发明提供转基因植物或其一部分,优选高粱属或玉米植物或其部分,包括
[0366] a)第一外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽(优选WRI1多肽),以及
[0367] b)第二外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽(优选DGAT多肽和/或PDAT多肽)
[0368] c)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的三酰甘油(TAG)含量,
[0369] 以及一种或多种以下表型:
[0370] d)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的可溶性蛋白质含量,
[0371] e)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的氮含量,
[0372] f)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中减少的碳:氮的比例,
[0373] g)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加光合基因表达,
[0374] h)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的光合能力,
[0375] i)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中减少的总膳食纤维(TDF)含量,
[0376] j)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的碳含量,
[0377] k)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的能量含量,以及
[0378] l)相对于相应的野生型植物或其部分增加的TTQ,
[0379] 其中,每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物或其部分中的表达的启动子。
[0380] 在一个实施方案中,所述植物或其部分来源于包括所述第一和第二外源多核苷酸的祖先转基因植物,其中所述祖先转基因植物选自多个候选转基因植物,在所述祖先转基因植物包括一种或多种以下表型的基础上,所述候选转基因植物每一个包含所述第一外源性多核苷酸和第二外源多核苷酸;
[0381] a)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的可溶性蛋白质含量,
[0382] b)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的氮含量,
[0383] c)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中减少的碳:氮的比例,
[0384] d)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加光合基因表达,
[0385] e)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的光合能力,
[0386] f)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中减少的总膳食纤维(TDF)含量,
[0387] g)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的碳含量,以及
[0388] h)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的能量含量。
[0389] 在另一方面,本发明提供转基因植物或其部分,优选高粱属或玉米植物或其部分,其包括:
[0390] a)第一外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽(优选WRI1多肽),以及
[0391] b)第二外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽(优选DGAT多肽和/或PDAT多肽),
[0392] c)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的三酰甘油(TAG)含量,
[0393] 其中,每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物或其部分中的表达的启动子,其中所述植物或其部分来源于包括所述第一和第二外源多核苷酸的祖先转基因植物,其中所述祖先转基因植物选自多个候选转基因植物,在所述祖先转基因植物包括一种或多种以下表型的基础上,所述候选转基因植物每一个包含所述第一外源性多核苷酸和第二外源多核苷酸
[0394] i)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的可溶性蛋白质含量,
[0395] ii)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的氮含量,
[0396] iii)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中减少的碳:氮的比例,
[0397] iv)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加光合基因表达,
[0398] v)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的光合能力,
[0399] vi)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中减少的总膳食纤维(TDF)含量,
[0400] vii)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的碳含量,
[0401] viii)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的能量含量,以及
[0402] ix)相对于相应的野生型植物或其部分增加的TTQ和/或增加的TAG含量,
[0403] 在上述两个方面的实施方案中,所述植物或其部分具有以下一种或多种或全部;
[0404] i)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的可溶性蛋白质含量,
[0405] ii)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的氮含量,
[0406] iii)相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中减少的碳:氮的比例,
[0407] 在一个实施方案中,所述植物或其部分具有以下一种或多种或全部;
[0408] i)所述植物或其部分相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的可溶性蛋白质含量为至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约100%、在约10%至约200%之间、在约50%至约150%之间、或约在50%至约125%之间,
[0409] ii)所述植物或其部分相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的氮含量为至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约100%、在约10%至约200%之间、在约50%至约150%之间、或约在50%至约
125%之间,
[0410] iii)所述部分为叶,其相对于相应的野生型叶具有增加的可溶性蛋白质含量为至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约100%、在约10%至约200%之间、在约50%至约150%之间、或在约50%至约125%之间,
[0411] iv)所述部分为叶,其相对于相应的野生型叶具有增加的氮含量为至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约100%、在约10%至约200%之间、在约50%至约150%之间、或在约50%至约125%之间,
[0412] v)所述植物或其部分相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中减少的碳:氮含量为至少约10%、至少约25%、至少约40%、在约10%至约50%之间、或约在25%至约50%之间,
[0413] vi)相对于相应的野生型植物或其部分,在植物或其部分中增加与光合作用有关的一个或多个基因的表达,
[0414] vii)所述植物或其部分相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的碳含量为至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约100%、至少约125%、至少约150%、在约10%至约300%之间、在约50%至约
250%之间、或在约100%至约200%之间,
[0415] viii)所述植物或其部分相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中增加的能量含量为至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少约100%、至少约125%、至少约150%、至少约200%、至少约250%、在约10%至约
400%之间、在约50%至约300%之间、或在约200%至约300%之间,
[0416] ix)所述植物或其部分相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中具有降低至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、在约5倍和约35倍之间、在约10倍和约30倍之间、或在约20倍至约30倍之间的淀粉含量,
[0417] x)所述植物或其部分相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中降低的TDF含量为至少约10%、至少约30%、至少约50%、在约10%至约70%之间、或在约30%至约65%之间,以及
[0418] xi)所述植物或其部分相对于相应的野生型植物或其部分在所述转基因植物的所述部分或至少一部分中具有约0.5倍至2倍的可溶性糖含量。
[0419] 在另一个实施方案中,所述植物或其部分还包括以下一种或多种或全部;
[0420] a)第一遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分相比时,其下调参与所述植物或其部分中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽(优选SDP1 TAG脂肪酶)的内源生成和/或活性,
[0421] b)第三外源多核苷酸,其编码这样的多肽,当与缺少第三外源多核苷酸的相应植物相比时,所述多肽(优选酰基-ACP硫酯酶多肽)增加脂肪酸输出所述植物的质体,[0422] c)第四外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的第二转录因子多肽(优选LEC2多肽),以及
[0423] d)第五外源多核苷酸,其编码油体包衣(OBC)多肽,
[0424] e)第二遗传修饰,当与缺少所述第二遗传修饰的相应植物相比时,其下调参与将脂肪酸输入所述植物的质体的多肽的内源生成和/或活性,
[0425] f)第三遗传修饰,当与缺少所述第三遗传修饰的相应植物相比时,其下调参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性,其中每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物或其部分中的表达的启动子。
[0426] 在一优选实施方案中,相对于包含第一和第二外源多核苷酸但缺少每个所述第一遗传修饰、所述第三外源多核苷酸或所述第四外源多核苷酸的相应植物或其部分,所述第一遗传修饰、所述第三外源多核苷酸或所述第四外源多核苷酸的存在,连同第一和第二外源多核苷酸增加所述植物或其部分的总非极性脂质含量,优选营养性植物部分如叶或茎。更优选地,所述增加是协同性的。最优选地,至少指导第一外源多核苷酸表达的启动子是除组成型启动子以外的启动子。可选地,对于高粱属或玉米,所述启动子优选是组成型启动子如,例如泛素基因启动子。
[0427] 在一实施方案中,添加一种或多种外源多核苷酸或遗传修饰,优选编码OBC或脂肪酰基硫酯酶的外源多核苷酸或者下调参与植物或其部分中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽的内源生成和/或活性的遗传修饰,更优选编码FATA硫酯酶或LDAP或者减少内源TAG脂肪酶如SDP1 TAG脂肪酶在植物或其部分中的表达的外源多核苷酸,当添加至转基因WRI1和DGAT对时导致植物或其部分的总非极性脂质含量的协同增加,特别是在植物开花之前,甚至更特别是在植物的茎和/或根中。例如,参见实施例8、11和15。在一优选实施方案中,相对于用编码WRI1和DGAT1的基因转化但缺少FATA硫酯酶、LDAP和下调参与植物或其部分中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽的内源生成和/或活性的遗传修饰的相应植物或其部分,植物的茎或根中的TAG含量增加至少2倍,更优选至少3倍。最优选地,至少指导第一外源多核苷酸表达的启动子是除组成型启动子以外的启动子。可选地,对于高粱属或玉米,所述启动子优选是组成型启动子如,例如泛素基因启动子。
[0428] 在一实施方案中,所述每个遗传修饰是独立地部分或完全失活基因的内源基因突变,如点突变、插入或缺失,或编码RNA分子的外源多核苷酸,所述RNA分子抑制外源基因的表达,其中所述外源多核苷酸与能够指导所述多核苷酸在植物或其部分中的表达的启动子可操作地连接。点突变可以是减少基因或所编码的多肽的活性的提前终止密码子、剪接位点突变、移码突变或氨基酸取代。缺失可以是基因的转录外显子或启动子内的一个或多个核苷酸的缺失,或者延伸跨过或进入一个以上外显子,或者延伸至整个基因的缺失。优选地,通过使用ZF、TALEN或CRISPR技术引入缺失。在一可选实施方案中,一个或多个或全部遗传修饰是编码抑制内源基因表达的RNA分子的外源多核苷酸,其中将所述外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物或其部分中的表达的启动子。减少内源基因表达的外源多核苷酸的实例选自反义多核苷酸、有义多核苷酸、microRNA、编码结合内源酶的多肽的多核苷酸、双链RNA分子和由其衍生的加工的RNA分子。在一实施方案中,所述植物或其部分包含是内源基因中的引入突变的遗传修饰以及编码减少另一内源基因表达的RNA分子的外源多核苷酸。可选地,全部所述提供增加的TTQ和或TAG水平的遗传修饰都是外源基因的突变。
[0429] 在一个实施方案中,所述植物或其部分具有以下一种或多种或全部;
[0430] i)所述转录因子多肽选自由Wrinkled 1(WRI1)、Leafy Cotyledon 1(LEC1)、LEC1样、Leafy Cotyledon 2(LEC2)、BABY BOOM(BBM)、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4、Dof11组成的组,或者由MYB73、bZIP53、AGL15、MYB115、MYB118、TANMEI、WUS、GFR2a1、GFR2a2和PHR1组成的组,
[0431] ii)参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽是参与植物或其部分中的TAG、DAG或单酰甘油(MAG)生物合成的脂肪酰基酰基转移酶,例如DGAT、PDAT、LPAAT、GPAT或MGAT,优选DGAT或PDAT,或为PDCT或CPT多肽,或PLC或PLD多肽,
[0432] iii)参与植物或其部分中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽是SDP1脂肪酶、Cgi58多肽、酰基-CoA氧化酶如ACX1或ACX2、或者参与细胞中脂肪酸的β-氧化的多肽如PXA1过氧化物酶体ATP-结合盒转运蛋白,优选SDP1脂肪酶,
[0433] iv)所述油体包衣(OBC)多肽是油质蛋白,如聚油质蛋白(polyoleosin)或油体钙蛋白(caleosin),或者脂滴相关蛋白(LDAP),优选非过敏性OBC,
[0434] v)增加脂肪酸输出所述植物或其部分的质体的多肽是C16或C18脂肪酸硫酯酶如FATA多肽或FATB多肽、脂肪酸转运蛋白如ABCA9多肽或长链酰基-CoA合成酶(LACS),[0435] vi)参与将脂肪酸输入所述植物或其部分的质体的多肽是脂肪酸转运蛋白或其亚基或其调节多肽,优选TGD多肽,更优选TGD5多肽,以及
[0436] vii)参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽是质体GPAT、质体LPAAT或质体PAP。
[0437] 在一个实施方案中,相对于野生型细胞或营养性植物部分在细胞或营养性植物部分中PDCT或CPT的活性增加。可选地,PDCT或CPT的活性减少,例如通过在编码所述酶的内源基因中的突变或通过减少其表达的RNA分子下调所述基因。
[0438] 在一个实施方案中,涉及一种或多种非极性脂质的生物合成中的多肽是DGAT或PDAT以及在植物或其部分中TAG的代谢中涉及的多肽为SDP1脂肪酶。
[0439] 在一个实施方案中,在植物或其部分中增加了一个或多个糖分解和/或脂肪酸生物合成基因的表达的转录因子多肽是WRI1多肽,以及在一种或多种非极性脂质的生物合成中涉及的多肽是DGAT或PDAT。
[0440] 在一实施方案中,增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽是WRI1多肽、LEC2多肽、LEC1多肽或LEC1样多肽,并且参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽是DGAT。
[0441] 在一实施方案中,增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽是WRI1多肽、LEC2多肽、LEC1多肽或LEC1样多肽,并且参与所述植物或其部分中三酰甘油(TAG)的分解代谢的多肽是SDP1脂肪酶。
[0442] 在一实施方案中,增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽是WRI1多肽、LEC2多肽、LEC1多肽或LEC1样多肽,参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽是DGAT或PDAT,并且参与所述植物或其部分中三酰甘油(TAG)的分解代谢的多肽是SDP1脂肪酶。
[0443] 在一实施方案中,增加所述植物中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽是WRI1多肽、LEC2多肽、LEC1多肽或LEC1样多肽,并且参与将脂肪酸输入所述植物或其部分的质体的多肽是TGD多肽。
[0444] 在一实施方案中,增加所述植物中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽是WRI1多肽、LEC2多肽、LEC1多肽或LEC1样多肽,并且参与二酰甘油(DAG)生成的多肽是质体GPAT。
[0445] 在一实施方案中,增加所述植物中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽是WRI1多肽、LEC2多肽、LEC1多肽或LEC1样多肽,增加脂肪酸输出所述植物质体的多肽是脂肪酸硫酯酶,优选FATA或FATB多肽,并且参与将脂肪酸输入所述植物质体的多肽是TGD多肽。
[0446] 在一实施方案中,增加所述植物中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽是WRI1多肽、LEC2多肽、LEC1多肽或LEC1样多肽,增加脂肪酸输出所述植物质体的多肽是脂肪酸硫酯酶,优选FATA或FATB多肽,并且参与二酰甘油(DAG)生成的多肽是质体GPAT。
[0447] 在一实施方案中,增加所述植物中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽是WRI1多肽、LEC2多肽、LEC1多肽或LEC1样多肽,参与将脂肪酸输入所述植物质体的多肽是TGD多肽,并且参与二酰甘油(DAG)生成的多肽是质体GPAT。
[0448] 在一实施方案中,当存在时,两个转录因子为WRI1和LEC2,或者WRI1和LEC1。
[0449] 在上述实施方案中,所述植物或其部分优选包含编码DGAT的外源多核苷酸和下调外源SDP1脂肪酶生成的遗传修饰。更优选地,所述植物或其部分不含编码PDAT的外源多核苷酸,和/或是除本氏烟草(N.benthamiana)或其部分以外的植物或其部分,和/或所述WRI1是除拟南芥WRI1(SEQ ID NO:21或22)外的WRI1,和/或除油菜籽或其部分之外的植物或其部分。在一个实施方案中,所述植物或其部分中的至少一种外源多核苷酸表达自不是组成型启动子的启动子,例如优先在所述植物的绿色组织或茎中表达或者在开花起始后或衰老期间上调的启动子。
[0450] 在一实施方案中,编码WRI1的外源多核苷酸包含以下一个或多个:
[0451] i)核苷酸,其编码包含序列如SEQ ID NO:21-75或205-210中任一个所示的氨基酸的多肽或其生物活性片段,或者氨基酸序列与SEQ ID NO:21-75或205-210中的任何一个或多个至少30%相同性的多肽,
[0452] ii)序列与i)至少30%相同的核苷酸,以及
[0453] iii)在严格条件下杂交至i)和/或ii)的核苷酸。优选地,所述WRI1多肽是除拟南芥WRI1(SEQ ID NO:21或22)以外的WRI1多肽。更优选地,所述WRI1多肽包含序列如SEQ ID NO:199所示的氨基酸或其生物活性片段,或者氨基酸序列与其至少30%相同性的多肽。
[0454] 在一个实施方案中,所述部分是营养性部分以及一个或多个或全部启动子相对于植物的种子在营养性部分中以较高水平表达。
[0455] 在另一个实施方案中,所述植物或其部分具有以下的一个或多个或全部;
[0456] i)所述植物或其部分,优选在开花前,包含至少约8%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、8%-75%、10%-75%、11%-75%、约15%-75%、约20%-75%、约30%-75%、约40%-75%、约50%-
75%、约60%-75%或约25%-50%(w/w干重)的总非极性脂质含量,
[0457] vi)植物的营养性部分,优选在开花前,包含至少约8%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、8%-75%、10%-75%、11%-75%、约15%-75%、约20%-75%、约30%-75%、约40%-75%、约50%-
75%、约60%-75%或约25%-50%(w/w干重)的TAG含量,
[0458] iii)一种或多种或全部启动子选自组织特异性启动子如叶和/或茎特异性启动子,发育调节启动子如衰老特异性启动子如SAG12启动子,诱导型启动子,或者昼夜节律调节启动子,
[0459] iv)所述植物或其部分是至少约1,500、至少约3,000或至少约5,000株这样的植物或其部分(优选营养性植物部分)的群体或集合的一个成员,其中所述第一外源性多核苷酸和所述第二外源多核苷酸插入所述植物的每一个的基因组中的同一染色位置
[0460] v)所述植物是豆科(或Leguminosae)的成员,如苜蓿、三叶草、豌豆、紫花苜蓿、菜豆、小扁豆、羽扇豆、牧豆树、豆树、大豆和花生,或禾木科的成员如玉米或高粱,以及[0461] vi)所述部分是成熟的叶或多个叶。
[0462] 在一实施方案中,在所述植物开花之前,所述植物的营养性部分包含至少约8%、至少约10%、约11%、8%-15%或9%-12%(w/w干重)的总非极性脂质含量。
[0463] 在另一个实施方案中,所述植物或其部分为;
[0464] i)16:3植物或者在其营养性部分或种子,并且包含以下一个或多个或全部;
[0465] a)外源多核苷酸,其编码这样的多肽,当与缺少所述外源多核苷酸的相应植物相比时,所述多肽增加脂肪酸输出所述植物的质体,
[0466] b)第一遗传修饰,当与缺少所述第一遗传修饰的相应植物相比时,其下调参与将脂肪酸输入所述植物的质体的多肽的内源生成和/或活性,
[0467] c)第二遗传修饰,当与缺少所述第二遗传修饰的相应植物相比时,其下调参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性,
[0468] 其中所述外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物或其部分中的表达的启动子,或
[0469] ii)18:3植物或者其营养性部分或种子。
[0470] 在一实施方案中,所述植物或其部分具有以下的一种或多种或全部;
[0471] i)所述植物包含部分(优选营养性植物部分),相对于缺少所述第一外源多核苷酸的相应部分,所述部分具有增加的总脂肪酸合成,或者相对于缺少所述第一外源多核苷酸的相应部分,所述部分具有减少的总脂肪酸代谢,或者两者,从而相对于缺少第一外源多核苷酸的相应部分其具有升高水平的总脂肪酸,
[0472] ii)所述植物包含部分(优选营养性植物部分),相对于具有所述第一外源多核苷酸且缺少编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽的外源多核苷酸的相应部分,所述部分具有增加的脂肪酰基酰基转移酶表达和/或活性,所述脂肪酰基酰基转移酶催化TAG、DAG或MAG的合成,优选TAG,
[0473] iii)所述植物包含部分(优选营养性植物部分),相对于具有所述第一外源多核苷酸且缺少下调参与所述植物部分的质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性的遗传修饰的相应部分,所述部分在其质体中具有减少的从酰基-ACP和G3P生成溶血磷脂酸(LPA),
[0474] iv)所述植物包含部分(优选营养性植物部分),相对于缺少所述外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应部分,所述部分在其总脂肪酸含量和/或其半乳糖脂含量中具有改变的C16:3-C18:3脂肪酸比例,优选减少的比例,
[0475] v)油酸占所述植物或其部分中的总脂肪酸含量的至少20%(mol%)、至少22%(mol%)、至少30%(mol%)、至少40%(mol%)、至少50%(mol%)或至少60%(mol%),优选约65%(mol%)或20%-约65%,
[0476] vi)所述植物或其部分(优选营养性部分)中的非极性脂质包含水平增加的一种或多种脂肪酸,所述脂肪酸包含羟基、环氧基、环丙烷基、双碳-碳键、三碳-碳键、缀合的双键、支链如甲基化或羟基化的支链,或者它们中两种或更多种的组合,或者上述基团、键或支链中的任何两种、三种、四种、五种或六种,
[0477] vii)所述植物或其部分(优选营养性部分)中的非极性脂质包含一种或多种多不饱和脂肪酸,其选自二十碳二烯酸(EDA)、花生四烯酸(ARA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、或者它们中两种或更多种的组合,
[0478] viii)所述部分是营养性植物部分,例如叶或茎或其部分,
[0479] ix)一种或多种或全部启动子选自除组成型启动子以外的启动子,优选组织特异性启动子如叶和/或茎特异性启动子,发育调节启动子如衰老特异性启动子如SAG12启动子,诱导型启动子,或者昼夜节律调节启动子,优选其中至少一个可操作地连接至编码转录因子多肽的外源多核苷酸的启动子是除组成型启动子以外的启动子,
[0480] x)所述植物或其部分(优选营养性部分)包含这样的总脂肪酸含量,相对于缺少所述外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应植物或其部分,其油酸水平升高至少2%,和/或相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应植物或其部分,其α-亚麻酸(ALA)水平降低至少2%,
[0481] xi)相对于缺少所述外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应植物或其部分中的非极性脂质,所述植物或其部分(优选营养性部分)中的非极性脂质包含修饰水平的总固醇,优选游离(非酯化的)固醇、硬脂酰酯、硬脂酰糖苷,
[0482] xii)所述植物或其部分中的非极性脂质包含蜡和/或蜡酯,
[0483] xiii)所述植物包含编码沉默抑制子的外源多核苷酸,其中所述外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物中的表达的启动子,
[0484] xiv)在重量基础上,所述植物或其部分(优选营养性部分)的一种或多种非极性脂质和/或总非极性脂质含量的水平分别比包含编码拟南芥WRI1(SEQ ID NO:21)和拟南芥DGAT1(SEQ ID NO:1)的外源多核苷酸的相应植物或其部分高至少2%,
[0485] xv)相对于缺少所述外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应植物的总PUFA含量减少的总多不饱和脂肪酸(PUFA)含量,
[0486] xvi)所述植物部分是铃薯(Solanum tuberosum)茎、甜菜(Beta vulgaris)根或叶、甘蔗(Saccharum sp.)或两色高粱(Sorghum bicolor)茎、单子叶植物种子,其中相对于相应的野生型胚乳细胞,所述种子在其胚乳中具有增加的总脂肪酸含量,例如小麦(Triticum aestivum)谷粒或玉米(Zea mays)粒、烟草属(Nicotiana spp.)叶片、或具有增加的总脂肪酸含量的豆类种子,例如芸苔属(Brassica sp.)种子或大豆(Glycine max)种子,
[0487] xvii)如果所述植物部分是种子,所述种子以基本与相应野生型种子相同的速率萌发或当播种在土壤中产生植物,所述植物的种子以基本与相应野生型种子相同的速率萌发,以及
[0488] xviii)所述植物是藻类植物如藻(硅藻类(bacillariophyte))、绿藻(绿藻类(chlorophyte))、蓝绿藻(蓝藻类(cyanophyte))、金褐藻(金藻类(chrysophyte))、定鞭藻类(haptophyte)、褐藻类和异鞭毛藻类。
[0489] 在一个实施方案中,所述植物或其部分包括编码WRI1的第一外源多核苷酸、编码DGAT或PDAT(优选为DGATl)的第二外源多核苷酸、编码减少编码SDP1多肽的表达的RNA的第三外源多核苷酸,以及编码油质蛋白的第四外源多核苷酸。在优选的实施方案中,所述植物或其部分具有以下特征中的一种或多种或全部:
[0490] i)至少8%、至少10%、至少12%、至少14%或至少15.5%(%干重)的总脂质含量,[0491] ii)相对于缺少所述外源多核苷酸的相应植物或其部分,在所述植物或其部分中高至少3倍、至少5倍、至少7倍、至少8倍或至少10倍的总脂质含量,
[0492] iii)至少5%。、至少6%、至少6.5%或至少7%(干重或种子重量的重量%)的总TAG含量,
[0493] iv)相对于缺少所述外源多核苷酸的相应植物或其部分高至少40、至少50倍、至少60倍、或至少70倍、至少100倍、或至少120-倍的总TAG含量,
[0494] v)油酸占TAG中的至少15%、至少19%或至少22%(干重或种子重量的重量%)的脂肪酸,
[0495] vi)相对于缺少所述外源多核苷酸的相应植物或其部分,TAG中高至少10倍、至少15倍或至少17倍水平的油酸,
[0496] vii)棕榈酸占TAG中的至少20%、至少25%、至少30%或至少33%(%重量)的脂肪酸,
[0497] viii)相对于缺少所述外源多核苷酸的相应植物或其部分,TAG中高至少1.5倍水平的棕榈酸,
[0498] ix)亚油酸占TAG中的至少22%、至少25%、至少30%或至少34%(%重量)的脂肪酸,
[0499] x)α-亚麻酸占TAG中的少于20%、少于15%、少于11%或少于8%(%重量)的脂肪酸,
[0500] xi)相对于缺少所述外源多核苷酸的相应植物或其部分,TAG中低至少5倍或至少8倍水平的α-亚麻酸,以及
[0501] xii)当所述部分为马铃薯块茎,在干重基础上至少0.5%的TAG含量和/或在干重基础上至少1%,优选至少1.5%或至少2.0%的总脂肪酸含量。
[0502] 在上述实施方案中,优选的植物部分是具有至少1cm2的表面积的叶片或具有至少1cm的长度的茎段。
[0503] 在上述方面的一实施方案中,已处理所述植物或植物部分,所以其不再能够繁殖或产生活的植物,即其是死的。例如,已将所述植物或植物部分干燥和/或研磨。在另一个实施方案中,所述植物部分是活的,例如绿叶或茎。
[0504] 在一个实施例中,所述部分是种子、果实、或营养性部分(例如气生植物部分)或绿色部分(例如叶或茎)。
[0505] 在上述实施方案中,优选该部分是来自植物的营养性部分,所述植物在土壤中生长或在土壤中生长并且随后收获所述植物部分,并且其中所述营养性部分在重量基础(%干重)上包含至少8%的TAG,例如8%-75%或8%-30%。更优选地,所述TAG含量为至少10%,例如10%-75%或10%-30%。优选地,这些TAG水平存在于植物开花前或开花期或植物发育的结种期之前的营养性部分中。在这些实施方案中,优选叶子中TAG含量与植物茎中TAG含量的比例在1:1和10:1之间,和/或相对于包含第一和第二外源多核苷酸并且缺少第一遗传修饰的相应营养性部分比例增加。优选地,所述营养性植物部分相对于相应野生型营养部分具有增加的可溶性蛋白质含量为至少约100%、或约50%-约125%。优选地,所述营养性植物部分相对于相应野生型营养性部分具有增加的氮含量为至少约100%、或约
50%-约125%。优选地,所述营养性植物部分相对于相应野生型营养性植物部分具有降低的碳:氮含量为至少约40%、或约25%-约50%。优选地,所述营养性植物部分相对于相应野生型营养性植物部分具有降低的TDF含量为至少约30%、或约30%-约65%。
[0506] 在一个实施方案中,本发明的植物是单子叶植物或其部分(优选叶、谷粒、茎、根或胚乳),当与相应的野生型单子叶植物或其部分相比时,其总脂肪酸含量或TAG含量在重量基础上增加至少5倍。可选地,所述单子叶植物具有胚乳,所述胚乳在重量基础上包含至少2.0%、优选至少3%、更优选至少4%或至少5%的TAG含量,或其部分(优选叶、谷粒、茎、根或胚乳)。在一个实施方案中,所述胚乳具有至少2%的TAG含量,其相对于相应的野生型胚乳增加至少5倍。优选地,所述植物是完全雄性和雌性可育的,其花粉基本上是100%存活的,并且其谷粒相对于相应的野生型谷粒具有70%-100%的萌发率。在一个实施方案中,本发明的转基因植物是源自初始转基因植物至少两代的子代植物,并且对于所述转基因优选是纯合的。在实施方案中,所述单子叶植物或其部分(优选叶、谷粒、茎、根或胚乳)进一步的特征在于在描述于上下文中的本发明的植物或其部分的一种或多种特征。在实施方案中,当与缺少所述遗传修饰和/或外源多核苷酸的相应植物或其部分相比时,本发明的单子叶植物或其部分,优选叶、谷粒、茎或胚乳,优选在总脂肪酸含量和总脂肪酸含量的TAG部分中具有升高水平的单不饱和脂肪酸(MUFA)和/或较低水平的多不饱和脂肪酸(PUFA),例如升高水平的油酸和降低水平的LA(18:2)。优选地,当与缺少所述遗传修饰和/或外源多核苷酸的相应植物或其部分相比时,相对于相应的野生型植物或其部分,所述谷粒或胚乳的总脂肪酸含量中的亚油酸(LA,18:2)水平降低至少5%和/或总脂肪酸含量中的油酸水平升高至少5%,优选至少10%或更优选至少15%。
[0507] 在一种实施方式中,所述植物或其部分是刺干椰(Acrocomia aculeata(macauba palm))、拟南芥、花生(Aracinis hypogaea,花生(peanut))、木鲁星果棕(Astrocaryum murumuru(murumuru))、Astrocaryum vulgare(tucuma)、Attalea geraensis(Indaiá-rateiro)、Attalea humilis(美洲油棕(American oil palm))、Attalea oleifera(andaia)、Attalea phalerata(uricuri)、Attalea speciosa(babassu)、燕麦(Avena sativa,燕麦(oats))、甜菜(甜菜(sugar beet))、芸苔属如Brassica carinata、Brassica juncea、Brassica napobrassica、欧洲油菜(油菜)、亚麻荠(Camelina sativa,亚麻荠(false flax))、大麻(Cannabis sativa,大麻(hemp))、红花(Carthamus tinctorius,红花(safflower))、Caryocar brasiliense(pequi)、椰子(Cocos nucifera,椰子(Coconut))、海甘蓝(Crambe abyssinica,海甘蓝(Abyssinian kale))、甜瓜(Cucumis melo,甜瓜(melon))、油棕(Elaeis guineensis,非洲棕榈(African palm))、大豆(大豆(soybean))、陆地棉(Gossypium hirsutum,棉花)、向日葵属(Helianthus sp.)如向日葵(Helianthus annuus,向日葵(sunflower))、大麦(Hordeum vulgare,大麦(barley))、麻树(Jatropha curcas,麻风树(physic nut))、Joannesia princeps(arara nut-tree)、浮萍属(Lemna sp.,浮萍(duckweed))如青萍(Lemna aequinoctialis)、Lemna disperma、Lemna ecuadoriensis、膨胀浮萍(Lemna gibba,膨胀浮萍swollen duckweed)、日本浮萍(Lemna japonica)、浮萍(Lemna minor)、单脉萍(Lemna minuta)、Lemna obscura、稀脉萍(Lemna paucicostata)、稀脉浮萍(Lemna perpusilla)、Lemna tenera、吕藻(Lemna trisulca)、鳞根萍(Lemna trisulca)、Lemna valdiviana、Lemna yungensis、奥蒂树(Licania rigida,奥蒂(oiticica))、亚麻(Linum usitatissimum,亚麻(flax))、羽扇豆(Lupinus angustifolius,羽扇豆(lupin))、曲叶矛榈(Mauritia flexuosa,buriti棕榈)、摩帝椰子(Maximiliana maripa,inaja棕榈)、芒属(Miscanthus sp.)如异源三倍体芒草奇岗(Miscanthus x giganteus)和中国芒(Miscanthus sinensis),烟草属(Nicotiana sp.,烟草(tabacco))如红花烟草(Nicotiana tabacum)或本氏烟草、巴卡巴酒实棕(Oenocarpus bacaba,巴卡巴酒实棕(bacaba-do-azeite))、巴套阿酒实棕(Oenocarpus bataua,pataua)、Oenocarpus distichus(bacaba-de-leque),稻属(稻(rice))如水稻(Oryza sativa)和光稃稻(Oryza glaberrima)、柳枝稷(Panicum  virgatum,柳枝稷(switchgrass))、Paraqueiba paraensis(mari)、鳄梨(Persea amencana,鳄梨
(avocado))、水黄皮(Pongamia pinnata,印度山毛榉(Indian beech))、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis,蓖麻(castor)),甘蔗(甘蔗(sugarcane))、芝麻(Sesamumindicum,芝麻(sesame))、马铃薯(马铃薯(potato))、高粱属(Sorghum sp.)如两色高粱(Sorghum bicolor)、高粱(Sorghum vulgare)、大花可可(Theobroma grandiforum,cupuassu)、三叶草属(Trifolium sp.)、巴西针棕(Trithrinax brasiliensis,巴西针棕(Brazilian needle palm))、小麦属(Triticum sp.,小麦(wheat))如小麦(Triticum aestivum)和玉米(玉米(corn))。
[0508] 在一个实施方案中,所述植物或其部分是至少约1,500、至少约3,000或至少约5,000株这样的植物或其部分的群体或集合的一个成员。
[0509] 在一个实施方案中,TFA含量、TAG含量、总非极性脂质含量,或一种或多种非极性脂质,和/或通过使用从植物或其植物部分获得的脂肪酸甲酯的气相色谱分析来确定植物或其部分中的油酸或PUFA的水平。
[0510] 在一实施方案中,所述植物或其部分中的总非极性脂质含量、或者一种或多种非极性脂质、和/或油酸或PUFA的水平可通过利用获得自所述植物或其营养性部分的脂肪酸甲基酯的气相色谱分析确定。
[0511] 在另一实施方案中,其中所述植物部分是叶,并且所述叶的总非极性脂质含量可通过利用核磁共振(NMR)分析确定。
[0512] 在上述每个实施方案中,优选所述植物是源自初始转基因植物至少两代的转基因子代植物,并且对于所述转基因优选是纯合的。
[0513] 在一个实施方案中,本发明的所述植物或其部分是表型正常的,因为当与未修饰的植物或其部分相比时其生长和繁殖的能力未显著降低。在一实施方案中,当在相同条件下生长时,产生的生物质、生长速度、发芽率、贮藏器官大小、种子大小和/或活种子的数量不少于相应野生型植物的70%、不少于相应野生型植物的80%或不少于相应野生型植物的90%。在一实施方案中,所述植物是与相应的野生型植物同样雄性或雌性繁殖的,并且其花粉(如果产生)是如相应的野生型植物花粉可存活的,优选至少约75%或至少约90%或接近
100%可存活的。在一实施方案中,当所述植物物种产生种子时,相对于野生型植物的相应种子的发芽率,所述植物产生具有至少约75%或至少约90%发芽率的种子。在一实施方案中,本发明的植物具有相对于在相同条件下生长的相应野生型植物的高度至少约75%或至少约80%或至少约90%的植物高度。设想这些特性中的每个的组合。在一可选实施方案中,本发明的植物具有相对于在相同条件下生长的相应野生型植物的高度60%-90%的植物高度。在一实施方案中,本发明的植物或其部分,优选植物叶不表现出增加的坏死,即如果存在,坏死的程度与在相同的条件下生长和在相同的植物发育阶段的相应野生型植物或其部分所表现出的相同。这种特性特别应用于包含编码脂肪酸硫酯酶如FATB硫酯酶的外源多核苷酸的植物或其部分。
[0514] 在另一方面,本发明提供至少约1,500、至少约3,000或至少约5,000个营养性植物部分的集合,每个是本发明的营养性植物部分,其中所述营养性植物部分已从生长在田间的植物收获。
[0515] 在一个实施方案中,所述第一和第二外源多核苷酸插入所述营养性植物部分的每个的基因组中的相同染色体位置,优选地,在所述营养性植物部分的每个的核基因组中。
[0516] 还提供了一种存储箱,其包括本发明的营养性植物部分的集合。
[0517] 进一步提供的是从本发明的植物中获得的种子或本发明的植物的种子,优选的是至少约1,500、至少约3,000、至少约5,000个或至少约10,000个本发明的种子的集合,所述种子包括所述外源多核苷酸。
[0518] 在另一方面,本发明提供了植物或其部分的提取物。所述提取物优选相对于相应的野生型提取物具有不同的脂肪酸组成。
[0519] 在一个实施方案中,所述提取物包含所述第一和第二外源多核苷酸。
[0520] 在一个实施方案中,所述提取物缺乏至少50%或至少90%的所述植物或其部分的非极性脂质。
[0521] 在一个实施方案中,所述提取物包含所述植物或其部分的可溶性蛋白质含量。
[0522] 在一个实施方案中,所述提取物包含所述植物或其部分的氮含量。
[0523] 在一个实施方案中,所述提取物缺乏至少50%或至少90%的所述植物或其部分的叶绿素和/或可溶性糖。
[0524] 在一个实施方案中,所述提取物包含所述植物或其部分的碳含量。
[0525] 在一个实施方案中,所述提取物包含在所述提取物中结合蛋白质的染料。
[0526] 本发明的提取物可容易地使用本领域的标准技术产生。
[0527] 上述方面的特征的组合对于植物、植物部分和细胞,以及在产生和使用它们的过程中是显而易见的。
[0528] 在另一方面,本发明提供了一种产生植物提取物的方法,所述方法包括:
[0529] i)获得本发明的植物或其部分,或本发明的种子;
[0530] ii)处理所述植物或其部分或种子,以产生所述提取物。
[0531] 在一个实施方案中,本发明的植物或其部分或本发明的种子是转基因的。
[0532] 在一个实施方案中,步骤ii)包括从植物或其部分或种子产生两种或多种级分,并且选择至少一个而不是全部的级分。
[0533] 在一个实施方案中,所述选择的级分具有以下特征中的一个或多个;
[0534] i)包括所述第一和第二外源性多核苷酸,
[0535] ii)缺乏至少50%或至少90%的所述植物或其部分的非极性脂质,
[0536] iii)包括所述植物或其部分的可溶性蛋白质含量,
[0537] iv)包括所述植物或其部分的氮含量,
[0538] v)缺乏至少50%或至少90%的所述植物或其部分的叶绿素和/或可溶性糖,以及[0539] vi)包括所述植物或其部分的碳含量。
[0540] 在另一个方面中,本发明提供了一种用于选择具有所需表型的植物或其部分的方法,所述方法包括
[0541] i)获得多个候选植物或其部分,其每一个包括
[0542] a)第一外源多核苷酸,其编码增加所述植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽,以及
[0543] b)第二外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽[0544] 其中将每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述植物或其部分中的表达的启动子。
[0545] ii)分析来自步骤i)的多个部分中或所述多个候选植物中的每个植物的至少一部分中的脂质,
[0546] iii)分析来自步骤i)的多个部分中或所述多个候选植物中的每个植物的至少一部分中的以下一个或多个或全部;
[0547] a)可溶性蛋白含量,
[0548] b)氮含量,
[0549] c)碳:氮比,
[0550] d)光合基因表达,
[0551] e)光合能力,
[0552] f)总膳食纤维(TDF)含量,
[0553] g)碳含量,
[0554] h)能量含量,
[0555] i)TAG含量,以及
[0556] j)TTQ,以及
[0557] iv)选择植物或其部分,所述部分中或所述植物的至少一部分中相对于相应野生型植物或其部分包含增加的TTQ和/或增加的三酰甘油(TAG)含量,以及选自以下的一个或多个或全部的所需表型;
[0558] (i)从植物的第一开花时间和种子的第一成熟期之间的植物中收获所述营养性植物部分,
[0559] (ii)所述高粱属植物是两色高粱植物,
[0560] (iii)所述营养性植物部分包括叶和/或茎或其部分,
[0561] (iv)所述营养性植物部分包含约8%或约10%(w/w干重)的平均总脂肪酸含量,[0562] (v)所述营养性植物部分的总脂肪酸含量包含相对于相应的野生型营养性植物部分的油酸含量增加至少2%或至少3%的油酸含量,
[0563] (vi)所述营养性植物部分的总脂肪酸含量包含相对于相应的野生型营养性植物部分的棕榈酸含量增加至少2%或至少3%的棕榈酸含量,
[0564] (vii)所述营养性植物部分的总脂肪酸含量包含相对于相应的野生型营养性植物部分的ALA含量减少至少2%或至少3%的α-亚油酸(ALA)含量,
[0565] A)所述部分或所述植物的至少一部分包含相对于相应的野生型植物或其部分增加的可溶性蛋白质含量,
[0566] B)所述部分或所述植物的至少一部分包含相对于相应的野生型植物或其部分增加的氮含量,
[0567] C)所述部分或所述植物的至少一部分包含相对于相应的野生型植物或其部分减少的碳:氮比,
[0568] D)所述部分或所述植物的至少一部分包含相对于相应的野生型植物或其部分增加的光合基因表达,
[0569] E)所述部分或所述植物的至少一部分包含相对于相应的野生型植物或其部分增加的光合能力,
[0570] F)所述部分或所述植物的至少一部分包含相对于相应的野生型植物或其部分减少的总膳食纤维(TDF)含量,
[0571] G)所述部分或所述植物的至少一部分包含相对于相应的野生型植物或其部分增加的碳含量,以及
[0572] H)所述部分或所述植物的至少一部分包含相对于相应的野生型植物或其部分增加的能量含量。
[0573] 在一个实施方案中,通过任何可能或可能不涉及首次提取所述脂质的手段,通过分析总脂肪酸含量、TAG含量、脂肪酸组成中的一种或多种来确定增加的三酰基甘油(TAG)含量。
[0574] 在又一个实施方案中,所选择的植物或其部分具有如本文所述的一个或多个特征。
[0575] 在另一方面,本发明提供了一种生产饲料的方法,该方法包括混合具有至少一种其他食物成分的本发明的任何一种植物或其部分、本发明的种子、或本发明的提取物。
[0576] 在另一方面,本发明提供了一种饲料,所述饲料包含本发明的细胞、本发明的植物或其部分、本发明的种子、本发明的提取的油或提取物。
[0577] 在一个实施方案中,所述饲料为青贮饲料、颗粒饲料或干草饲料。
[0578] 在又一个方面中,本发明提供了一种用于饲养动物的方法,该方法包括向所述动物提供本发明的细胞、本发明的植物或一部分、本发明的提取的脂质或其它提取物、或本发明的饲料。在一个实施方案中,提供给所述动物的材料是在已经提取出至少一些油后留下的残余植物材料,如菜粕或叶/茎粉等。
[0579] 在一个实施方案中,相对于所述动物摄入在干重基础上相同量的由相应的野生型植物或其部分产生的相应的野生型细胞、植物或其部分、种子或提取物或饲料,所述动物摄入增加量的氮、蛋白质、碳和/或潜在能量。
[0580] 本发明人已经鉴定了非过敏性的或不被认为是过敏性的(例如对人)OBC的亚类。
[0581] 因此,在另一方面,本发明提供了一种重组真核细胞,优选为高粱属或玉米细胞,其包括至少第一外源多核苷酸,所述第一外源多核苷酸编码非过敏性OBC,其中所述外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述细胞中的表达的启动子。
[0582] 在一个实施方案中,所述第一外源多核苷酸包括以下各项中的一种或多种:
[0583] i)编码OBC多肽的核苷酸,所述多肽含有如SEQ ID NO:306-314任意一个所示的氨基酸的序列,或其生物活性片段,或编码OBC多肽的核苷酸,所述OBC多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:306-314任意一个或多个相同具有至少30%相同性,其中所述OBC多肽是非过敏性的,
[0584] ii)核苷酸,其序列与i)具有至少30%相同性,和
[0585] iii)多核苷酸,其在严格条件下与i)或ii)中的一项或两项杂交。在一个实施方案中,所述油质蛋白L不是芝麻油质蛋白L(SEQ ID NO:305)。
[0586] 在一个实施方案中,所述重组细胞包括下述中的一种或多种:
[0587] a)第二外源多核苷酸,其编码增加所述细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽(优选WRI1多肽),以及
[0588] b)第三外源多核苷酸,其编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽(优选DGAT和/或PDAT),
[0589] c)第一遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应细胞相比时,其下调参与所述细胞中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽(优选SDP1 TAG脂肪酶)的内源生成和/或活性,[0590] d)第四外源多核苷酸,其编码这样的多肽,当与缺少第三外源多核苷酸的相应细胞相比时,所述多肽(优选酰基-ACP硫酯酶多肽)增加脂肪酸输出所述细胞的质体,[0591] e)第五外源多核苷酸,其编码增加所述细胞中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的第二转录因子多肽(优选LEC2多肽),以及
[0592] f)第二遗传修饰,当与缺少所述第二遗传修饰的相应细胞相比时,其下调参与将脂肪酸输入所述细胞的质体的多肽的内源生成和/或活性,
[0593] g)第六多核苷酸,其编码油体包衣(OBC)多肽或脂滴相关蛋白(LDAP),以及[0594] h)第三遗传修饰,当与缺少所述第三遗传修饰的相应细胞相比时,其下调参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性,以及
[0595] i)第四遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应细胞相比时,其下调参与将脂肪酸输入所述细胞的质体的多肽的内源生成和/或活性,
[0596] 其中每个外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述细胞中的表达的启动子。
[0597] 在一个实施方案中,所述细胞是来自植物的营养性部分或在植物的营养部分中的植物细胞以及一个或多个或全部的启动子以相对于植物的种子较高的水平在营养性部分中的表达。
[0598] 在一个实施方案中,所述第一外源多核苷酸为了诸如高粱属或玉米细胞的植物细胞中表达而被密码子优化。
[0599] 在一个实施例中,以下特征中的一个或多个或全部应用于上述方面:
[0600] i)所述细胞相对于缺少第二外源多核苷酸的相应细胞具有增加的总脂肪酸合成,或者相对于缺少第二外源多核苷酸的相应细胞具有减少的总脂肪酸分解代谢,或者两者,从而相对于缺少第二外源多核苷酸的相应细胞其具有升高水平的总脂肪酸,
[0601] ii)相对于具有第二外源多核苷酸且缺少编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽的第三外源多核苷酸的相应细胞,所述细胞具有增加的脂肪酰基酰基转移酶表达和/或活性,所述脂肪酰基酰基转移酶催化TAG、DAG或MAG的合成,优选TAG,
[0602] iii)相对于具有第二外源多核苷酸且缺少下调参与细胞质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性的第三遗传修饰的相应细胞,所述细胞在其质体中具有减少的从酰基-ACP和G3P生成溶血磷脂酸(LPA),
[0603] iv)相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应细胞,所述细胞在其总脂肪酸含量和/或其半乳糖脂含量中具有改变的C16:3-C18:3脂肪酸比例,优选减少的比例,[0604] v)所述细胞在植物的营养性部分中,并且包含至少约8%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约
40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、8%-
75%、10%-75%、11%-75%、约15%-75%、约20%-75%、约30%-75%、约40%-75%、约
50%-75%、约60%-75%或约25%-50%(w/w干重)的总非极性脂质含量,
[0605] vi)所述细胞在植物的营养性部分中,并且包含至少约8%、至少约10%、至少约11%、至少约12%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约
40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、8%-
75%、10%-75%、11%-75%、约15%-75%、约20%-75%、约30%-75%、约40%-75%、约
50%-75%、约60%-75%或约25%-50%(w/w干重)的TAG含量,
[0606] vii)所述转录因子多肽选自由Wrinkled 1(WRI1)、Leafy Cotyledon 1(LEC1)、LEC1样、Leafy Cotyledon 2(LEC2)、BABY BOOM(BBM)、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4和Dof11组成的组,
[0607] viii)油酸包含细胞中的总脂肪酸含量的至少20%(mol%)、至少22%(mol%)、至少30%(mol%)、至少40%(mol%)、至少50%(mol%)或至少60%(mol%),优选约65%(mol%)或20%-约65%,
[0608] ix)所述细胞中的非极性脂质包含脂肪酸,所述脂肪酸包含羟基、环氧基、环丙烷基、双碳-碳键、三碳-碳键、缀合的双键、支链如甲基化或羟基化的支链,或者它们中两种或更多种的组合,或者上述基团、键或支链中的任何两种、三种、四种、五种或六种,[0609] x)所述细胞中的非极性脂质包含一种或多种多不饱和脂肪酸,其选自二十碳二烯酸(EDA)、花生四烯酸(ARA)、十八碳四烯酸(SDA)、二十碳三烯酸(ETE)、二十碳四烯酸(ETA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、或者它们中两种或更多种的组合,
[0610] xi)所述细胞在植物或其部分中,优选营养性植物部分,或者所述细胞是藻细胞如硅藻(硅藻类(bacillariophyte))、绿藻(绿藻类(chlorophyte))、蓝绿藻(蓝藻类(cyanophyte))、金褐藻(金藻类(chrysophyte))、定鞭藻类(haptophyte)、褐藻类和异鞭毛藻类,或者所述细胞来自或是适合发酵的生物体如真菌
[0611] xii)一种或多种或全部启动子选自组织特异性启动子如叶和/或茎特异性启动子,发育调节启动子如衰老特异性启动子如SAG12启动子,诱导型启动子,或者昼夜节律调节启动子,
[0612] xiii)所述细胞包含总脂肪酸含量(其包含中链脂肪酸,优选C12:0、C14:0或两者,水平为总脂肪酸含量的至少5%)以及任选存在的编码LPAAT的外源多核苷酸,所述LPAAT对具有中链长度(C8-C14)的脂肪酸具有偏好活性,优选C12:0或C14:0,
[0613] xiv)所述细胞包含这样的总脂肪酸含量,相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应细胞,其油酸水平和/或棕榈酸水平升高至少2%,和/或相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应细胞,其α-亚麻酸(ALA)水平和/或亚油酸水平降低至少2%,[0614] xv)相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应细胞中的非极性脂质,所述细胞中的非极性脂质包含修改水平的总固醇,优选游离(非酯化的)固醇、硬脂酰酯、硬脂酰糖苷,
[0615] xvi)所述细胞中的非极性脂质包含蜡和/或蜡酯,
[0616] xvii)所述细胞是至少约1000个这类细胞的群体或集合的成员之一,优选在营养性植物部分或种子中,
[0617] xviii)所述细胞包含编码沉默抑制子的外源多核苷酸,其中将所述外源多核苷酸可操作地连接至能够指导所述多核苷酸在所述细胞中的表达的启动子,
[0618] xix)在重量基础上,所述细胞的一种或多种非极性脂质和/或总非极性脂质含量的水平比包含编码拟南芥WRI1(SEQ ID NO:21)和拟南芥DGAT1(SEQ ID NO:1)的外源多核苷酸的相应细胞高至少2%,以及
[0619] xx)相对于缺少外源多核苷酸和/或遗传修饰的相应细胞的总PUFA含量减少的总多不饱和脂肪酸(PUFA)含量。
[0620] 除非另有特别说明,本文的任何实施方案应当准用于任何其他实施方案。
[0621] 上述方面的特征的组合对于本发明的植物、植物部分和细胞,以及在生产和使用它们的过程中是显而易见的。
[0622] 本发明的范围并不限于本文所述的具体实施方案,其仅为了示例的目的。明确地,功能等同的产物、组合物和方法在如本文所述的发明的范围内。
[0623] 在这个说明书中,除非另有特别说明或上下文另有要求,提到单一步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组应当涵盖那些步骤、物质的组合物、步骤的组或物质的组合物的组中的一个或许多(即一个或多个)。
[0624] 此后本发明通过以下非限制性实施例并参考附图来描述。
[0625] 附图简述
[0626] 图1.真核细胞中脂质合成的图示,示出质体中合成的一些脂肪酸通过质体相关膜(PLAM)输出至内质网(ER),以及一些脂肪酸从ER输入质体用于真核半乳糖脂合成。缩写:
[0627] 乙酰基-CoA和丙二酰基-CoA:乙酰基-辅酶A和丙二酰基-辅酶A;
[0628] ACCase:乙酰基-CoA羧化酶;
[0629] FAS:脂肪酸合酶复合物;
[0630] 16:0-ACP、18:0-ACP和18:1-ACP:C16:0-酰基载体蛋白(ACP)、C18:0-酰基载体蛋白、C18:1-酰基载体蛋白;
[0631] KAS II:酮脂酰-ACP合酶II(EC 2.3.1.41);
[0632] PLPAAT:质体LPAAT;
[0633] PGPAT:质体GPAT;
[0634] PAP:PA磷酸化酶(EC 3.1.3.4);
[0635] G3P:甘油-3-磷酸;
[0636] LPA:溶血磷脂酸;
[0637] PA:磷脂酸;
[0638] DAG:二酰甘油;
[0639] TAG:三酰甘油;
[0640] 酰基-CoA和酰基-PC:酰基-辅酶A和酰基-磷脂酰胆碱;
[0641] PC:磷脂酰胆碱;
[0642] GPAT:甘油-3-磷酸酰基转移酶;
[0643] LPAAT:溶血磷脂酸酰基转移酶(EC 2.3.1.51);
[0644] LPCAT:酰基-CoA:溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶;或者同义词1-酰基甘油磷酸胆碱O-酰基转移酶;酰基-CoA:1-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱O-酰基转移酶(EC 2.3.1.23);
[0645] CPT:CDP-胆碱:二酰甘油胆碱磷酸转移酶;或者同义词1-烷基-2-乙酰基甘油胆碱磷酸转移酶;烷基酰基甘油胆碱磷酸转移酶;胆碱磷酸转移酶;磷酰胆碱-甘油酯转移酶(EC 2.7.8.2);
[0646] PDCT:磷脂酰胆碱:二酰甘油胆碱磷酸转移酶;
[0647] PLC:磷脂酶C(EC 3.1.4.3);
[0648] PLD:磷脂酶D;胆碱磷酸酶;卵磷脂酶D;磷脂二酯酶II(EC 3.1.4.4);
[0649] PDAT:磷脂:二酰甘油酰基转移酶;或者同义词磷脂:1,2-二酰基-sn-甘油O-酰基转移酶(EC 2.3.1.158);
[0650] FAD2:脂肪酸△12-去饱和酶;FAD3,脂肪酸△15-去饱和酶;
[0651] UDP-Gal:尿苷二磷酸半乳糖;
[0652] MGDS:单半乳糖基二酰甘油合酶;
[0653] MGDG:单半乳糖基二酰甘油;DGDG:二半乳糖基二酰甘油
[0654] FAD6,7,8:分别为在低温下诱导的质体脂肪酸△12-去饱和酶、质体ω3-去饱和酶、质体ω3-去饱和酶。
[0655] 图2.本氏烟草SDP1发夹构建体的示意图。所示的遗传片段如实施例12所述。缩写如图12所示。attB位点代表来自pHELLSGATE12载体的重组位点。
[0656] 图3.用来自pOIL51的T-DNA转化的烟草植物的绿色叶样品中的TAG含量,株系#61和#69,在开花前收获。对照物(母体)样品来自用来自pJP3502的T-DNA转化的植物。
[0657] 图4.野生型(wt)植物和单独地含有来自pJP3502的T-DNA或额外地含有来自pOIL051的T-DNA的转基因红花烟草转基因植物的根和茎组织中的TAG水平(%干重)。
[0658] 图5.在生长的结种期转化的烟草植物的叶样中的TAG含量,用来自pOIL049的T-DNA进行转化,株系#23c和#32b。对照物(母体)样品来自用来自pJP3502的T-DNA转化的植物。所述上部线表示所述TAG中的18:2百分比,所述下部线表示所述脂肪酸含量中的18:3(ALA)百分比。
[0659] 图6.野生型(wt)和转基因红花烟草植物的根和茎组织中的TAG水平(%干重),所述植物单独地含有来自pJP3502的T-DNA或额外地含有来自pOIL049的T-DNA。
[0660] 图7.A.来自野生型植物(WT)和含有来自pJP3502的T-DNA(HO对照)或来自pJP3502和pOIL051两者(pOIL51.61和pOIL51.69)或pJP3502和pOIL049两者(pOIL49.32b)的T-DNA的转基因植物的叶组织中的淀粉含量。数据代表来自至少三个单独植物的组合结果。B.野生型植物(WT)和含有来自pJP3502(HO对照)的T-DNA或来自pJP3502和pOIL051两者(pOIL51.61和pOIL51.69)或pJP3502和pOIL049两者(pOIL49.32b)的T-DNA的转基因植物的叶组织中淀粉和TAG含量之间的相关性。数据代表来自至少三个单独植物的组合结果。
[0661] 图8.在结种期取样的野生型植物(空心圆)和转基因植物(实心圆)(T1)的衰老叶子中基于干重(DW)的淀粉和可溶性糖含量。转基因红花烟草植物包括那些命名为HO、SDP1和LEC2的植物。在每种情况下,分析中包括三种植物。数据点基于三次重复分析。
[0662] 图9.从植物69DAS收获的不同年龄的WT和HO叶片的叶片N(A)和可溶性蛋白(B)。
[0663] 图10.WT和HO烟草中的叶可溶性蛋白质含量随叶和植物年龄的变化。
[0664] 图11.在改良条件下生长的烟草植物中叶片9、15和20的平均总脂肪酸(TFA)含量(mg/100mg干重):光强度增加的(左上图);对照(右上图);光周期增加的,光照强度增加的和二氧化碳浓度增加的(左下图);在高光强度下光周期减少的(右下图)。
[0665] 图12.从野生型和转基因双色乳杆菌中提取的总叶脂的TLC分离。Wt,野生型;EV,空矢量控制;2,用pOIL136转化双色S.(事件2);TAG,三酰基甘油;FFA,游离脂肪酸;DAG,二酰基甘油。在转移到土壤后,从幼小的营养植物收获叶组织。
[0666] 图13.A.在生长的营养阶段用遗传构建体pOIL103和pOIL197的组合转化的高粱叶中的脂质水平。显示了TFA、TAG和极性脂质的水平(干重的重量%)。每组4个柱依次显示来自野生型植物(WT,蓝色)、空载体对照植物(EV,橙色)和转基因植物TX-03-8(灰色)和TX-03-38(黄色)的叶子中的水平。B.如A一样,叶中半乳糖MGDG和DGDG以及磷脂PG、PC、PE、PA、PS和PI的水平。
[0667] 图14.载体pOIL122的示意图。缩写:TER Agrtu-Nos,根癌农杆菌胭脂碱合酶终止子;NPTII,新霉素磷酸转移酶蛋白编码区;PRO CaMV35S-Ex2,具有双增强子区的花椰菜花叶病毒35S启动子;Arath-DGAT1,拟南芥DGAT1酰基转移酶蛋白编码区;PRO Arath-Rubisco SSU,拟南芥Rubisco小亚基启动子;Arath-FATA2,拟南芥FATA2硫酯酶蛋白编码区;Arath-WRI,拟南芥WRI1转录因子蛋白编码区;TER Glyma-凝集素,大豆凝集素终止子;enTCUP2启动子,红花烟草隐蔽性组成型启动子;attB1和attB2,Gateway重组位点;NB SDP1片段,hpRNAi沉默靶向的本氏烟草SDP1区;OCS终止子,根癌农杆菌(A.tumefaciens)章鱼碱合酶终止子。T-DNA区外的骨架特征源自pORE04(Coutu et al.,2007)。
[0668] 图15.本氏烟草叶组织中的TAG水平(%叶干重),用编码不同WRI1多肽的基因渗透,有(右边的条)或无(左边的条)DGAT1的共表达(n=3)。所有样品还用P19构建体渗透。
[0669] 图16.LDAP多肽的系统发生树(实施例11)。
[0670] 图17.在左右边界之间包括T-DNA区的遗传构建体pJP3506的示意图。缩写如图12以及:Sesin-油质蛋白,芝麻油质蛋白蛋白编码区。
[0671] 图18.转基因小麦种子的脂肪酸含量。
[0672] 图19.对于以下的在生长的根叶阶段的高粱植物的叶中TFA和TAG水平(叶干重的重量%):野生型植物(阴性对照)、用基因构建体转化以表达DGAT和油质蛋白(DGAT+油质蛋白)的植物、用基因构建体转化以表达由Ubi启动子表达的WRI(Ubi:WRIl)的植物、用遗传构建体转化以表达由Ubi启动子表达的DGAT、油质蛋白和WRI(Ubi:WRIl+DGAT+油质蛋白)的植物、用遗传构建体转化以表达由PEPC启动子表达的DGAT、油质蛋白和WRI(PEPC:WRI1+DGAT+油质蛋白)的植物、用遗传构建体转化以表达由SSU启动子表达的DGAT、油质蛋白和WRI(SSU:WRI1+DGAT+油质蛋白)的植物。每个点表示独立转基因植物所见的水平。对于每种植物类型,左边的点的列(蓝色)显示TFA水平,并且右边的点的列(红色)表示同一组植物中的TAG水平。
[0673] 图20.用于在引入编码WRI1、DGATl和油体多肽(pOIL382-387)的基因后的本氏烟草的叶组织中选择的脂肪酸的TAG含量和脂肪酸组成。
[0674] 序列表的标注
[0675] SEQ ID NO:1 拟南芥DGAT1多肽(CAB44774.1)
[0676] SEQ ID NO:2 拟南芥DGAT2多肽(NP_566952.1)
[0677] SEQ ID NO:3 蓖麻DGAT2多肽(AAY16324.1)
[0678] SEQ ID NO:4 油桐(Vernicia fordii)DGAT2多肽(ABC94474.1)
[0679] SEQ ID NO:5 拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)DGAT2多肽(AAK84179.1)[0680] SEQ ID NO:6 智人(Homo sapiens)DGAT2多肽(Q96PD7.2)
[0681] SEQ ID NO:7 智人DGAT2多肽(Q58HT5.1)
[0682] SEQ ID NO:8 家牛(Bos taurus)DGAT2多肽(Q70VZ8.1)
[0683] SEQ ID NO:9 小家鼠(Mus musculus)DGAT2多肽(AAK84175.1)
[0684] SEQ ID NO:10 YFP三肽–保守的DGAT2和/或MGAT1/2序列基序
[0685] SEQ ID NO:11 HPHG四肽–保守的DGAT2和/或MGAT1/2序列基序
[0686] SEQ ID NO:12 EPHS四肽–保守的植物DGAT2序列基序
[0687] SEQ ID NO:13 RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q)–DGAT2的长保守序列基序,其是推定的甘油磷脂结构域的部分
[0688] SEQ ID NO:14 FLXLXXXN–小鼠DGAT2和MGAT1/2的保守序列基序,其是推定的中性脂质结合结构域
[0689] SEQ ID NO:15 GPAT的plsC酰基转移酶结构域(PF01553)
[0690] SEQ ID NO:16 GPAT的HAD样水解酶(PF12710)超家族结构域
[0691] SEQ ID NO:17 磷酸丝氨酸磷酸酶结构域(PF00702)。GPAT4-8包含与这个结构域同源的N-端区域
[0692] SEQ ID NO:18 保守的GPAT氨基酸序列GDLVICPEGTTCREP
[0693] SEQ ID NO:19 保守的GPAT/磷酸酶氨基酸序列(基序I)
[0694] SEQ ID NO:20 保守的GPAT/磷酸酶氨基酸序列(基序III)
[0695] SEQ ID NO:21 拟南芥WRI1多肽(A8MS57)
[0696] SEQ ID NO:22 拟南芥WRI1多肽(Q6X5Y6)
[0697] SEQ ID NO:23 琴叶拟南芥琴叶亚种(Arabidopsis lyrata subsp.lyrata)WRI1多肽(XP_002876251.1)
[0698] SEQ ID NO:24 欧洲油菜WRI1多肽(ABD16282.1)
[0699] SEQ ID NO:25 欧洲油菜WRI1多肽(ADO16346.1)
[0700] SEQ ID NO:26 大豆WRI1多肽(XP_003530370.1)
[0701] SEQ ID NO:27 麻风树WRI1多肽(AEO22131.1)
[0702] SEQ ID NO:28 蓖麻WRI1多肽(XP_002525305.1)
[0703] SEQ ID NO:29 毛果杨WRI1多肽(XP_002316459.1)
[0704] SEQ ID NO:30 葡萄(Vitis vinifera)WRI1多肽(CBI29147.3)
[0705] SEQ ID NO:31 二穗短柄草(Brachypodium distachyon)WRI1多肽(XP_003578997.1)
[0706] SEQ ID NO:32 大麦(Hordeum vulgare subsp.Vulgare)WRI1多肽(BAJ86627.1)[0707] SEQ ID NO:33 水稻WRI1多肽(EAY79792.1)
[0708] SEQ ID NO:34 两色高粱WRI1多肽(XP_002450194.1)
[0709] SEQ ID NO:35 玉米WRI1多肽(ACG32367.1)
[0710] SEQ ID NO:36 二穗短柄草WRI1多肽(XP_003561189.1)
[0711] SEQ ID NO:37 小颖短柄草(Brachypodium sylvaticum)WRI1多肽(ABL85061.1)[0712] SEQ ID NO:38 水稻WRI1多肽(BAD68417.1)
[0713] SEQ ID NO:39 两色高粱WRI1多肽(XP_002437819.1)
[0714] SEQ ID NO:40 两色高粱WRI1多肽(XP_002441444.1)
[0715] SEQ ID NO:41 大豆WRI1多肽(XP_003530686.1)
[0716] SEQ ID NO:42 大豆WRI1多肽(XP_003553203.1)
[0717] SEQ ID NO:43 毛果杨WRI1多肽(XP_002315794.1)
[0718] SEQ ID NO:44 葡萄WRI1多肽(XP_002270149.1)
[0719] SEQ ID NO:45 大豆WRI1多肽(XP_003533548.1)
[0720] SEQ ID NO:46 大豆WRI1多肽(XP_003551723.1)
[0721] SEQ ID NO:47 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)WRI1多肽(XP_003621117.1)[0722] SEQ ID NO:48 毛果杨WRI1多肽(XP_002323836.1)
[0723] SEQ ID NO:49 蓖麻WRI1多肽(XP_002517474.1)
[0724] SEQ ID NO:50 葡萄WRI1多肽(CAN79925.1)
[0725] SEQ ID NO:51 二穗短柄草WRI1多肽(XP_003572236.1)
[0726] SEQ ID NO:52 水稻WRI1多肽(BAD10030.1)
[0727] SEQ ID NO:53 两色高粱WRI1多肽(XP_002444429.1)
[0728] SEQ ID NO:54 玉米WRI1多肽(NP_001170359.1)
[0729] SEQ ID NO:55 琴叶拟南芥琴叶亚种WRI1多肽(XP_002889265.1)
[0730] SEQ ID NO:56 拟南芥WRI1多肽(AAF68121.1)
[0731] SEQ ID NO:57 拟南芥WRI1多肽(NP_178088.2)
[0732] SEQ ID NO:58 琴叶拟南芥琴叶亚种WRI1多肽(XP_002890145.1)
[0733] SEQ ID NO:59 小盐芥(Thellungiella halophila)WRI1多肽(BAJ33872.1)[0734] SEQ ID NO:60 拟南芥WRI1多肽(NP_563990.1)
[0735] SEQ ID NO:61 大豆WRI1多肽(XP_003530350.1)
[0736] SEQ ID NO:62 二穗短柄草WRI1多肽(XP_003578142.1)
[0737] SEQ ID NO:63 水稻WRI1多肽(EAZ09147.1)
[0738] SEQ ID NO:64 两色高粱WRI1多肽(XP_002460236.1)
[0739] SEQ ID NO:65 玉米WRI1多肽(NP_001146338.1)
[0740] SEQ ID NO:66 大豆WRI1多肽(XP_003519167.1)
[0741] SEQ ID NO:67 大豆WRI1多肽(XP_003550676.1)
[0742] SEQ ID NO:68 蒺藜苜蓿WRI1多肽(XP_003610261.1)
[0743] SEQ ID NO:69 大豆WRI1多肽(XP_003524030.1)
[0744] SEQ ID NO:70 大豆WRI1多肽(XP_003525949.1)
[0745] SEQ ID NO:71 毛果杨WRI1多肽(XP_002325111.1)
[0746] SEQ ID NO:72 葡萄WRI1多肽(CBI36586.3)
[0747] SEQ ID NO:73 葡萄WRI1多肽(XP_002273046.2)
[0748] SEQ ID NO:74 毛果杨WRI1多肽(XP_002303866.1)
[0749] SEQ ID NO:75 葡萄WRI1多肽(CBI25261.3)
[0750] SEQ ID NO:76 Sorbi-WRL1
[0751] SEQ ID NO:77 Lupan-WRL1
[0752] SEQ ID NO:78 Ricco-WRL1
[0753] SEQ ID NO:79 狭叶羽扇豆(Lupin angustifolius)WRI1多肽
[0754] SEQ ID NO:80 烟曲霉(Aspergillus fumigatus)DGAT1多肽(XP_755172.1)[0755] SEQ ID NO:81 蓖麻DGAT1多肽(AAR11479.1)
[0756] SEQ ID NO:82 油桐DGAT1多肽(ABC94472.1)
[0757] SEQ ID NO:83 斑鸠菊(Vernonia galamensis)DGAT1多肽(ABV21945.1)
[0758] SEQ ID NO:84 斑鸠菊DGAT1多肽(ABV21946.1)
[0759] SEQ ID NO:85 卫矛(Euonymus alatus)DGAT1多肽(AAV31083.1)
[0760] SEQ  ID  NO:86 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis  elegans)DGAT1多肽(AAF82410.1)
[0761] SEQ ID NO:87 褐鼠(Rattus norvegicus)DGAT1多肽(NP_445889.1)
[0762] SEQ ID NO:88 智人DGAT1多肽(NP_036211.2)
[0763] SEQ ID NO:89 WRI1基序(R G V T/S R H R W T G R)
[0764] SEQ ID NO:90 WRI1基序(F/Y E A H L W D K)
[0765] SEQ ID NO:91 WRI1基序(D L A A L K Y W G)
[0766] SEQ ID NO:92 WRI1基序(S X G F S/A R G X)
[0767] SEQ ID NO:93 WRI1基序(H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V)
[0768] SEQ ID NO:94 WRI1基序(Q E E A A A X Y D)
[0769] SEQ ID NO:95 欧洲油菜油质蛋白多肽(CAA57545.1)
[0770] SEQ ID NO:96 欧洲油菜油质蛋白S1-1多肽(ACG69504.1)
[0771] SEQ ID NO:97 欧洲油菜油质蛋白S2-1多肽(ACG69503.1)
[0772] SEQ ID NO:98 欧洲油菜油质蛋白S3-1多肽(ACG69513.1)
[0773] SEQ ID NO:99 欧洲油菜油质蛋白S4-1多肽(ACG69507.1)
[0774] SEQ ID NO:100 欧洲油菜油质蛋白S5-1多肽(ACG69511.1)
[0775] SEQ ID NO:101 花生(Arachis hypogaea)油质蛋白1多肽(AAZ20276.1)
[0776] SEQ ID NO:102 花生油质蛋白2多肽(AAU21500.1)
[0777] SEQ ID NO:103 花生油质蛋白3多肽(AAU21501.1)
[0778] SEQ ID NO:104 花生油质蛋白5多肽(ABC96763.1)
[0779] SEQ ID NO:105 蓖麻油质蛋白1多肽(EEF40948.1)
[0780] SEQ ID NO:106 蓖麻油质蛋白2多肽(EEF51616.1)
[0781] SEQ ID NO:107 大豆油质蛋白同种型a多肽(P29530.2)
[0782] SEQ ID NO:108 大豆油质蛋白同种型b多肽(P29531.1)
[0783] SEQ ID NO:109 亚麻油质蛋白低分子量同种型多肽(ABB01622.1)
[0784] SEQ ID NO:110 亚麻油质蛋白高分子量同种型多肽的氨基酸序列(ABB01624.1)[0785] SEQ ID NO:111 向日葵油质蛋白多肽(CAA44224.1)
[0786] SEQ ID NO:112 玉米油质蛋白多肽(NP_001105338.1)
[0787] SEQ ID NO:113 欧洲油菜油体固醇蛋白多肽(ABM30178.1)
[0788] SEQ ID NO:114 欧洲油菜油体固醇蛋白SLO1-1多肽(ACG69522.1)
[0789] SEQ ID NO:115 欧洲油菜油体固醇蛋白SLO2-1多肽(ACG69525.1)
[0790] SEQ ID NO:116 芝麻油体固醇蛋白多肽(AAL13315.1)
[0791] SEQ ID NO:117 玉米油体固醇蛋白多肽(NP_001152614.1)
[0792] SEQ ID NO:118 欧洲油菜油体钙蛋白CLO-1多肽(ACG69529.1)
[0793] SEQ ID NO:119 欧洲油菜油体钙蛋白CLO-3多肽(ACG69527.1)
[0794] SEQ ID NO:120 芝麻油体钙蛋白多肽(AAF13743.1)
[0795] SEQ ID NO:121 玉米油体钙蛋白多肽(NP_001151906.1)
[0796] SEQ ID NO:122 pJP3502 TDNA(插入基因组)序列
[0797] SEQ ID NO:123 pJP3507载体序列
[0798] SEQ ID NO:124 接头序列
[0799] SEQ ID NO:125 选择用于hpRNAi沉默的部分本氏烟草CGI-58序列(pTV46)
[0800] SEQ ID NO:126 选择用于hpRNAi沉默的部分红花烟草AGPase序列(pTV35)
[0801] SEQ ID NO:127 GXSXG脂肪酶基序
[0802] SEQ ID NO:128 HX(4)D酰基转移酶基序
[0803] SEQ ID NO:129 VX(3)HGF可能的脂质结合基序
[0804] SEQ ID NO:130 拟南芥CGi58多核苷酸(NM_118548.1)
[0805] SEQ ID NO:131 二穗短柄草CGi58多核苷酸(XM_003578402.1)
[0806] SEQ ID NO:132 大豆CGi58多核苷酸(XM_003523590.1)
[0807] SEQ ID NO:133 玉米CGi58多核苷酸(NM_001155541.1)
[0808] SEQ ID NO:134 两色高粱CGi58多核苷酸(XM_002460493.1)
[0809] SEQ ID NO:135 蓖麻CGi58多核苷酸(XM_002510439.1)
[0810] SEQ ID NO:136 蒺藜苜蓿CGi58多核苷酸(XM_003603685.1)
[0811] SEQ ID NO:137 拟南芥LEC2多核苷酸(NM_102595.2)
[0812] SEQ ID NO:138 蒺藜苜蓿LEC2多核苷酸(X60387.1)
[0813] SEQ ID NO:139 欧洲油菜LEC2多核苷酸(HM370539.1)
[0814] SEQ ID NO:140 拟南芥BBM多核苷酸(NM_121749.2)
[0815] SEQ ID NO:141 蒺藜苜蓿BBM多核苷酸(AY899909.1)
[0816] SEQ ID NO:142 拟南芥LEC2多肽(NP_564304.1)
[0817] SEQ ID NO:143 蒺藜苜蓿LEC2多肽(CAA42938.1)
[0818] SEQ ID NO:144 欧洲油菜LEC2多肽(ADO16343.1)
[0819] SEQ ID NO:145 拟南芥BBM多肽(NP_197245.2)
[0820] SEQ ID NO:146 蒺藜苜蓿BBM多肽(AAW82334.1)
[0821] SEQ ID NO:147 可诱导的黑曲霉(Aspergilus niger)alcA启动子
[0822] SEQ ID NO:148 在乙醇存在下激活AlcA启动子的AlcR诱导物
[0823] SEQ ID NO:149 拟南芥LEC1;(AAC39488)
[0824] SEQ ID NO:150 琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)LEC1(XP_002862657)
[0825] SEQ ID NO:151 欧洲油菜LEC1(ADF81045)
[0826] SEQ ID NO:152 蓖麻LEC1(XP_002522740)
[0827] SEQ ID NO:153 大豆LEC1(XP_006582823)
[0828] SEQ ID NO:154 蒺藜苜蓿LEC1(AFK49653)
[0829] SEQ ID NO:155 玉米LEC1(AAK95562)
[0830] SEQ ID NO:156 花生LEC1(ADC33213)
[0831] SEQ ID NO:157 拟南芥LEC1样(AAN15924)
[0832] SEQ ID NO:158 欧洲油菜LEC1样(AHI94922)
[0833] SEQ ID NO:159 荷包豆(Phaseolus coccineus)LEC1样(AAN01148)
[0834] SEQ ID NO:160 拟南芥FUS3(AAC35247)
[0835] SEQ ID NO:161 欧洲油菜FUS3
[0836] SEQ ID NO:162 蒺藜苜蓿FUS3
[0837] SEQ ID NO:163 拟南芥SDP1 cDNA序列,登录号NM_120486,3275nt
[0838] SEQ ID NO:164 欧洲油菜SDP1 cDNA;登录号GN078290
[0839] SEQ ID NO:165 二穗短柄草SDP1 cDNA,2670nt
[0840] SEQ ID NO:166 毛果杨SDP1 cDNA,3884nt
[0841] SEQ ID NO:167 蒺藜苜蓿SDP1 cDNA;XM_003591377;2490nt
[0842] SEQ ID NO:168 大豆SDP1 cDNA XM_003521103;2783nt
[0843] SEQ ID NO:169 两色高粱SDP1 cDNA XM_002458486;2724nt
[0844] SEQ ID NO:170 玉米SDP1 cDNA,NM_001175206;2985nt
[0845] SEQ ID NO:171 小立碗藓(Physcomitrella patens)SDP1 cDNA,XM_001758117;1998nt
[0846] SEQ ID NO:172 大麦SDP1 cDNA,AK372092;3439nt
[0847] SEQ ID NO:173 本氏烟草SDP1 cDNA,Nbv5tr6404201
[0848] SEQ ID NO:174 hpRNAi沉默靶向的本氏烟草SDP1 cDNA区域
[0849] SEQ ID NO:175 拟南芥SDP1基因的启动子,1.5kb
[0850] SEQ ID NO:176 pJP3502的T-DNA中的pSSU-Oleosin基因补体的核苷酸序列。顺序为(互补序列):大豆凝集素终止子348nt,3’外显子255nt,UBQ10内含子304nt,5’外显子213nt,SSU启动子1751nt
[0851] SEQ ID NO:177 拟南芥质体GPAT cDNA,NM_179407
[0852] SEQ ID NO:178 拟南芥质体GPAT多肽,NM_179407
[0853] SEQ ID NO:179 毛果杨质体GPAT cDNA,XP_006368351
[0854] SEQ ID NO:180 麻风树质体GPAT cDNA,ACR61638
[0855] SEQ ID NO:181 蓖麻质体GPAT cDNA,XP_002518993
[0856] SEQ ID NO:182 向日葵质体GPAT cDNA,ADV16382
[0857] SEQ ID NO:183 蒺藜苜蓿质体GPAT cDNA,XP_003612801
[0858] SEQ ID NO:184 大豆质体GPAT cDNA,XP_003516958
[0859] SEQ ID NO:185 红花质体GPAT cDNA,CAHG3PACTR
[0860] SEQ ID NO:186 马铃薯质体GPAT cDNA,XP_006352898
[0861] SEQ ID NO:187 水稻,粳稻质体GPAT cDNA,NM_001072027
[0862] SEQ ID NO:188 两色高粱质体GPAT cDNA,XM_002467381
[0863] SEQ ID NO:189 玉米质体GPAT cDNA,NM_001158637
[0864] SEQ ID NO:190 大麦质体GPAT cDNA,AK371419
[0865] SEQ ID NO:191 小立碗藓质体GPAT cDNA,XM_001771247
[0866] SEQ ID NO:192 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)质体GPAT cDNA,XM_001694925
[0867] SEQ ID NO:193 拟南芥FATA1
[0868] SEQ ID NO:194 拟南芥FATA2
[0869] SEQ ID NO:195 拟南芥FATB
[0870] SEQ ID NO:196 拟南芥WRI3
[0871] SEQ ID NO:197 拟南芥WRI4
[0872] SEQ ID NO:198 燕麦WRI1
[0873] SEQ ID NO:199 两色高粱WRI1
[0874] SEQ ID NO:200 玉米WRI1
[0875] SEQ ID NO:201 乌臼(Triadica sebifera)WRI1
[0876] SEQ ID NO:202 马铃薯(S.tuberosum)Patatin B33启动子序列
[0877] SEQ ID NOs 203-206和236-245 寡核苷酸引物
[0878] SEQ ID NO:207 玉米(Z.mays)SEE1启动子区(来自登录号AJ494982的1970nt)[0879] SEQ ID NO:208 马伴草(A.littoralis)AlSAP启动子序列,登录号DQ885219[0880] SEQ ID NO:209 发根农杆菌(A.rhizogenes)ArRolC启动子序列,登录号DQ160187[0881] SEQ ID NO:210 包含本氏烟草质体GPAT的732bp片段的hpRNAi构建体
[0882] SEQ ID NO:211 油棕(Elaeis guineensis,油棕(oil palm))DGAT1
[0883] SEQ ID NO:212 栽培大豆MYB73,登录号ABH02868
[0884] SEQ ID NO:213 拟南芥bZIP53,登录号AAM14360
[0885] SEQ ID NO:214 拟南芥AGL15,登录号NP_196883
[0886] SEQ ID NO:215 拟南芥MYB118,登录号AAS58517
[0887] SEQ ID NO:216 拟南芥MYB115,登录号AAS10103
[0888] SEQ ID NO:217 拟南芥TANMEI,登录号BAE44475
[0889] SEQ ID NO:218 拟南芥WUS,登录号NP_565429
[0890] SEQ ID NO:219 欧洲油菜(B.napus)GFR2a1,登录号AFB74090
[0891] SEQ ID NO:220 欧洲油菜GFR2a2,登录号AFB74089
[0892] SEQ ID NO:221 拟南芥PHR1,登录号AAN72198
[0893] SEQ ID NO:222 本氏烟草TGD1片段
[0894] SEQ ID NO:223 马铃薯SDP1氨基酸
[0895] SEQ ID NO:224 马铃薯SDP1核苷酸序列
[0896] SEQ ID NO:225 马铃薯AGPase小亚基
[0897] SEQ ID NO:226 马铃薯AGPase小亚基核苷酸序列
[0898] SEQ ID NO:227 乌桕(Sapium sebiferum)LDAP-1核苷酸序列
[0899] SEQ ID NO:228 乌桕LDAP-1氨基酸序列
[0900] SEQ ID NO:229 乌桕LDAP-2核苷酸序列
[0901] SEQ ID NO:230 乌桕LDAP-2氨基酸序列
[0902] SEQ ID NO:231 乌桕LDAP-3核苷酸序列
[0903] SEQ ID NO:232 乌桕LDAP-3氨基酸序列
[0904] SEQ ID NO:233 两色高粱(S.bicolor)SDP1(登录号XM_002463620)
[0905] SEQ ID NO:234 小麦(T.aestivum)SDP1核苷酸序列(登录号AK334547)
[0906] SEQ ID NO:235 两色高粱SDP1 hpRNAi片段
[0907] SEQ ID NO:246 甘蔗杂种DIRIGENT(DIR16)启动子序列
[0908] SEQ ID NO:247 甘蔗杂种O-甲基转移酶(OMT)启动子序列
[0909] SEQ ID NO:248 甘蔗杂种R1MYB1基因的A1启动子等位基因的序列
[0910] SEQ ID NO:249 甘蔗杂种载入茎基因5(LSG5)启动子序列
[0911] SEQ ID NO:250 两色高粱TGD5基因cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列,登录号XM_002442154;297nt
[0912] SEQ ID NO:251 两色高粱TGD5多肽的氨基酸序列,登录号XM_002442154;98aa[0913] SEQ ID NO:252 玉米TGD5基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列,登录号EU972796.1;297nt
[0914] SEQ ID NO:253 玉米TGD5多肽的氨基酸序列,登录号EU972796.1;98aa
[0915] SEQ ID NO:254 编码AGPase小亚基的高粱基因cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号XM_002462095.1);1533nt
[0916] SEQ  ID  NO:255  两色高粱AGPase小亚基多肽的氨基酸序列(登录号XM_002462095.1);510aa
[0917] SEQ ID NO:256 编码AGPase小亚基多肽的玉米基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号XM_008666513.1);1554nt
[0918] SEQ ID NO:257 玉米AGPase小亚基多肽的氨基酸序列(登录号XM_008666513.1);517aa
[0919] SEQ ID NO:258两色高粱PDAT1基因cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号XM_002462417.1);
[0920] SEQ ID NO:259 两色高粱PDAT1多肽的氨基酸序列(登录号XM_002462417.1);682aa
[0921] SEQ ID NO:260 玉米PDAT1基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号NM_001147943);2037nt
[0922] SEQ ID NO:261 玉米PDAT1多肽的氨基酸序列(登录号NM_001147943);678aa[0923] SEQ ID NO:262 两色高粱PDCT基因cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号XM_002437214);846nt
[0924] SEQ ID NO:263 两色高粱PDCT多肽的氨基酸序列(登录号XM_002437214);281aa[0925] SEQ ID NO:264 玉米PDCT基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号EU973573.1);849nt
[0926] SEQ ID NO:265 玉米PDCT多肽的氨基酸序列(登录号EU973573.1);282aa
[0927] SEQ ID NO:266 两色高粱TST1基因cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号XM_002467535.1);2223nt
[0928] SEQ ID NO:267 两色高粱TST1多肽的氨基酸序列(登录号XM_002467535.1);740aa
[0929] SEQ ID NO:268 玉米TST1基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号NM_001158464);2244nt
[0930] SEQ ID NO:269 玉米TST1多肽的氨基酸序列(登录号NM_001158464);747aa[0931] SEQ  ID NO:270 两色高粱TST2基因cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(Sb04G008150;Sobic.004G099300;登录号KXG29849.1);2238nt
[0932] SEQ ID NO:271 两色高粱TST2多肽的氨基酸序列(登录号KXG29849.1);745aa[0933] SEQ ID NO:272 玉米TST2基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号XM_008647398.1);2238nt
[0934] SEQ ID NO:273 玉米TST2多肽的氨基酸序列(登录号XM_008647398.1);745aa[0935] SEQ  ID NO:274 两色高粱INV3基因cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(Sobic.004G004800;Sb04g000620;登录号XM_002451312);1464nt
[0936] SEQ ID NO:275 两色高粱INV3多肽的氨基酸序列(登录号XM_002451312);487aa[0937] SEQ ID NO:276 两色高粱INV3多肽的氨基酸序列;可选的较长剪接形式(登记号EES04332.2);638aa
[0938] SEQ ID NO:277 玉米INV2基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(与Sb INV3的玉米同源物)(登录号NM_001305860.1);2022nt
[0939] SEQ ID NO:278 玉米INV2多肽的氨基酸序列(Sb INV3的玉米同源物)(登录号NM_001305860.1);673aa
[0940] SEQ  ID NO:279 两色高粱SUS4基因cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(Sobic.001G344500;Sb01g033060;登录号XM_002465116.1);2451nt
[0941] SEQ ID NO:280 两色高粱SUS4多肽的氨基酸序列(登录号XM_002465116.1);816aa
[0942] SEQ ID NO:281 玉米SUS1基因(Sb SUS4的玉米同源物)的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号NM_001111853);2451nt
[0943] SEQ ID NO:282 玉米SUS1多肽的氨基酸序列(登录号NM_001111853);816aa[0944] SEQ  ID NO:283 两色高粱bCIN基因cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(Sobic.004G172700;Sb04g022350;登录号XM_002453920.1);
[0945] SEQ ID NO:284 两色高粱bCIN多肽的氨基酸序列(登录号XM_002453920.1);559aa
[0946] SEQ ID NO:285 玉米胞质INV基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(Sb bCIN的同源物)(登录号NM_001175248.1);1680nt
[0947] SEQ ID NO:286 玉米INV多肽的氨基酸序列(登录号NM_001175248.1);559aa[0948] SEQ  ID NO:287 两色高粱SUT4基因cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(Sb04g038030;登录号XM_002453038.1);1785nt
[0949] SEQ ID NO:288 两色高粱SUT4多肽的氨基酸序列(登录号XM_002453038.1);594aa
[0950] SEQ ID NO:289 玉米SUT2基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号AY581895.1);1779nt
[0951] SEQ ID NO:290 玉米SUT2多肽的氨基酸序列(登录号AY581895.1);592aa
[0952] SEQ ID NO:291 拟南芥SWEET16基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号NM_001338249.1);693nt
[0953] SEQ ID NO:292 拟南芥SWEET16多肽的氨基酸序列(登录号NM_001338249.1);230aa
[0954] SEQ ID NO:293 拟南芥MED15-1基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号NM_101446.4);4008nt
[0955] SEQ ID NO:294 拟南芥MED15-1多肽的氨基酸序列(登录号NM_101446.4);1335aa[0956] SEQ ID NO:295 玉米MED15-1基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号NM_001321633.1);3927nt
[0957] SEQ ID NO:296 玉米MED15-1多肽的氨基酸序列(登录号NM_001321633.1);1308aa
[0958] SEQ ID NO:297 拟南芥14-3-3κ基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号AY079350);
[0959] SEQ ID NO:298 拟南芥14-3-3κ多肽的氨基酸序列(登录号AY079350);248aa[0960] SEQ ID NO:299 两色高粱14-3-3κ基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号XM_002445734.1);762nt
[0961] SEQ ID NO:300 两色高粱14-3-3κ多肽的氨基酸序列(登录号XM_002445734.1);253AA
[0962] SEQ ID NO:301 拟南芥14-3-3λ基因的cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号NM_001203346);777nt
[0963] SEQ ID NO:302 拟南芥14-3-3λ多肽的氨基酸序列(登录号NM_001203346);258aa[0964] SEQ ID NO:303 两色高粱14-3-3λ基因cDNA的蛋白质编码区的核苷酸序列(登录号XM_002445734.1);762nt
[0965] SEQ ID NO:304 两色高粱14-3-3λ多肽的氨基酸序列(登录号XM_002445734.1);253AA
[0966] SEQ ID NO:305 芝麻油质蛋白L的氨基酸序列(登录号AF091840)
[0967] SEQ ID NO:306 无花果(Ficus pumila var.awkeotsang)油质蛋白L直系同源多肽的氨基酸序列(登录号ABQ57397.1)
[0968] SEQ ID NO:307 黄瓜(Cucumis sativus)油质蛋白L直系同源多肽的氨基酸序列(登录号XP_004146901.1)
[0969] SEQ ID NO:308亚麻油质蛋白L直系同源多肽的氨基酸序列(登录号ABB01618.1)[0970] SEQ ID NO:309 大豆油质蛋白L直系同源多肽的氨基酸序列(登录号XP_003556321.2)
[0971] SEQ ID NO:310 凤梨(Ananas comosus)油质蛋白L直系同源多肽的氨基酸序列(登录号OAY72596.1)
[0972] SEQ ID NO:311 小米(Setaria italic)油质蛋白L直向同源多肽的氨基酸序列(登录号XP_004956407.1)
[0973] SEQ ID NO:312 草莓(Fragaria vesca subsp.vesca)油质蛋白L直系同源多肽的氨基酸序列(登录号XP_004307777.1)
[0974] SEQ ID NO:313 欧洲油菜油质蛋白L直系同源多肽的氨基酸序列(登录号CDY03377.1)
[0975] SEQ ID NO:314 番茄(Solanum lycopersicum)油质蛋白L直系同源多肽的氨基酸序列(登录号XP_004240765.1)
[0976] SEQ ID NO:315.来自香草(Vanilla planifolia)的U1油质蛋白的氨基酸序列[0977] SEQ ID NO:316.来自乌臼(中国牛脂)的TsLDAP1的氨基酸序列
[0978] SEQ ID NO:317.来自乌臼(中国牛脂)的TsLDAP2的氨基酸序列
[0979] SEQ ID NO:318.来自乌臼(中国牛脂)的TsLDAP3的氨基酸序列
[0980] SEQ ID NO:319.来自椰子的GPAT9的氨基酸序列
[0981] SEQ ID NO:320.玉米CPT1的氨基酸序列(登录号NP_001151915.1)
[0982] SEQ ID NO:321.玉米CPT1的氨基酸序列(登录号XP_008649199.1)
[0983] SEQ ID NO:322.两色高粱CPT1的氨基酸序列(登录号XP_002451408.1)
[0984] SEQ ID NO:323.两色高粱CPT1的氨基酸序列(登录号XP_021305900.1)
[0985] 发明详述
[0986] 一般技术
[0987] 除非另外明确限定,否则本文所用的所有科技术语应采取本领域(如,细胞培养、分子遗传学、植物生物学、细胞生物学、蛋白化学、脂质和脂肪酸化学、动物营养学、生物燃料生产和生物化学领域)技术人员通常所理解的相同含义。
[0988] 除非另外指明,否则本发明所用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。此类技术在诸如以下文献资源中有所描述和解释:J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989),T.A.Brown(编者),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,卷1和2,IRL Press(1991),D.M.Glover和B.D.Hames(编者),DNA Cloning:A Practical 
Approach,卷1-4,IRL Press(1995和1996),F.M.Ausubel等(编者),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,包括到目前为止的所有更新),Ed Harlow和David Lane(编者)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988),和J.E.Coligan等(编者)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括到目前为止的所有更新)。
[0989] 所选的定义
[0990] 在多核苷酸或多肽背景下的术语“外源”是指当存在于天然不含所述多核苷酸或多肽的细胞中时的多核苷酸或多肽。这样的细胞在本文中称作“重组细胞”或“转基因细胞”,以及包含所述细胞的植物称作“转基因植物”。在一实施方案中,外源多核苷酸或多肽来自与包含所述外源多核苷酸或多肽的植物或其部分的细胞不同的属。在另一实施方案中,外源多核苷酸或多肽来自不同的物种。在一实施方案中,在植物细胞中表达的外源多核苷酸或多肽来自不同的物种或属。所述外源多核苷酸或多肽可以是非天然存在的,例如,由重组DNA方法所产生的合成DNA分子。所述DNA分子可以,优选地,包括已经过密码子优化用于在该细胞中表达的蛋白编码区,由此产生具有与天然存在的多肽相同的氨基酸序列的多肽,尽管所述蛋白编码区的核苷酸序列并不是天然存在的。所述外源多核苷酸可以编码、或所述外源多肽可以是:例如二酰甘油酰基转移酶(DGAT)如DGAT1或DGAT2、Wrinkled 1(WRI1)转录因子、OBC如油质蛋白或优选LDAP、脂肪酸硫酯酶如FATA或FATB多肽、或者沉默抑制子多肽。在一个实施方案中,本发明的细胞是重组细胞。
[0991] 本文所用的术语“三酰基甘油(TAG)含量”或其变体是指所述细胞、植物或其部分中的TAG的量。可以使用本领域已知的技术计算TAG含量,例如用如下方程将甘油与脂肪酰基部分求和:TAG的重量%=100x((41x总的FAME mol/3)+(总的FAME g-(15x总的FAME mol)))/g,其中41和15分别是甘油部分和甲基的分子量(其中FAME是脂肪酸甲酯)(参见例如实施例1)。
[0992] 本文所用术语“总脂肪酸(TFA)含量”或其变体是指所述细胞、植物或其部分中的脂肪酸的总量,作为细胞、植物或其部分的重量百分比。除非另有说明,所述细胞、植物或其部分的重量为所述细胞、植物或其部分的干重。TFA含量如本文实施例1中所述测定。该方法涉及将样品中的脂肪酸转化为FAME,并通过GC测量FAME的量,使用已知量的诸如C17:0的不同脂肪酸标准作为GC中的定量标准。因此,TRA代表了仅仅脂肪酸的重量,不是所述脂肪酸及其在所述植物脂质中的连接部分(moiety)的重量。
[0993] 如本文所用,“TAG/TFA商”或“TTQ”参数计算为TAG(%)的水平除以TFA(%)的水平,各自作为植物材料干重的百分比。例如,10%的TFA水平包含在6%的TAG水平,则TTQ为0.6。如本文所述测量TAG和TFA水平。应理解,在本文中,TFA水平是指总脂肪酸含量的重量,并且TAG水平是指TAG的重量,包括TAG的甘油部分(moiety)。
[0994] 如本文所用,术语“可溶性蛋白质含量”或其变体是指植物或其部分中可溶性蛋白质的量。可溶性蛋白质含量可使用本领域已知的技术计算。例如,可以研磨新鲜组织,通过在2.5mM HEPES缓冲液中50-80%(v/v)乙醇(pH7.5)中加热至80℃提取叶绿素和可溶性糖,离心,在蒸馏水中洗涤沉淀,用0.1M NaOH重悬沉淀并加热至95℃30分钟,然后使用Bradford测定法(Bradford,1976)测定可溶性蛋白质含量。可选地,可以将新鲜组织在含有100mM Tris-HCl(pH 8.0)和10mM MgCl2的缓冲液中研磨。
[0995] 如本文所用,术语“氮含量”或其变体是指植物或其部分中的氮的量。可以使用本领域已知的技术计算氮含量。例如,可以使用具有ANCA制备系统的Europa20-20同位素比质谱仪分析冷冻干燥的组织,所述ANCA制备系统包括分别在1000℃和600℃下操作的燃烧和还原管,以测定氮含量。
[0996] 如本文所用,术语“碳含量”或其变体是指植物或其部分中的碳的量。可以使用本领域已知的技术计算碳含量。例如,可以使用Shaw(1959)描述的方法或如实施例1中所述的方法测定有机碳水平。
[0997] 如本文所用,术语“碳:氮比”或其变体是指当与细胞、植物或其部分中的氮的量相比时,细胞、植物或其部分中的碳的相对量。碳和氮含量可以如上所述计算并表示为比率。
[0998] 如本文所用,术语“光合基因表达”或其变体是指表达参与植物或其部分中的光合途径的蛋白质的一种或多种基因。可在本发明的植物或其部分中上调的光合基因的实例包括但不限于表10中列出的一种或多种基因。
[0999] 如本文所用,术语“光合能力”或其变体是指植物或其部分光合作用的能力(将光能转化为化学能)。光合能力(Amax)是叶片在光合作用过程中能够固定碳的最大速率的量度。它通常测量为每平方米每秒固定的二氧化碳量,例如μmolm-2sec-1。可以使用本领域已知的技术计算光合能力。
[1000] 如本文所用,术语“总膳食纤维(TDF)含量”或其变体是指细胞、植物或其部分中的纤维(包括可溶性和不溶性纤维)的量。如本领域技术人员所理解的,膳食纤维包括非淀粉多糖(例如阿拉伯木聚糖)、纤维素和许多其他植物组分,例如抗性淀粉、抗性糊精、菊粉、木质素、几丁质、果胶、β-葡聚糖和低聚糖。可以使用本领域已知的技术计算TDF。例如,使用Prosky方法(Prosky等人,1985)、McCleary方法(McCleary等人,2007)或快速整合的总膳食纤维方法(McCleary等人,2015)。
[1001] 如本文所用,术语“能量含量”或其变体是指植物或其部分中的食物能量。更具体地说,动物(包括人类)从其食物中获得的化学能量。能量含量可使用本领域已知的技术计算。例如,可以基于炸弹量热计中的燃烧热量和考虑到消化和吸收效率以及尿液中尿素和其他物质的产生的校正来确定能量含量。作为另一个例子,可以如实施例1中所述计算能量含量。
[1002] 如本文所用,术语“提取的脂质”是指从包含至少60%(w/w)脂质的本发明的细胞、植物或其部分(例如本发明的转基因细胞、植物或其部分)提取的组合物。
[1003] 如本文所用,术语“非极性脂质”是指可溶于有机溶剂但不溶于水的脂肪酸及其衍生物。脂肪酸可以为游离脂肪酸和/或为酯化形式。非极性脂质的酯化形式的实例包括但不限于三酰甘油(TAG)、二酰甘油(DAG)、单酰甘油(MAG)。非极性脂质还包括固醇、固醇酯和蜡酯。非极性脂质也称为“中性脂质”。非极性脂质在室温下通常为液体。优选地,非极性脂质主要(>50%)包含长度为至少16个碳的脂肪酸。更优选地,非极性脂质中总脂肪酸的至少50%为C18脂肪酸,例如油酸。在一实施方案中,非极性脂质中总脂肪酸的至少5%为C12或C14脂肪酸,或者两者。在一实施方案中,本发明的非极性脂质中脂肪酸的至少50%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、更优选至少91%、更优选至少92%、更优选至少93%、更优选至少94%、更优选至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少
98%、更优选至少99%可作为TAG存在。非极性脂质可以例如通过用强碱水解以释放游离脂肪酸或通过分馏、蒸馏等方法进一步纯化或处理。非极性脂质可存在于或得自植物部分如种子、叶、块茎、根或果实。本发明的非极性脂质如果得自种子则可形成“种子油”的一部分。
[1004] 提取的脂质中的游离和酯化固醇(例如,谷固醇、菜油固醇、豆固醇、芸苔固醇、D5-燕麦固醇(D5-avenasterol)、谷甾烷醇(sitostanol)、菜油甾烷醇(campestanol)和胆固醇)浓度可如Phillips等,2002中所述。植物油中的固醇存在为:游离醇、与脂肪酸的酯(酯化的固醇)、固醇的糖苷和酰化的糖苷。天然存在的植物油(种子油)中的固醇浓度范围在高达最大约1100mg/100g。氢化的棕榈油具有天然存在的植物油的最低浓度之一,约60mg/100g。本发明的回收或提取的种子油优选具有约100至约1000mg的总固醇/100g的油。对于作为食品或饲料的用途,优选固醇主要作为游离或酯化的形式存在而不是糖基化的形式。
在本发明的种子油中,优选油中至少50%的固醇作为酯化的固醇存在,除了大豆种子油外(其有约25%的固醇被酯化)。本发明的油菜油和油菜籽(rapeseed)油优选具有约500至约
800mg的总固醇/100g,其中谷固醇为主要固醇而菜油固醇其次。本发明的玉米种子油优选具有约600至约800mg的总固醇/100g,其中谷固醇为主要固醇。本发明的大豆种子油优选具有约150至约350mg的总固醇/100g,其中谷固醇为主要固醇而豆固醇其次,并且具有比酯化的固醇多的游离固醇。本发明的棉花种子油优选具有约200至约350mg的总固醇/100g,其中谷固醇为主要固醇。本发明的椰子油和棕榈油优选具有约50至约100mg的总固醇/100g,其中谷固醇为主要固醇。本发明的红花种子油优选具有约150至约250mg的总固醇/100g,其中谷固醇为主要固醇。本发明的花生种子油优选具有约100至约200mg的总固醇/100g,其中谷固醇为主要固醇。本发明的芝麻种子油优选具有约400至约600mg的总固醇/100g,其中谷固醇为主要固醇。本发明的向日葵种子油优选具有约200至400mg的总固醇/100g,其中谷固醇为主要固醇。得自本发明的营养性植物部分的油优选具有低于200mg的总固醇/100g,更优选低于100mg的总固醇/100g,以及最优选低于50mg的总固醇/100g,其中固醇的大部分为游离固醇。
[1005] 如本文所用,术语“营养性油”是指从包含至少60%(w/w)脂质的植物的营养性部分获得的或者在营养性油仍存在于营养性部分中时可从营养性部分获得的组合物。也就是说,本发明的营养性油包括存在于营养性部分中的油,以及已从营养性部分中提取出来的油(提取的油)。营养性油优选为提取的营养性油。营养性油在室温下通常为液体。优选地,营养性油中的总脂肪酸(TFA)含量主要(>50%)包含长度为至少16个碳的脂肪酸。更优选地,营养性油中的总脂肪酸的至少50%为C18脂肪酸,例如油酸。脂肪酸通常为酯化形式,例如TAG、DAG、酰基-CoA、半乳糖脂或磷脂。脂肪酸可以为游离脂肪酸和/或为酯化形式。在一实施方案中,本发明的营养性油中脂肪酸的至少50%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、更优选至少91%、更优选至少92%、更优选至少93%、更优选至少94%、更优选至少95%、更优选至少96%、更优选至少97%、更优选至少98%、更优选至少99%可作为TAG存在。在一实施方案中,本发明的营养性油是已从在营养性植物部分中或粗提取物中与其相关的一种或多种其他脂质、核酸、多肽或其他污染分子分离的“基本上纯化的”或“纯化的”油。优选的是,基本上纯化的营养性油至少60%、更优选至少75%、更优选至少90%不含在营养性植物部分或提取物中与其相关的其他组分。本发明的营养性油可进一步包含非脂肪酸分子,例如但不限于固醇。在一实施方案中,所述营养性油是油菜油(芸苔属如Brassica carinata、Brassica juncea、Brassica napobrassica、欧洲油菜)、芥子油(芥菜(Brassica juncea)),其它芸苔油(例如,Brassica napobrassica,Brassica camelina),向日葵油(向日葵属如向日葵),亚麻油(亚麻),大豆油(大豆),红花油(红花),玉米油(玉米),烟草油(烟草属如红花烟草或本氏烟草),花生油(花生),棕榈油(油棕),棉花油(陆地棉),椰子油(椰子),鳄梨油(鳄梨(Persea americana)),橄榄油(橄榄(Olea europaea)),腰果油(腰果(Anacardium occidentale)),澳大利亚坚果油(澳大利亚坚果(Macadamia intergrifolia)),杏仁油(杏仁(Prunus amygdalus)),燕麦油(燕麦),米油(稻属如水稻和光稃稻),拟南芥油(拟南芥),花生(Aracinis  hypogaea),甜菜,亚麻荠,海甘蓝(Abyssinian kale),甜瓜,大麦,麻风树(physic nut),Joannesia princeps(arara nut-tree),奥蒂树(oiticica),羽扇豆,芒属如异源三倍体芒草奇岗和中国芒,柳枝稷(Panicum virgatum,柳枝稷(switchgrass)),水黄皮(印度山毛榉),毛果杨,蓖麻,蔗类(甘蔗),芝麻,马铃薯,高粱属如两色高粱、高粱,大花可可,三叶草属和小麦属如小麦。营养性油可通过本领域已知的任何方法(例如提取种子油的方法)从营养性植物部分中提取。这通常涉及使用通常与种子的第一次破碎相关的非极性溶剂诸如乙醚、石油醚、氯仿/甲醇或丁醇混合物进行提取。与淀粉或其他多糖相关的脂质可使用水饱和的丁醇提取。种子油可以通过本领域已知的方法“脱胶”以除去极性脂质(例如磷脂),或者以其他方式处理以除去污染物或者改善纯度、稳定性或色泽。可以将营养性油中的TAG和其他酯水解以释放游离脂肪酸,或者如本领域所已知将油氢化、化学处理或酶法处理。如本文所用,术语“种子油”具有相近的含义,除了它是指从本发明的植物的种子中获得脂质组合物。
[1006] 如本文所用,术语“脂肪酸”是指饱和或不饱和的具有长度为至少8个碳原子的长脂族尾部的羧酸。优选的脂肪酸具有长度为至少12个碳的碳-碳键合链。大多数天然存在的脂肪酸具有偶数个碳原子,因为它们的生物合成涉及具有两个碳原子的乙酸酯。脂肪酸可以为游离状态(非酯化)或酯化形式,例如TAG、DAG、MAG、酰基-CoA(硫代酯)键合、酰基-ACP键合或其他共价键合形式的一部分。当以酯化形式共价键合时,脂肪酸在本文中称作“酰基”基团。脂肪酸可以酯化为磷脂,例如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)或双磷脂酰甘油。饱和脂肪酸沿着链不含任何双键或其他官能团。术语“饱和”是指氢,因为所有的碳(除了羧酸[-COOH]基团)都包含尽可能多的氢。换句话说,omega(ω)端包含3个氢(CH3-),并且链内的每个碳包含2个氢(-CH2-)。不饱和脂肪酸具有与饱和脂肪酸相似的形式,不同的是一个或多个烯烃官能团沿着链存在,而每个烯烃用双键的"-CH=CH-"部分(即,以双键键合到另一个碳的碳)取代链的单键"-CH2-CH2-"部分。结合到双键任一侧的链中的两个紧邻碳原子可以按顺式或反式构型存在。
[1007] 如本文所用,术语“单不饱和脂肪酸”或“MUFA”是指包含其碳链中的至少12个碳原子以及仅一个烯烃基团(碳-碳双键)的脂肪酸,其可以是酯化或非酯化(游离)的形式。如本文所用,术语“多不饱和脂肪酸”或"PUFA"是指包含其碳链中的至少12个碳原子以及至少两个烯烃基团(碳-碳双键)的脂肪酸,其可以是酯化或非酯化(游离)的形式。
[1008] “单酰基甘油酯”或“MAG”是其中甘油被一个脂肪酸酯化的甘油酯。如本文所用,MAG包含位于sn-1/3(本文中也称为sn-1 MAG或1-MAG或1/3-MAG)或sn-2位(本文中也称为2-MAG)的羟基,因此MAG不包括磷酸化的分子如PA或PC。MAG因此是植物或其部分中的中性脂质的组分。
[1009] “二酰基甘油酯”或“DAG”是其中甘油被两个脂肪酸酯化的甘油酯,所述两个脂肪酸可以是相同的、或优选不同的。如本文所用,DAG包含位于sn-1,3或sn-2位的羟基,因此DAG不包括磷酸化的分子如PA或PC。DAG因此是植物或其部分中的中性脂质的组分。在DAG合成的Kennedy途径中(图1),前体sn-甘油-3-磷酸(G3P)在sn-1位通过甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)催化的第一反应中酯化到两个酰基(每个来自脂肪酸辅酶A酯)形成LysoPA,然后在通过溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)催化的sn-2位的第二酰化形成磷脂酸(PA)。这个中间体然后通过PAP去磷酰化形成DAG。DAG还可通过脂肪酶移除酰基由TAG形成,或者通过PDCT、PLC或PLD中的任一种酶移除胆碱头基而基本上由PC形成(图1)。
[1010] “三酰基甘油酯”或“TAG”是其中甘油被三个脂肪酸酯化的甘油酯,所述三个脂肪酸可以是相同的(如甘油三油酸酯(tri-olein)中)、或者更常见的是不同的。在TAG合成的Kennedy途径中,DAG如上文所述形成,然后通过DGAT的活性将第三酰基酯化到甘油骨架。形成TAG的可选途径包括酶PDAT催化的途径(图1)和本文所述的MGAT途径。
[1011] 如本文所用,术语“野生型”或其变化是指细胞、植物或其部分如细胞、营养性植物部分、种子、块茎或根,根据本发明,其尚未被遗传修饰,如不包含所述第一和第二外源多核苷酸的细胞、植物或其部分。
[1012] 术语“相应”是指细胞、植物或其部分(如细胞、营养性植物部分、种子、块茎或根),其具有与本发明的细胞、植物或其部分(如营养性植物部分、种子、块茎或根)相同或相似的遗传背景,但是尚未如本文所述进行修饰(例如,缺少所述第一和第二外源多核苷酸的营养性植物部分或种子)。在一优选实施方案中,相应的植物或其部分例如营养性植物部分处于与本发明的植物或其部分例如营养性植物部分相同的发育阶段。例如,如果所述植物是开花植物,则优选相应的植物也正在开花。相应的细胞、植物或其部分例如营养性植物部分可以用作对照以与如本文所述修饰的细胞、植物或其部分例如营养性植物部分比较核酸或蛋白表达水平,或者性状修饰的程度和性质,例如TTQ和/或TAG含量。本领域技术人员能够很容易地确定适当的“相应的”细胞、植物或其部分例如营养性植物部分用于这样的比较。
[1013] 如本文所用,“与……比较”或“相对于”是指表达一种或多种外源多核苷酸、遗传修饰或外源多肽的细胞、植物或其部分与缺少一种或多种外源多核苷酸、遗传修饰或外源多肽的细胞、植物或其部分例如营养性植物部分的例如TTQ或三酰甘油(TAG)含量、一种或多种或全部可溶性蛋白含量、氮含量、碳:氮比、光合基因表达、光合能力、总膳食纤维(TDF)、碳含量以及能量含量或非极性脂质含量或组成、总非极性脂质含量、总脂肪酸含量或其他参数的比较水平。
[1014] 如本文所用,“协同作用”、“协同的”、“协同地作用”和相关术语每个都是比较术语,其表示本发明的细胞、植物或其部分中的存在的元件的组合,例如元件A和B的组合的效果大于元件单独在相应植物或其部分中的效果的总和,例如A的效果和B的效果的总和。当两个以上的元件存在于植物或其部分中时,例如元件A、B和C,其表示所有元件的组合的效果大于元件的单独效果的效果总和。在一优选实施方案中,其表示元件A、B和C的组合的效果大于合并的元件A和B的效果以及元件C的效果的总和。在这样的情况下,可以说元件C与元件A和B协同作用。如会理解的,在例如于相同条件下生长和处于生物发育的相同阶段的相应的细胞、植物或其部分中测量效果。
[1015] 如本文所用,“以与相应的野生型植物基本上相同的速度发芽”或相似短语是指当与缺少定义的外源多核苷酸和遗传修饰的野生型植物的种子相比时,本发明的植物的种子相对地能够发芽。发芽可以体外在组织培养基上测量,或者可以在土壤中当田中出现时测量。在一实施方案中,例如在植物物种的最佳温室条件下生长时,发芽的种子数量在与相应的野生型种子相比时是至少75%,更优选至少90%。在另一实施方案中,例如在植物物种的最佳温室条件下生长时,当与相应的野生型种子相比时,发芽、产生以一定速度生长的幼苗的种子是至少75%,更优选至少90%。这称作“幼苗活力”。在一实施方案中,本发明的幼苗的初始根生长和新梢生长的速度与在相同条件下生长的相应的野生型幼苗相比基本上相同。在一实施方案中,相对于在相同条件下,优选在田中生长的相应的野生型植物,本发明的植物的叶生物质(干重)是至少80%,优选至少90%的叶生物质。在一实施方案中,相对于在相同条件下,优选在田中生长且优选成熟的相应的野生型植物,本发明的植物的高度是至少70%,优选至少80%,更优选至少90%的植物高度。
[1016] 如本文所用,术语“下调内源多肽的生成和/或活性的外源多核苷酸”或其变化是指编码下调生成和/或活性的RNA分子,本文的术语“沉默RNA分子”或其变体(例如,编码amiRNA或hpRNAi)的多核苷酸,或者其本身下调内源多肽的生成和/或活性(例如,是可以直接递送至例如所述植物或其部分的amiRNA或hpRNA)。这包括在细胞中处理通过表达外源多核苷酸产生的初始RNA转录物以形成实际沉默RNA分子的情况。生成或活性下调的内源多肽包括例如SDP1 TAG脂肪酶、质体GPAT、质体LPAAT、TGD多肽(例如TGD5)、TST(例如TST1或TST2)、AGPase、PDCT、CPT或△12脂肪酸去饱和酶(FAD2)或者它们中的两种或更多种的组合。通常,所述RNA分子减少编码多肽的内源基因的表达。下调的程度通常小于100%,例如相对于野生型,生成或活性降低25%至95%。可以常规地确定剩余生成或活动的最佳水平。
[1017] 如本文所用,术语“在重量基础上”是指作为包含物质的组合物(例如,种子、叶干重)的重量百分比的物质(例如,TAG、DAG、脂肪酸、蛋白、氮、碳)的重量。例如,如果转基因种子具有25μg总脂肪酸每120μg种子重量;则总脂肪酸的百分比在重量基础上为20.8%。
[1018] 如本文所用,术语“在相对基础上”是指参数如包含物质的组合物中物质的量与相应组合物的参数比较,为百分比。例如,从3单位减少至2单位是在相对基础上减少33%。
[1019] 如本文所用,“质体”是植物(包括藻类)中的细胞器,其是从光合作用制造包括糖、淀粉和脂肪酸在内的碳基化合物的地点。质体包括含有叶绿素并进行光合作用的叶绿体,是叶绿体的前身的黄化质体,以及特化的质体如用于色素的合成和储存的有色质体,在衰老期间控制光合作用装置的拆除的老质体(gerontoplast),用于淀粉合成和储存的造粉体,用于脂质的储存的油质体,用于储存和修饰蛋白的蛋白质体。
[1020] 如本文所用,术语“生物燃料”是指任何类型的燃料,通常用于动力机械如汽车、飞机、船、卡车或石油动力的发动机,其能量从生物碳固定递送。生物燃料包括源自生物质转化的燃料,以及固体生物质,液体燃料生物气。生物燃料的实例包括生物醇、生物柴油、合成柴油、植物油、生物醚(bioether)、生物气、合成气、固体生物燃料、藻类衍生燃料、生物氢气,生物甲醇、2,5-二甲基呋喃(DMF)、生物二甲基醚(bioDME)、Fischer-Tropsch柴油、生物氢气柴油、混合醇和木柴油(wood diesel)。
[1021] 如本文所用,术语“生物醇”是指生物学产生的醇类,例如,乙醇、丙醇和丁醇。生物醇由微生物和/或酶通过糖、半纤维素或纤维素的发酵的作用产生。
[1022] 如本文所用,术语“生物柴油”是指包含脂肪酸甲基-或乙基-酯(通过酯交换衍生自脂质)的组合物。
[1023] 如本文所用,术语“合成柴油”是指衍生自可再生原料而不是大多数柴油燃料中使用的化石原料的柴油燃料形式。
[1024] 如本文所用,术语“植物油”包括纯的植物的油(或者无添加(straight)的植物油)或者废物植物油(其它产业的副产品),包括营养性植物部分或种子中产生的油。植物油包括如本文所定义的营养性油和种子油。
[1025] 如本文所用,术语“生物气”是指通过厌氧生物对有机材料厌氧消化而产生的甲烷或者甲烷与其它气体的可燃混合物。
[1026] 如本文所用,术语“合成气”是指含有变化量的一氧化碳和氢气以及可能的其它烃的气体混合物,其由生物质的部分燃烧所产生。合成气可以在催化剂(通常是基的)的存在下转化为甲醇,随后在不同催化剂(例如,硅-)的存在下甲醇脱水。
[1027] 如本文所用,术语“生物炭”是指从生物质制备的炭,例如,通过生物质的热解。
[1028] 如本文所用,术语“原料”是指当用于产生产品(例如,生物燃料如生物柴油或合成柴油)时所用的材料,例如,生物质或其转化产物(例如,合成气)。
[1029] 如本文所用,术语“工业产品”是指主要由碳和氢组成的烃产品,如例如脂肪酸甲基-和/或乙基-酯或者烷烃如甲烷,较长链的烷烃(在室温通常为液态)的混合物,生物燃料,一氧化碳和/或氢气,或者生物醇如乙醇、丙醇或丁醇,或者生物炭。术语“工业产品”意图包括可以转化为其他工业产品的中间产品,例如,合成气本身被认为是工业产品,其可以用于合成也被认为是工业产品的烃产品。如本文所用,术语工业产品包括上述化合物的纯的形式,或者更常见地是各种化合物和组分的混合物,例如烃产品可以含有一定范围的碳链长度,这是本领域熟知的。
[1030] 如本文所用,“子代”表示产生自亲代的后代的中间和所有随后的世代,例如第二、第三或后来的世代后代。
[1031] 如本文所用,术语“祖先”是指包含第一和第二外源多核苷酸的任何早期代植物。祖先可以是亲本植物、祖父母植物、曾祖父母植物等。
[1032] 如本文所用,术语“选择植物”是指基于其具有所需表型,例如与相应的野生型植物相比增加的TTQ、增加的TAG和蛋白质含量,主动选择植物。
[1033] 如本文所用,短语例如“包含约5%(w/w干重)的TFA含量”或“包含约6%(w/w干重)的总TAG含量”或类似的结构化短语,意味着可能存在超过定义的水平。例如,短语“包含约5%(w/w干重)的TFA含量”可与“包含至少约5%TFA(w/w干重)”互换使用。进一步扩展该实施例,包含约5%(w/w干重)的TFA含量的营养植物部分可具有6%、或7.5%或更高的TFA含量。
[1034] 如本文所用,除非上下文另有说明,否则当用于提及多肽时,术语“增加的含量”,或包括对特定多肽的参考的类似的短语,是指外源多肽或内源多肽。例如,各自相对于相应的野生型营养植物部分,本发明的营养植物部分可包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和降低的SDP1多肽含量,其中WRI1和DGAT多肽中的每一个独立地是外源多肽或内源多肽。作为另一个实例,各自相对于相应的野生型营养植物部分,本发明的营养植物部分可包含增加的WRI1多肽含量、增加的DGAT多肽含量和增加的LEC2多肽含量,其中WRI1、DGAT和LEC2多肽中的每一个独立地是外源多肽或内源多肽。作为另一个实例,各自相对于相应的野生型营养体,本发明的营养植物部分可包含增加的PDAT或DGAT多肽含量、降低的TGD多肽含量和降低的SDP1多肽含量,其中PDAT或DGAT是外源多肽或内源多肽,等等。外源多肽可以是在本发明的细胞或植物或其部分中表达编码多肽的转基因的结果。内源多肽可以是内源基因表达增加的结果,例如诱导过表达和/或为基因提供增加水平的转录因子。
[1035] 在整个说明书中,单词包含“(comprise)”或者变化形式如“包含(comprises)”或“comprising”会理解为简单地包括所述元素、整数或步骤,或者元素、整数或步骤的组,但是不排除任何其他元素、整数或步骤,或者元素、整数或步骤的组。
[1036] 术语“和/或”,例如“X和/或Y”应当理解为表示“X和Y”或者“X或Y”,并且应当用来提供对两种含义或任一种含义的明确支持。
[1037] 如本文所用,除非另有相反的说明,术语约指指定值的+/-10%、更优选+/-5%、更优选+/-2%、更优选+/-1%、更优选+/-0.5%。
[1038] 具有修饰的性状的植物的产生
[1039] 本发明是基于这样的发现,植物或其部分中的植物性状、例如两种或多种非极性脂质含量、蛋白含量、TTQ、TAG含量、氮含量、碳含量可以通过选自本文中命名如下的那些的修饰的组合增加:(A).推,(B).拉,(C).保护,(D).包装,(E).质体输出,(F).质体输入和(G).原核途径。
[1040] 因此本发明的植物或其部分例如营养性植物部分具有外源多核苷酸和/或遗传修饰的许多组合,每个提供修饰之一。这些外源多核苷酸和/或遗传修饰包括:
[1041] (A)外源多核苷酸,其编码增加植物或其部分例如营养性植物部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽,提供“推”修饰,
[1042] (B)外源多核苷酸,其编码参与植物或其部分例如营养性植物部分中的一种或多种非极性脂质生物合成的多肽,提供“拉”修饰,
[1043] (C)遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分例如营养性植物部分相比时,其下调参与植物或其部分例如营养性植物部分中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽的内源生成和/或活性,提供“保护”修饰,
[1044] (D)外源多核苷酸,其编码油体包衣(OBC)多肽,例如脂滴相关多肽(LDAP)提供“包装”修饰,
[1045] (E)外源多核苷酸,其编码当与缺少所述外源多核苷酸的相应植物或其部分例如营养性植物部分相比时,增加脂肪酸输出植物或其部分例如营养性植物部分的质体的多肽,提供“质体输出”修饰,
[1046] (F)遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分例如营养性植物部分相比时,其下调参与将脂肪酸输入植物或其部分例如营养性植物部分的质体的多肽的内源生成和/或活性,提供“质体输入”修饰,以及
[1047] G)遗传修饰,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分例如营养性植物部分相比时,其下调参与植物或其部分例如营养性植物部分的质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性,提供“原核途径”修饰。
[1048] 本发明的外源多核苷酸和/或遗传修饰的优选组合(在本文中也称作组)是;
[1049] 1)A、B以及任选存在的C、D、E、F或G之一;
[1050] 2)A、C以及任选存在的D、E、F或G之一;
[1051] 3)A、D以及任选存在的E、F或G之一;
[1052] 4)A、E以及任选存在的F或G;
[1053] 5)A、F和任选存在的G;
[1054] 6)A和G;
[1055] 7)A、B、C以及任选存在的D、E、F或G之一;
[1056] 8)A、B、D以及任选存在的E、F或G之一;
[1057] 9)A、B、E以及任选存在的F或G;
[1058] 10)A、B、F和任选存在的G;
[1059] 11)A、B、C、D以及任选存在的E、F或G之一;
[1060] 12)A、B、C、E以及任选存在的F或G;
[1061] 13)A、B、C、F和任选存在的G;
[1062] 14)A、B、D、E以及任选存在的F或G;
[1063] 15)A、B、D、F和任选存在的G;
[1064] 16)A、B、E、F和任选存在的G;
[1065] 17)A、C、D以及任选存在的E、F或G之一;
[1066] 18)A、C、E以及任选存在的F或G;
[1067] 19)A、C、F和任选存在的G;
[1068] 20)A、C、D、E以及任选存在的F或G;
[1069] 21)A、C、D、F和任选存在的G;
[1070] 22)A、C、E、F和任选存在的第五修饰G;
[1071] 23)A、D、E以及任选存在的F或G;
[1072] 24)A、D、F和任选存在的G;
[1073] 25)A、D、E、F和任选存在的G;
[1074] 26)A、E、F和任选存在的G;
[1075] 27)A、B、C、D、E、F和G中的6个,省略A、B、C、D、E、F或G之一,以及[1076] 28)上述1-26中的任一种,其中有两种或更多种外源多核苷酸,其编码增加植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的两种或更多种不同的转录因子多肽,例如编码WRI1的一种外源多核苷酸和编码LEC2的另一种外源多核苷酸。
[1077] 在每个上述优选组合中,可以有至少两种不同的外源多核苷酸,其编码增加植物或其部分例如营养性植物部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的至少两种不同的转录因子多肽。
[1078] 这些修饰更全面地描述如下:
[1079] A“.推”修饰的特征在于植物或其部分的质体中的总脂肪酸合成增加。在一实施方案中,这通过调节质体中的脂肪酸合成的转录因子的表达和/或活性增加而发生。在一实施方案中,这可以通过在转基因植物或其部分中表达外源多核苷酸来实现,所述外源多核苷酸编码增加植物或其部分中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽。在一实施方案中,增加的脂肪酸合成不是由向植物或其部分提供改变的ACCase所引起的,相对于植物或其部分中的内源ACCase,所述改变的ACCase的活性较少受到脂肪酸抑制。在一实施方案中,所述植物或其部分包含编码转录因子的外源多核苷酸,所述转录因子优选在除组成型启动子以外的启动子的控制下。转录因子可以选自由WRI1、LEC1、LEC1样、LEC2、BBM、FUS3、ABI3、ABI4、ABI5、Dof4、Dof11组成的组,或者由MYB73、bZIP53、AGL15、MYB115、MYB118、TANMEI、WUS、GFR2a1、GFR2a2和PHR1组成的组,并且优选WRI1、LEC1或LEC2。在另一实施方案中,增加的总脂肪酸合成是相对于相应的野生型植物或其部分。在一实施方案中,有编码两种或更多种不同的转录因子多肽的两种或更多种外源多核苷酸。所述“推”修饰也可以通过增加调节WRI1活性的多肽(例如MED15或14-3-3多肽)的表达来实现。
[1080] B“. 拉”修饰的特征在于植物或其部分中的催化植物或其部分中的TAG、DAG或MAG合成的脂肪酰基酰基转移酶的表达和/或活性增加,如DGAT、PDAT、LPAAT、GPAT或MGAT,优选DGAT或PDAT。在一实施方案中,这可以通过在转基因植物或其部分中表达外源多核苷酸来实现,所述外源多核苷酸编码参与一种或多种非极性脂质的生物合成的多肽。在一实施方案中,酰基转移酶是膜结合的酰基转移酶,在DGAT、LPAAT、GPAT或MGAT的情况下其使用酰基-CoA底物作为酰基供体,或者在PDAT的情况下其使用来自PC的酰基作为酰基供体。拉修饰可以是相对于相应的野生型植物或其部分,或者优选地,相对于具有推修饰的相应植物或其部分。在一实施方案中,所述植物或其部分包含编码脂肪酰基酰基转移酶的外源多核苷酸。所述“拉”修饰也可以通过增加PDCT、CPT或磷脂酶C或D多肽的表达来实现,这增加了PC中DAG的产生。
[1081] C“. 保护”修饰的特征在于植物或其部分中的三酰甘油(TAG)的分解代谢减少。在一实施方案中,这可以通过植物或其部分中的遗传修饰实现,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分相比时,所述遗传修饰下调参与植物或其部分中的三酰甘油(TAG)分解代谢的多肽的内源生成和/或活性。在实施方案中,所述植物或其部分具有减少的植物或其部分中的内源TAG脂肪酶表达和/或活性,优选SDP1脂肪酶,Cgi58多肽,酰基-CoA氧化酶如ACX1或ACX2,或者参与植物或其部分中脂肪酸的β-氧化的多肽如PXA1过氧化物酶体ATP-结合盒转运蛋白。这可以通过在植物或其部分中表达编码RNA分子的外源多核苷酸而发生,所述RNA分子减少例如编码TAG脂肪酶如SDP1脂肪酶、酰基CoA氧化酶或参与植物或其部分中脂肪酸的β-氧化的多肽的内源基因的表达,或者通过编码例如TAG脂肪酶、酰基-CoA氧化酶或参与脂肪酸的β-氧化的多肽的内源基因中的突变而发生。在一实施方案中,减少的表达和/或活性是相对于相应的野生型植物或其部分或者相对于具有推修饰的相应植物或其部分。
[1082] D“.包装”修饰的特征在于油体包衣(OBC)多肽的表达和/或积累增加。在一实施方案中,这可以通过在转基因植物或其部分中表达编码油体包衣(OBC)多肽的外源多核苷酸来实现。OBC多肽可以是油质蛋白,例如聚油质蛋白、油体钙蛋白或油体固醇蛋白,或者优选LDAP。在一实施方案中,所述真核植物或其部分中积累的油质蛋白的水平相对于包含来自pJP3502的T-DNA的油质蛋白基因的相应植物或其部分高至少2-倍。在一实施方案中,增加的OBC多肽的表达或积累不是仅由推修饰引起的。在一实施方案中,表达和/或积累是相对于相应的野生型植物或其部分,或者优选地,相对于具有推修饰的相应植物或其部分。
[1083] E“. 质体输出”修饰的特征在于真核植物或其部分的质体的总脂肪酸输出速度增加。在一实施方案中,这可以通过在转基因植物或其部分中表达外源多核苷酸来实现,所述外源多核苷酸编码这样的多肽,当与缺少所述外源多核苷酸的相应植物或其部分相比时,所述多肽增加脂肪酸输出植物或其部分的质体。在一实施方案中,这通过脂肪酸硫酯酶(TE)、脂肪酸转运蛋白多肽如ABCA9多肽、或者长链酰基-CoA合成酶(LACS)的表达和/或活性增加而发生。在一实施方案中,所述植物或其部分包含编码TE、脂肪酸转运蛋白多肽或LACS的外源多核苷酸。TE可以是FATB多肽或优选FATA多肽。在一实施方案中,质体输出修饰是相对于相应的野生型植物或其部分,或者优选地,相对于具有推修饰的相应植物或其部分。
[1084] F“. 质体输入”修饰的特征在于脂肪酸从质体外输入植物或其部分的质体的速度减少。在一实施方案中,这可以通过植物或其部分中的遗传修饰实现,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分相比时,所述遗传修饰下调参与将脂肪酸输入植物或其部分的质体的多肽的内源生成和/或活性。例如,这可以通过在植物或其部分中表达编码RNA分子的外源多核苷酸而发生,所述RNA分子减少编码转运蛋白多肽如TGD多肽(例如TGD1、TGD2、TGD3、TGD4或优选TGD5多肽)的内源基因的表达,或者通过编码TGD多肽的内源基因中的突变而发生。在一实施方案中,减少的输入速度是相对于相应的野生型植物或其部分或者相对于具有推修饰的相应植物或其部分。
[1085] G“. 原核途径”修饰的特征在于植物或其部分的质体中的DAG量或DAG生成速度减少。在一实施方案中,这可以通过植物或其部分中的遗传修饰实现,当与缺少所述遗传修饰的相应植物或其部分相比时,所述遗传修饰下调参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的内源生成和/或活性。在一实施方案中,减少的DAG生成量或速度通过质体中从酰基-ACP和G3P生成LPA减少而发生。减少的DAG生成量或速度可以通过在植物或其部分中表达编码RNA分子的外源多核苷酸而发生,所述RNA分子减少编码质体GPAT、质体LPAAT或质体PAP(优选质体GPAT)的内源基因的表达,或者同编码质体多肽的内源基因中的突变而发生。在一实施方案中,减少的DAG生成量或速度是相对于相应的野生型植物或其部分,或者优选地,相对于具有推修饰的相应植物或其部分。
[1086] 推修饰对于本发明是高度期望的,而拉修饰是优选的。保护和包装修饰可以是互补的,即两个之一可以是足够的。所述植物或其部分可以包含质体输出、质体输入和原核途径修饰中的一个、两个或全部三个。在一实施方案中,所述植物或其部分中的至少一个外源多核苷酸,优选至少编码调节质体中的脂肪酸合成的转录因子的外源多核苷酸在(H)除组成型启动子以外的启动子的控制下表达,例如,发育相关启动子,优先在光合作用细胞中活化的启动子,组织特异性启动子,已通过相对于相应的天然启动子减少其表达水平来修饰的启动子,或者优选衰老特异性启动子。更优选地,至少编码调节质体中的脂肪酸合成的转录因子的外源多核苷酸在除组成型启动子以外的启动子的控制下表达,并且编码下调参与三酰甘油分解代谢的多肽的内源生成和/或活性的RNA分子的外源多核苷酸也在除组成型启动子以外的启动子的控制下表达,所述启动子可以相同或不同。可选地,在单子叶植物中,编码调节质体中脂肪酸合成的转录因子的外源多核苷酸在组成型启动子(例如泛素基因启动子或肌动蛋白基因启动子)的控制下表达。
[1087] 植物通过所谓的原核途径在质体中产生它们的一些但不是全部膜脂质如MGDG(图1)。在植物中,还有用于半乳糖脂和甘油脂合成的真核途径,其首先在质体中合成FA,然后在ER中将FA组装为甘油脂。通过真核途径合成的MGDG包含在MGDG的sn-2位置酯化的C18:3(ALA)脂肪酸。包括ALA用于通过这个途径的MGDG合成的DAG骨架在ER中组装,然后输入质体。相比之下,通过原核途径合成的MGDG包含在MGDG的sn-2位置酯化的C16:3脂肪酸。在产生MGDG(16:3)对MGDG(18:3)中原核途径相对于真核途径的分布的比例是不同植物物种的特征和区别性特性(Mongrand et al.1998)。MGDG的这种区别性脂肪酸组成允许将所有高等植物(被子植物)分类为所谓的16:3或18:3植物。通过拟南芥(Arabidopsis)和欧洲油菜示例的16:3物种一般具有MGDG合成操作的原核和真核途径,而通过两色高粱、玉米、红花烟草、豌豆和大豆示例的18:3物种一般仅(或几乎全部)具有MGDG合成的真核途径,在营养性组织中提供很少或没有C16:3脂肪酸积累。如本文所用,“16:3植物”或“16:3物种”是在其光合作用组织的总脂肪酸含量中具有超过2%C16:3脂肪酸的植物。如本文所用,“18:3植物”或“18:3物种”是在其光合作用组织的总脂肪酸含量中具有少于2%C16:3脂肪酸的植物。如本文所述,通过合适的遗传修饰可以将植物从16:3植物转化为18:3植物。原核和真核途径之间的流量比例在不同植物物种或组织中不是保守的。在16:3物种中,叶中多达40%的流量通过真核途径发生(Browse et al.,1986),而在18:3物种中,如豌豆和大豆,将质体中合成的约90%的FA输出质体至ER以供应FA的来源用于真核途径(Ohlrogge and Browse,
1995;Somerville et al.,2000)。
[1088] 因此在不同植物物种的糖脂内发现了不同量的18:3和16:3脂肪酸。这用来区分其具有3个双键的脂肪酸几乎全部是C18脂肪酸的18:3植物与包含具有3个双键的C16-和C18-脂肪酸的16:3植物。在18:3植物的叶绿体中,催化磷脂酸转化为二酰甘油和二酰甘油转化为单半乳糖基二酰甘油(MGD)的酶促活性明显比16:3叶绿体中更不活跃。在18:3植物的叶中,叶绿体在基质中合成硬脂酰基-ACP2,将第一双键引入饱和烃链,然后通过硫酯酶水解硫酯(图1)。释放的油酸通过叶绿体被膜输出进入细胞的膜,可能是内质网,在这里将其并入PC。PC连接的油酰基在这些膜中去饱和,随后回到叶绿体。MGD连接的酰基是用于引入第三双键的底物,以便获得具有两个亚麻酰基残基的MGD。这种半乳糖脂是18:3植物如菊科和豆科的特征。在例如伞形科和十字花科成员代表的16:3植物的光合作用活性细胞中,两种途径平行操作以提供具有MGD的类囊体。
[1089] 在一实施方案中,本发明的植物或其部分例如营养性植物部分产生比缺少遗传修饰或外源多核苷酸的相应的植物或其部分例如营养性植物部分高水平的非极性脂质如TAG,或者总脂肪酸(TFA)含量,优选两者。在一实例中,当与相应的种子、叶、表面积至少2
1cm 的叶部分、茎或块茎相比时,本发明的植物产生具有增加的非极性脂质含量如TAG或TFA含量(优选两种)的种子,叶,或者具有表面积至少1cm2的叶部分,茎和/或块茎。
[1090] 在另一实施方案中,植物或其部分优选营养性植物部分,产生富集一种或多种特定脂肪酸的TAG。可以将广谱的脂肪酸并入TAG,包括饱和和不饱和脂肪酸以及短链和长链脂肪酸。可以并入TAG并且可以水平升高的脂肪酸的一些非限制性实例包括:羊蜡酸(10:0)、月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕榈酸(16:0)、棕榈油酸(16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、异油酸(18:1)、亚油酸(18:2)、桐油酸(18:3)、γ-亚麻酸(18:3)、α-亚麻酸(18:3ω
3)、十八碳四烯酸(18:4ω3)、花生酸(20:0)、二十碳二烯酸(20:2)、二高-γ-亚油酸(20:
3)、二十碳三烯酸(20:3)、花生四烯酸(20:4)、二十碳四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5ω
3)、二十二烷酸(22:0)、二十二碳五烯酸(22:5ω)、二十二碳六烯酸(22:6ω3)、二十四烷酸(24:0)、神经酸(24:1)、蜡酸(26:0)和褐煤酸(28:0)脂肪酸。在本发明的一实施方案中,营养性植物部分、真核细胞、种子或者转基因生物体或其部分(如块茎或根)富集包含油酸的TAG,和/或亚麻酸(ALA)减少,优选在绝对基础上至少2%或至少5%。
[1091] 优选地,用一种或多种外源多核苷酸(例如嵌合DNA)转化本发明的植物或其部分例如营养性植物部分。在多种嵌合DNA的情况下,优选将这些共价连接在一个DNA分子如单个T-DNA分子上,并且优选整合在宿主细胞基因组(优选宿主核基因组)的单个基因座。或者,嵌合DNA在可以在宿主基因组中不连接的两个或更多个DNA分子上,或者不将DNA分子整合入宿主基因组,如瞬时表达实验中出现的。植物或其部分例如营养性植物部分优选对于插入其基因组的一个DNA分子是纯合的。
[1092] 转录因子
[1093] 在植物细胞中各种转录因子参与脂肪酸的合成和脂质并入脂肪酸如TAG,因此可以操作用于推修饰。优选的转录因子是WRI1。如本文所用,术语“Wrinkled 1”或“WRI1”或“WRL1”是指AP2/ERWEBP类的转录因子,其调节参与糖酵解和从头脂肪酸生物合成的几种酶的表达。WRI1具有两个植物特异性(AP2/EREB)DNA-结合结构域。至少拟南芥中的WRI1还调节蔗糖经糖酵解的断裂,从而调节脂肪酸生物合成前体的供应。换句话说,其控制从光合作用至储存脂质的碳流。至少拟南芥中的wri1突变体具有褶皱(wrinkled)种子表型,这是由于将蔗糖和葡糖糖并入TAG的缺陷
[1094] 由WRI1转录的基因实例包括但不限于编码以下的基因中的一种或多种,优选全部:丙酮酸激酶(At5g52920、At3g22960),丙酮酸脱氢酶(PDH)E1α亚基(At1g01090),乙酰基-CoA羧化酶(ACCase),BCCP2亚基(At5g15530),烯酰基-ACP还原酶(At2g05990;EAR),磷酸甘油酸变位酶(At1g22170),胞质果糖激酶,和胞质磷酸甘油酸变位酶,蔗糖合酶(SuSy)(参见,例如,Liu等,2010;Baud等,2007;Ruuska等,2002)。
[1095] WRI1包含保守结构域AP2(cd00018)。AP2是在植物里转录调节因子中发现的DNA-结合结构域如APETALA2和EREBP(乙烯反应元件结合蛋白)。在EREBP中该结构域特异性地结合乙烯反应元件(ERE,乙烯反应中必要的启动子元件)的11bp GCC盒。参与应激应答的EREBP和C-重复序列结合因子CBF1包含单拷贝的AP2结构域。在植物发育中发挥作用的APETALA2样蛋白包含两个拷贝。
[1096] WRI1及其功能同源物中可以找到的其它序列基序包括:
[1097] 1.R G V T/S R H R W T G R(SEQ ID NO:89).
[1098] 2.F/Y E A H L W D K(SEQ ID NO:90).
[1099] 3.D L A A L K Y W G(SEQ ID NO:91).
[1100] 4.S X G F S/A R G X(SEQ ID NO:92).
[1101] 5.H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K V(SEQ ID NO:93).
[1102] 6.Q E E A A A X Y D(SEQ ID NO:94).
[1103] 如本文所用,术语“Wrinkled 1”或“WRI1”还包括“Wrinkled 1样”或“WRI1样”蛋白。WRI1蛋白的实例包括登录号:Q6X5Y6,(拟南芥;SEQ ID NO:22),XP_002876251.1(琴叶拟南芥琴叶亚种;SEQ ID NO:23),ABD16282.1(欧洲油菜;SEQ ID NO:24),ADO16346.1(欧洲油菜;SEQ ID NO:25),XP_003530370.1(大豆;SEQ ID NO:26),AEO22131.1(麻风树;SEQ ID NO:27),XP_002525305.1(蓖麻;SEQ ID NO:28),XP_002316459.1(毛果杨;SEQ ID NO:29),CBI29147.3(葡萄;SEQ ID NO:30),XP_003578997.1(二穗短柄草;SEQ ID NO:31),BAJ86627.1(大麦;SEQ ID NO:32),EAY79792.1(水稻;SEQ ID NO:33),XP_002450194.1(两色高粱;SEQ ID NO:34),ACG32367.1(玉米;SEQ ID NO:35),XP_003561189.1(二穗短柄草;
SEQ ID NO:36),ABL85061.1(小颖短柄草;SEQ ID NO:37),BAD68417.1(水稻;SEQ ID NO:
38),XP_002437819.1(两色高粱;SEQ ID NO:39),XP_002441444.1(两色高粱;SEQ ID NO:
40),XP_003530686.1(大豆;SEQ ID NO:41),XP_003553203.1(大豆;SEQ ID NO:42),XP_
002315794.1(毛果杨;SEQ ID NO:43),XP_002270149.1(葡萄;SEQ ID NO:44),XP_
003533548.1(大豆;SEQ ID NO:45),XP_003551723.1(大豆;SEQ ID NO:46),XP_
003621117.1(蒺藜苜蓿;SEQ ID NO:47),XP_002323836.1(毛果杨;SEQ ID NO:48),XP_
002517474.1(蓖麻;SEQ ID NO:49),CAN79925.1(葡萄;SEQ ID NO:50),XP_003572236.1(二穗短柄草;SEQ ID NO:51),BAD10030.1(水稻;SEQ ID NO:52),XP_002444429.1(两色高粱;SEQ ID NO:53),NP_001170359.1(玉米;SEQ ID NO:54),XP_002889265.1(琴叶拟南芥琴叶亚种;SEQ ID NO:55),AAF68121.1(拟南芥;SEQ ID NO:56),NP_178088.2(拟南芥;SEQ ID NO:57),XP_002890145.1(琴叶拟南芥琴叶亚种;SEQ ID NO:58),BAJ33872.1(小盐芥;
SEQ ID NO:59),NP_563990.1(拟南芥;SEQ ID NO:60),XP_003530350.1(大豆;SEQ ID NO:
61),XP_003578142.1(二穗短柄草;SEQ ID NO:62),EAZ09147.1(水稻;SEQ ID NO:63),XP_
002460236.1(两色高粱;SEQ ID NO:64),NP_001146338.1(玉米;SEQ ID NO:65),XP_
003519167.1(大豆;SEQ ID NO:66),XP_003550676.1(大豆;SEQ ID NO:67),XP_
003610261.1(蒺藜苜蓿;SEQ ID NO:68),XP_003524030.1(大豆;SEQ ID NO:69),XP_
003525949.1(大豆;SEQ ID NO:70),XP_002325111.1(毛果杨;SEQ ID NO:71),CBI36586.3(葡萄;SEQ ID NO:72),XP_002273046.2(葡萄;SEQ ID NO:73),XP_002303866.1(毛果杨;
SEQ ID NO:74)以及CBI25261.3(葡萄;SEQ ID NO:75)。其他实例包括Sorbi-WRL1(SEQ ID NO:76)、Lupan-WRL1(SEQ ID NO:77)、Ricco-WRL1(SEQ ID NO:78)和狭叶羽扇豆WRI1(SEQ ID NO:79)。优选的WRI1是玉米WRI1或高粱WRI1。
[1104] 最近,WRI1样转录因子的一个子集已重新分类为WRI2、WRI3或WRI4转录因子,其特征在于在植物的茎和/或根中而不是在发育的种子中的优先表达(To et al.,2012)。尽管它们重新分类,但是在本文中它们包括在“WRI1”的定义中。优选的WRI1样转录因子是可以补充植物中wri1突变的功能的那些WRI1样转录因子,特别是植物发育的种子如拟南芥wri1突变体中的功能。WRI1样多肽的功能还可以如本文所述在本氏烟草瞬时测定中测定。
[1105] WRI1转录因子可以对植物或细胞是内源的,或对植物或细胞是外源的,例如由外源多核苷酸表达。WRI1转录因子可以是天然存在的WRI1多肽或其变体,条件是它保留转录因子活性。内源性WRI1多肽的水平或活性也可以通过增加MED15多肽(Kim等人,2016)或14-3-3多肽(Ma等,2016)的表达来增加,例如所述MED15多肽为以SEQ ID NO:293或295的氨基酸序列的形式提供的多肽,所述14-3-3多肽例如SEQ ID NO:297-304。认为MED15多肽有助于将WRI1导向其靶启动子和WRI1表达本身的表达,而14-3-3多肽被认为与WRI1多肽相互作用以增加WRI1效应。
[1106] 如本文所用,“LEAFY COTYLEDON”或“LEC”多肽表示转录因子,其是LEC1、LEC1样、LEC2、ABI3或FUS3转录因子,表现出对种子成熟和脂肪酸合成的广泛控制。LEC2、FUS3和ABI3是相关的多肽,各自包含仅在植物蛋白中发现的120个氨基酸的B3 DNA-结合结构域(Yamasaki et al.,2004)。它们可以通过系统发育分析来区分,以便确定氨基酸序列中与具有如下登录号的拟南芥多肽成员的相关性:LEC2,登录号AAL12004.1;FUS3(也称作FUSCA3),登录号AAC35247。LEC1属于不同类别的多肽,并且与CBF结合因子类别的HAP3多肽同源(Lee et al.,2003)。在早期胚胎发生中需要LEC1、LEC2和FUS3基因以维持胚胎细胞命运和指定子叶身份,并且后来在胚胎成熟的启动和维持中需要LEC1、LEC2和FUS3基因(Santos-Mendoza et al.,2008)。它们还通过结合至启动子中存在的RY基序来诱导编码种子贮藏蛋白的基因的表达,以及诱导油质蛋白基因的表达。它们还可以通过它们在种子发育中的表达模式或者通过它们补充拟南芥中的相应突变的能力来区分。
[1107] 如本文所用,术语“Leafy Cotyledon 1”或“LEC1”是指NF-YB型转录因子,其参与合子发育和体细胞胚胎发生。内源基因特异性地在种子中于胚和胚乳中表达。LEC1激活编码WRI1的基因以及一大类脂肪酸合成基因。LEC2的异位表达还引起生长素应答基因的快速激活,并且可以引起体细胞配体的形成。LEC1多肽的实例包括来自拟南芥(AAC39488,SEQ ID NO:149)、蒺藜苜蓿(AFK49653,SEQ ID NO:154)和欧洲油菜(ADF81045,SEQ ID NO:151)、琴叶拟南芥(A.lyrata)(XP_002862657,SEQ ID NO:150)、蓖麻(R.communis)(XP_
002522740,SEQ ID  NO:152)、栽培大豆(XP_006582823,SEQ  ID NO:153)、花生
(A.hypogaea)(ADC33213,SEQ ID NO:156)、玉米(AAK95562,SEQ ID NO:155)的蛋白。
[1108] LEC1样(L1L)与LEC1密切相关,但是具有不同模式的基因表达,在胚胎发生期间较早表达(Kwong et al.,2003)。LEC1样多肽的实例包括来自拟南芥(AAN15924,SEQ ID NO:157)、欧洲油菜(AHI94922,SEQ ID NO:158)和荷包豆LEC1样(AAN01148,SEQ ID NO:159)的蛋白。
[1109] 如本文所用,术语“Leafy Cotyledon 2”或“LEC2”是指B3结构域转录因子,其参与合子发育和体细胞胚胎发生,并且其激活编码WRI1的基因的表达。其异位表达有助于从营养性植物组织的胚胎发生(Alemanno et al.,2008)。LEC2多肽的实例包括来自拟南芥(登录号NP_564304.1,SEQ ID NO:142)、蒺藜苜蓿(登录号CAA42938.1,SEQ ID NO:143)和欧洲油菜(登录号ADO16343.1,SEQ ID NO:144)的蛋白。
[1110] 在一实施方案中,编码LEC2的本发明的外源多核苷酸包含以下一个或多个:
[1111] i)核苷酸,其编码包含序列如SEQ ID NO:142-144中任一个所示的氨基酸的多肽或其生物活性片段,或者氨基酸序列与SEQ ID NO:142-144中的任何一个或多个至少30%相同的多肽,
[1112] ii)序列与i)至少30%相同的核苷酸,以及
[1113] iii)在严格条件下杂交至i)或ii)中的一种或两者的多核苷酸。
[1114] 如本文所用,术语“FUS3”是指B3结构域转录因子,其参与合子发育和体细胞胚胎发生,并且主要在胚胎的原表皮组织中检测到(Gazzarrini et al.,2004)。FUS3多肽的实例包括来自拟南芥(AAC35247,SEQ ID NO:160)、欧洲油菜(XP_006293066.1,SEQ ID NO:161)和蒺藜苜蓿(XP_003624470,SEQ ID NO:162)的蛋白。来自外源多核苷酸的任何LEC1、L1L、LEC2、FUS3和ABI的过量表达优选由发育调节启动子控制,如衰老特异性启动子,诱导型启动子,或者已工程化用于提供相对于天然启动子降低水平的表达的启动子,特别是在除拟南芥和欧洲油菜品种Westar以外的植物中,以便避免通常与这些转录因子的过量表达相关的植物发育中的发育异常(Mu et al.,2008)。
[1115] 如本文所用,术语“BABY BOOM”或“BBM”是指AP2/ERF转录因子,其在通常不支持野生型植物中的再生的培养条件下诱导再生。欧洲油菜和拟南芥中欧洲油菜BBM(BnBBM)基因的异位表达诱导从不含激素的基础培养基上生长的幼苗的自发体细胞胚胎发生和器官发生(Boutilier et al.,2002)。在烟草中,异位BBM表达足以在基础培养基上诱导不定新梢和根再生,但是体细胞胚胎(SE)形成需要外源细胞分裂素(Srinivasan et al.,2007)。BBM多肽的实例包括来自拟南芥(登录号NP_197245.2,SEQ ID NO:145)、玉米(US 7579529)、两色高粱(登录号XP_002458927)和蒺藜苜蓿(登录号AAW82334.1,SEQ ID NO:146)的蛋白。
[1116] 在一实施方案中,除非另有说明,编码BBM的本发明的外源多核苷酸包含以下一个或多个:
[1117] i)核苷酸,其编码包含序列如SEQ ID NO:145或146之一所示的氨基酸的多肽或其生物活性片段,或者氨基酸序列与SEQ ID NO:145或146中的一个或两个至少30%相同的多肽,
[1118] ii)序列与i)至少30%相同的核苷酸,以及
[1119] iii)在严格条件下杂交至i)或ii)中的一种或两者的多核苷酸。
[1120] ABI3多肽(拟南芥登录号NP_189108)与玉米VP1蛋白相关,在营养组织中以低水平表达,并且影响质体发育。ABI4多肽(拟南芥登录NP_181551)属于包含植物特异性AP2结构域的转录因子家族(Finkelstein et al.,1998),并且在ABI3的下游发挥作用。ABI5(拟南芥登录号NP_565840)是bZIP家族的转录因子,其影响ABA敏感性并控制种子中一些LEA基因的表达。其结合至ABA-反应元件。
[1121] 在它们在植物中的胚胎发生中发挥功能的基础上选择以下转录因子中的每一个。登录号在表10中提供。每个的同系物可以在许多其他植物物种中容易地鉴定,并且如实施例10所述进行测试。
[1122] MYB73是已在大豆中鉴定的转录因子,参与应激应答。
[1123] bZIP53是拟南芥中鉴定的bZIP蛋白家族中的转录因子。
[1124] AGL15(Agamous样15)是在胚胎发生中天然表达的MADS盒转录因子。AGL15还在叶原基、茎顶端分生组织和年轻的花芽中表达,表明AGL15还可以在发芽后发育中具有功能。AGL15在胚胎发生和赤霉酸分解代谢中具有作用。其靶向是胚胎发生的关键调节物的B3结构域转录因子。
[1125] MYB115和MYB118是参与胚胎发生的来自拟南芥的MYB家族中的转录因子。
[1126] 也称作EMB2757的TANMEI编码拟南芥中胚胎发育需要的WD重复蛋白。
[1127] 也称作Wuschel的WUS是控制胚胎中的干细胞池的同源盒基因。其在分生组织的干细胞组织中心中表达,并且是将干细胞保持在未分化状态所需要的。该转录因子结合至TAAT元件核心基序。
[1128] GFR2a1和GFR2a2是至少来自大豆的转录因子。
[1129] 脂肪酰基酰基转移酶
[1130] 如本文所用,术语“脂肪酰基酰基转移酶”是指能够将酰基从酰基-CoA、PC或-ACP(优选酰基-CoA或PC)转移至底物以形成TAG、DAG或MAG的蛋白。这些酰基转移酶包括DGAT、PDAT、MGAT、GPAT和LPAAT。
[1131] 如本文所用,术语“二酰甘油酰基转移酶”(DGAT)是指将脂肪酰基从酰基-CoA转移至DAG底物以产生TAG的蛋白。因此,术语“二酰甘油酰基转移酶活性”是指将酰基从酰基-CoA转移至DAG以产生TAG。DGAT还可以具有MGAT功能,但是主要用作DGAT,即,当将酶活性以nmol产物/min/mg蛋白为单位表示时,它作为DGAT的催化活性高于作为MGAT的催化活性(参见例如Yen et al.,2005)。DGAT的活性在种子中的TAG合成中可以是限速的(Ichihara et al.,1988)。DGAT使用酰基-CoA底物作为酰基供体,并且将其转移至DAG的sn-3位置以形成TAG。该酶在细胞的内质网(ER)中以其天然状态发挥功能。
[1132] 有三种已知类别的DGAT,分别称作DGAT1、DGAT2和DGAT3。DGAT1多肽是通常具有10个跨膜结构域的膜蛋白,DGAT2多肽也是膜蛋白,但是通常具有2个跨膜结构域,而DGAT3多肽通常不含跨膜结构域并被认为可溶于细胞质,而不整合入膜。植物DGAT1多肽通常具有约510-550个氨基酸残基,而DGAT2多肽通常具有约310-330个残基。DGAT1是大多数发育的植物种子中负责从DAG产生TAG的主要酶,而来自产生大量的罕见脂肪酸的植物物种如油桐树(油桐)和蓖麻子(蓖麻)的DGAT2看来在TAG中的罕见脂肪酸积累中起重要作用。烟草叶中AtDGAT1的过量表达导致增加6-7倍的TAG含量(Bouvier-Nave et al.,2000)。
[1133] DGAT1多肽的实例包括来自烟曲霉(XP_755172.1;SEQ ID NO:80)、拟南芥(CAB44774.1;SEQ ID NO:1)、蓖麻(AAR11479.1;SEQ ID NO:81)、油桐(ABC94472.1;SEQ ID NO:82)、斑鸠菊(ABV21945.1和ABV21946.1;分别为SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:84)、卫矛(AAV31083.1;SEQ ID NO:85)、微拟球藻(Zienkiewicz et al 2017)、酵母(Zulu et al 2017)、秀丽隐杆线虫(AAF82410.1;SEQ ID NO:86)、褐鼠(NP_445889.1;SEQ ID NO:87)、智人(NP_036211.2;SEQ ID NO:88)的DGAT1蛋白,以及它们的变体和/或突变体。DGAT2多肽的实例包括由来自拟南芥(NP_566952.1;SEQ ID NO:2)、蓖麻(AAY16324.1;SEQ ID NO:3)、油桐(ABC94474.1;SEQ ID NO:4)、拉曼被孢霉(AAK84179.1;SEQ ID NO:5)、智人(Q96PD7.2;
SEQ ID NO:6)(Q58HT5.1;SEQ ID NO:7)、家牛(Q70VZ8.1;SEQ ID NO:8)、小家鼠(AAK84175.1;SEQ ID NO:9)的DGAT2基因编码的蛋白,以及它们的变体和/或突变体。DGAT1和DGAT2氨基酸序列表现出很少的同源性。在增加油含量(TAG)中,在叶中表达外源DGAT2的效率是DGAT1的两倍。此外,与DGAT1相比,相对于油酰基-CoA,拟南芥DGAT2对亚油酰基-CoA和亚麻酰基-CoA作为酰基供体具有更大偏好。除了它们的氨基酸序列,这种底物偏好可以用来区分这两种DGAT类别。
[1134] DGAT3多肽的实例包括由来自花生(Arachis hypogaea,Saha,et al.,2006)的DGAT3基因编码的蛋白,以及它们的变体和/或突变体。DGAT几乎没有可检测的MGAT活性,例如低于300pmol/min/mg蛋白,优选低于200pmol/min/mg蛋白,更优选低于100pmol/min/mg蛋白。
[1135] 在一实施方案中,编码DGAT1的本发明的外源多核苷酸包含以下一个或多个:
[1136] i)核苷酸,其编码包含序列如SEQ ID NO:1或80-88中任一个所示的氨基酸的多肽或其生物活性片段,或者氨基酸序列与SEQ ID NO:1或80-88中的任何一个或多个至少30%相同的多肽,
[1137] ii)序列与i)至少30%相同的核苷酸,以及
[1138] iii)在严格条件下杂交至i)或ii)中的一种或两者的多核苷酸。
[1139] 在一实施方案中,编码DGAT2的本发明的外源多核苷酸包含以下一个或多个:
[1140] i)核苷酸,其编码包含序列如SEQ ID NO:2-9中任一个所示的氨基酸的多肽或其生物活性片段,或者氨基酸序列与SEQ ID NO:2-9中的任何一个或多个至少30%相同的多肽,
[1141] ii)序列与i)至少30%相同的核苷酸,以及
[1142] iii)在严格条件下杂交至i)或ii)中的一种或两者的多核苷酸。
[1143] 如本文所用,术语“磷脂:二酰甘油酰基转移酶”(PDAT;EC 2.3.1.158)或其同义词“磷脂:1,2-二酰基-sn-甘油O-酰基转移酶”表示将酰基从磷脂(通常从PC的sn-2位置)转移至DAG的sn-3位置以形成TAG和溶血磷脂酰胆碱(LPC)的酰基转移酶。此反应与DGAT不同并且使用磷脂作为酰基-供体。增加PDAT(例如PDAT1)的表达,其可以是本发明的细胞或植物的外源或内源的,增加了从PC的TAG产生。酶LPCAT可以使LPC重新酰化以形成更多的PC,从而允许通过PDAT继续生产DAG。在植物细胞中有几种形式的PDAT,包括PDAT1、PDAT2或PDAT3(Ghosal et al.,2007)。示例性PDAT编码区和多肽的序列在本文中提供为SEQ ID NO:258-261(高粱和玉米PDAT1,登录号XM_002462417.1和NM_001147943)、(Dahlqvist等,2000;Fan等,2013;Fan et al.,2014),尽管可以使用任何PDAT编码基因。来自这些或其他植物、真菌或藻类物种的同源物和天然存在的PDAT变体可以容易地鉴定并用于本发明。在一个实施方案中,所述同源物或变体与所列SEQ ID NO或登录号的氨基酸序列具有至少95%相同性、优选至少99%相同性。PDAT可以是植物或其部分的外源或内源的。。
[1144] 如本文所用,术语“单酰甘油酰基转移酶”或“MGAT”是指将脂肪酰基从酰基-CoA转移至MAG底物如sn-2 MAG以产生DAG的蛋白。因此,术语“单酰甘油酰基转移酶活性”至少是指将酰基从酰基-CoA转移至MAG以产生DAG。如本文所用的术语“MGAT”包括作用于sn-1/3 MAG和/或sn-2 MAG底物以分别形成sn-1,3 DAG和/或sn-1,2/2,3-DAG的酶。在一优选实施方案中,相对于sn-1 MAG,MGAT对sn-2 MAG底物具有偏好,或者基本上仅使用sn-2 MAG作为底物。如本文所用,MGAT不包括相对于MAG将酰基优先转移至LysoPA的酶,此类酶称作LPAAT。也就是说,MGAT优先地使用非磷酰化单酰基底物,即使它们还可能对LysoPA的催化活性较低。优选的MGAT不具有可检测的酰化LysoPA的活性。MGAT还可以具有DGAT功能,但主要用作MGAT,即,当将酶活性以nmol产物/min/mg蛋白为单位表示时,它作为MGAT的催化活性高于作为DGAT的催化活性(还参见Yen et al.,2002)。有三种已知类别的MGAT,分别称作MGAT1、MGAT2和MGAT3。MGAT1、MGAT2和MGAT3多肽的实例描述于WO2013/096993中。
[1145] 如本文所用,“MGAT途径”是指形成TAG的不同于Kennedy途径的合成代谢途径,其中DAG通过MGAT催化的sn-1 MAG或优选sn-2 MAG的酰化而形成。DAG随后可以用来形成TAG或其他脂质。WO2012/000026首先证实植物叶组织可以从G-3-P合成MAG,从而MAG是叶组织中表达的外源MGAT可使用的,第二,来自各种来源的MGAT可以在植物组织中发挥功能,需要与参与脂质合成的其他植物因子成功相互作用,第三,外源MGAT活性产生的DAG是植物DGAT或外源DGAT可使用的,以便产生TAG。MGAT和DGAT活性可以通过将编码酶(或候选酶)的构建体引入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株H1246并证明TAG积累来测定。
[1146] 已表明在某些DGAT2中对催化活性具有重要意义的某些基序在MGAT酰基转移酶中也是保守的。特别感兴趣的是具有共有序列FLXLXXXN(SEQ ID NO:14)(其中每个X独立地为非脯氨酸的任何氨基酸,并且N为任何非极性氨基酸,该序列位于N端跨膜区内)的推定中性脂质结合结构域,接着为推定甘油/磷脂酰基转移酶结构域。FLXLXXXN基序(SEQ ID NO:14)存在于小鼠DGAT2(氨基酸81-88)和MGAT1/2中但不存在于酵母或植物DGAT2中。它对小鼠DGAT2的活性具有重要意义。其他DGAT2和/或MGAT1/2序列基序包括:
[1147] 1.存在于大多数DGAT2多肽中也存在于MGAT1和MGAT2中的高度保守的YFP三肽(SEQ ID NO:10),例如作为小鼠DGAT2中的氨基酸139-141而存在。通过非保守取代使酵母DGAT2内的这个基序发生突变将使酶丧失功能。
[1148] 2.在MGAT中以及在来自动物和真菌的DGAT2序列中高度保守的HPHG四肽(SEQ ID NO:11),例如作为小鼠DGAT2中的氨基酸161-164而存在,并至少在酵母和小鼠DGAT2中对催化活性具有重要意义。植物DGAT2酰基转移酶相反具有EPHS(SEQ ID NO:12)保守序列,因此可以接受对第一和第四氨基酸的保守变化。
[1149] 3.作为推定甘油磷脂结构域一部分的较长保守基序。这个基序的实例为RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q)(SEQ ID NO:13),其作为小鼠DGAT2中的氨基酸304-327而存在。这个基序在氨基酸序列中不如其他的保守,如可以通过其长度所预料,但是通过基序搜素可以识别同系物。在更保守的氨基酸之间,间距可以变化,即,与上面的序列相比,在基序内可以存在额外的X氨基酸或者更少的X氨基酸。
[1150] 从脂肪酸酯化为ACP或CoA的甘油脂合成中的一个重要组分是酶sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT),其是参与非极性脂质的生物合成的另一种多肽。这种酶参与不同的代谢途径和生理功能。其催化以下反应:G3P+脂肪酰基-ACP或-CoA→LPA+游离-ACP或-CoA。GPAT催化的反应发生在3种不同的植物亚细胞区室中:质体、内质网(ER)和线粒体。这些反应是通过3种不同类型的GPAT酶催化的,使用酰基-ACP作为其天然酰基底物的位于质体基质中的可溶形式(图1中的PGPAT),以及分别使用酰基-CoA和酰基-ACP作为天然酰基供体的位于ER和线粒体中的2种膜结合形式(Chen et al.,2011)。
[1151] 如本文所用,术语“甘油-3-磷酸酰基转移酶”(GPAT;EC 2.3.1.15)及其同义词“甘油-3-磷酸O-酰基转移酶”是指使甘油-3-磷酸(G-3-P)酰化形成LysoPA和/或MAG的蛋白,如果GPAT还具有对LysoPA的磷酸酶活性则形成后一产物。如果GPAT是ER类型GPAT(也称作“微粒体GPAT”的“酰基-CoA:sn-甘油-3-磷酸1-O-酰基转移酶”),则转移的酰基来自酰基-CoA,或者如果GPAT是质体类型GPAT(PGPAT),则转移的酰基来自酰基-ACP。因此,术语“甘油-3-磷酸酰基转移酶活性”是指G-3-P酰化形成LysoPA和/或MAG。术语“GPAT”涵盖使G-3-P酰化形成sn-1 LPA和/或sn-2 LPA优选sn-2 LPA的酶。优选地,可以在推修饰中过量表达的GPAT是在细胞的ER中发挥功能的膜结合的GPAT,更优选GPAT9,而在原核途径中下调的质体GPAT是可溶性GPAT(“质体GPAT”)。在一优选实施方案中,GPAT具有磷酸酶活性。在一最优选的实施方案中,GPAT是具有产生sn-2 MAG的磷酸酶活性的sn-2 GPAT。
[1152] 如本文所用,术语“sn-1甘油-3-磷酸酰基转移酶”(sn-1 GPAT)是指使sn-甘油-3-磷酸(G-3-P)酰化优先地形成1-酰基-sn-甘油-3-磷酸(sn-1 LPA)的蛋白。因此,术语“sn-1甘油-3-磷酸酰基转移酶活性”是指使sn-甘油-3-磷酸酰化形成1-酰基-sn-甘油-3-磷酸(sn-1 LPA)。
[1153] 如本文所用,术语“sn-2甘油-3-磷酸酰基转移酶”(sn-2 GPAT)是指使sn-甘油-3-磷酸(G-3-P)酰化优先地形成2-酰基-sn-甘油-3-磷酸(sn-2 LPA)的蛋白。因此,术语“sn-2甘油-3-磷酸酰基转移酶活性”是指使sn-甘油-3-磷酸酰化形成2-酰基-sn-甘油-3-磷酸(sn-2 LPA)。
[1154] GPAT家族是一个庞大的家族,并且所有已知的成员均包含两个保守结构域:plsC酰基转移酶结构域(PF01553;SEQ ID NO:15)和HAD样水解酶(PF12710;SEQ ID NO:16)超家族结构域及其变体。除此之外,至少在拟南芥中,亚类GPAT4-GPAT8中的GPAT均包含与磷酸丝氨酸磷酸酶结构域(PF00702;SEQ ID NO:17)同源的N端区域,并且产生MAG作为产物的GPAT可以通过这样的同源区的存在来鉴定。在叶组织中内源表达的一些GPAT包含保守氨基酸序列GDLVICPEGTTCREP(SEQ ID NO:18)。GPAT4和GPAT6均包含已知对磷酸酶活性至关重要的保守残基,具体地讲,位于N端的基序I(DXDX[T/V][L/V];SEQ ID NO:19)和基序III(K-[G/S][D/S]XXX[D/N];SEQ ID NO:20)中的保守氨基酸(Yang et al.,2010)。
[1155] 拟南芥GPAT4(登录号NP_171667.1)和GPAT6(NP_181346.1)的同源物包括AAF02784.1(拟南芥)、AAL32544.1(拟南芥)、AAP03413.1(水稻)、ABK25381.1(北美杉(Picea sitchensis))、ACN34546.1(玉米)、BAF00762.1(拟南芥)、BAH00933.1(水稻)、EAY84189.1(水稻)、EAY98245.1(水稻)、EAZ21484.1(水稻)、EEC71826.1(水稻)、EEC76137.1(水稻)、EEE59882.1(水稻)、EFJ08963.1(江南卷柏(Selaginella 
moellendorffii))、EFJ11200.1(江南卷柏)、NP_001044839.1(水稻)、NP_001045668.1(水稻)、NP_001147442.1(玉米)、NP_001149307.1(玉米)、NP_001168351.1(玉米)、AFH02724.1(欧洲油菜)NP_191950.2(拟南芥)、XP_001765001.1(小立碗藓)、XP_001769671.1(小立碗藓)、(葡萄)、XP_002275348.1(葡萄)、XP_002276032.1(葡萄)、XP_002279091.1(葡萄)、XP_
002309124.1(毛果杨)、XP_002309276.1(毛果杨)、XP_002322752.1(毛果杨)、XP_
002323563.1(毛果杨)、XP_002439887.1(两色高粱)、XP_002458786.1(两色高粱)、XP_
002463916.1(两色高粱)、XP_002464630.1(两色高粱)、XP_002511873.1(蓖麻)、XP_
002517438.1(蓖麻)、XP_002520171.1(蓖麻)、ACT32032.1(油桐)、NP_001051189.1(水稻)、AFH02725.1(欧洲油菜)、XP_002320138.1(毛果杨)、XP_002451377.1(两色高粱)、XP_
002531350.1(蓖麻)以及XP_002889361.1(琴叶拟南芥)。
[1156] 可溶性质体GPAT(PGPAT,在拟南芥中也称作ATS1)已被纯化,并且编码它们的基因克隆自几种植物物种如豌豆(Pisum sativum,登录号:P30706.1)、菠菜(Spinacia oleracea,登录号:Q43869.1)、squash(Cucurbita moschate,登录号:P10349.1)、黄瓜(Cucumis sativus,登录号:Q39639.1)和拟南芥(登录号:Q43307.2)。可溶性质体GPAT是已知为甘油脂合成的原核途径的第一个保证步骤,并且仅在质体中可操作(图1)。所谓的原核途径仅位于植物质体中,并且组装DAG用于包含在甘油骨架的sn-2位置酯化的C16:3脂肪酸的半乳糖脂(MGDG和DGMG)的合成。
[1157] 保守基序和/或残基可以用作基于序列的诊断法,用于GPAT酶。或者,可以利用更严格的基于功能的测定。这样的测定包括例如向细胞或微粒体供给加标记的甘油-3-磷酸,然后通过薄层层析或类似技术定量标记产物的水平。GPAT活性导致产生标记的LPA,而GPAT/磷酸酶活性则导致产生标记的MAG。
[1158] 如本文所用,术语“溶血磷脂酸酰基转移酶”(LPAAT;EC 2.3.1.51)及其同义词“1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶”、“酰基-CoA:1-酰基-sn-甘油-3-磷酸2-O-酰基转移酶”和“1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶”是指使溶血磷脂酸(LPA)酰化形成磷脂酸(PA)的蛋白。如果LPAAT是ER类型LPAAT,则转移的酰基来自酰基-CoA,或者如果LPAAT是质体类型LPAAT(PLPAAT),则转移的酰基来自酰基-ACP。因此,术语“溶血磷脂酸酰基转移酶活性”是指LPA酰化形成PA。
[1159] 油体包衣多肽
[1160] 植物种子和花粉在一般直径为0.5-2.5μm的称作油体的亚细胞结构中积累TAG。如本文所用,也称作“油体”的“脂滴”是用于储存或交换天然脂质(主要包括TAG)的富含脂质的细胞器。脂滴大小可以大大不同,从约20nm至100μm。这些细胞器具有磷脂单层所包围的TAG核,所述磷脂单层包含参与脂质代谢和储存以及脂质运输至其他膜的几种嵌入的蛋白,如果油体来自植物种子或花组织则包括油质蛋白(Jolivet et al.,2004)。它们一般由0.5-3.5%蛋白组成,而剩余的是脂质。它们是大多数细胞中密度最小的细胞器,并且因此可以通过浮选离心容易地分离。油质蛋白代表来自种子的油体膜中最丰富(至少80%)的蛋白。
[1161] 在一个实施方案中,所述油体包衣多肽是非过敏性的,或者不知道是过敏性的,例如对人类。如本文所用,术语“过敏性多肽”是指多肽的特征在于存在两个特征:(i)其氨基酸序列包含至少80个连续氨基酸的区域,其序列与已知过敏性蛋白的至少80个连续氨基酸的序列具有至少35%相同性,和(ii)其氨基酸序列包含至少8个连续氨基酸,其在序列上与已知过敏性蛋白的至少8个连续氨基酸的区域相同。如本文所用,“非过敏性多肽”为不是过敏性多肽的多肽。优选的非过敏性多肽为不具有特征(i)和(ii)中的每一个的多肽。为清楚起见,非过敏性多肽可具有特征(i)或特征(ii)但不具有特征(i)和特征(ii)两者。非过敏性多肽的子集具有特征(i)但不具有特征(ii);这些不优于既不具有特征(i)也不具有特征(ii)的多肽。
[1162] 描述为(i)和(ii)的特征可以通过使用AllergenOnline数据库和搜索工具进行搜索来确定,该数据库和搜索工具可从www.allergenonline.org获得。使用目标多肽的氨基酸序列进行两次搜索,其用于查询以在AllergenOnline中搜索已知过敏性序列的数据库。第一次搜索使用来自目标多肽(氨基酸1-80,2-81,3-82等)的80个氨基酸的滑动窗口,通过FASTA程序寻找至少35%相同性的匹配(Pearson和Lipman,1988)。在向监管机构提供的用于评估转基因作物中多肽的科学咨询中提出了80个氨基酸区段的35%相同性,参见FAO/WHO 2001和Codex 2003。评估80个氨基酸区段的区段匹配过程似乎相当保守。也就是说,当该第一次搜索本身用于将多肽分类为潜在过敏性时,当相同性程度对过敏性没有生物学意义时,35%相同性水平的阳性匹配可能将多肽错误分类为潜在过敏性的。因此,还进行第二次8-氨基酸匹配搜索,并且基于两次搜索中的阳性匹配将感兴趣的多肽分类为潜在过敏性,而不仅仅是一次搜索。
[1163] 当使用查询序列搜索AllergenOnline数据库时,包括以下的多肽在80个氨基酸的滑动窗口搜索显示为零匹配,因此被归类为非过敏性:玉米WRI1、拟南芥DGAT1、棕榈DGAT1.1、椰子GPAT9、拟南芥FatA2、拟南芥油体钙蛋白(At2g33380)、微拟球藻LDSP,辣椒原纤维蛋白、红球菌(Rhodococcus)TadA和所有测试的油体钙蛋白。其他序列包括香草U1油质蛋白、中国牛脂LDAP2、拟南芥固醇蛋白(At5g50600)、花生油质蛋白3,芝麻油质蛋白H、牛油果油质蛋白、无花果油质蛋白、黄瓜油质蛋白、亚麻油质蛋白、大豆油脂蛋白、芸苔油质蛋白和马铃薯油质蛋白均产生一个或多个在80个氨基酸的滑动窗口搜索的匹配(即与至少80个氨基酸的区域中的已知过敏性蛋白具有至少35%相同性),但在8个氨基酸搜索中没有提供任何匹配。因此,根据上述定义,这些被归类为非过敏性。相反,芝麻油质蛋白L被鉴定为过敏性多肽,在两次搜索中都提供匹配。
[1164] 如本文所用,术语“油质蛋白”是指存在于种子的贮藏组织中的油体膜中的两亲蛋白(参见,例如,Huang,1996;Tai et al.,2002,Lin et al.,2005;Capuano et al.,2007;Lui et al.,2009;Shimada and Hara-Nishimura,2010)和人工产生的变体(参见例如WO2011/053169和WO2011/127118)。
[1165] 油质蛋白具有低Mr(15-26,000),对应约140-230个氨基酸,这允许它们紧紧包裹在油体表面上。在每个种子物种内,通常有两种或更多种不同Mr的油质蛋白。每个油质蛋白分子含有相对亲水的可变N-端结构域(例如,约48个氨基酸残基),中间的完全疏水结构域(例如,约70-80个氨基酸残基的),其特别富含脂肪族氨基酸如丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸,以及位于或邻近C-末端的约30-40个氨基酸残基的两亲性α-螺旋结构域。中间的疏水结构域通常包含在其中心的约12个残基的脯氨酸节基序。一般来说,将疏水残基的中心段插入脂质核心,并且两亲性N-端和/或两亲性C-端位于油体的表面,带正电荷的残基包埋在磷脂单层中,而带负电荷的残基暴露于外部。
[1166] 如本文所用,术语“油质蛋白”涵盖聚油质蛋白,其具有以头尾方式融合在一起成为单个多肽的多个油质蛋白多肽(WO2007/045019),例如2x、4x或6x油质蛋白肽;以及涵盖油体钙蛋白,其结合钙并且是包被种子中的油体的蛋白的最小蛋白组分(Froissard et al.,2009);以及涵盖油体固醇蛋白,其结合固醇(WO2011/053169)。然而,一般油体的油质蛋白的大部分(至少80%)都不会是油体钙蛋白和/或油体固醇蛋白。术语“油质蛋白”还涵盖已人工修饰的油质蛋白多肽,用半胱氨酸残基人工置换天然油质蛋白的一个或多个氨基酸的这类油质蛋白,如WO2011/053169所述。通常,人工取代4-8个残基,优选6个残基,但是可以取代多达2-14个残基。优选地,两亲性N-端和两亲性C-端结构域包含半胱氨酸取代。该修饰增加油质蛋白的交联能力,并且增加热稳定性和/或蛋白抗蛋白酶降解的稳定性。
[1167] 从许多不同的植物物种已知大量的油质蛋白序列和编码它们的核苷酸序列。实例包括但不限于来自芝麻、拟南芥、油菜、玉米、稻、花生、蓖麻,大豆、亚麻、葡萄、甘蓝、棉花、向日葵、高粱和大麦的油质蛋白。油体蛋白(与它们的登录号)的实例包括欧洲油菜油质蛋白(CAA57545.1;SEQ ID NO:95)、欧洲油菜油质蛋白S1-1(ACG69504.1;SEQ ID NO:96)、欧洲油菜油质蛋白S2-1(ACG69503.1;SEQ ID NO:97)、欧洲油菜油质蛋白S3-1(ACG69513.1;SEQ ID NO:98)、欧洲油菜油质蛋白S4-1(ACG69507.1;SEQ ID NO:99)、欧洲油菜油质蛋白S5-1(ACG69511.1;SEQ ID NO:100)、花生油质蛋白1(AAZ20276.1;SEQ ID NO:101)、花生油质蛋白2(AAU21500.1;SEQ ID NO:102)、花生油质蛋白3(AAU21501.1;SEQ ID NO:103)、花生油质蛋白5(ABC96763.1;SEQ ID NO:104)、蓖麻油质蛋白1(EEF40948.1;SEQ ID NO:
105)、蓖麻油质蛋白2(EEF51616.1;SEQ ID NO:106)、大豆油质蛋白同种型a(P29530.2;SEQ ID NO:107)、大豆油质蛋白同种型b(P29531.1;SEQ ID NO:108)、亚麻油质蛋白低分子量同种型(ABB01622.1;SEQ ID NO:109)、亚麻油质蛋白高分子量同种型(ABB01624.1;SEQ ID NO:110)、向日葵油质蛋白(CAA44224.1;SEQ ID NO:111)、玉米油质蛋白(NP_001105338.1;
SEQ ID NO:112)、欧洲油菜油体固醇蛋白(ABM30178.1;SEQ ID NO:113)、欧洲油菜油体固醇蛋白SLO1-1(ACG69522.1;SEQ ID NO:114)、欧洲油菜油体固醇蛋白SLO2-1(ACG69525.1;
SEQ ID NO:115)、芝麻油体固醇蛋白(AAL13315.1;SEQ ID NO:116)、芝麻油质蛋白L(Tai等,2002;登录号AF091840;SEQ ID NO:305)、无花果油质蛋白L-同种型(登录号ABQ57397.1;SEQ ID NO:306)、黄瓜油质蛋白L(登录号XP_004146901.1;SEQ ID NO:307)、亚麻油质蛋白L(登录号ABB01618.1;SEQ ID NO:308)、Glycine max油质蛋白L(登录号XP_
003556321.2;SEQ ID NO:309)、凤梨油质蛋白L(登录号OAY72596.1;SEQ ID NO:310)、小米油质蛋白L(登录号XP_004956407.1;SEQ ID NO:311)、草莓油质蛋白L(登录号XP_
004307777.1;SEQ ID NO:312)、欧洲油菜油质蛋白L(登录号CDY03377.1;SEQ ID NO:313)、番茄油质蛋白L(登录号XP_004240765.1;SEQ ID NO:314)、芝麻油质蛋白H1(Tai et al.,
2002;登录号AF302807)、香草叶油质蛋白U1(Huang and Huang,2016;登录号SRX648194)、鳄梨(Persea americana)中果皮油质蛋白M脂滴相关蛋白(Huang and Huang,2016;登录号SRX627420)、花生油质蛋白3(Parthibane等人,2012;登录号AY722696)、拟南芥油体钙蛋白
3(Shen等人,2014;Laibach等人,2015;登录号AK317039),拟南芥油体固醇蛋白(保藏号AT081653),玉米油体固醇蛋白(NP_001152614.1;SEQ ID NO:117)、欧洲油菜油体钙蛋白CLO-1(ACG69529.1;SEQ ID NO:118)、欧洲油菜油体钙蛋白CLO-3(ACG69527.1;SEQ ID NO:
119)、芝麻油体钙蛋白(AAF13743.1;SEQ ID NO:120)、玉米油体钙蛋白(NP_001151906.1;
SEQ  ID NO:121)、大豆油体钙蛋白(AAB71227)。功能等同的其他脂质包裹多肽是plastoglobulin和MLDP多肽(WO2011/127118)。
[1168] 在一实施方案中,除非另有说明,编码油质蛋白的本发明的外源多核苷酸包含以下一个或多个:
[1169] i)核苷酸,其编码包含序列如SEQ ID NO:95-112或305-314中任一个所示的氨基酸的多肽或其生物活性片段,或者氨基酸序列与SEQ ID NO:95-112或305-314中的任何一个或多个至少30%相同的多肽,
[1170] ii)序列与i)至少30%相同的核苷酸,以及
[1171] iii)在严格条件下杂交至i)或ii)中的一种或两者的多核苷酸。
[1172] 在一实施方案中,除非另有说明,编码油体固醇蛋白的本发明的外源多核苷酸包含以下一个或多个:
[1173] i)核苷酸,其编码包含序列如SEQ ID NO:113-117中任一个所示的氨基酸的多肽或其生物活性片段,或者氨基酸序列与SEQ ID NO:113-117中的任何一个或多个至少30%相同的多肽,
[1174] ii)序列与i)至少30%相同的核苷酸,以及
[1175] iii)在严格条件下杂交至i)或ii)中的一种或两者的多核苷酸。
[1176] 在一个实施方案中,所述油质蛋白是油质蛋白L或其直系同源物。油质蛋白L缺乏朝向其他油质蛋白的C末端的约18个氨基酸的H-形式插入(参见,例如,Tai等,2002)。因此,基于蛋白质比对,油质蛋白L可以容易地与其他油质蛋白区分开。
[1177] 在一实施方案中,除非另有说明,编码油质蛋白L的本发明的外源多核苷酸包含以下一个或多个:
[1178] i)核苷酸,其编码包含序列如SEQ ID NO:305-314中任一个所示的氨基酸的多肽或其生物活性片段,或者氨基酸序列与SEQ ID NO:305-314中的任何一个或多个至少30%相同的多肽,
[1179] ii)序列与i)至少30%相同的核苷酸,以及
[1180] iii)在严格条件下杂交至i)或ii)中的一种或两者的多核苷酸。
[1181] 在一可选实施方案中,除非另有说明,编码油质蛋白的本发明的外源多核苷酸包含以下一个或多个:
[1182] i)核苷酸,其编码包含序列如SEQ ID NO:306-314中任一个所示的氨基酸的多肽或其生物活性片段,或者氨基酸序列与SEQ ID NO:306-314中的任何一个或多个至少30%相同的多肽,
[1183] ii)序列与i)至少30%相同的核苷酸,以及
[1184] iii)在严格条件下杂交至i)或ii)中的一种或两者的多核苷酸,其中所述油质蛋白是非过敏性的或者不知道是过敏性的,例如对人类。
[1185] 如本文所用,“脂滴相关蛋白”或“LDAP”表示除种子、花药和花粉以外的组织或器官(如包括果皮和中果皮的果实组织)中的与植物中的脂滴相关的多肽。LDAP可以与种子、花药或花粉以及除种子、花药或花粉以外的组织或器官中的油体相关。它们不同于油质蛋白,油质蛋白是与种子组织、花药和花粉中的脂滴表面相关的多肽。如本文所用的LDAP包括植物组织中天然产生的LDAP多肽以及人工产生的氨基酸序列变体。这类变体的功能可以如实施例11中示例的进行测试。
[1186] Horn等人(2013)鉴定了在鳄梨果皮中表达的2个LDAP基因。所编码的鳄梨LDAP1和LDAP2多肽在氨基酸中62%相同,并且与拟南芥At3g05500编码的多肽和橡胶树SRPP样蛋白具有同源性。Gidda等人(2013)鉴定了在油棕(Elaeis guineensis)中果皮中但不在果仁中表达的3个LDAP基因,并且得出结论,LDAP基因是植物特异性的,并且在所有植物物种中是保守的。LDAP多肽可以包含额外的结构域(Gidda et al.,(2013)。编码LDAP的基因一般在具有丰富脂质的非种子组织中上调,并且从而可以鉴定但不认为在产生油(包括用于短暂储存)的所有非种子细胞中表达。Horn等人(2013)示出了植物中的SRPP样蛋白的系统树。示例性LDAP多肽描述于本文的实施例11和实施例17中,例如红球菌(Rhodococcus opacus)TadA脂滴相关蛋白(MacEachran等,2010;登录号HM625859)、微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)LSDP油体蛋白(Vieler等,2012;登录号JQ268559)和里氏木霉(Trichoderma reesei)HFBI疏水蛋白(Linder等,2005;登录号Z68124)。其他植物物种中的LDAP的同系物可以由本领域技术人员容易地鉴定。
[1187] 在一实施方案中,除非另有说明,编码LDAP的本发明的外源多核苷酸包含以下一个或多个:
[1188] i)核苷酸,其编码包含序列如SEQ ID NO:228、230或232中任一个所示的氨基酸的多肽或其生物活性片段,或者氨基酸序列与SEQ ID NO:228、230或232中的任何一个或多个至少30%相同的多肽,
[1189] ii)序列与i)至少30%相同的核苷酸,以及
[1190] iii)在严格条件下杂交至i)或ii)中的一种或两者的多核苷酸。
[1191] 如本文所用,术语“参与淀粉生物合成的多肽”是指任何多肽,其在植物细胞中下调至低于正常(野生型)水平导致淀粉合成水平的降低以及淀粉水平的降低。这降低了碳从糖到淀粉的流动。这样的多肽的实例是AGPase。
[1192] 如本文所用,术语“ADP-葡糖糖磷酸化酶”或“AGPase”是指调节淀粉生物合成的酶,催化葡萄糖-1-磷酸和ATP至ADP-葡糖糖(其用作淀粉多聚物的构件)的转化。AGPase酶的活性形式由2个大亚基和2个小亚基组成。
[1193] 植物中的AGPase酶主要作为四聚体存在,其由2个大亚基和2个小亚基组成。虽然这些亚基根据物种在它们的催化和调节作用上有所不同(Kuhn et al.,2009),但是在植物中小亚基一般表现出催化活性。小亚基的分子量为约50-55kDa。示例性AGPase小亚基多肽的序列在本文中以SEQ ID NO:254-257(高粱和玉米AGPase,登录号XM_002462095.1和XM_008666513.1)提供(Sanjaya等人,2011,Zale等人,2016)。大亚基的分子量为约55-60kDa。
该植物酶由3-磷酸甘油酸盐(PGA)强烈激活,其为二氧化碳固定的产物;在缺乏PGA时,该酶仅表现出大约其3%的活性。植物AGPase还被无机磷酸盐(Pi)强烈抑制。相反,细菌和藻类AGPase以50kDa的同源四聚体存在。藻类酶(与其植物对应物类似)被PGA激活且被Pi抑制,而细菌酶则被果糖-1,6-二磷酸盐(FBP)激活且被AMP和Pi抑制。
[1194] TAG脂肪酶和β-氧化
[1195] 如本文所用,术语“参与脂质降解和/或减少脂质含量的多肽”是指使脂质发生分解代谢的任何多肽,其在植物细胞中下调至低于正常(野生型)水平会导致转基因植物或其部分(例如营养性部分、块茎、根或种子)的细胞中油(如脂肪酸和/或TAG)水平的提高。这类多肽的实例包括但不限于,脂肪酶类(lipases),或者脂肪酶如CGi58(比较基因标识符-58样)多肽、SUGAR-DEPENDENT 1(SDP1)三酰基甘油脂肪酶(参见,例如,Kelly et al.,2011)以及WO 2009/027335中描述的脂肪酶。
[1196] 如本文所用,术语“TAG脂肪酶”(EC.3.1.1.3)是指将TAG水解为一种或多种脂肪酸以及DAG、MAG或甘油中的任一种的蛋白。因此,术语“TAG脂肪酶活性”是指TAG至甘油和脂肪酸的水解。
[1197] 如本文所用,术语“CGi58”是指拟南芥中的At4g24160基因编码的可溶性酰基-CoA依赖性溶血磷脂酸酰基转移酶及其在其他植物中的同系物以及酵母中的“Ict1p”及其同系物。植物基因如来自拟南芥基因基因座At4g24160的植物基因表达为两个可选择的转录物:较长的全长同种型(At4g24160.1)和较短的缺少3'末端的同种型(At4g24160.2)(参见James et al.,2010;Ghosh et al.,2009;US 201000221400)。两种mRNA均编码蛋白,所述蛋白与人CGI58蛋白和这个α/β水解酶家族(ABHD)的其他直系进化同源成员同源。在一实施方案中,CGI58(At4g24160)蛋白含有三个在植物物种间保守的基序:GXSXG脂肪酶基序(SEQ ID NO:127)、HX(4)D酰基转移酶基序(SEQ ID NO:128)、和可能的脂质结合基序VX(3)HGF(SEQ ID NO:129)。人CGI-58蛋白具有溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)活性但不具有脂肪酶活性。相反,植物和酵母蛋白具有标准的脂肪酶序列基序GXSXG(SEQ ID NO:127),其在脊椎动物(人、小树和斑马鱼)蛋白中缺失,并且具有脂肪酶和磷脂酶活性(Ghosh et al.,
2009)。虽然植物和酵母CGI58蛋白看来在LPAAT活性之外还具有可检测量的TAG脂肪酶和磷脂酶A活性,但人类蛋白却并不如此。
[1198] 拟南芥中同源CGI-58基因的破坏导致天然脂滴在成熟叶中的累积。来自cgi-58功能缺失突变体的分离的脂滴的质谱显示出它们包含具有常规叶特异性脂肪酸的三酰甘油。成熟cgi-58植物的叶表现出绝对三酰甘油水平的显著提高,比野生植物中高超过10倍。
cgi-58功能缺失植物的储油种子中的脂质水平没有变化,并且与β-氧化中的突变不同,该cgi-58种子正常萌发和生长,不需要用蔗糖拯救(James et al.,2010)。
[1199] 编码CGi58多肽的核苷酸的实例包括来自以下的核苷酸:拟南芥(编码NP_194147.2的NM_118548.1;SEQ ID NO:130)、二穗短柄草(XP_003578450.1;SEQ ID NO:
131)、大豆(编码XP_003523638.1的XM_003523590.1;SEQ ID NO:132)、玉米(编码NP_
001149013.1的NM_001155541.1;SEQ ID NO:133)、两色高粱(编码XP_002460538.1的XM_
002460493.1;SEQ ID NO:134)、蓖麻(编码XP_002510485.1的XM_002510439.1;SEQ ID NO:
135)、蒺藜苜蓿(编码XP_003603733.1的XM_003603685.1;SEQ ID NO:136)以及水稻(编码EAZ09782.1)。
[1200] 在一实施方案中,本发明的遗传修饰下调CGi58的内源生成,其中CGi58由以下一个或多个编码:
[1201] i)包含如SEQ ID NO:130-136中任一个所示的序列的核苷酸,
[1202] ii)包含与SEQ ID NO:130-136中任一个或更多个至少30%相同的序列的核苷酸,以及
[1203] iii)在严格条件下杂交至i)或ii)中的一种或两者的多核苷酸。
[1204] 对TAG具有脂肪酶活性的其他脂肪酶包括SUGAR-DEPENDENT1三酰甘油脂肪酶(SDP1,参见例如Eastmond et al.,2006;Kelly et al.,2011)和在植物物种以及酵母(TGL4多肽)和动物细胞中发现的SDP1样多肽,其参与储存TAG的分解。SDP1和SDP1样多肽看来负责在萌发之后于种子中开始TAG分解(Eastmond et al.,2006)。在外源WRI1和DGAT1不存在的情况下,SDP1突变的植物表现出它们的TAG中升高水平的PUFA。如本文所用,“SDP1多肽”包括SDP1多肽、SDP1样多肽和它们在植物物种中的同系物。植物中的SDP1和SDP1样多肽的长度为800-910个氨基酸残基,具有可以与油体表面相关的patatin样酰基水解酶结构域,并且优先将TAG水解为DAG或MAG。据认为SDP1对水解TAG的sn-2位置的酰基具有偏好。拟南芥包含至少3个编码SDP1脂肪酶的基因,即SDP1(登录号NP_196024,核苷酸序列SEQ ID NO:163和其他物种中的同系物)、SDP1L(登录号NM_202720和其他物种中的同系物,Kelly et al.,2011)和ATGLL(At1g33270)(Eastmond et al,2006)。对减少基因活性特别关注的是在植物中的营养组织如叶、茎和根中表达的SDP1基因。因此可以通过减少植物部分中的SDP1多肽的活性来提高营养性植物部分中非极性脂质的水平,例如通过编码SDP1多肽的内源基因的突变或者引入编码减少内源SDP1基因表达的沉默RNA分子的外源基因。这样的减少在块茎作物如甜菜和马铃薯中以及在“高蔗糖”植物如甜高粱、甘蔗和甜菜中特别有益。
[1205] 选择的编码植物物种中的SDP1同源物(包括SDP1样同源物)的基因可以通过与已知SDP1基因序列的同源性容易地鉴定。已知的SDP1核苷酸或氨基酸序列包括登录号:欧洲油菜中,GN078290(SEQ ID NO:164)、GN078281、GN078283;荠菜(Capsella rubella),XP_006287072;可可(Theobroma cacao),XP_007028574.1;毛果杨,XP_002308909(SEQ ID NO:
166);桃树(Prunus persica),XP_007203312;梅花(Prunus mume),XP_008240737;苹果(Malus domestica),XP_008373034;蓖麻,XP_002530081;蒺藜苜蓿,XP_003591425(SEQ ID NO:167);番茄(Solanum lycopersicum),XP_004249208;菜豆,XP_007162133;大豆,XP_
003554141(SEQ ID NO:168);马铃薯,XP_006351284;大豆,XP_003521151;鹰嘴豆(Cicer arietinum),XP_004493431;黄瓜,XP_004142709;甜瓜,XP_008457586;麻风树,KDP26217;
葡萄,CBI3074;水稻,粳稻组BAB61223;水稻,籼稻组EAY75912;水稻,粳稻组NP_001044325;
两色高粱,XP_002458531(SEQ ID NO:169);二穗短柄草,XP_003567139(SEQ ID NO:165);
玉米,AFW85009;大麦,BAK03290(SEQ ID NO:172);节节麦(Aegilops tauschii),EMT32802;两色高粱,XP_002463665;玉米,NP_001168677(SEQ ID NO:170);大麦,BAK01155;节节麦,EMT02623;乌拉尔图小麦(Triticum urartu),EMS67257;小立碗藓,XP_
001758169(SEQ ID NO:171)。用于抑制内源基因表达的遗传构建体中使用的优选SDP1序列来自对应于在植物细胞、营养性植物部分或种子(无论哪个待修饰)中最高表达的基因的cDNA。如果期望减少该物种中的基因家族所有成员的活性,则优选在对应于植物物种中的所有SDP1基因的cDNA之间高度保守的核苷酸序列。
[1206] 在一实施方案中,本发明的遗传修饰下调SDP1的内源生成,其中SDP1由以下一个或多个编码:
[1207] i)序列如SEQ ID NO:163-174中任一个所示的核苷酸,
[1208] ii)序列与如SEQ ID NO:163-174所示的任何一个或多个序列至少30%相同的核苷酸,以及
[1209] iii)在严格条件下杂交至i)或ii)中的一种或两者的核苷酸序列。
[1210] 如实施例所示,植物叶中SDP1 TAG脂肪酶的表达和/或活性的减少大大增加TAG含量,在植物发育期间积累的TAG量和积累的较早时间方面,在共表达转录因子WRI1和脂肪酰基酰基转移酶的背景下。特别地,在开花之前于植物中观察到增加,并且在衰老发生时在重量基础(%干重)上高达约70%。增加是相对于用编码WRI1和脂肪酰基酰基转移酶的外源多核苷酸转化但缺少减少SDP1表达和/或活性的修饰的相应植物叶中观察到的TAG水平。
[1211] 减少植物部分中其他TAG分解代谢基因的表达也可以增加TAG含量,如编码酰基CoA氧化酶的ACX基因如Acx1(At4g16760和其他植物物种中的同系物)或Acx2(At5g65110和其他植物物种中的同系物)基因。参与脂质分解代谢的另一多肽是PXA1,其是β-氧化的脂肪酸输入所需要的过氧化物酶体ATP-结合盒转运蛋白(Zolman et al.2001)。
[1212] 从质体输出脂肪酸
[1213] 如本文所用,术语“增加脂肪酸输出细胞质体的多肽”是指辅助将脂肪酸从植物或其部分中的植物细胞的质体内转移至质体外(其可以是细胞的任何其他部分,例如内质网(ER))的任何多肽。这类多肽的实例包括但不限于C16或C18脂肪酸硫酯酶如FATA多肽或FATB多肽,C8-C14脂肪酸硫酯酶(其也是FATB多肽),脂肪酸转运蛋白如ABCA9多肽或长链酰基-CoA合成酶(LACS)。
[1214] 如本文所用,术语“脂肪酸硫酯酶”或“FAT”或“酰基-ACP硫酯酶”是指催化酰基-ACP中酰基部分和酰基载体蛋白(ACP)之间的硫酯键的水解以及游离脂肪酸的释放的酶。这类酶通常在从头合成脂肪酸的生物体的质体中发挥功能。如本文所用,术语“C16或C18脂肪酸硫酯酶”是指在质体中催化酰基-ACP中C16和/或C18酰基部分和ACP之间的硫酯键的水解以及游离C16或C18脂肪酸的释放的酶。然后在其转运出质体时,游离脂肪酸在质体被膜中重新酯化为CoA。质体中的脂肪酸硫酯酶(FAT)酶的底物特异性参与决定从质体输出的脂肪酸的链长度和饱和程度谱。基于它们的底物特异性和核苷酸序列,可以将FAT酶分为两类,FATA和FATB(EC 3.1.2.14)(Jones et al.,1995)。FATA多肽优选油酰基-ACP作为底物,而FATB多肽对不同链长度的饱和酰基-ACP表现出更高活性,如作用于棕榈酰-ACP产生游离棕榈酸。可用于本发明的FATA多肽的实例包括但不限于来自拟南芥(NP_189147)、花生(GU324446)、向日葵(AAL79361)、红花(AAA33020)、Morus notabilis(XP_010104178.1)、欧洲油菜(CDX77369.1)、蓖麻(XP_002532744.1)和亚麻荠(AFQ60946.1)的那些FATA多肽。可用于本发明的FATB多肽的实例包括但不限于来自玉米(AIL28766)、欧洲油菜(ABH11710)、向日葵(AAX19387)、拟南芥(AEE28300)、加州月桂(AAC49001)、花生(AFR54500)、蓖麻(EEF47013)和小颖短柄草(ABL85052.1)的那些FATB多肽。
[1215] 如本文所用,术语“脂肪酸转运蛋白”涉及质体膜中存在的多肽,其参与将脂肪酸从质体主动转移至质体外。可用于本发明的ABCA9(ABC转运蛋白A家族成员9)多肽的实例包括但不限于来自拟南芥(Q9FLT5)、荠菜(XP_006279962.1)、Arabis alpine(KFK27923.1)、亚麻荠(XP_010457652.1)、欧洲油菜(CDY23040.1)和芜菁(Brassica rapa)(XP_009136512.1)的那些ABCA9多肽。
[1216] 如本文所用,术语“酰基-CoA合成酶”或“ACS”(EC6.2.1.3)表示是连接酶家族成员的多肽,其催化通过腺苷酸化中间体进行的两步方法形成脂肪酰基-CoA,利用非酯化的脂肪酸、CoA和ATP作为底物产生酰基CoA酯、AMP和焦磷酸盐作为产物。如本文所用,术语“长链酰基-CoA合成酶”(LACS)是对至少C18游离脂肪酸底物具有活性的ACS,虽然其可以对任何C14-C20游离脂肪酸具有更广泛的活性。内源质体LACS酶位于质体的外膜中,并且与脂肪酸硫酯酶一起发挥功能用于从质体输出脂肪酸(Schnurr et al.,2002)。在拟南芥中,有至少9种鉴定的LACS基因(Shockey et al.,2002)。优选的LACS多肽是LACS9亚类的,其在拟南芥中是主要的质体LACS。可用于本发明的LACS多肽的实例包括但不限于来自拟南芥
(Q9CAP8)、亚麻荠(XP_010416710.1)、荠菜(XP_006301059.1)、欧洲油菜(CDX79212.1)、芜菁(XP_009104618.1)、雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)(XP_012450538.1)和葡萄(XP_
002285853.1)的那些LACS多肽。上文提到的多肽在其他物种中的同系物可以由本领域技术人员容易地鉴定。
[1217] 参与二酰甘油(DAG)生成的多肽
[1218] 还可以通过减少参与植物部分中的质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽的活性来提高例如营养性植物部分中的非极性脂质的水平,例如通过编码这样的多肽的内源基因的突变或者引入编码减少参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的靶基因表达的沉默RNA分子的外源基因。
[1219] 如本文所用,术语“参与质体中的二酰甘油(DAG)生成的多肽”是指直接参与二酰甘油合成的植物或其部分中的植物细胞的质体中的任何多肽。这类多肽的实例包括但不限于质体GPAT、质体LPAAT或质体PAP。
[1220] GPAT在本文件中的其他地方描述。可以靶向用于本发明中的下调的质体GPAT多肽的实例包括但不限于来自拟南芥(BAA00575)、荠菜(XP_006306544.1)、亚麻荠(010499766.1)、欧洲油菜(CDY43010.1)、芜菁(XP_009145198.1)、向日葵(ADV16382.1)和蜜柑(Citrus unshiu)(BAB79529.1)的那些质体GPAT多肽。其他物种中的同系物可以由本领域技术人员容易地鉴定。
[1221] LPAAT在本文件中的其他地方描述。技术人员会理解,靶向用于下调以减少质体中的DAG合成的质体LPAAT不是在质体外发挥功能的内源LPAAT,如ER中的那些,例如可用于产生包含中链长度脂肪酸的TAG。可以靶向用于本发明中的下调的质体LPAAT多肽的实例包括但不限于来自欧洲油菜(ABQ42862)、芜菁(XP_009137939.1)、拟南芥(NP_194787.2)、亚麻荠(XP_010432969.1)、大豆(XP_006592638.1)和马铃薯(XP_006343651.1)的那些质体LPAAT多肽。上文提到的多肽在其他物种中的同系物可以由本领域技术人员容易地鉴定。
[1222] 如本文所用,术语“磷脂酸磷酸酶”(PAP)(EC 3.1.3.4)是指水解3-sn-磷脂酸盐上的磷酸基团产生1,2-二酰基-sn-甘油(DAG)和磷酸盐的蛋白。可以靶向用于本发明中的下调的质体PAP多肽的实例包括但不限于来自拟南芥(Q6NLA5)、荠菜(XP_006288605.1)、亚麻荠(XP_010452170.1)、欧洲油菜(CDY10405.1)、芜菁(XP_009122733.1)、大豆(XP_003542504.1)和马铃薯(XP_006361792.1)的那些质体PAP多肽。上文提到的多肽在其他物种中的同系物可以由本领域技术人员容易地鉴定。
[1223] 通过增加植物部分中ER中涉及二酰基甘油(DAG)生成的多肽的活性,也可以增加例如营养性植物部分中TAG的水平。DAG也通过从PC中释放DAG部分而在本发明的植物和植物部分中产生,并且可以用于合成TAG。该DAG在本文中称为“PC衍生的DAG”。释放可以通过一种或多种酶磷脂酰胆碱:二酰基甘油胆碱-磷酸转移酶(PDCT),胆碱:二酰基甘油胆碱磷酸转移酶(CPT)或磷脂酶C(PLC)或磷脂酶D(PLD)的逆反应发生。这些酶导致ER而不是质体中生成DAG。如本文所用,术语“磷脂酰胆碱:二酰基甘油胆碱磷酸转移酶”或“PDCT”(EC 2.7.8.2)是指从磷脂(通常为PC)转移磷酸胆碱头基以产生DAG,或从DAG产生PC的逆反应的胆碱磷酸转移酶。因此,PDCT可以互相转换PC和DAG(Lu等,2009;Hu等,2012)。因此,正向反应的两个底物是胞苷一磷酸(CMP)和磷脂酰胆碱,并且两种产物是CDP-胆碱和DAG。PDCT属于磷脂酸磷酸酶相关蛋白家族,通常具有脂质磷酸酶/磷酸转移酶(LPT)结构域。在拟南芥中,PDCT由ROD1(At3g15820)和ROD2(At3g15830)基因编码(Lu等人,2009)。同源基因很容易在其他植物物种中鉴定出来(Guan等,2015)。本文提供了如SEQ ID NO:262-265(高粱和玉米PDCT,登录号XM_002437214和EU973573.1)的示例性PDCT编码区和多肽的序列,但是可以使用任何PDCT编码基因。示例性PDCT多肽具有由以下登录号提供的氨基酸序列:NP_
566527.1(拟南芥)、XP_010487422.1(亚麻芥)、XP_003531718.1(大豆)、XP_013695400.1(欧洲油菜)、XP_012073167.1(麻风树)、XP_002517643.1(蓖麻)、XP_013587626.1(甘蓝(Brassica oleracea))、XP_016725741.1和XP_016725742.1(陆地棉)、AQK82308.1、NP_
001145186.1(玉米)和XP_021306179.1(两色高粱)。可以容易地鉴定来自这些或其他植物、真菌或藻类物种的同源物和天然存在的变体并用于本发明。在一个实施方案中,所述同源物或变体与所列登录号的氨基酸序列具有至少95%相同性,优选具有至少99%相同性。在一个实施方案中,所述PDCT不是拟南芥PDCT(Lu等人,2009)。PDCT的表达增加增加酯化的酰基从PC到DAG的流动,并从而增加总脂肪酸中的TTQ含量以及本发明的营养性植物部分或细胞中的TAG水平,所述PDCT可以是本发明的细胞或植物的外源或内源的并且优选地由外源多核苷酸表达。可选地,通过基因突变或通过沉默RNA分子降低细胞或植物中PDCT活性的水平减少了来自DAG的PC的生成、反向PDCT反应,并且允许更多的用于TAG合成的从头DAG。
[1224] PDCT酶提供将18:1从DAG转移到PC中用于去饱和,并且还用于将多不饱和脂肪酸18:2和18:3从PC逆转移到DAG中,其可以用于TAG合成。脂肪酸标记实验表明,从头DAG和PC衍生的DAG由两个独立的DAG池(Bates 2016)代表,所述DAG池可能在ER中保持空间分离。一些报道表明,PC衍生的DAG可能是TAG合成中使用的DAG的主要形式(Bates和Browse,2011)。
[1225] 如本文所用,术语“CDP-胆碱:二酰基甘油胆碱磷酸转移酶”或“CPT”,(EC 2.7.8.2)是指催化胆碱基团从CDP-胆碱转移至DAG,形成PC和CMP的酶。该正向反应导致来自DAG的PC的净合成。CPT还催化从PC形成DAG的逆反应,可能允许细胞中DAG和PC水平的平衡。拟南芥含有编码CPT酶的两个基因(AtAAPT1和AtAAPT2,登录号AAC61768.1和
AAC61769.1)。任一基因的突变都会影响膜的稳态,并且双重突变体是致命的(Liu et al.,
2015)。示例性CPT酶具有由以下登录号提供的氨基酸序列:XP_010495346.1和XP_
019084815.1(亚麻芥);XP_013731103.1和XP_013720632.1(欧洲油菜);XP_013585950.1(甘蓝);XP_015572083.1(蓖麻);XP_016679754.1(陆地棉);XP_010687532.1(Beta vulgaris);XP_012081980.1(麻风树);XP_011070871.1(芝麻);NP_001151915.1和XP_
008649199.1(玉米);XP_002451408.1和XP_021305900.1(两色高粱)。可以容易地鉴定来自这些或其他植物、真菌或藻类物种的同源物和天然存在的变体并用于本发明。在一个实施方案中,所述同源物或变体与所列登录号的氨基酸序列具有至少95%相同性,优选具有至少99%相同性。
[1226] 磷脂酶是将磷脂水解成磷脂酸(PA)、DAG、游离脂肪酸(FFA)或溶血磷脂(LPL)等产品的酶,具体取决于磷脂酶的种类。如本文所用,术语“磷脂酶C”或“PLC”是指催化磷脂裂解形成DAG和磷酸化头基的酶,其中裂解发生在磷脂的磷酸基团和甘油骨架之间的酯键处。当磷脂是PC时,磷酸化的头基是磷酸胆碱。PLC不同于磷脂酶D酶以及磷脂酶A1和磷脂酶A2,所述磷脂酶D酶切割磷脂的头部基团以形成磷脂酸(PA)作为产物,而不是DAG作为产物,所述磷脂酶A1和磷脂酶A2从磷脂产生FFA。PLC是在植物、动物和原核生物中广泛存在的膜相关酶。PLC根据其底物特异性范围可分为三类:磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)、磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(PC-PLC)、以及水解糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定蛋白的PLC(GPI-PLC)(Pokotylo等,2013,Hong等,2016)。多域动物PI-PLC是调节钙水平和蛋白激酶C的G蛋白激活酶,并因此是细胞生长和发育的调节系统的关键组分。PI-PLC在本发明中不太优选。植物中的PC-PLC(也称为非特异性PLC(NPC))具有更宽的底物范围并且通常在PC上最具活性,并因此在本发明中是优选的。已经在细菌(Titball 1993)、真菌(Morelle等人,2005)和植物(Hong等人,2016)中鉴定了PC-PLC,更优选植物。已经在以下中鉴定出PC-PLC基因:拟南芥中的6个基因(Wang,2001;Nakamura等,2005)、大豆中的9个基因(Huang等,2010)、水稻中的5个基因(Singh等,2013)和多个不同植物物种的复制物。基于与拟南芥氨基酸序列的同源性,植物PC-PLC分为几个亚组,即NPC1、NPC2、NPC3-5和NPC6亚组(Pokotylo等,2013),所述亚组也有不同的(但是重叠)底物特异性和组织分布。例如,拟南芥NPC4显示出对PC和PE的活性,对PS有轻微活性,但对PA和PIP2没有活性。NPC5能够切割PC和PE,而NPC3显示出溶血磷脂酸(LPA)磷酸酶活性,导致生成MAG以及切割PC。NPC4在成熟叶中表达,NPC6在大多数组织中表达。拟南芥PLC具有510至540个氨基酸残基。在植物中,PLC涉及脂质重构和植物对磷酸盐损失,和渗透、盐和热胁迫,以及其他功能的响应。PLC的实例包括鉴定的具有以下登录号的氨基酸序列的那些:来自拟南芥:NPC1,NP_172203.2;NPC2,NP_180255.1;NPC4,NP_
566206.1;NPC5,NP_566207.1;NPC6,NP_190430.2;来自亚麻荠的NPC1,XP_010457889.1;
NPC2,XP_010473071.1;NPC4,XP_010463802.1;NPC5,XP_010485694.1;NPC6,XP_
010426358.1;来自欧洲油菜的NPC1,XP_013687149.1;NPC2,XP_013744020.1;NPC4,XP_
013682889.1;NPC6,XP_002511167.1;来自蓖麻的NPC1,XP_002525632.1;NPC4,XP_
002524007.1;NPC6,XP_002511167.1;来自陆地棉的NPC1,XP_016715492.1;NPC2,XP_
016745351.1;NPC4,XP_016697678.1;NPC6,XP_016734150.1;来自甜菜的NPC1,XP_
010685575.1;NPC2,XP_010673757.1;NPC4,XP_010691936.1;来自玉米NPC1同系物,NP_
001170209.1;来自水稻的NPC1,XP_015631592.1;来自大豆的NPC1,XP_003551286.1;NPC2,XP_003556783.1;NPC4,XP_003521010.1;NPC6,XP_003523153.1;NPC6,XP_003526950.1;来自麻风树的NPC2,XP_012065897.1;NPC4,XP_012070293.1;NPC6,XP_012090681.1;来自马铃薯的NPC2,XP_006362756.1;来自油棕的NPC2,XP_010938556.1;NPC4,XP_010919939.1;
来自二穗短柄草的NPC2,XP_003565100.1;来自地三叶(Trifolium subterraneum)的NPC4,GAU26202.1;NPC6,GAU26767.1;来自蒺藜苜蓿的NPC4,XP_013444051.1;来自向日葵的NPC6,XP_021984157.1。可以容易地鉴定来自这些或其他植物、真菌或藻类物种的同源物和天然存在的变体并用于本发明。在一个实施方案中,所述同源物或变体与所列登录号的氨基酸序列具有至少95%相同性,优选至少99%相同性。
[1227] 如本文所用,术语“磷脂酶D”或“PLD”是指催化膜磷脂的头部基团的磷酸二酯键断裂以形成磷脂酸(PA)和可溶性头基的酶,所述断裂发生在在磷脂的甘油主链的远端的磷酸二酯处。当磷脂是PC时,可溶性头基产物是胆碱。随后通过PAP的作用将PA转化为DAG。已在植物、动物、真菌和原核生物中鉴定出许多PLD。检查的所有植物物种具有至少10个PLD基因的PLD家族(Wang,2005),例如拟南芥PLD家族有12个鉴定了的PLD基因。根据序列和酶学特性将PLD分为α,β,γ,δ,ε和ζ亚群(Hong等,2016)。PLD具有涉及钙离子和磷脂结合的约130个氨基酸的C2结构域或者普列克底物蛋白(pleckstrin)同源性(PH)结构域和phox(PX)同源结构域。所有检测的真核PLD都含有两个重复的催化HKD基序,所述两个重复的催化HKD基序在拟南芥PLD中被超过300个的氨基酸分开,但它们相互作用形成活性位点(Hong等,2013)。示例性PLD包括来自以下登录号的那些:来自拟南芥,AAL06337.1,CAJ58441.1;来自亚麻荠,XP_010465702.1,XP_010430169.1;来自陆地棉,XP_016724300.1;来自蓖麻,XP_
015573380.1;来自番茄,XP_004229274.1;来自麻风树,XP_012083994.1;来自大豆,XP_
003534832.1,NP_001275522.1;来自油棕,XP_010921600.1;来自芜菁(Brassica rapa),XP_009146059.1;来自甜菜,XP_010693582.1和XP_016713715.1;蒺藜苜蓿XP_
003591178.2;来自欧洲油菜,XP_013677646.1。可以容易地鉴定来自这些或其他植物、真菌或藻类物种的同源物和天然存在的变体并用于本发明。在一个实施方案中,所述同源物或变体与所列登录号的氨基酸序列具有至少95%相同性,优选至少99%相同性。
[1228] 脂肪酸输入质体
[1229] 还可以通过减少植物部分中的TGD多肽的活性来提高营养性植物部分中的非极性脂质的水平,例如通过编码TGD多肽的内源基因的突变或者引入编码减少内源TGD基因表达的沉默RNA分子的外源基因。如本文所用,“三半乳糖基二酰甘油(TGD)多肽”是参与ER至叶绿体的脂质运输(Xu et al.,2010)以及参与形成对脂质具有通透酶功能的蛋白复合物的多肽。已知4种这样的多肽形成或与TGD通透酶相关,即TGD-1(登录号At1g19800和其他物种中的同系物)、TGD-2(登录号At2g20320和其他物种中的同系物)、TGD-3(登录号NM-105215和其他物种中的同系物)和TGD-4(At3g06960和其他物种中的同系物)(US 20120237949)。TGD5还参与从ER到叶绿体脂质运输,并且TGD5的下调与油产量增加相关(US2015/337017;
Fan等,2015)。示例性TGD5多肽的序列在本文中以SEQ ID NO:250-253(高粱和玉米TGD5,登录号XM_002442154和EU972796.1)提供。据认为TGD-1、-2和-3多肽是与叶绿体的内被膜相关的ATP-结合盒(ABC)转运蛋白的组分。TGD-2和TGD-4多肽结合至磷脂酸,而TGD-3多肽的功能为叶绿体基质中的ATPase。如本文所用,“内源TGD基因”是编码植物中的TGD多肽的基因。拟南芥中TGD-1基因的突变引起三酰甘油、寡半乳糖脂和磷脂酸(PA)的积累(Xu et al.,2005)。TGD基因或SDP1基因中的突变,或者实际上植物中的任何期望基因中的突变,可以通过如本领域已知的人工锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子(TALEN)或CRISPR技术(使用Cas9型核酸酶)以位点特异性方式引入。优选的编码沉默RNA的外源基因是编码双链RNA分子如发夹RNA或人工微RNA前体的那些外源基因。
[1230] 蔗糖代谢
[1231] 本发明的细胞、植物和植物部分中的总脂肪含量的TAG水平和/或TTQ也可以通过改变蔗糖代谢来增加,特别是在诸如甘蔗、高粱和玉米等植物的茎中。在一个实施方案中,这通过增加蔗糖代谢多肽(例如转化酶或蔗糖合酶)或蔗糖转运多肽(例如SUS1、SUS4、SUT2、SUT4或SWEET)的表达来实现。这些多肽的作用是增加细胞胞质溶液中蔗糖及其单糖组分的供应和/或减少细胞液泡中蔗糖的转移和/或储存,特别是在干细胞中。这些多肽的实例的序列提供在SEQ ID NO:274-292中。诸如bCIN、INV2或INV3的转化酶将蔗糖转化为己糖,其可以从液泡输出到细胞质中(McKinley等,2016)。增加SUS1或SUS4的表达将细胞质蔗糖分解成己糖用于糖酵解和从头脂肪酸合成,而不是将蔗糖转移到液泡中(例如在茎实质细胞中)(McKinley等,2016)。增加糖转运多肽如液泡膜(tonoplast)蔗糖输出物(例如SUT2或SUT4)或SWEET多肽的表达释放液泡蔗糖用于细胞溶质糖酵解并增加从头脂肪酸生物合成(Bihmidine等,2016;Qazi等,2012;Schneider等人,2012;Hedrich等人,2015;Klemens等人,2013)。
[1232] 通过降低TST多肽(如TST1或TST2)的水平,特别是在诸如甘蔗、高粱和玉米的植物的茎中,也可以增加本发明的细胞、植物和植物部分中的总脂肪含量的TAG水平和/或TTQ。可以通过突变编码多肽的内源基因或通过引入编码沉默RNA分子的外源多核苷酸来降低TST多肽。示例性TST cDNA和多肽的序列以SEQ ID NO:266-273提供。
[1233] 脂肪酸修饰酶
[1234] 如本文所用,术语“FAD2”是指膜结合的Δ-12脂肪酸去饱和酶,其将油酸(C18:1Δ9)去饱和以产生亚油酸(C18:2Δ9,12)。
[1235] 如本文所用,术语“环氧化酶”或“脂肪酸环氧化酶”是指将环氧基引入脂肪酸的酶,其导致产生环氧基脂肪酸。在优选的实施方案中,在脂肪酸链上的第12个碳上引入环氧基,在此情形中该环氧化酶是Δ12-环氧化酶,特别是C16或C18脂肪酸链。所述环氧化酶可以是Δ9-环氧化酶、Δ15环氧化酶、或者如本领域已知的那样作用于酰基链中的不同位置。所述环氧化酶可以是P450类的。优选的环氧化酶是如WO98/46762中所述的单氧化酶类的。
许多环氧化酶或推定的环氧化酶已被克隆并且是本领域已知的。环氧化酶的其他实例包括含有WO 2009/129582的SEQ ID NO:21中提供的氨基酸序列的蛋白,由来自还阳参(Crepis paleastina)(CAA76156,Lee et al.,1998)、琉璃菊(Stokesia laevis)(AAR23815)(单氧化酶类型)、大戟(Euphorbia lagascae)(AAL62063)(P450类型),人CYP2J2(花生四烯酸环氧化酶,U37143)的基因编码的多肽;人CYP1A1(花生四烯酸环氧化酶,K03191)、以及它们的变体和/或突变体。
[1236] 如本文所用,术语“羟化酶”或“脂肪酸羟化酶”是指将羟基引入脂肪酸内的酶,其导致产生羟基化的脂肪酸。在一优选实施方案中,羟基被引入C18脂肪酸链的第2、第12和/或第17个碳。优选地,羟基被引入第12个碳,在此情形中该羟化酶是Δ12-羟化酶。在另一优选实施方案中,羟基被引入C16脂肪酸链的第15个碳。羟化酶还可以具有作为脂肪酸去饱和酶的酶活性。编码Δ12-羟化酶的基因的实例包括来自以下的那些:蓖麻(AAC9010,van de Loo 1995);Physaria lindheimeri(ABQ01458,Dauk et al.,2007);Lesquerella fendleri(AAC32755,Broun et al.,1998);野胡萝卜(Daucus carota)(AAK30206);将脂肪酸的末端羟基化的脂肪酸羟化酶,例如:拟南芥CYP86A1(P48422,脂肪酸ω-羟化酶);救荒野豌豆(Vicia sativa)CYP94A1(P98188,脂肪酸ω-羟化酶);小鼠CYP2E1(X62595,月桂酸ω-1羟化酶);大鼠CYP4A1(M57718,脂肪酸ω-羟化酶),以及它们的变体和/或突变体。
[1237] 如本文所用,术语“轭合酶(conjugase)”或“脂肪酸轭合酶”是指能够在脂肪酸的酰基链中形成共轭键的酶。轭合酶的实例包括由来自以下的基因所编码的那些:金盏花(Calendula officinalis)(AF343064,Qiu et al.,2001);油桐(AAN87574,Dyer et al.,2002);石榴(Punica granatum)(AY178446,Iwabuchi et al.,2003)和栝楼
(Trichosanthes kirilowii)(AY178444,Iwabuchi et al.,2003);以及它们的变体和/或突变体。
[1238] 如本文所用,术语“乙炔酶(acetylenase)”或“脂肪酸乙炔酶”是指将三键引入脂肪酸的酶,其导致产生乙炔(acetylenic)脂肪酸。在一优选实施方案中,三键被引入至C18脂肪酸链的第2、第6、第12和/或第17个碳。乙炔酶的实例包括来自向日葵(AA038032、ABC59684)的那些,以及它们的变体和/或突变体。
[1239] 此类脂肪酸修饰基因的实例包括通过推定功能分组的根据以下登录号的蛋白、以及来自其他物种的同源物:Δ12-乙炔酶ABC00769、CAA76158、AAO38036、AAO38032;Δ12轭合酶AAG42259、AAG42260、AAN87574;Δ12去饱和酶P46313、ABS18716,AAS57577、AAL61825、AAF04093、AAF04094;Δ12环氧化酶XP_001840127、CAA76156、AAR23815;Δ12羟化酶ACF37070、AAC32755、ABQ01458、AAC49010;以及Δ12 P450酶如AF406732。
[1240] 沉默抑制子
[1241] 在一实施方案中,本发明的转基因植物或其部分可以包含沉默抑制子。
[1242] 如本文所用,“沉默抑制子”增强本发明的植物或其部分中的转基因表达。例如,沉默抑制子的存在导致当与缺少沉默抑制子的相应植物或其部分相比时,本发明的植物或其部分中的外源多核苷酸产生更高水平的多肽。在一实施方案中,相对于不同长度的dsRNA分子,沉默抑制子优先结合长度为21个碱基对的dsRNA。这是至少p19类型的沉默抑制子的特性,即p19及其功能直系同源物。在另一实施方案中,相对于具有平端的相应的双链RNA分子,沉默抑制子优先结合至具有突出的5’末端的双链RNA分子。这是V2类型的沉默抑制子的特性,即p19及其功能直系同源物。在一实施方案中,dsRNA分子或其加工的RNA产物包含至少19个连续的核苷酸,优选其长度为19-24个核苷酸,在双链发夹RNA分子或加工的RNA产物的情况下具有19-24个连续的碱基对,更优选长度上由20、21、22、23或24个核苷酸组成,并且优选包含甲基化的核苷酸,其与靶RNA的区域的补体至少95%相同,并且其中靶RNA的区域是i)在靶RNA的5’非翻译区内,ii)在靶RNA的5’一半内,iii)在靶RNA的编码蛋白的开放阅读框内,iv)在靶RNA的3’一半内,或者v)在靶RNA的3’非翻译区内。
[1243] 关于沉默抑制子的更多细节是本领域公知的,并且描述于WO 2013/096992和WO 2013/096993中。
[1244] 多核苷酸
[1245] 术语“多核苷酸”和“核酸”可交换使用。它们是指任何长度的聚合物形式的核苷酸,即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或者它们的类似物。本发明的多核苷酸可以具有基因组、cDNA、半合成或合成起源,可为双链或单链的,并且归因于其起源或操纵:(1)与其在自然界中相关的多核苷酸的全部或一部分无关,(2)连接到其在自然界中所连接的之外的多核苷酸,或者(3)不存在于自然界中。以下是多核苷酸的非限制性实例:基因或基因片段的编码或非编码区、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、任何序列的嵌合DNA、核酸探针和引物。为了体外使用,多核苷酸可以包含修饰的核苷酸,如通过与标记组分缀合。
[1246] 如本文所用,“分离的多核苷酸”是指已从其天然状态下与之相关或连接的多核苷酸序列中分离的多核苷酸,或者非天然存在的多核苷酸。
[1247] 如本文所用,术语“基因”将采取其最广泛的含义,并且包括以下脱氧核糖核苷酸序列,其包含结构基因的转录区以及发生翻译时的蛋白编码区并包括位于5'和3'两个末端上的编码区附近的序列,它们在任一末端上距离末端的距离为至少约2kb并参与基因的表达。就这一点而言,基因包含与给定基因天然相关的控制信号如启动子、增强子、终止和/或多腺苷酸化信号,或者包含异源控制信号,在此情况下,基因称作“嵌合基因”。位于蛋白编码区的5'并存在于mRNA上的序列称作5'非翻译序列。位于蛋白编码区的3'或并存在于mRNA上的序列称作3'非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA和基因组两种形式。基因的基因组形式或克隆包含可通过称为“内含子”、“间插区”或“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子是转录为核RNA(nRNA)的基因片段。内含子可以包含调控元件如增强子。内含子从核或原代转录物中移除或“剪除”;因此内含子不存在于mRNA转录物中。包含至少一个内含子的基因可以进行可变剪接,导致来自单一转录基因的可选mRNA,因此导致多肽变体。天然状态的基因或嵌合基因可以缺少内含子。mRNA在翻译过程中起到指定新生多肽中的氨基酸序列或顺序的作用。术语“基因”包括编码本文所述的本发明蛋白的全部或一部分的合成或融合分子以及与上文任何一种序列互补的核苷酸序列。
[1248] 如本文所用,“嵌合DNA”是指不是天然存在于自然界中的任何DNA分子;在本文中也称作“DNA构建体”或“遗传构建体”。通常,嵌合DNA包含不是一起天然存在于自然界中的调控和转录或蛋白编码序列。因此,嵌合DNA可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列,或者衍生自相同来源的调控序列和编码序列但以不同于自然界中所存在的方式排列。开放阅读框可以或可以不连接至其天然上游和下游调控元件。开放阅读框可以整合至例如植物基因组中、处于非天然位置或者处于复制子或载体中,在其中它在天然状态下不存在,如细菌质粒或病毒载体。术语“嵌合DNA”不限于能在宿主中复制的DNA分子,而是包括能够通过例如特定的衔接子序列连接至复制子中的DNA。
[1249] “转基因”是已通过转化程序引入基因组中的基因。该术语包括子代植物或其部分例如营养性植物部分中的被引入其祖细胞的基因组内的基因。这类子代细胞等可以至少是所述经首次转化的祖细胞的第三代或第四代子代,或者是祖代转基因植物(在本文中称作T0植物)的第三代或第四代子代。子代可以通过性繁殖或者营养性地产生,例如,从马铃薯中的块茎或甘蔗中的的截根苗(ratoon)产生。术语“遗传修饰的”、“遗传修饰”及其变化是范围更宽的术语,其包括通过转化或转导将基因引入细胞,使细胞中的基因突变以及从遗传学上改变或调节细胞中的基因调控,或如上所述进行修饰的任何细胞的子代。
[1250] 如本文所用的“基因组区域”是指基因组内的位置,在该位置处已将转基因或转基因群组(在本文中也称作基因簇)插入细胞或其前体细胞。这类区域仅包含已通过人工干预如通过本文所述的方法整合的核苷酸。
[1251] 本发明的“重组多核苷酸”是指已通过人工重组方法构建或修饰的核酸分子。重组多核苷酸与其天然状态相比可以改变的量存在于细胞或植物或其部分中或以改变的速率表达(例如,就mRNA而言)。在一实施方案中,将多核苷酸引入天然不含该多核苷酸的细胞。通常,将外源DNA用作mRNA转录的模板,然后在转化的细胞内翻译为编码本发明的多肽的氨基酸残基的连续序列。在另一实施方案中,多核苷酸是植物或其部分的内源多核苷酸,并且其表达通过重组手段改变,例如,将外源控制序列引入所关注的内源基因的上游,以使得转化的植物或其部分能表达由所述基因编码的多肽,或者通过ZFN、Talen或CRISPR方法在所关注的基因中产生缺失。
[1252] 本发明的重组多核苷酸包括尚未与其所存在的基于细胞或无细胞的表达系统的其他组分分离的多核苷酸,以及在所述基于细胞或无细胞的系统中产生、随后从至少某些其他组分中纯化的多核苷酸。多核苷酸可以是核苷酸的连续延伸(contiguous stretch),或者包含来自不同来源(天然存在的和/或合成的)的接合形成单个多核苷酸的核苷酸的两个或更多个连续延伸。通常,这类嵌合多核苷酸包含至少一个编码本发明的多肽的开放阅读框,其可操纵地连接至适合驱动该开放阅读框在所关注的细胞中转录的启动子。
[1253] 关于所定义的多核苷酸,应当理解高于上文所提供的那些值的%相同性数字会涵盖优选的实施方案。因此,当适用时,根据最小%相同性数字,优选多核苷酸包含与相关指定的SEQ ID NO至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,更优选至少90%,更优选至少91%,更优选至少92%,更优选至少
93%,更优选至少94%,更优选至少95%,更优选至少96%,更优选至少97%,更优选至少
98%,更优选至少99%,更优选至少99.1%,更优选至少99.2%,更优选至少99.3%,更优选至少99.4%,更优选至少99.5%,更优选至少99.6%,更优选至少99.7%,更优选至少
99.8%,以及甚至更优选99.9%相同的多核苷酸。
[1254] 本发明的多核苷酸或可用于本发明的多核苷酸可以在严格条件下选择性地杂交至本文所定义的多核苷酸。如本文所用,严格条件是以下那些:(1)在42℃下在杂交期间采用诸如甲酰胺的变性剂,例如50%(v/v)甲酰胺与0.1%(w/v)牛血清白蛋白、0.1%Ficoll、0.1%聚乙烯吡咯烷酮、含750mM NaCl、75mM柠檬酸钠的50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5);或者(2)在42℃下在0.2x SSC和0.1%SDS中采用50%甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075 M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1%焦磷酸钠、5x Denhardt溶液、超声处理的鲑精DNA(50g/ml)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖;和/或(3)在50℃下采用低离子强度和高温进行洗涤,例如0.015 M NaCl/0.0015 M柠檬酸钠/0.1%SDS。
[1255] 本发明的多核苷酸当与天然存在的分子相比时可以具有一个或多个突变,它们为核苷酸残基的缺失、插入或取代。相对于参考序列,具有突变的多核苷酸可以是天然存在的(也就是说,从天然来源中分离)或合成的(例如,通过对如上所述的核酸进行位点定向诱变或DNA改组)。
[1256] 减少基因表达的多核苷酸
[1257] RNA干扰
[1258] RNA干扰(RNAi)对于特异性地减少基因表达特别有用,如果所述基因编码蛋白,这导致特定蛋白的产生减少。虽然不希望用理论来进行局限,Waterhouse等(1998)已经提供了dsRNA(二倍体RNA)可用于减少蛋白产生的机制的模型。这个技术依赖于包含与所关注的基因的mRNA或其部分基本上相同的序列的dsRNA分子的存在。方便地,所述dsRNA可以从重组载体或宿主细胞中的单个启动子产生,其中正义和反义序列旁侧有不相关的序列使得所述正义和反义序列能够杂交以形成dsRNA分子,其中不相关的序列形成结构。合适的dsRNA分子的设计和产生是本领域技术人员能力范围之内的,特别是参考Waterhouse et al.(1998),Smith et al.(2000)、WO 99/32619、WO 99/53050、WO 99/49029和WO 01/34815。
[1259] 在一实例中,引入DNA指导至少部分双链RNA产物(与待失活的靶基因有同源性)的合成,例如SDP1、TGD、质体GPAT、质体LPAAT、质体PAP、AGPase基因。因此该DNA包含正义和反义序列,这二者在转录为RNA时,可以杂交以形成双链RNA区。在本发明的一实施方案中,正义和反义序列被间隔区分开,所述间隔区包含内含子,该内含子在转录为RNA时被剪切掉。此安排已经显示出导致更高效率的基因沉默(Smith et al.,2000)。双链区可以包含一个或两个RNA分子,其转录自一个DNA区或两个。据认为双链分子的存在引发内源系统的应答,破坏双链RNA以及来自靶基因的同源RNA转录物,有效降低或消除靶基因的活性。
[1260] 杂交的正义和反义序列的长度每个均应为至少19个连续的核苷酸,优选至少50个连续的核苷酸,更优选至少100个或至少200个连续的核苷酸。一般来说,使用对应于靶基因mRNA区域的100-1000个核苷酸的序列。可以使用对应于整个基因转录物的全长序列。正义序列与靶转录物的相同性程度(因此还有反义序列与靶转录物的补体的相同性)应为至少85%、至少90%或至少95-100%。所述RNA分子当然可以包含不相关的序列,其可发挥作用以稳定该分子。所述RNA分子可以在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III启动子的控制下表达。后者的实例包括tRNA或snRNA启动子。
[1261] 优选的小干扰RNA("siRNA")分子包含与靶mRNA的大约19-21个连续核苷酸相同的核苷酸序列。优选地,所述siRNA序列以双核苷酸AA起始,包含约30-70%的GC含量(优选30-60%,更优选40-60%以及更优选约45%-55%),并且与所要引入的生物体基因组中除靶标之外的任何核苷酸序列不具有高百分比相同性,例如,通过标准的BLAST搜索确定。
[1262] 微RNA
[1263] 微RNA(缩写为miRNA)一般是19-25个核苷酸(在植物中通常为约20-24个核苷酸)的非编码RNA分子,其衍生自更大的前体(形成不完美的茎-环结构)。miRNA结合至靶信使RNA转录物(mRNA)上的互补序列,通常导致翻译阻抑或者靶标降解和基因沉默。如本领域公知的,可以基于天然miRNA设计人工miRNA(amiRNA)用于减少所关注的任何基因的表达。
[1264] 在植物细胞中,据认为miRNA前体分子在细胞核中进行大规模加工。pri-miRNA(包含一个或多个局部双链或“发夹”区以及mRNA通常的5'"帽"和多腺苷酸化尾巴)被加工为较短的miRNA前体分子(也包括茎-环或反折叠(fold-back)结构且被命名为"pre-miRNA")。在植物中,pre-miRNA由独特的DICER样(DCL)酶切割,产生miRNA:miRNA*二倍体。在转移出细胞核之前,这些二倍体被甲基化。
[1265] 在细胞质中,来自所述miRNA:miRNA二倍体的miRNA链被选择性地加入到有活性的RNA-诱导沉默复合物(RISC)中用于靶标识别。该RISC-复合物包含特定子集的Argonaute蛋白,其发挥序列特异性基因压制作用(参见,例如,Millar and Waterhouse,2005;Pasquinelli等,2005;Almeida and Allshire,2005)。
[1266] 共抑制
[1267] 基因可以阻抑相关内源基因和/或已存在于基因组中的转基因的表达,称作同源性依赖性基因沉默的现象。同源性依赖性基因沉默的大部分的情况分为两类——在转基因的转录水平发挥作用的那些,以及在转录后运作的那些。
[1268] 转录后同源性依赖性基因沉默(即,共抑制)描述的是转基因植物中转基因和相关的内源或病毒基因表达的丧失。共抑制通常(但并不总是)在转基因转录物丰富的时候发生,并且通常认为其在mRNA加工、定位和/或降解的水平触发。已存在若干模型以解释共抑制如何发挥作用(参见Taylor,1997)。
[1269] 共抑制包括将额外拷贝的基因或其片段以针对用于其表达的启动子而言有义的方向引入植物中。本领域技术人员可以确定正义片段的大小,其与靶基因区的对应性、以及其与靶基因的序列相同性程度。在某些情况下,基因序列的额外拷贝干扰靶植物基因的表达。对于共抑制方法的实施,参考WO 97/20936和EP 0465572。
[1270] 反义多核苷酸
[1271] 术语“反义多核苷酸”应当理解为表示DNA或RNA分子,其至少与编码内源多肽的特定mRNA分子的一部分互补,并且能够干扰转录后的事件如mRNA的翻译。反义方法的使用是本领域公知的(参见例如,G.Hartmann and S.Endres,Manual of  Antisense Methodology,Kluwer(1999))。反义技术在植物中的使用已经由Bourque(1995)和Senior(1998)进行了综述。Bourque(1995)列举了如何在植物体系中使用反义序列作为失活方法的大量实例。Bourque还提到了,可能并不必需要达成任何酶活性的100%抑制,因为部分抑制已经可以导致体系中可测量的变化。Senior(1998)提到了,反义方法现在是用于操控基因表达的很成熟的技术。
[1272] 在一实施方案中,反义多核苷酸在生理条件下杂交,即,反义多核苷酸(其为全部或部分单链)至少能够在细胞中的正常条件下与编码多肽的mRNA(例如,SDP1、TGD、质体GPAT、质体LPAAT、质体PAP或AGPase mRNA)形成双链多核苷酸。
[1273] 反义分子可以包括对应于结构基因的序列或者用于实现针对基因表达或沉默事件的控制的序列。例如,反义序列可以对应于内源基因的靶向编码区、或者5'-非翻译区(UTR)或3'-UTR或者这些的组合。其可以与内含子序列(可以在转录期间或转录后被剪掉)部分互补,优选仅与靶基因的外显子序列互补。考虑到一般非常多样的UTR,靶向这些区域提供了基因抑制的更高特异性。
[1274] 反义序列的长度应当为至少19个连续核苷酸,优选至少50个核苷酸,并且更优选至少100、200、500或1000个核苷酸。可以使用与整个基因转录物互补的全长序列。长度最优选为100-2000个核苷酸。反义序列与靶标转录物的相同性程度应当为至少90%,并且更优选95-100%。反义RNA分子当然可以包含不相关的序列,其可发挥作用以稳定该分子。
[1275] 重组载体
[1276] 本发明的一实施方案包括重组载体,其包含本文所定义的至少一种多核苷酸并能够将该多核苷酸递送入宿主细胞。重组载体包括表达载体。重组载体包含异源多核苷酸序列,即,天然不与本文所定义的多核苷酸相邻的多核苷酸序列,优选地,源自不同的物种。载体可以是RNA或DNA,并且通常为病毒载体、衍生自病毒、或为质粒。质粒载体通常包含附加的核酸序列,以便于在原核细胞中表达盒的选择、扩增和转化,例如,pUC衍生的载体、pGEM衍生的载体或者包含一个或多个T-DNA区域的二元载体。附加的核酸序列包括复制起点(提供载体的自主复制),优选编码抗生素或除草剂抗性的选择标记基因,提供多个位点以插入核酸构建体中编码的核酸序列或基因的独特的多克隆位点,以及增强原核和真核(特别是植物)细胞转化的序列。
[1277] 如本文所用的“可操纵地连接”是指两个或更多个核酸(例如,DNA)片段之间的功能关系。通常,是指转录序列的转录调控元件(启动子)的功能关系。例如,将启动子可操纵地连接至本文所定义的多核苷酸的编码序列,如果它在合适的细胞中刺激或调节该编码序列的转录。一般来说,可操作地连接至转录序列的启动子转录调控元件与转录序列在物理上是连续的,即它们是顺式作用的。但是,一些转录调控元件如增强子不必与其增强转录的编码序列在物理上连续或靠近编码序列。
[1278] 当存在多个启动子时,每个启动子可以独立地为相同的或不同的。
[1279] 重组载体还可以包含一个或多个信号肽序列以使得本文所定义的表达多肽保持在细胞中的内质网(ER)中,或者转移至质粒中和/或包含融合序列,其导致核酸分子作为融合蛋白表达。合适的信号片段的实例包括能够引导本文所定义的多肽分泌或定位的任何信号片段。
[1280] 为了有利于鉴定转化体,重组载体有利地包含选择或筛选标记基因。“标记基因”表示使表达该标记基因的细胞具有不同的表型并因此允许将此类转化细胞与没有该标记的细胞进行区分的基因。选择标记基因赋予一种性状,可以根据对选择剂(如,除草剂、抗生素)的抗性对其加以“选择”。筛选标记基因(或报告基因)赋予可以通过观察或测试,即,通过“筛选”进行鉴定的性状(例如,不存在于未转化的细胞中的β-葡糖酸酶、荧光素酶、GFP或其他酶活性)。选择植物转化体的示例性选择标记包括但不限于:编码潮霉素B抗性的hyg基因;赋予卡那霉素、巴龙霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因;赋予谷胱甘肽源除草剂抗性的来自大鼠肝脏的谷胱甘肽-S-转移酶基因,例如,EP256223中所述;过量表达时赋予谷氨酰胺合成酶抑制剂(诸如草胺膦)抗性的谷氨酰胺合成酶基因,例如,WO 87/05327中所述;赋予选择剂草胺膦抗性的来自绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的乙酰基转移酶基因,例如,EP 275957中所述;编码赋予草双甘膦耐性的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因,例如,Hinchee et al.(1988)所述;赋予双丙氨磷抗性的bar基因,例如,WO91/02071中所述;赋予溴苯腈抗性的来自臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)的腈水解酶基因,如bxn(Stalker et al.,1988);赋予甲氨蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(Thillet et al.,1988);赋予咪唑啉酮类、磺酰脲类或其他ALS抑制性化学剂的突变乙酰乳酸合酶基因(ALS)(EP 154,204);赋予5-甲基色氨酸抗性的突变邻氨基苯甲酸合成酶基因;或者赋予除草剂抗性的茅草枯脱卤素酶基因。
[1281] 优选地,重组载体稳定地整合至细胞如植物细胞的基因组中。因此,重组载体可以包含允许载体整合至细胞的基因组或染色体中的合适元件。
[1282] 表达载体
[1283] 如本文所用,“表达载体”是能够转化宿主细胞并实现一种或多种指定多核苷酸表达的DNA载体。本发明的表达载体包含调控序列如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点以及与宿主细胞相容并控制本发明的多核苷酸表达的其他调控序列。具体地讲,本发明的表达载体包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制起始的那些转录控制序列,例如启动子、增强子、操纵子和阻遏子序列。所用调控序列的选择取决于所关注的目标生物如植物和/或目标器官或组织。这类调控序列可以获得自任何真核生物如植物或植物病毒,或者可以化学合成。许多适合植物细胞稳定转染或适合建立转基因植物的载体已在例如Pouwels et al.,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985,supp.1987,Weissbach and Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989,和Gelvin et al.,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers,1990中有所描述。通常,植物表达载体包含例如受5'和3'调控序列的转录控制的一个或多个克隆植物基因以及显性选择标记。这类植物表达载体还可以包含启动子调控区域(例如,控制诱导或组成型、受环境或发育调控的、或者细胞或组织特异性表达的调控区域)、转录起始位点、核糖体结合位点、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。
[1284] 许多在植物细胞中具有活性的组成型启动子已得到了描述。在植物中组成型表达的合适启动子包括但不限于:花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)35S、来自核酮糖-1,5-双-磷酸羧化酶小亚基(SSU)的光诱导型启动子、水稻细胞溶质丙糖磷酸异构酶启动子、拟南芥腺嘌呤磷酸核糖转移酶启动子、水稻肌动蛋白1基因启动子、甘露氨酸合酶和章鱼碱合酶启动子、Adh启动子、蔗糖合酶启动子、R基因复合启动子以及叶绿素α/β结合蛋白基因启动子。这些启动子已用于构建已在植物中表达的DNA载体,参见例如WO84/02913。所有这些启动子已用于构建各种类型的植物表达性重组DNA载体。
[1285] 为了在植物的源组织如叶、根或茎中表达,优选的是,用于本发明的启动子在这些特定组织中具有相对高的表达。为此,可以针对具有组织或细胞特异性表达或增强表达的基因选择多种启动子。在文献中报导的这类启动子的实例包括:来自豌豆的叶绿体谷氨酰胺合成酶GS2启动子、来自小麦的叶绿体果糖-1,6-二磷酸酶启动子、来自马铃薯的核光合作用ST-LS1启动子、来自拟南芥的丝氨酸/苏氨酸激酶启动子和葡萄糖淀粉酶(CHS)启动子。还报导在光合有效组织中具有活性的是来自北美落叶松(Larix laricina)的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶启动子,来自松树的Cab基因Cab6的启动子,来自小麦的Cab-1基因的启动子,来自菠菜的Cab-1基因的启动子,来自水稻的Cab1R基因的启动子,来自玉米的丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)启动子,烟草Lhcb1*2基因的启动子;拟南芥Suc2蔗糖-H30同向转运启动子,以及来自菠菜的类囊体膜蛋白基因的启动子(PsaD、PsaF、PsaE、PC、FNR、AtpC、AtpD、Cab、RbcS)。叶绿素α/β-结合蛋白的其他启动子也可以用于本发明,如来自白芥(Sinapis alba)的LhcB基因和PsbP基因的启动子。
[1286] 响应环境、激素、化学和/或发育信号而调控的多种植物基因启动子也可以用于在植物细胞中表达RNA结合蛋白基因,包括受以下因素调控的启动子:(1)热;(2)光(例如,豌豆RbcS-3A启动子、玉米RbcS启动子);(3)激素,如脱落酸;(4)创伤(例如,WunI);或者(5)化学剂,如茉莉酸甲酯、水杨酸、甾类激素、醇、安全剂(WO 97/06269),或者也可以有利地采用(6)器官特异性启动子。
[1287] 如本文所用,术语“植物贮藏器官特异性启动子”是指当与其他植物组织相比时优先指导植物贮藏器官中的基因转录的启动子。为了在植物的库组织中表达,如马铃薯植物的块茎、番茄的果实或者大豆、油菜、棉花、玉米、小麦、水稻和大麦的种子,优选的是,用于本发明的启动子在这些特定组织中具有相对高的表达。可以使用β-伴球蛋白的启动子或其他种子特异性启动子,如欧洲油菜蛋白(napin)、玉米蛋白、核丝(linin)和菜豆蛋白启动子。还可以使用根特异性启动子。这样的启动子的实例为酸性几丁质酶基因的启动子。根组织中的表达还可以通过利用已得到鉴定的CaMV35S启动子的根特异性亚结构域来实现。
[1288] 在一特别优选的实施方案中,启动子指导其中发生脂质生物合成的组织和器官中的表达。这类启动子可以在合适的时间作用于种子发育以改变种子中的脂质组成。种子特异性表达的优选启动子包括:1)来自编码参与种子中的脂质生物合成和积聚的酶(如去饱和酶和延长酶)的基因的启动子;2)来自编码种子贮藏蛋白的基因的启动子;以及3)来自编码参与种子中的碳水化合物生物合成和积聚的酶的基因的启动子。合适的种子特异性启动子为:油料种子油菜napin基因启动子(US 5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)USP启动子(Baumlein et al.,1991)、拟南芥油质蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)、芸苔Bce4启动子(WO 91/13980)或豆球蛋白B4启动子(Baumlein等,1992)以及导致单子叶植物如玉米、大麦、小麦、裸麦、水稻等种子特异性表达的启动子。值得注意的合适启动子为大麦lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或者WO 99/16890中所述的启动子(来自大麦醇溶蛋白基因、水稻谷蛋白基因、水稻素(oryzin)基因、水稻醇溶蛋白基因、小麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高粱醇溶蛋白基因、黑麦醇溶蛋白基因的启动子)。其他启动子包括Broun et al.(1998)、Potenza et al.(2004)、US 20070192902和US 20030159173所述的那些。在一实施方案中,种子特异性启动子优先在种子的限定部分如子叶或胚乳中表达。子叶特异性启动子的实例包括但不限于:FP1启动子(Ellerstrom et al.,1996)、豌豆豆球蛋白启动子(Perrin et al.,2000)和菜豆植物凝集素启动子(Perrin et al.,2000)。胚乳特异性启动子的实例包括但不限于:玉米醇溶蛋白-1启动子(Chikwamba et al.,2003)、水稻谷蛋白-1启动子(Yang et al.,2003)、大麦D-醇溶蛋白启动子(Horvath et al.,2000)和小麦HMW谷蛋白启动子(Alvarez et al.,2000)。在进一步的实施方案中,种子特异性启动子在胚芽中和/或种子发芽后不表达或仅以低水平表达。
[1289] 在另一实施方案中,植物贮藏器官特异性启动子为果实特异性启动子。实例包括但不限于番茄聚半乳糖醛酸酶、E8和Pds启动子以及苹果ACC氧化酶启动子(有关综述,参见Potenza et al.,2004)。在一优选实施方案中,相对于果皮或果实内的种子,启动子优先指导果实可食用部分(例如果髓)中的表达。
[1290] 在一实施方案中,可诱导启动子是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)alc体系。可用于替代构巢曲霉alc体系的可诱导表达体系的实例在Padidam(2003)和Corrado and Karali(2009)的综述中有描述。在另一实施方案中,可诱导启动子是安全剂(safener)可诱导启动子,例如,玉米ln2-1或ln2-2启动子(Hershey and Stoner,1991),安全剂可诱导启动子是玉米GST-27启动子(Jepson et al.,1994),或大豆GH2/4启动子(Ulmasov et al.,1995)。
[1291] 在另一实施方案中,可诱导启动子是衰老诱导启动子,例如,来自拟南芥的衰老诱导启动子SAG(衰老相关基因)12和SAG 13(Gan,1995;Gan and Arnasino,1995)和来自欧洲油菜的LSC54(Buchanan-Wollaston,1994)。这类启动子在植物组织(特别是叶)的衰老发生时表现出增加的表达。
[1292] 对于在营养性组织中的表达,可以使用叶特异性启动子,如核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)启动子。例如,番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因在叶和光生长的幼苗中表达(Meier et al.,1997)。可以使用几乎仅在叶片和叶稍中的叶肉细胞内高水平表达的核酮糖二磷酸羧化酶启动子,如Matsuoka et al.(1994)所述。另一种叶特异性启动子是光收获叶绿素a/b结合蛋白基因启动子(参见,Shiina et al.,1997)。Li et al.(1996)所描述的拟南芥myb相关基因启动子(Atmyb5)是叶特异性的。所述Atmyb5启动子在发育中的叶表皮毛、托叶、以及幼年莲座叶和茎生叶的边缘上的表皮细胞、以及未成熟的种子中表达。还可以使用由Busk et al.(1997)在玉米中鉴别的叶启动子。
[1293] 在某些情况下,例如当重组表达LEC2或BBM时,可能会期望转基因不以高水平表达。可以用于这类情况的启动子的实例是截短的芸苔素A启动子,其保留了种子特异性表达模式但却处于降低的表达水平(Tan et al.,2011)。
[1294] 5'非翻译前导序列可以衍生自所选的启动子以表达本发明的多核苷酸的异源基因序列,或者可以相对于待产生的酶的编码区是异源的,并且可以根据需要进行特定修饰以便增强mRNA的翻译。有关优化转基因表达的综述,参见Koziel et al.(1996)。5'非翻译区还可以获得自植物病毒RNA(烟草花叶病毒、烟草蚀纹病毒、玉米矮小花叶病毒、苜蓿花叶病毒等),来自合适的真核基因、植物基因(小麦和玉米叶绿素a/b结合蛋白基因前导序列)或来自合成的基因序列。本发明不限于其中非翻译区衍生自伴随启动子序列的5'非翻译序列的构建体。前导序列还可以衍生自无关启动子或编码序列。可用于本发明背景的前导序列包含玉米Hsp70前导序列(US 5,362,865和US 5,859,347)以及TMVω元件。
[1295] 转录的终止通过在表达载体中可操纵地连接至所关注的多核苷酸的3'非翻译DNA序列而完成。重组DNA分子的3'非翻译区包含在植物中作用以使腺苷酸核苷酸加成至RNA的3'端的多腺苷酸化信号。3'非翻译区可以获得自在植物细胞中表达的多种基因。胭脂碱合酶3'非翻译区、来自豌豆小亚基Rubisco基因的3'非翻译区、来自大豆7S种子贮藏蛋白基因的3'非翻译区常用于此能力。包含农杆菌属(Agrobacterium)肿瘤诱导(Ti)质粒基因的多腺苷酸化信号的3'转录非翻译区也是合适的。
[1296] 重组DNA技术可以用来通过操纵例如通过根据宿主细胞物种密码子优化来翻译所得转录物的效率、或者使转录物不稳定的序列的缺失以及翻译后修饰的效率来提高转化的多核苷酸的表达。
[1297] 转移核酸
[1298] 转移核酸可以用于将外源多核苷酸递送到细胞,并且包含一个、优选两个边界序列以及一个或多个所关注的多核苷酸。转移核酸可以或可以不编码选择标记。优选地,转移核酸在细菌中形成二元载体的一部分,其中该二元载体进一步包含这样的元件,它们允许载体在细菌中复制、选择或维持包含该二元载体的细菌细胞。转移至真核细胞后,二元载体的转移核酸组分能够整合至真核细胞的基因组中,或者对于瞬时表达实验,仅能够在细胞中表达。
[1299] 如本文所用,术语“染色体外转移核酸”是指能够从细菌如农杆菌属(Agrobacterium sp.)转移至植物细胞如植物叶细胞的核酸分子。染色体外转移核酸是一种遗传元件,它作为能够转移随后将其边界内所含的核苷酸序列整合至受体细胞基因组中的元件而广为人知。在这方面,转移核酸的侧翼通常为两个“边界”序列,但在某些情况下,可以使用一个末端的单个边界,而转移核酸的第二末端则在转移过程中随机生成。所关注的多核苷酸通常位于转移核酸的左边界样序列与右边界样序列之间。转移核酸内所含的多核苷酸可以可操作地连接至多种不同的有利于其表达(即,多核苷酸的转录和/或翻译)的启动子和终止子调控元件。来自农杆菌属如根癌农杆菌或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的转移DNA(T-DNA)及其人造变体/突变体可能是转移核酸中研究最为透彻的实例。另一实例是来自植物的包含T-DNA边界样序列的P-DNA(“植物DNA”)。
[1300] 如本文所用,"T-DNA"是指根癌农杆菌Ti质粒或发根农杆菌Ri质粒的T-DNA,或者其功能为将DNA转移至植物细胞中的变体。T-DNA可以包括同时包含左右边界序列的整个T-DNA,但只需要包含转移所需的顺式最小序列,即右侧T-DNA边界序列。本发明的T-DNA已插入它们之间,位于左右侧边界序列(如果存在)之间的任何位置,所关注的多核苷酸。编码将T-DNA转移至植物细胞中所需的因子的反式序列如vir基因可以插入T-DNA,或者可以存在于与T-DNA相同的复制子上,或优选地以反式存在于农杆菌宿主的相容复制子上。这类“二元载体系统”是本领域公知的。如本文所用,"P-DNA"是指从植物基因组分离的转移核酸或其人造变体/突变体,并在每个末端或只在一个末端包含T-DNA边界样序列。
[1301] 如本文所用,转移核酸的“边界”序列可以从所选的生物如植物或细菌中分离,或者可以为其人造变体/突变体。边界序列促进并有利于其所连接的多核苷酸的转移,并且可以有利于其在受体细胞基因组中的整合。在一实施方案中,边界序列的长度为10-80bp。来自农杆菌属的T-DNA的边界序列在本领域中是公知的,并且包括Lacroix et al.(2008)中描述的那些。
[1302] 虽然在传统上仅使用农杆菌属将基因转移到植物细胞,但是现今已鉴定/开发了大量的系统可按类似于农杆菌属的方式发挥作用。最近已对几种非农杆菌属物种遗传修饰,从而能够用于基因转移(Chung et al.,2006;Broothaerts et al.,2005)。它们包括根瘤菌属(Rhizobium sp.)NGR234、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)和百脉根中慢生根瘤菌(Mezorhizobium loti)。
[1303] 如本文所用,术语“转染”、“转化”及其变化通常可互换使用。“转染的”或“转化的”细胞可以经过操纵引入所关注的多核苷酸,或者可以是由其衍生的子代细胞。
[1304] 植物
[1305] 本发明还提供包含本文所述的两种或多种外源多核苷酸和/或遗传修饰的植物或其部分。当用作名词时,术语“植物”是指整个植株,而术语“其部分”是指植物器官(例如,叶、茎干、根部、花朵、果实)、单个细胞(例如,花粉)、种子、种子部分(如胚芽、胚乳、盾片或种皮)、植物组织(如脉管组织)、植物细胞及其子代。如本文所用,植物部分包括植物细胞。
[1306] 如本文所用,术语“在植物中”和“在所述植物中”在对植物的修饰的上下文中表示修饰已发生在至少一部分的植物中,包括修饰已发生在整个植物中,并且不排除修饰仅发生在植物的一部分或多个部分但不是全部部分中。例如,据说组织特异性启动子“在植物中”表达,即使其可能仅在植物的某些部分中表达。类似地,“增加植物中的一种或多种糖酵解和/或脂肪酸生物合成基因表达的转录因子多肽”表示增加的表达发生在至少一部分植物中。
[1307] 如本文所用,术语“植物”以其最广泛的含义使用,包括植物界中的任何生物。其还包括红藻和褐藻以及绿藻。其包括但不限于开花植物、草、农作物或谷类(如油料种子、玉米、大豆)、秣料或草料、水果或蔬菜植物、草药植物、木本植物或树的任何物种。这不表示将植物限制到任何特定的结构。它还指单细胞植物(例如,微藻)。关于植物的术语“其部分”是指植物细胞及其子代,多个植物细胞、在植物发育的任何阶段存在的结构、或者植物组织。这类结构包括但不限于叶、茎、花朵、果实、坚果、根部、种子、种皮、胚芽。术语“植物组织”包括植物的分化和未分化组织,包括存在于叶、茎、花朵、果实、坚果、根部、种子中的那些,例如胚芽组织、胚乳、皮组织(例如,表皮、周皮)、脉管组织(例如,木质部、韧皮部)或基本组织(包括薄壁组织、厚角组织和/或厚壁组织细胞)以及培养中的细胞(例如,单细胞、原生质体、愈伤组织、胚芽等)。植物组织可以在原位,在器官培养、组织培养或细胞培养中。
[1308] 如本文所用,术语“营养组织”或“营养性植物部分”是除植物的有性生殖器官以外的任何植物组织、器官或部分。植物的有性生殖器官具体是包含种子的器官、花朵、花粉、果实和种子。营养组织和部分包括至少植物叶、茎(包括蓊(bolt)和蘖(tiller)但不包括穗(head))、块茎和根部,但是不包括花、花粉、种子(包括种皮、胚芽和胚乳)、果实(包括中果皮)、携有种子的荚(pod)和携有种子的穗。在一实施方案中,植物的营养性部分是地表植物部分。在另一或进一步的实施方案中,营养性植物部分是绿色部分如叶或茎。
[1309] “转基因植物”或其变化是指包含不存在于相同物种、品种或品系的野生型植物中的转基因的植物。在本发明背景下定义的转基因植物包括使用重组技术进行遗传修饰以导致在所需的植物或其部分中产生本文所定义的至少一种多肽的植物及其子代。转基因植物部分具有相应的含义。本发明的植物或其部分可以包含遗传修饰(例如基因突变)并且只要它们缺少转基因则被认为是“非转基因的”。
[1310] 术语“种子”和“谷粒”在本文中可互换使用。“谷粒”是指成熟的谷粒,如收获的谷粒或仍在植物上但已准备收获的谷粒,但根据上下文还可以指吸胀或发芽后的谷粒。成熟的谷粒通常具有低于约18%的水分含量。在一优选实施方案中,谷粒的水分含量处于一般认为是对储藏安全的水平,优选5%-15%、6%-8%、8%-10%、或10%-15%。如本文所用的“发育中的种子”是指成熟前的种子,通常存在于受精或开花后的植物生殖结构中,但也可以指从植物中分离的成熟前的此类种子。成熟的种子通常具有低于约12%的水分含量。
[1311] 如本文所用,术语“植物贮藏器官”是指特化以贮藏例如蛋白质、碳水化合物、脂质形式的能量的植物部分。植物贮藏器官的实例为种子、果实、块状根和块茎。本发明的优选植物贮藏器官为种子。
[1312] 如本文所用,术语“表型正常的”是指遗传修饰的植物或其部分,例如植物例如转基因植物,或者贮藏器官如本发明的种子、块茎或果实,它们与未修饰的植物或其部分相比时生长和繁殖能力无明显降低。优选地,当在相同条件下生长时,产生的生物质、生长速度、发芽率、贮藏器官大小、种子大小和/或活种子的数量不少于缺少所述遗传修饰或外源多核苷酸的植物的90%。这个术语不涵盖可能不同于野生型植物但不影响植物对商业目的的有用性的植物特性,例如,幼苗叶的芭蕾表型(ballerina phenotype)。在一实施方案中,表型正常的遗传修饰的植物或其部分包含编码可操作地连接至植物贮藏器官特异性启动子的沉默抑制子的重组多核苷酸,并且具有基本上与不含所述多核苷酸的相应植物或其部分相同的生长或繁殖能力。
[1313] 植物经历一系列生长阶段,从种子播种、萌芽和幼苗出苗到开花、结实、生理成熟和最终衰老。这些阶段是众所周知的并且容易定义,例如以下对于高粱植物的。当第一天幼苗首次出现在土壤上方时为第0天,生长的营养性阶段在本文中定义为从第10天开始到约60-70天开花,并且在约100天达到生理成熟,这取决于环境条件。营养性阶段包括从约45天到第一次开花的靴叶阶段。靴叶是在植物上形成的最后一片叶子,从所述靴叶出现穗(顶部)。“靴叶阶段”定义为从靴叶完全出现到开始开花时。
[1314] 如本文所用,关于植物的术语“开始开花”或“起始开花”是指植物上的第一朵花打开的时间,或者开花发生的时间。
[1315] 如本文所用,关于包含种子的植物的术语“结籽”是指植物的第一个种子达到成熟的时间。本领域公知的,这通常可通过种子的颜色或其水分含量观察。
[1316] 如本文所用,术语“成熟”是涉及植物的叶,意味着它已达到完整大小但尚未开始显示衰老或死亡的迹象(例如变黄和/或衰老)。本领域技术人员可以容易地确定特定植物的叶子是否可以被认为是成熟的。
[1317] 如本文所用,关于整个植物的术语“衰老”是指生长完成之后的植物发育的最后阶段,通常在植物达到最大地表生物质或高度之后。当植物地表生物质达到其最大值并且量开始下降时衰老开始,并且一般以大部分植物组织的死亡结束。在这个阶段期间,植物将生长期间积累的来自叶和其他部分的细胞组分调动和回收至其他部分以完成其生殖发育。衰老是一个复杂的调节过程,其包括一些基因的新的或增加的基因表达。通常,一些植物部分衰老,同时相同植物的其他部分继续生长。因此,关于植物叶或其他绿色器官,如本文所用的术语“衰老”是指叶或器官中的叶绿素量开始减少的时间。衰老通常与叶或器官的干燥相关,主要在衰老的最后阶段。衰老通常可通过叶的颜色从绿色向黄色并且在完全干燥时最终至褐色的变化观察。据信细胞衰老是植物和器官衰老的基础。
[1318] 本发明提供的或设想用于实践本发明的植物既包括单子叶植物也包括双子叶植物。在优选的实施方案中,本发明的植物为农作物(例如,谷类和豆类、玉米、小麦、马铃薯、水稻、高粱、小米、木薯、大麦)或豆科植物如大豆、菜豆或豌豆。植物可以生长产生可食用的根部、块茎、叶、茎、花或果实。植物可以是其营养性部分用作食物的蔬菜植物。本发明的植物可以为:刺干椰、拟南芥、花生、木鲁星果棕(murumuru)、星实棕榈(tucuma)、Attalea geraensis(Indaia-rateiro)、Attalea humilis(美洲油棕)、Attalea oleifera(andaia)、Attalea phalerata(uricuri)、Attalea speciosa(babassu)、燕麦、甜菜、芸苔属如Brassica carinata、芥菜、Brassica napobrassica、欧洲油菜(油菜)、亚麻荠、大麻、红花、Caryocar brasiliense(pequi)、椰子、海甘蓝、甜瓜、油棕(非洲棕榈)、大豆、陆地棉(棉花)、向日葵属如向日葵、大麦、麻风树、Joannesia princeps(arara nut-tree)、浮萍属(duckweed)如青萍、Lemna disperma、Lemna ecuadoriensis、膨胀浮萍、日本浮萍、浮萍、单脉萍、Lemna obscura、稀脉萍、稀脉浮萍、Lemna tenera、吕藻、鳞根萍、Lemna valdiviana、Lemna yungensis、奥蒂树(oiticica)、亚麻、羽扇豆、曲叶矛榈(曲叶矛榈)、摩帝椰子(inaja palm)、芒属如异源三倍体芒草奇岗和中国芒、烟草属(烟草)如红花烟草或本氏烟草、巴卡巴酒实棕(bacaba-do-azeite)、巴套阿酒实棕(pataua)、Oenocarpus distichus(bacaba-de-leque)、稻属如水稻和光稃稻、柳枝稷、Paraqueiba paraensis(mari)、鳄梨、水黄皮(印度山毛榉)、毛果杨、蓖麻、甘蔗、芝麻、马铃薯、高粱属如两色高粱、高粱、大花可可、三叶草属、巴西针棕(巴西针棕)、小麦属(小麦)如小麦、玉米、紫花苜蓿(Medicago sativa)、黑麦(Secale cerale)、甜土豆(Lopmoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Cofea spp.)、凤梨(Anana comosus)、合欢树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia senensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifer indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、夏威夷果(Macadamia intergrifolia)和杏仁(Prunus amygdalus)。
[1319] 在一实施方案中,所述植物不是烟草属的。
[1320] 除了上文提到的那些,其他优选的植物包括C4草类植物如大须芒草(Andropogon gerardi)、垂穗草(Bouteloua curtipendula)、细格兰马草(B.gracilis)、野牛草(Buchloe dactyloides)、裂稃草(Schizachyrium scoparium)、印度草(Sorghastrum nutans)、曲折鼠尾粟(Sporobolus cryptandrus);C3草类植物如加拿大披碱草(Elymus canadensis)、豆科植物头状胡枝子(Lespedeza capitata)和Petalostemum villosum、非禾本草本植物Aster azureus;以及木本植物如Quercus ellipsoidalis和大果栎(Q.macrocarpa)。其它优选的植物包括C3草类植物。
[1321] 在一优选实施方案中,所述植物为被子植物。
[1322] 在一实施方案中,植物为油料种子(oilseed)植物,优选为油料种子作物植物。如本文所用,“油料种子植物”是用于从植物种子商业生产脂质的植物物种。油料种子植物可以是例如油菜籽(如油菜)、玉米、向日葵、红花、大豆、高粱、亚麻(亚麻籽)或甜菜。此外,油料种子植物可以是其他芸苔属植物、棉花、花生、罂粟、芜菁甘蓝、芥菜、蓖麻、芝麻、红花、麻风树或产坚果植物。植物可以在其果实中产生高水平的脂质,如橄榄、油棕或椰子。可以应用本发明的园艺植物为莴苣、菊苣或蔬菜类芸苔属植物,包括卷心菜、西兰花或花椰菜。本发明可应用于烟草、葫芦科植物、胡萝卜、草莓、番茄或胡椒。
[1323] 在一个优选的实施方案中,植物是豆科(或leguminosae)的成员,例如苜蓿、三叶草、豌豆、紫花苜蓿、菜豆、小扁豆、羽扇豆、牧豆树、角豆树、大豆和花生,或禾本科的成员,如玉米、高粱、小麦、大麦和燕麦。在一个特别优选的实施方案中,所述植物是苜蓿、三叶草、玉米或高粱,它们中的每一种都特别适用于动物的饲料或草料。
[1324] 在一优选实施方案中,转基因植物对于已引入的每一个基因(转基因)为纯合的,使得其子代不发生所需表型的分离。转基因植物也可对于引入的转基因为杂合的,优选对于转基因为均匀杂合的,例如在通过杂交种子生长成的F1子代中。这类植物可以提供本领域熟知的多种优点如杂种优势
[1325] 植物的转化
[1326] 转基因植物可以使用本领域已知的技术而产生,如通常在Slater et al.,Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants,Oxford University Press(2003)和Christou and Klee,Handbook of Plant Biotechnology,John Wiley and Sons(2004)中所述的那些技术。
[1327] 如本文所用,术语“稳定转化”、“稳定转化的”及其变化是指多核苷酸整合到细胞基因组中使得它们在细胞分裂过程中转移到后代细胞而无需对它们的存在进行阳性选择。稳定的转化体或其子代可以通过本领域已知的任何方法进行选择,如对染色体DNA的Southern印迹或基因组DNA的原位杂交。
[1328] 农杆菌介导的转移是将基因引入植物细胞的广泛使用的系统,因为可以将DNA引入整个植物组织、植物器官或植物培养中的外植体中的细胞,从而瞬时表达或将DNA稳定整合到植物细胞基因组中。例如,可以使用花序浸渍法(植物中)。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞在本领域是熟知的。待转移的DNA区域通过边界序列限定,并且通常将间插DNA(T-DNA)插入植物基因组中。这是首选的方法,原因在于基因转移的容易性和确定性。
[1329] 可用的加速方法包括例如微弹轰击法(microprojectile bombardment)等。将转化核酸分子递送至植物细胞的方法的一个实例为微弹轰击法。这种方法在Yang et al.,Particle Bombardment Technology for Gene Transfer,Oxford Press,Oxford,England(1994)中进行了综述。非生物性粒子(微弹)可用核酸包被并通过推进力递送入细胞,例如未成熟胚的细胞。示例性粒子包括由钨、金、铂等构成的那些。
[1330] 在其他方法中,质粒可以稳定转化。针对在高等植物中进行质粒转化所公开的方法包括含有选择标记并通过同源重组将DNA靶向质粒基因组的DNA的粒子枪递送(US 5,451,513、US 5,545,818、US 5,877,402、US 5,932479和WO 99/05265)。其他细胞转化方法也可以使用,并且包括但不限于通过将DNA直接转移入花粉、通过将DNA直接注射入植物的生殖器官或通过将DNA直接注射入未成熟胚的细胞然后通过干燥胚的再水合来将DNA引入植物。
[1331] 通过单个植物原生质体转化株或通过各种转化的外植体实现植物的再生、发育和培养在本领域是熟知的(Weissbach et al.,In:Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,San Diego,Calif.,(1988))。这种再生和生长过程通常包括选择转化细胞、通过胚发育的通常阶段培养那些个体化细胞、通过生根苗阶段的步骤。使转基因胚和种子相似地再生。之后,将所得的转基因生根芽植入合适的生长培养基中,如土壤。
[1332] 包含异体外源基因的植物的发育或再生在本领域是熟知的。优选地,使再生的植物自花受粉以提供纯合的转基因植物。或者,将得自再生植物的花粉异花授粉到在农学上重要谱系的由种子长成的植物。反之,将得自这些重要谱系的植物的花粉用于对再生植物授粉。将本发明的包含所需多核苷酸的转基因植物用本领域技术人员熟知的方法进行培养。
[1333] 为了确认转基因在转基因细胞和植物中的存在,可使用本领域技术人员已知的方法进行聚合酶链反应(PCR)扩增或Southern印迹分析。可以根据产物性质按多种方式的任何一种检测转基因的表达产物,并且包括Northern印迹杂交、Western印迹和酶测定法。一旦得到转基因植物后,可以让它们生长以产生具有所需表型的植物组织或部分。可以收获植物组织或植物部分,和/或收集种子。种子可以用作长成其组织或部分具有所需特性的另外植物的来源。优选地,在非极性脂质的产量处于其最高时收获营养性植物部分。在一实施方案中,在大约开花的时间或开花已开始之后收获营养性植物部分。优选地,在大约衰老开始的时间收获植物部分,通常通过叶的变黄和干燥指示。
[1334] 使用农杆菌或其他转化方法形成的转基因植物通常在一条染色体上包含单个遗传基因座。这类转基因植物对于添加的基因可称为半合子的。更优选的是对于添加的基因为纯合的转基因植物,即包含两个添加的基因的转基因植物,一个基因位于染色体对的每条染色体上的相同基因座。纯合的转基因植物可以通过使半合子转基因植物自株传粉、使产生的其中一些种子发芽以及分析所得植物的所关注基因而获得。
[1335] 还应当了解,包含两个独立分离的外源基因或基因座的两种不同的转基因植物也可以异花授粉(配育)以产生包含两组基因或基因座的后代。合适的F1子代的自花受精可以产生对于两种外源基因或转座子为纯合的植物。还可以考虑亲本植株的回交以及与非转基因植物的异交,如营养繁殖。相似地,转基因植物可以与包含遗传修饰如突变基因的第二植物杂交,并且鉴定包含转基因和遗传修饰的子代。常用于不同性状和农作物的其他育种方法的描述可见于Fehr,In:Breeding Methods for Cultivar Development,Wilcox J.ed.,American Society of Agronomy,Madison Wis.(1987)。
[1336] TILLING
[1337] 在一实施方案中,TILLING(定向诱导基因组局部突变技术)可用于产生其中内源基因包含突变的植物,例如,编码SDP1或TGD多肽、TST、质体GPAT、质体LPAAT、磷脂酸磷酸酶(PAP)或者它们中两种或更多种的组合的基因。在第一步中,通过以下方法在一组植物中诱导引入的突变如新的单一碱基对变化:用化学诱变剂处理种子(或花粉),然后使植物生长到突变会稳定遗传的世代。提取DNA,并且从种群的所有成员保存种子,以形成可随时间反复获取的资源。对于TILLING测定,使用特异性内切核酸酶的异源双链方法可以用来检测单核苷酸多态性(SNP)。或者,来自诱变的植物池的DNA的下一代测序可以用来鉴定选择的基因中的突变体。通常,实现诱变的群体中1个突变体/1000株植物的突变频率。利用这种方法,可以筛选数千种植物以鉴定在基因组的任何基因或特定区域中具有单碱基变化以及小插入或缺失(1-30bp)的任何个体。TILLING进一步描述见Slade and Knauf(2005)和Henikoff et al.(2004)。
[1338] 除了实现突变的高效检测之外,高通量TILLING技术是检测自然多态性的理想选择。因此,通过与已知序列构建异源双链来探查未知的同源DNA可揭露多态位点的数量和位置。核苷酸变化以及小插入和缺失均进行鉴定,包括至少一些重复数多态性。这称为Ecotilling(Comai et al.,2004)。
[1339] 利用位点特异性核酸酶的基因组编辑
[1340] 基因组编辑使用工程化的核酸酶如RNA指导的DNA内切核酸酶或者由融合至非特异性DNA切割模块的序列特异性DNA结合结构域组成的核酸酶。这些工程化的核酸酶使得能够通过诱导靶向DNA双链断裂来进行高效和精确的遗传修饰,所述DNA双链断裂刺激细胞的内源细胞DNA修复机制以修复诱导的断裂。这类机制包括例如错误倾向的非同源末端连接(NHEJ)和同源性指导的修复(HDR)。
[1341] 在具有延长的同源臂的供体质粒的存在下,HDR可以导致引入单个或多个转基因以纠正或替换现有基因。在不存在供体质粒的情况下,NHEJ介导的修复获得引起基因破坏的靶标的小插入或缺失突变。
[1342] 可用于本发明的方法的工程化的核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样(TAL)效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9型核酸酶以及相关核酸酶。
[1343] 通常通过质粒DNA、病毒载体或体外转录的mRNA将编码核酸酶的基因递送至细胞中。
[1344] 锌指核酸酶(ZFN)包含DNA-结合结构域和DNA-切割结构域,其中DNA结合结构域包含在至少一个锌指中,并且可操作地连接至DNA-切割结构域。锌指DNA-结合结构域在蛋白的N-端,而DNA-切割结构域位于所述蛋白的C-端。
[1345] ZFN必须具有至少一个锌指。在一优选实施方案中,ZFN会具有至少3个锌指以具有足够的特异性用于宿主细胞或生物体中的靶向遗传重组。通常,具有3个以上锌指的ZFN用每个额外的锌指会具有越来越大的特异性。
[1346] 锌指结构域可以衍生自任何类别或类型的锌指。在一特定实施方案中,锌指结构域包含例如锌指转录因子TFIIIA或Sp1非常普遍代表的Cis2His2类型的锌指。在一优选实施方案中,锌指结构域包含3个Cis2His2类型锌指。可以改变ZFN的DNA识别和/或结合特异性以在细胞DNA中的任何所选位点完成靶向遗传重组。可以利用已知的分子细胞学和/或化学合成技术完成这样的修饰。(参见,例如,Bibikova et al.,2002)。
[1347] ZFN DNA-切割结构域衍生自一类非特异性DNA切割结构域,例如II型限制性酶如FokI的DNA-切割结构域(Kim et al.,1996)。其他可用的内切核酸酶可以包括例如HhaI、HindIII、Nod、BbvCI、EcoRI、BglI和AlwI。
[1348] 转录激活因子样(TAL)效应子核酸酶(TALEN)包含TAL效应子DNA结合结构域和内切核酸酶结构域。
[1349] TAL效应子是病原体注射入植物细胞的植物病原细菌蛋白,在植物细胞中它们行进至核,并且具有转录因子的功能以打开特异性植物基因。TAL效应子的一级氨基酸序列决定其结合的核苷酸序列。因此,可以对TAL效应子预测靶位点,并且为了结合至特定核苷酸序列的目的可以工程化和产生TAL效应子。
[1350] 融合至编码TAL效应子的核酸序列是编码核酸酶或一部分核酸酶的序列,通常是来自II型限制性内切核酸酶如FokI的非特异性切割结构域(Kim et al.,1996)。其他可用的内切核酸酶可以包括例如HhaI、HindIII、Nod、BbvCI、EcoRI、BglI和AlwI。可以利用一些内切核酸酶(例如,FokI)仅作为二聚体发挥功能的事实以增强TAL效应子的靶标特异性。例如,在某些情况下,可以将每个FokI单体融合至识别不同DNA靶序列的TAL效应子序列,并且仅在两个识别位点接近时,失活的单体在一起产生具有功能的酶。通过需要DNA结合以激活核酸酶,可以产生高度位点特异性的限制性酶。
[1351] 序列特异性TALEN可以识别细胞中存在的预先选择的靶核苷酸序列内的特定序列。因此,在一些实施方案中,可以扫描靶核苷酸序列的核酸酶识别位点,并且可以基于靶序列选择特定核酸酶。在其他情况下,可以将TALEN工程化以靶向特定细胞序列。
[1352] 利用可编程的RNA指导的DNA内切核酸酶的基因组编辑
[1353] 不同于上文所述的位点特异性核酸酶,成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)/Cas系统提供ZFN和TALEN的另一种选择用于通过RNA指导的DNA切割诱导靶向遗传改变。
[1354] CRISPR系统依赖于CRISPR RNA(crRNA)和反式激活嵌合RNA(tracrRNA)用于DNA的序列特异性切割。存在3种类型的CRISPR/Cas系统:在II型系统中,Cas9用作在crRNA–tracrRNA靶标识别时切割DNA的RNA指导的DNA内切核酸酶。CRISPR RNA与tracrRNA碱基配对形成2-RNA结构,所述2-RNA结构将Cas9内切核酸酶引导至切割的互补DNA位点。
[1355] 通过共递送表达Cas内切核酸酶的质粒和必需的crRNA组分,CRISPR系统对于植物细胞是可携带的。可以将Cas内切核酸酶转换为切口酶以提供对DNA修复机制的额外控制(Cong et al.,2013)。
[1356] CRISPR通常是包含多达11bp的内部和末端反向重复的24-40bp的短部分回文序列。虽然已检测分离的元件,但是它们一般是成簇(多达约20个或更多个每基因组)排列的独特间插20-58bp序列间隔的重复单元。CRISPR一般在给定基因组内是均质的,它们的大部分相同。但是,例如在古细菌中有异质性的实例(Mojica et al.,2000)。
[1357] 饲料
[1358] 本发明包括可以用作饲料的组合物。为了本发明的目的,“饲料”包括供动物(包括人)消耗的任何食物或制品,并且其用来滋养或建立组织或者供应能量,和/或维持、恢复或支持足够的营养状况或代谢功能。本发明的饲料包括针对婴儿和/或幼儿的营养组合物。
[1359] 如本文所用,术语“动物”是指能够摄取植物衍生材料的任何真核生物。在一个实施方案中,所述动物是反刍动物(牛、绵羊、山羊等)。可选地,所述动物是非反刍动物。在一个实施方案中,所述动物是哺乳动物。在一个实施方案中,所述动物是人。在一个实施方案中,所述动物是家畜,例如但不限于牛、山羊、绵羊、猪、马、家禽如鸡等。在一个实施方案中,所述牛是日记牛或肉牛。在另一个实施方案中,所述动物是鱼,例如使用水产养殖繁殖的鱼,包括但不限于三文鱼、鳟鱼、鲤鱼、鲈鱼、鲷鱼、大菱鲆、鳎目鱼、遮目鱼、鲻鱼、石斑鱼、比目鱼、鲈鱼、鳕鱼、黑线鳕、日本比目鱼、鲶鱼、鲑鱼、白鲑、鲟鱼、丁鲷、斜齿鳊、梭鱼、梭鲈、黄尾鱼、罗非鱼、鳗鱼或热带鱼(如新鲜、咸淡水和咸水热带鱼)。所述动物可以是甲壳类动物,例如但不限于磷虾、蛤、虾(包括对虾)、蟹和龙虾。
[1360] 本发明的饲料包含与合适载体一起的例如本发明的植物或其部分例如营养性植物部分。术语“载体”以其最广泛的含义使用以涵盖可以或可以不具有营养价值的任何组分。如本领域技术人员将会知道,载体必须适用于(或以足够低的浓度用于)饲料,从而其对消耗饲料的生物没有有害作用。饲料可包括已经收获并随后加工或处理的植物部分,例如通过劈砍(chopping)、切割、干燥、压榨(pressing)或造粒(pelleting)所述植物部分,形成适合动物食用的形式,或通过诸如干燥或发酵以产生干草或青贮饲料。
[1361] 本发明的饲料包含通过使用本文所公开的方法、植物或其部分直接或间接产生的脂质和/或蛋白质。组合物可以为固体或液体形式。此外,组合物可以包括特定用途所需量的可食用大量营养素、维生素和/或矿物质。这些成分的量会随组合物是旨在用于正常个体还是用于具有特殊需求的个体如患有代谢病症等的个体而变化。
[1362] 具有营养价值的合适载体的实例包括但不限于大量营养素如食用脂肪、碳水化合物和蛋白质。这类食用脂肪的实例包括但不限于椰子油、琉璃苣油、真菌油、黑醋栗油、大豆油以及单-和二-甘油酯。这类碳水化合物的实例包括但不限于葡萄糖、食用乳糖和水解淀粉。此外,可以用于本发明的营养组合物的蛋白质的实例包括但不限于大豆蛋白、电渗乳清、电渗析脱脂乳、乳清或这些蛋白质的水解产物。
[1363] 关于维生素和矿物质,可以将以下成分添加至本发明的饲料组合物中:钙、磷、、钠、氯化物、镁、锰、、铜、锌、硒、碘以及维生素A、E、D、C和B族。还可以添加其他此类维生素和矿物质。
[1364] 本发明的饲料组合物还可以添加到食物中,甚至在不需要膳食补充时。例如,可以将该组合物添加至任何类型的食物中,包括但不限于人造黄油、黄油、奶酪、牛奶、酸奶、巧克力、糖果、小吃、色拉油、烹调用油、烹调用脂肪、肉类、鱼肉和饮料。
[1365] 此外,根据本发明产生的材料也可用作动物食物补充剂以改变动物组织或牛奶脂肪酸组成以更适合人或动物消耗或减少反刍动物中的甲烷产生。此外,本发明的饲料可以用于水产养殖以提高鱼中的脂肪酸水平供人或动物消耗。
[1366] 本发明的优选饲料是可以直接用作人或其他动物的食物或饲料的植物、种子和其他植物部分如叶、果实和茎。例如,动物可以直接吃田野中生长的这类植物或以控制摄食的方式喂养更加定量的量。本发明包括将这类植物和植物部分用作饲料,以提高人和其他动物中的多不饱和脂肪酸水平。
[1367] 为了非人动物消耗,所述饲料可以是任何合适的形式,例如但不限于田野中生长的青贮饲料、草料或牧草。在一实施方案中,用于非人消耗的饲料是豆科植物或其部分,其是豆科(或leguminosae)的成员,如苜蓿、三叶草、豌豆、紫花苜蓿、菜豆、小扁豆、羽扇豆、牧豆树、角豆树、大豆和花生。
[1368] 在实施方案中,所述动物处于饲养场和/或棚屋中。
[1369] 在一个实施方案中,所述植物或其部分包含至少约5%、至少约10%、至少约50%、至少约75%、至少约90%或全部的饲料。
[1370] 青贮饲料
[1371] 如本文所用,“青贮饲料”是相对高水分的饲料,其已经在称为饲料青贮法的过程中生产和储存,并且通常饲喂给牛、绵羊或其他反刍动物。在储存期间,植物材料中的碳水化合物、脂质和蛋白质发酵,产生有机酸或氧化分解或两者兼有。收获时的植物材料和后发酵植物材料都包括在如本文所用的术语青贮饲料中。青贮饲料通常使用植物的绿色地上部分,由草类作物如玉米、高粱、燕麦或其他谷物制成,或者由混合牧草和豆类如苜蓿或三叶草制成。制作青贮饲料是通过将切割的植被(通常是包括生殖组织的整个地上植物生物量)放入坑或筒仓或其他储存方式,并将其压缩以便尽可能少地在植物材料里留下空气来。通过用塑料薄膜覆盖青贮饲料或将植物材料紧紧包裹在塑料薄膜(打包)中以减少空气流入,以在某种程度上排除氧气。青贮饲料由具有适当水分含量的植物材料制成,通常为鲜重的约50%至60%,具体取决于储存方式和使用的压缩程度以及储存时将损失的水量,但不会超过75%。对于高粱和玉米,当整株植物水分处于合适的水平时开始收获,理想的是在成熟前几天。对于牧草型作物,将植物修剪并使其枯萎一天左右,直到水分含量降至合适的水平。理想情况下,作物在盛开时被修剪,并在切割当天放入坑或筒仓中。在收获时或之后,通过收割机将植物材料切碎或劈砍成通常约1-5cm长的片。植物材料可以放置在地面上的大堆中并压缩以减少空气量,然后用塑料覆盖或者进入筒仓。可选地,所述植物材料可以用塑料打捆打包以排除空气,这通常需要约30-40%的较低水分含量,但仍然太潮湿而不能作为干燥干草储存。
[1372] 切割或劈砍的储存的植物材料经历大部分厌氧发酵,所述发酵在坑或筒仓填充后约48小时开始。发酵过程将糖和其他碳水化合物(如半纤维素)转化为有机酸(主要是乙酸、丙酸、乳酸和丁酸)。在捕获的氧被消耗之后开始发酵并且在储存约两周后基本上完成,或者可以持续更长的时间。当所述植物材料紧密堆积时,氧的供应受到限制并且发酵导致材料中的碳水化合物、一些脂质和蛋白质分解成有机酸。该产品被命名为酸青贮饲料。另一方面,如果饲料更松散地打捆,则主要反应是氧化,其进行得更快并且温度升高。如果在温度为60-75℃时压缩物质,则反应停止并产生甜青贮。通过接种特定的微生物如乳酸菌(例如用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum))可以辅助发酵来加速发酵或改善所得的青贮饲料。
[1373] 散装青贮饲料通常饲喂奶牛,而打包青贮饲料倾向于用于肉牛、绵羊和马。青贮饲料作为动物饲料的优点有几个。在发酵过程中,青贮饲料细菌作用于饲料中的纤维素和其他碳水化合物以产生有机脂肪酸,从而降低pH。这抑制了可能导致腐败的竞争细菌,并且因此有机酸起到天然防腐剂的作用、提高消化率和适口性。这种防腐作用在冬季温带地区特别重要,因为绿色牧草不可得到。
[1374] 青贮饲料可以使用本领域已知的技术生产,例如CN101940272,CN103461658,CN101946853,CN101946853,CN104381743,US3875304和US6224916中描述的那些。用于动物饲料的颗粒可以使用本领域已知的技术生产,例如在US3035920,US3573924和US 5871802中描述的那些。
[1375] 植物生物质
[1376] 植物生物质的总脂质含量的提高等价于更高的能量含量,使得其作为饲料或牧草或者在生产生物燃料中的用途更加经济。
[1377] 天然存在的植物生物质的主要成分为碳水化合物(约75%,干重)和木质素(约25%),其可随着植物类型而变化。碳水化合物主要为纤维素或半纤维素纤维,其赋予植物结构的强度,以及木质素,其将纤维收拢在一起。植物生物质通常具有低能量密度,这是其物理形式和水分含量的结果。这还使得其在没有经过某种预加工的情况下储存和运输不方便且低效。有许多方法可用于将其转化为更方便的形式,包括:1)物理预加工(例如,磨碎),或者2)用热方法(例如,燃烧、气化、热解)或化学方法(例如,厌氧消化、发酵、堆肥、酯交换)来转化。以此方式,将生物质转化为所描述的生物质燃料。
[1378] 燃烧
[1379] 燃烧是允许可燃物质在空气或氧气的存在下烧着的过程,其中有热的释放。基本过程为氧化。燃烧是生物质可被用为能量的最简便的方法,并被用于提供热。这种热本身即能够以许多方式使用:1)空间加热,2)水(或其它液体)加热以用于中央或区域加热或生产用热,3)产生蒸汽以用于发电或动力。当可燃燃料物质是生物质的形式时,则主要是纤维素、半纤维素、木质素、和其他存在的分子中的碳(C)和氢(H)的氧化以形成二氧化碳(CO2)和水(H2O)。本发明的植物通过增加的脂质含量提供改进的燃料用于燃烧。
[1380] 气化
[1381] 气化是部分氧化的过程,其中碳源如植物生物质,被分解为一氧化碳(CO)和氢气(H2),外加二氧化碳(CO2)和可能的烃分子如甲烷(CH4)。如果气化在相对低的温度下发生,如700℃-1000℃,则产物气体将会具有相对高水平的烃(与高温度气化比较)。结果其可以直接使用,以燃烧用于加热或经蒸汽机发电,或者经适宜的气体净化,可用于运转内部燃烧的发动机用于发电。简单锅炉燃烧室可以与气化器紧密连接,或者产物气体可以被清洁掉长链烃(焦油)、运输、储存、以及在别处燃烧。气化体系可以与组合的循环蒸汽机紧密整合以用于发电(IGCC–整合的气化组合循环)。更高温度气化(1200℃-1600℃)导致产物气体中很少的烃,以及更高比例的CO和H2。这已知为合成气体(合成气或生物合成气),因为其可以用于合成较长链的烃(使用技术如Fischer-Tropsch(FT)合成)。如果H2与CO的比例正确(2:1),FT合成可以用于将合成气转化为高质量的与传统化石柴油和柴油机兼容的合成柴油生物燃料。
[1382] 热解
[1383] 如本文所用,术语“热解"是指在缺乏氧气的情况下使用缓慢加热以从生物质产生气态的、油和碳(char)产品的过程。热解是基于脂质的物质(特别是基于甘油三酯的物质)的热或热-化学转化。热解的产物包括气体、液体和固体碳,其各自的比例取决于过程的参数。较低温度(400℃左右)倾向于产生更多的固体碳(缓慢热解),而更高一些的温度(500℃左右)产生比例高得多的液体(生物油),前提是蒸汽余留时间保持低至1s左右或更短。约275℃-约375℃的温度可以用来产生具有更高比例的较长链烃的液体生物油。热解包括脂质的直接热裂解或者热和催化裂解的组合。在约400-500℃的温度,裂解发生,产生短链烃如烷烃、烯烃、二烯烃、芳烃、石蜡和羧酸、以及一氧化碳和二氧化碳。
[1384] 可以使用四类主要的催化剂类型,包括过渡金属催化剂、分子筛型催化剂、激活的铝土(alumina)和碳酸钠(Maher et al.,2007)。实例在US 4102938中给出。酸激活的铝土(Al2O3)是有效的催化剂(US 5233109)。分子筛催化剂是表现出大小选择性的多孔、高度晶体结构,因此仅有特定大小的分子能够穿过。这些包括沸石催化剂如ZSM-5或HZSM-5,其是包含AlO4和SiO4及其他硅胶-铝土催化剂的晶体材料。这些催化剂的活性和选择性取决于酸度、孔径和孔形,并且通常在300-500℃运作。过渡金属催化剂例如在US 4992605中有描述。碳酸钠催化剂已用于油的热解(Dandik and Aksoy,1998)。
[1385] 如本文所用,也称作“热解聚”的“水热处理”、“HTP”是热解的一种形式,其使植物衍生的物质,特别是植物衍生的物质中的含碳材料与氢反应以产生生物油产品,其主要包含石蜡烃与其他气体和固体。HTP的显著优势是营养性植物材料在形成用于转化反应的组合物之前不需要干燥,虽然营养性植物材料可以预先干燥以辅助生物质的运输或储存。生物质可以如从田间收获的直接使用。反应器是可以耐受使用的高温和高压并且抗腐蚀的任何容器。HTP中使用的溶剂包括水或完全是水,或者可以包括一些油形式的烃化合物。一般来说,HTP中的溶剂缺少添加的醇。转化反应可以在氧化、还原或惰性环境中进行。如本文所用的“氧化”表示在空气的存在下;“还原”表示在还原剂的存在下,通常为氢气或甲烷,例如10-15%H2,剩余气体为N2;而“惰性”表示在惰性气体如氮气或氩气的存在下。转化反应优选在还原条件下进行。转化的含碳材料包括纤维素、半纤维素、木质素和蛋白质以及脂质。所述方法使用270℃-400℃的转化温度和70-350巴的压力,通常300℃-350℃和100-170巴的压力。作为所述方法的结果,产生有机蒸汽、热解气体和炭。使有机蒸汽冷凝以产生生物油。
生物油的回收可以通过冷却反应器并将压力降低至大气压来完成,这允许生物油(有机)和水相发展并从反应器移出生物油。
[1386] 回收的生物油的收率在干重基础上计算为输入生物质的干重的百分比。其根据下式计算:生物油的重量x 100/营养性植物部分的干重。生物油的重量不包括生物油混合物中可能存在的任何水或固体(其通过过滤或其他已知方法容易地去除)的重量。
[1387] 然后可以通过分馏将生物油分为级分,有或无额外的精炼过程。通常,在这些温度下凝聚的级分命名为:约370℃,燃油;约300℃,柴油;约200℃,煤油;约150℃,汽油(petrol)。较重的级分可以裂解为较轻的更可取的级分,这是本领域公知的。柴油燃料通常包含C13-C22烃化合物。
[1388] 酯交换
[1389] 如本文所用,“酯交换”是在催化剂如碱或酸的存在下,通过与短链醇如甲醇或乙醇反应将脂质(原则上是三酰甘油)转化为脂肪酸甲基酯或乙基酯。甲醇更加常用,因为其低成本和可用性,但是还可以使用乙醇、丙醇或丁醇或者醇的混合物。所述催化剂可以是同质催化剂、异质催化剂或酶催化剂。同质催化剂包括硫酸铁随后是KOH。异质催化剂包括CaO、K3PO4和WO3/ZrO2。酶催化剂包括从南极假丝酵母(Candida antarctica)产生的Novozyme 435。
[1390] 酯交换可以在提取的油上进行,或者优选在营养性植物材料中原位进行。可以在用来制备用于转化反应的组合物之前将营养性植物部分干燥和研磨,但不是必须如此。直接转化为脂肪酸酯(优选FAME)的优点是转化可以使用较低的温度和压力,并且仍然提供良好收率的产物,例如,包含至少50重量%FAME。如HTP方法计算通过酯交换回收的生物油的收率。
[1391] 非极性脂质的产生
[1392] 在本领域经常用于实践的技术可以用于提取、加工、纯化和分析本发明植物或其部分产生的脂质如TAG。这类技术在诸如以下文献资源中有所描述和解释:Fereidoon Shahidi,Current Protocols in Food Analytical Chemistry,John Wiley&Sons,Inc.(2001)D1.1.1-D1.1.11,和Perez-Vich et al.(1998)。
[1393] 从营养性植物部分或种子产生油
[1394] 通常,将营养性植物部分或植物种子煮熟、压榨和/或提取以产生粗制营养性油或种子油,然后脱胶、精炼、脱色和除臭。一般来讲,破碎种子的技术是本领域已知的。例如,可以通过向油料种子喷水以将含水量提高至例如8.5%来使油料种子缓和,然后使用间隙设为0.23-0.27mm的平滑辊压成薄片。根据种子的类型,在破碎前可以不加水。施热使酶失活有利于进一步破碎细胞、合并脂滴和聚集蛋白颗粒,所有这些都有利于提取过程。营养性植物部分可以取决于湿润程度相似地处理。
[1395] 在一实施方案中,大部分营养性油或种子油在通过螺旋榨油机后释放出来。螺旋榨油机排出的油饼(营养植物粉、籽粕)然后可以使用伴热柱通过溶剂提取(例如通过己烷提取),或不用溶剂处理(这种情况可以更适合于动物饲料)。可选择地,可以使通过压榨作业产生的粗制营养性油或种子油通过具有槽线排放盖的沉降槽,以除去在压榨作业期间与营养性油或种子油榨出的固体。可以使营养性油或澄清的种子油通过板框压滤机以除去任何剩余的细固体颗粒。
[1396] 一旦将溶剂从粗制油除去后,将压榨和提取的部分合并,然后接受正常的脂质加工工序(即,脱胶、碱炼、脱色和除臭)。
[1397] 从本发明的营养性植物部分提取脂质使用与本领域已知用于种子油提取的那些类似的方法。一种方式是物理提取,其通常不使用溶剂提取。榨油机压榨提取是一种常见类型,如螺旋压榨和冲击压榨提取方法。机械提取通常比溶剂提取效率低,在溶剂提取中,将有机溶剂(例如,己烷)至少与植物生物质混合,优选在生物质干燥和研磨之后。溶剂溶解生物质中的脂质,然后通过机械作用(例如,用上述压榨过程)将该溶液与生物质分离。这个分离步骤还可以通过过滤(例如,用压滤机或相似装置)或离心等进行。然后可以分离有机溶剂与非极性脂质(例如,通过蒸馏)。这个第二分离步骤从植物获得非极性脂质,并且如果采用常规蒸汽回收,可以获得可重复使用的溶剂。在一实施方案中,在提取之前通过如Hom et al.(2007)所述的近红外反射光谱分析植物部分或种子的油和/或蛋白含量。
[1398] 如果营养性植物部分不立即用来提取脂质,优选将其加工以确保将脂质含量尽可能地保留(参见,例如,Christie,1993),如通过干燥营养性植物部分。
[1399] 脱胶
[1400] 脱胶是精炼油的早期步骤并且其主要目的是从油中去除大部分的磷脂,其可占总的提取脂质的约1-2%。在70-80℃下将~2%的水(通常包含磷酸)添加至粗制油中,导致大部分磷脂(伴有微量的金属和色素)的分离。去除的不溶性物质主要是磷脂和三酰甘油的混合物并且也已知为卵磷脂(lecithin)。脱胶可通过以下方法进行:将浓磷酸加入粗制油以将不可水化的磷脂转化为可水化的形式,以及螯合存在的微量金属。通过离心将胶从油中分离。油可通过加入足量的氢氧化钠溶液以滴定所有脂肪酸并除去因此形成的皂而精炼。
[1401] 碱精炼
[1402] 碱精炼是一种处理粗制油的精炼过程,有时也称作中和。其通常在脱胶之后,并且在漂白之前。在脱胶后,可以通过加入足够量的碱溶液来处理油,以滴定所有的脂肪酸和磷酸,并且去除因此形成的皂。合适的碱物质包括氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化锂、氢氧化钙、碳酸钙和氢氧化铵。这个过程通常在室温下进行并去除游离的脂肪酸部分。通过离心或通过萃取至皂的溶剂而将皂去除,并用水洗涤中和的油。如果需要,可以用合适的酸如盐酸或硫酸中和油中任何过量的碱。
[1403] 漂白
[1404] 漂白是精炼过程,其中在漂白粉(0.2-2.0%)的存在下将油在90-120℃下加热10-30分钟,并且其中通过用氮气或蒸汽或在真空中操作而缺乏氧气。油加工中的这个步骤设计为去除不期望的色素(类胡萝卜素、叶绿素、棉酚等),并且该过程还去除氧化产物、微量金属、硫化合物和微量的皂。
[1405] 除臭
[1406] 除臭是在高温(200-260℃)和低压(0.1-1mm Hg)下处理油和脂肪。这通常是通过以约0.1ml/分钟/100ml油的速率将蒸汽引入油来实现。除臭可以通过在真空下将油加热到260℃并以约0.1ml/分钟/100ml油的速率将蒸汽缓慢引入油来进行。鼓泡约30分钟后,使油在真空下冷却。通常将油转移到玻璃容器中,用氩气吹扫,然后冷藏。如果油的量有限,可以将油放在真空下,例如在Parr反应器中,然后加热到260℃持续与除臭会采用的相同时长。
这个处理改善油的色泽,并且除去大部分挥发性物质或有气味的化合物,包括任何残余的游离脂肪酸、单酰甘油和氧化产物。
[1407] 冷滤(Winterisation)
[1408] 冷滤是有时用于油的商业生产的过程,用于在低室温下通过结晶将油和脂肪分离为固体(硬脂)和液体(软脂)部分。其最初应用于棉花种子油以产生无固体的产品。其通常用于降低油中的饱和脂肪酸含量。
[1409] 藻类
[1410] 藻类一年可以产生陆生植物10至100倍的物质,并且可以在开放池塘(如滚道式池塘和湖)或光生物反应器中的培养。最常见的产油藻类一般可包括硅藻(硅藻类)、绿藻(绿藻类)、蓝绿藻(蓝藻类)和金褐藻(金藻类)。此外,可以使用已知为定鞭藻类的第五组。组包括褐藻类和异鞭毛藻。具体的非限制性实例藻类包括以下类别:绿藻纲(Chlorophyceae)、大眼藻纲(Eustigmatophyceae)、土栖藻纲(Prymnesiophyceae)、硅藻纲(Bacillariophyceae)。能够产油的硅藻包括以下属:双肋藻属(Amphipleura)、双眉藻属(Amphora)、角毛藻属(Chaetoceros)、小环藻属(Cyclotella)、桥弯藻属(Cymbella)、脆杆藻属(Fragilaria)、菱板藻属(Hantzschia)、舟形藻属(Navicula)、菱形藻属(Nitzschia)、褐指藻属(Phaeodactylum)和海链藻属(Thalassiosira)。能够产油的绿藻的具体非限制性实例包括纤维藻属(Ankistrodesmus)、葡萄藻属(Botryococcus)、小球藻属(Chlorella)、绿球藻属(Chlorococcum)、杜氏藻属(Dunaliella)、单针藻属(Monoraphidium)、卵胞藻属(Oocystis)、栅藻属(Scenedesmus)和四爿藻属(Tetraselmis)。在一方面,绿藻可以是小球藻属或杜氏藻属。能够产油的蓝藻的具体非限制性实例包括颤藻属(Oscillatoria)和聚球藻属(Synechococcus)。能够产油的金藻类的具体实例包括黄金色藻(Boekelovia)。定鞭藻类的具体非限制性实例包括等鞭金藻属(Isochysis)和颗石藻(Pleurochysis)。
[1411] 可用于本发明的具体藻类包括,例如,衣藻属(Chlamydomonas sp.)如莱茵衣藻,杜氏藻属(Dunaliella  sp.)如盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、Dunaliella tertiolecta、嗜酸杜氏藻(D.acidophila)、D.lateralis、D.maritima、巴夫杜氏藻(D.parva)、多型杜氏藻(D.polmorpha)、D.primolecta、D.pseudosalina、D.quartolecta、绿色杜氏藻(D.viridis),红球藻属(Haematococcus sp.),小球藻属(Chlorella sp.)如绿球藻(Chlorella vulgaris)、Chlorella sorokiniana或原壳小球藻(Chlorella 
protothecoides),破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.),裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.),团藻属(Volvox sp.),微拟球藻属(Nannochloropsis sp.),可以包含超过60wt%脂质的布朗葡萄藻(Botryococcus braunii),三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum),伪矮海链藻(Thalassiosira pseudonana),等鞭金藻属(Isochrysis sp.),巴夫藻属(Pavlova sp.),绿球藻属(Chlorococcum sp.),后棘藻属(Ellipsoidion sp.),新绿藻(Neochloris sp.),栅藻属(Scenedesmus sp.)。
[1412] 本发明的藻类可以使用微孔筛网、通过离心、通过絮凝(使用例如壳聚糖、矾和氯化铁)以及通过泡沫浮选来收获。中断二氧化碳供应可以使藻类自身絮凝,这称为“自絮凝”。在泡沫浮选中,养殖机向水通气形成泡沫,然后从水面撇去藻类。超声和其他收获方法目前正在开发中。
[1413] 脂质可以通过机械破碎从藻类提取。当干燥藻类块时,藻类块保持其脂质含量,然后可以通过榨油机“榨出”。渗透压休克也可以用来从藻类释放细胞组分如脂质,并且超声提取可以加速提取过程。化学溶剂(例如,己烷、苯、石油醚)常用于从藻类中提取脂质。利用酶降解细胞壁的酶法提取也可以用于从藻类中提取脂质。超临界CO2也可以用作溶剂。在这种方法中,将CO2在压力下液化并加热至变为超临界状态(同时具有液体和气体的性质)的点,允许其作为溶剂。
[1414] 植物脂质的用途
[1415] 通过所述方法产生的脂质具有多种用途。在一些实施方案中,将脂质用作食用油。在其他实施方案中,将脂质精炼并用作润滑剂或用于其他工业用途如塑料合成。在一些优选实施方案中,将脂质精炼以生产生物柴油。生物柴油可以制备自衍生自本发明的植物、藻类和真菌的油。植物三酰甘油在生产生物燃料中的用途在Durrett et al.(2008)中进行了综述。所得的燃料通常称作生物柴油,并且具有1.9-6.0mm2s-1的动态粘度(ASTM D6751)。生物醇可以产生自除脂质提取之后残余的脂质以外的糖或生物质的发酵。生产生物燃料的一般方法可以在例如Maher and Bressler(2007),Greenwell et al.(2010),Karmakar et al.(2010),Alonso et al.(2010),Liu et al.(2010a).Gong and Jiang(2011),Endalew et al.(2011)和Semwal et al.(2011)中找到。
[1416] 本发明提供增加营养组织中的油含量的方法。本发明的植物具有增加的叶和/或茎的能量含量,从而可以收获整个地上植物部分并用来生产生物燃料。此外,油酸水平显著升高,而多不饱和脂肪酸α亚麻酸(ALA)减少。因此本发明的植物、藻类和真菌减少生物燃料的生产成本。
[1417] 生物柴油
[1418] 生物柴油或烷基酯的生产是公知的。有三种通过脂质产生酯的基本路线:1)通过醇进行脂质的碱催化酯交换反应;2)通过甲醇进行脂质的直接酸催化酯化反应;以及3)将脂质转化成脂肪酸,然后通过酸催化形成烷基酯。可以使用用于制备脂肪酸烷基酯和甘油醚(其中甘油上的一个、两个或三个羟基被醚化)的任何方法。例如,可以分别通过用酸或碱催化剂水解或皂化TAG来制备脂肪酸,或者可以使用酶如脂肪酶或酯酶。可以通过使脂肪酸与醇在酸催化剂的存在下反应来制备脂肪酸烷基酯。还可以通过使TAG与醇在酸或碱催化剂的存在下反应制备脂肪酸烷基酯。可以例如通过使甘油与卤代烷在碱的存在下反应来制备甘油醚,或者使甘油与石蜡或醇在酸催化剂的存在下反应来制备甘油醚。所述烷基酯可以直接与柴油燃料搀和(blended),或者用水或其他水性溶液洗涤以在搀和前去除各种杂质(包括催化剂)。
[1419] 航空燃料
[1420] 对于改善的生物燃料性能,已开发热和催化的化学键断裂(开裂)技术,其使得能够将生物油转化为石油衍生的柴油燃料和其他燃料如飞机燃油的生物基替代品。
[1421] 通过本发明的细胞、本发明的植物或其部分、本发明的种子、或者任一其转基因形式这样产生的中链脂肪酸来源排除需要高能脂肪酸链开裂以获得飞机燃料和其他燃料需要的具有低温流动性要求的较短分子。这种方法包括从甘油酯切割一个或多个中链脂肪酸基团以形成甘油以及一个或多个游离脂肪酸。此外,所述方法包括分离所述一个或多个中链脂肪酸与甘油,并且脱去所述一个或多个中链脂肪酸的羧基以形成一个或多个烃用于生产飞机燃料。
[1422] 组合物
[1423] 本发明还涵盖包含使用本发明的方法产生的一种或多种植物、植物部分、脂质、蛋白、含氮分子或含碳分子的组合物,尤其是药物组合物。
[1424] 药物组合物可以额外地包含活性成分以及标准、公知、无毒的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物如磷酸盐缓冲盐水、水、乙醇、多元醇、植物油、润湿剂或乳剂如水/油乳剂相结合。组合物可以为液体或固体形式。例如,组合物可以为片剂、胶囊、可摄取液体、散剂、外用膏剂或霜剂的形式。适当的流动性可以例如通过在分散剂的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持。包含等渗剂,例如糖、氯化钠等也可以是可取的。除了这类惰性稀释剂外,组合物还可以包含佐剂如润湿剂、乳化及助悬剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。
[1425] 特定脂肪酸的典型剂量为0.1mg-20g,每天使用一至五次(每天最多100g),并且优选在每天约10mg至约1、2、5或10g的范围内(以一个或多个剂量使用)。如本领域已知的,最低约300mg/天的脂肪酸,特别是多不饱和脂肪酸是可取的。然而,应当理解任何量的脂肪酸将有益于受试者。
[1426] 本发明的药物组合物的可能给药途径包括例如肠道和肠胃外。例如,可以口服给药液体制品。此外,均质混合物可以完全分散于水中,在无菌条件下与生理上可接受的稀释剂、防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合以形成喷雾剂或吸入剂。
[1427] 向受试者给药的组合物的剂量可以由本领域的普通技术人员决定,并且取决于多种因素如受试者的体重、年龄、总体健康状况、既往史、免疫状态等。
[1428] 此外,本发明的组合物可以用于美容目的。可以将所述组合物添加至现有美容组合物中使得形成混合物,或者可以将根据本发明产生的脂肪酸用作美容组合物中唯一的“活性”成分。
[1429] 多肽
[1430] 术语“多肽”和“蛋白”在本文中一般可互换使用。
[1431] 一种多肽或一类多肽可以通过其氨基酸序列与参考氨基酸序列的相同性程度(%相同性)或者通过与一个参考氨基酸序列比与另一个参考氨基酸序列具有更高的%相同性而限定。多肽与参考氨基酸序列的%相同性通常通过GAP分析(Needleman and Wunsch,1970;GCG程序)以空位形成罚分=5和空位延伸罚分=0.3的参数来确定。查询序列的长度为至少100个氨基酸,并且GAP分析在至少100个氨基酸的区域中比对两个序列。甚至更优选地,查询序列长度为至少250个氨基酸,并且GAP分析在至少250个氨基酸的区域中比对两个序列。甚至更优选地,GAP分析在它们的整个长度比对两个序列,并且相同性的程度由参考序列的全长确定。所述一种多肽或一类多肽可以具有与参考多肽相同的酶促活性、或不同的活性或无活性。优选地,多肽的酶活性为参考多肽的活性的至少10%。
[1432] 如本文所用,“生物活性片段”是本发明的多肽的一部分,其保持全长参考多肽的限定活性,例如DGAT活性。如本文所用的生物活性片段不包括全长多肽。生物活性片段可以是任何大小的部分,只要它们保持限定的活性。优选地,生物活性片段保持全长多肽活性的至少10%。
[1433] 至于限定的多肽或酶,应当理解高于本文所提供的那些数值的%相同性数值将涵盖优选的实施方案。因此,当适用时,根据最小%相同性数字,优选多肽/酶包含与相关指定的SEQ ID NO至少60%,更优选至少65%,更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,更优选至少90%,更优选至少91%,更优选至少92%,更优选至少
93%,更优选至少94%,更优选至少95%,更优选至少96%,更优选至少97%,更优选至少
98%,更优选至少99%,更优选至少99.1%,更优选至少99.2%,更优选至少99.3%,更优选至少99.4%,更优选至少99.5%,更优选至少99.6%,更优选至少99.7%,更优选至少
99.8%,以及甚至更优选99.9%相同的氨基酸序列。
[1434] 本文所限定的多肽的氨基酸序列突变体可以通过将合适的核苷酸变化引入本文所限定的核酸或者通过体外合成所需的多肽来制备。这类突变体包括例如氨基酸序列内残基的缺失、插入或取代。可以使缺失、插入和取代的组合到达最终构建体,只要最终多肽产物具有期望的特征。
[1435] 突变(改变)的多肽可以使用本领域已知的任何技术例如使用定向进化或合理设计策略(见下文)来制备。衍生自突变/改变的DNA的产物可以使用本文所述的技术容易地筛选,以确定它们是否具有转录因子、脂肪酸酰基转移酶或OBC活性。
[1436] 在设计氨基酸序列突变体中,突变位点的位置和突变的性质会取决于待改变的特征。突变位点可以单独或系列改变,例如通过(1)首先用保守的氨基酸选择取代,然后根据所得的结果用更激进的选择,(2)缺失靶残基,或者(3)相邻所处位点插入其他残基。
[1437] 氨基酸序列缺失一般范围为约1-15个残基,更优选约1-10个残基,并且通常约1-5个相邻残基。
[1438] 取代突变体具有至少一个在多肽中移除的氨基酸残基以及在其位置插入的不同残基。取代诱变灭活酶的最关注的位点包括鉴定为活性位点的位点。所关注的其他位点是其中获得自不同菌株或物种的特定残基相同的位点。这些位置对于生物活性可能很重要。优选以相对保守的方式取代这些位点,特别是落在至少其他三个相同的保守位点的序列内的位点。这类保守取代在表1中以“示例性取代”的标题示出。
[1439] 表1.示例性取代.
[1440]原始残基 示例性取代
Ala(A) val;leu;ile;gly
Arg(R) lys
Asn(N) gln;his
Asp(D) glu
Cys(C) ser
Gln(Q) asn;his
Glu(E) asp
Gly(G) pro,ala
His(H) asn;gln
Ile(I) leu;val;ala
Leu(L) ile;val;met;ala;phe
Lys(K) arg
Met(M) leu;phe
Phe(F) leu;val;ala
Pro(P) gly
Ser(S) thr
Thr(T) ser
Trp(W) tyr
Tyr(Y) trp;phe
Val(V) ile;leu;met;phe,ala
[1441] 在一优选实施方案中,当与天然存在的多肽相比时,突变体/变体多肽仅具有或不超过一个或两个或三个或四个保守氨基酸改变。保守氨基酸改变的细节在表1中提供。本领域技术人员会知道,可以合理地预测当在转基因植物或其部分中表达时,这类微小改变不会改变多肽的活性。可以利用本领域的标准程序如通过对所关注的已知基因进行随机诱变、靶向诱变或饱和诱变,或者通过对不同基因进行DNA改组将具有期望活性的突变体工程化。实施例
[1442] 实施例1.一般材料和方法
[1443] 以瞬时表达系统在植物细胞中表达基因
[1444] 使用基本上如Voinnet et al.(2003)和Wood et al.(2009)所述的瞬时表达系统在植物细胞中表达基因。将二元载体引入根癌农杆菌菌株AGL1,所述二元载体包含通过强组成型e35S启动子表达的编码区,该启动子包含重复的增强子区域。将用于表达p19病毒沉默抑制子的嵌合二元载体35S:p19单独地引入AGL1,如WO2010/057246中所述。将用于表达V2病毒沉默抑制子的嵌合二元载体35S:V2单独地引入AGL1。使重组细胞在补充了50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的LB肉汤中在28℃下生长至静止期。然后使细菌在室温下以5000g离心沉淀5分钟,之后在包含10mM MES pH 5.7、10mM MgCl2和100μM乙酰丁香酮的渗透缓冲液中重悬至OD600=1.0。然后,将细胞在28℃下振荡温育3小时,之后测量OD600,将达到OD600=0.125的最终浓度所需体积的各培养物(包括病毒抑制子构建体35S:p19或35S:V2)添加至新的管中。。最终体积用上述缓冲液补足。然后将叶用培养混合物渗透,而植株通常在渗透后再生长三到五天,之后回收叶圆片用于纯化的细胞裂解物制备或总脂质分离。
[1445] 两色高粱的转化
[1446] 植物材料
[1447] 近交品种TX-430(Miller,1984)的高粱植株在28±1℃的“白天”温度和20±1℃的“夜晚”温度下,“白天”期间以在900-1000LUX的光强度进行16小时光周期,在植物生长室(Conviron,PGC-20 flex)中生长。在开花之前,圆锥花序用白色半透明纸袋覆盖。在开花后12-15天从穗中收获未成熟胚。用水洗涤穗数次并分离大小均匀的发育中的种子,并使用
20%市售漂白剂与0.1%吐温-20混合进行15-20分钟表面灭菌。然后将它们用无菌蒸馏水洗涤3次,每次20分钟,并在层流罩中吸干。长度为1.4至2.5mm的未成熟胚(IE)在层流罩中无菌分离,并用作制备绿色再生组织的起始组织。
[1448] 基础培养基
[1449] 用于植物转化的培养基基于由PhytoTechnology Laboratories(M519)提供的MS(Murashige和Skoog,1962)。将培养基的pH调节至5.8,然后在121℃灭菌15分钟。将用作选择剂的热敏植物生长调节剂和其他添加剂如遗传霉素(G418,Sigma)过滤灭菌(0.2μm),并在灭菌后当培养基冷却至约55℃时加入培养基中。用于从愈伤组织诱导的植物转化到从未成熟胚诱导的绿色组织的植物再生的不同阶段的优化培养基组成示于表2中。
[1450] 栽培方法和材料
[1451] 将长度为1.4至2.5mm的分离的IE放置在愈伤组织诱导培养基-渗透培养基(CIM-渗透培养基,表2)上,其胚子叶朝上。除非另有说明通过包括α-硫辛酸(1至5mg/l)、褪黑激素(5至10mg/l)和2-氨基胍-2-膦酸HCl(1至2mg/l),来改进CIM基础培养基以及愈伤组织再生培养基,所述改进CIM基础培养基是为了改善未成熟胚的愈伤组织质量和诱导频率。为了发育绿色组织,将未成熟胚在24±2℃的组织培养室中在约45-50μmol.s-1m-2(16小时/天)的荧光下孵育。培养三天后,将未成熟胚的根和芽点无菌分离并重新接种到相同的CIM上并保持在与上述相同的条件下。将它们每两周传代培养到相同的CIM上共6周,并评估愈伤组织质量、愈伤组织诱导效率和转化效率。
[1452] 在CIM的前3-4周从IE开始的愈伤组织大多是胚性的并且缓慢分化成具有结节结构的胚性愈伤组织,所述具有结节结构的胚性愈伤组织颜色为从浅色到深绿色。选择具有绿色结节结构的胚性愈伤组织并在相同培养基(CIM)上通过每2周传代培养长达6个月或更长时间,以用作转化的外植体。这种类型的组织在本文中称为“分化胚性愈伤组织”组织或“DEC”组织,因为该组织形成分化细胞的结节结构,其保持胚胎发生和器官发生潜力,即使组织实际上是愈伤组织细胞的混合物,细胞形成结节结构和颗粒结构以及本发明人理解的中间细胞位于愈伤组织(未分化细胞)和结节结构之间的发育途径上。有时,组织包括早期(球状)体细胞胚。
[1453] 表2.用于高粱的DEC组织诱导和转化的培养基
[1454]
[1455]
[1456] 粒子轰击绿色再生DEC组织
[1457] 制备或获得质粒用于实现稳定转化的实验或用于与其他质粒的共轰击,所述质粒含有编码新霉素磷酸转移酶II(NptII)的选择标记基因,所述选择标记基因在pUbi启动子的控制下提供对抗生素遗传霉素的抗性并且由nos3'区域终止。根据制造商的说明,使用Zymopure TM Maxiprep试剂盒(USA)分离质粒DNA。作为用于转化的对照载体,获得含有设计用于在植物细胞中表达的uidA(GUS)和bar基因的遗传载体。uidA基因受玉米多聚泛蛋白启动子(pUbi)和根癌农杆菌章鱼碱合酶多腺苷酸化/终止子(ocs3')序列的调节控制。启动子和蛋白质编码区之间的序列包括5'UTR和Ubi基因的第一个内含子。uidA报告基因在其蛋白质编码区内还含有来自蓖麻子过氧化氢酶基因的内含子,该基因阻止农杆菌中功能性GUS蛋白的翻译,从而减少接种的植物组织中的背景GUS基因表达。因此,任何GUS表达都是由于uidA基因在植物细胞中的表达。bar基因也受pUbi启动子的调控,并以农杆菌胭脂碱合酶3'调节序列(nos3')终止。uidA/bar载体最初用于检测高粱DEC组织中的瞬时基因表达的实验。
[1458] 使用上述方法产生并且从开始培养6周至6个月的均匀健康的绿色再生DEC组织(4-5mm大小)用于用质粒进行微粒介导的转化(轰击)。将大约15个均匀的绿色DEC组织(每个4-5mm)置于含有CIM-渗透培养基(表2)的培养皿(直径90mm)的中心,并在轰击前在黑暗中孵育约4小时。如Liu等人(2014)所述,用PDS-1000 He装置(Biorad,Hercules,CA)进行轰击。轰击后,将组织保持在相同的渗透培养基上过夜,并在第二天早晨转移到预选培养基中[1459] 用具有编码NptII的选择标记的遗传载体质粒轰击的绿色DEC组织在任何选择之前转移到CIM-PS培养基中3-4天,并在培养基中加入两种化合物(L-半胱氨酸(50mg/l)和抗坏血酸(15毫克/升))作为抗氧化剂(表2)。如果没有在预选培养基中添加这些抗氧化剂,许多被轰击的组织在颜色上变成棕色,一些为非常暗的棕色,并且许多组织丧失了进一步生长的能力。在预选培养基上3-4天后,对一些轰击的组织进行GUS染色并在显微镜下观察以计数独特的蓝色(GUS阳性)斑点,以检查基因是否已经转移并且可以表达。如通过GUS基因的瞬时表达所示,在预选培养基中包含两种抗氧化剂提高了转化效率。
[1460] 优化条件下转基因植物的选择和再生
[1461] 轰击并在没有选择剂(遗传霉素)的预选培养基上培养3-4天后,轰击的组织的大小从4-5mm增加到约6-7mm。将这些组织转移到含有25mg/l遗传霉素的选择性培养基CIM/G25中(表2)并再培养4周。如果可能,将轰击的组织每个分成2-6片,增加独立转化体的回收率。如表2所述,将所有组织培养在培养基上并维持以再生推定的转基因植物。
[1462] 在这些培养基上生长后,植物有效再生。将每个轰击的组织和从其获得的芽进行传代培养并分别维持以计算转化效率。通过PCR对从芽样品中分离的植物基因组DNA确认阳性转化,显示存在选择标记基因。计算每个输入DEC组织的转化体的数量。获得约50%的转化效率,表示为每个输入轰击组织的独立转化体。
[1463] 农杆菌介导的绿色再生DEC组织的转化
[1464] 使用前述实施例的方法产生并且从开始培养6周至6个月的均匀健康的绿色再生DEC组织(4-5mm大小)用于农杆菌介导的转化。
[1465] 设计并制备具有含有转化基因的T-DNA区域的遗传载体,用于使用农杆菌介导的转化来转化绿色再生DEC组织。对照二元载体含有设计用于在植物细胞中表达的uidA(GUS)和bar基因的遗传载体。uidA基因受玉米多聚泛蛋白启动子(pUbi)和根癌农杆菌章鱼碱合酶多腺苷酸化/终止子(ocs3')序列的调节控制。启动子和蛋白质编码区之间的序列包括5'UTR和Ubi基因的第一个内含子。uidA报告基因在其蛋白质编码区内还含有来自蓖麻子过氧化氢酶基因的内含子,该基因阻止农杆菌中功能性GUS蛋白的翻译,从而减少接种的植物组织中的背景GUS基因表达。因此,任何GUS表达都是由于uidA基因在植物细胞中的表达。bar基因也受pUbi启动子的调控,并以农杆菌胭脂碱合酶3'调节序列(nos3')终止。
[1466] 合适的根癌农杆菌菌株如Lazo等人(1991)所述获得例如AGL1,并且通过热激法将遗传载体导入根癌农杆菌菌株中。
[1467] 携带遗传构建体的农杆菌培养物在合适的培养基(例如LB培养基)中生长,并在适当条件下生成农杆菌接种物,之后用农杆菌接种物感染均匀健康的绿色再生DEC组织。将感染的DEC组织印迹在无菌滤纸上以除去过量的农杆菌并转移至共培养培养基,任选地在培养基中补充抗氧化剂,并在黑暗中在约22-24℃孵育2-4天。孵育后,用适当的试剂处理DEC组织以杀死农杆菌,在无菌水中洗涤,转移到合适的培养基中并使其生长。4-6周后,切下芽并在芽伸长培养基上培养,然后使用适当的测定法检测推定的转基因芽。
[1468] 欧洲油菜转化
[1469] 如Kereszt et al.(2007)所述利用氯气将欧洲油菜种子灭菌并在组织培养基上萌发。如Belide et al.(2013)所述分离具有2-4mm柄的子叶叶柄并用作外植体。如Belide et al.(2013)所述制备包含二元载体的根癌农杆菌AGL1(Lazo et al.,1991)培养物并用所述培养物接种子叶叶柄。将感染的子叶叶柄在补充了1mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+3mg/L AgNO3+250mg/L头孢噻肟,50mg/L特美汀和25mg/L卡那霉素的MS培养基中培养,并且在24℃下培养4周,具有16hr/8hr光暗周期,在相同培养基上每两周亚培养。将具有绿色愈伤组织的外植体转移至新枝起始培养基(MS+1mg/L激动素+3mg/L AgNO3+250mg/L头孢噻肟+50mg/L特美汀+25mg/L卡那霉素)并另外培养2-3周。从抗性愈伤组织分离小的新枝(~1cm)并转移至新枝伸长培养基(具有0.1mg/L赤霉酸+3mg/L AgNO3+250mg/L头孢噻肟+25mg/L卡那霉素的MS培养基),并且另外培养2周。选择具有一片或两片叶的健康新枝并转移至生根培养基(具有1mg/L NAA+20mg/L ADS+3mg/L AgNO3+250mg/L头孢噻肟的1/2MS),并且培养2-3周。如制造商的方案所述利用植物DNA分离试剂盒(Bioline,Alexandria,NSW,Australia)从抗性新枝的小叶片分离DNA。通过对基因组DNA进行PCR扩增测试T-DNA序列的存在。将具有根的阳性转基因新枝转移至包含育苗混合物的盆中,并且使其在温室中于24℃白天/16℃夜晚(标准条件)下生长。
[1470] 纯化的叶裂解物–酶测定
[1471] 将之前如上所述渗透的本氏烟草叶组织在包含0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.2)和0.33M蔗糖的溶液中用玻璃匀浆器研磨。将叶匀浆物在4℃下以20,000g离心45分钟,之后收集各上清液。根据Bradford(1976)使用Wallac1420多标记计数仪和Bio-Rad蛋白测定染料试剂(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA USA)测量各上清液中的蛋白含量。酰基转移酶测定根据作了一些修改的Cao et al.(2007)方法使用100μg蛋白。反应培养基包含100mM Tris-HCl(pH 7.0)、5mM MgCl2、1mg/mL BSA(无脂肪酸)、200mM蔗糖、40mM冷油酰基-CoA、
16.4μM sn-2单油酰基甘油[14C](55mCi/mmol,American Radiochemicals,Saint Louis,MO USA)或6.0μM[14C]甘油-3-磷酸(G-3-P)二钠盐(150mCi/mmol,American Radiochemicals)。
测定进行7.5、15或30分钟。
[1472] 脂质分析
[1473] 种子中油含量的分析
[1474] 当要在小种子如拟南芥种子中确定种子油含量或总脂肪酸组成时,将种子中的脂肪酸直接甲基化而不破碎种子。将种子在干燥器中干燥24小时,并且将约4mg的种子转移至含有Teflon衬里螺旋盖的2ml玻璃小瓶中。将溶于0.1毫升甲苯的0.05毫克甘油三十七烷酸酯(triheptadecanoin)(具有3个C17:0脂肪酸的TAG)添加至小瓶中作为内部标准。通过将0.7ml的1N甲醇HCl(Supelco)添加至包含种子材料的小瓶中将种子脂肪酸甲基化。种子的破碎对于小种子如拟南芥种子的完全甲基化不是必需的。将混合物简短涡旋并在80℃下温育2小时。将混合物冷却至室温之后,将0.3ml的0.9%NaCl(w/v)和0.1ml的己烷添加至小瓶中并在Heidolph Vibramax 110中好好混合10分钟。将FAME收集至0.3ml的玻璃衬管中并如下文所述用火焰离子化检测器(FID)的通过GC分析。
[1475] 首先在市售标准GLC-411(NU-CHEK PREP,INC.,USA)中存在的已知量的相同FAME的峰面积响应的基础上将单个FAME的峰面积进行了修正。GLC-411包含等量的31种脂肪酸(重量%),范围从C8:0至C22:6。对于不存在于该标准中的脂肪酸的情况,采用最相似的FAME的峰面积响应。例如,16:1d9的FAME峰面积响应用于16:1d7,而C22:6的FAME响应用于C22:5。通过与内部标准量比较,经修正的面积用来计算样品中每种FAME的量。油主要以TAG的形式储存并且其重量基于FAME的重量计算。通过计算每种FAME的摩尔数并将FAME的总摩尔数除以三来确定甘油的总摩尔数。使用如下方程将TAG计算为甘油与脂肪酰基部分的和:油的重量%=100x((41x总的FAME mol/3)+(总的FAME g-(15x总的FAME mol)))/g种子,其中41和15分别是甘油部分和甲基的分子量。
[1476] 更大的种子中脂肪酸含量的分析
[1477] 为了确定较大的单个种子如油菜和亚麻荠种子或高良或玉米种子中的脂肪酸组成,如拟南芥种子进行种子中脂肪酸的直接甲基化,除了破碎种皮。这种方法从种子提取足够的油以允许脂肪酸组成分析。为了确定来自种子的总提取脂质的脂肪酸组成,将种子破碎并用CHCl3/MeOH提取脂质。将提取脂质的等分试样甲基化并通过GC分析。通过破碎之后利用CHCl3/MeOH从已知重量的干燥种子两次提取脂质,然后甲基化脂质的等分试样连同作为内部标准的17:0脂肪酸来确定油菜的汇集的种子-总脂质含量(种子油含量)。在更大的种子例如亚麻荠的情况下,如拟南芥油分析将来自已知量的种子的脂质连同已知量的17:0脂肪酸甲基化,并且通过GC分析FAME。对于TAG定量,利用TLC将TAG从提取的脂质分级分离并在硅中直接甲基化,利用17:0 TAG作为内部标准。这些方法更详细地描述如下。
[1478] 在植物成熟时收获之后,通过在室温下将种子储存在含有硅胶作为干燥剂的干燥器中24小时来将种子干燥。种子的水分含量通常为6-8%。通过使用氯仿和甲醇的混合物(2/1 v/v)在Eppendorf管中用Reicht组织裂解器(tissue iyser)(22频次/秒进行3分钟)和金属球破碎种子,以从已知重量的干燥种子中提取总脂质。加入1体积的0.1M KC1并将混合物摇晃10分钟。在将该混合物以3000rpm离心5分钟后收集下方的非极性相。用2体积的氯仿通过混合10分钟来洗涤余下的上方(水)相。第二非极性相也被收集并与第一个汇集。在氮气流下将溶剂从提取物的脂质蒸发,并将总干燥脂质溶于已知体积的氯仿中。
[1479] 为了测量所提取的材料中脂质的量,加入已知量的17:0-TAG作为内部标准并将来自已知量种子的脂质在1N的甲醇-HCl(Supelco)中于80℃下温育2小时。将如此制备的FAME在己烷中提取并通过GC分析。基于17:0 TAG-FAME的量将单个FAME定量。在从FAME减去酯化甲基的重量之后,通过除以单个FAME的分子量将单个FAME的重量转化为摩尔数。所有FAME的总摩尔数除以3以计算TAG(以及继而的甘油)的摩尔数。然后,将TAG的摩尔数转化为TAG的重量。最后,使用种子重量计算基于种子重量的百分比油含量,其中为了计算油含量的目的假设所有提取的脂质为TAG或等价于TAG。这种方法是基于Li et al.,(2006)。亚麻荠或油菜种子以外的具有类似大小的种子也可以通过此方法来分析。
[1480] 可以通过核磁共振技术测量油菜和其它种子油含量(Rossell and Pritchard,1991),如通过脉冲波NMS 100 Minispec(Bruker Pty Ltd Scientific Instruments,Germany)。NMR方法可以同时测量水分含量。种子油含量还可以通过近红外反射(NIR)光谱进行测量,如利用NIRSystems Model 5000单色仪。还可以根据Li et al,(2006),在来自一个批次种子的样品上通过在约100℃下干燥样品中的种子18小时来测量水分含量。
[1481] 来自叶裂解物测定的脂质的分析
[1482] 将来自裂解物测定的脂质用氯仿:甲醇:0.1M KCl(2:1:1)提取并回收。将样品中不同的脂质类别在用10%酸浸渍过的硅胶60薄层层析(TLC)板(MERCK,Dermstadt,Germany)上分离。用于从脂质提取物分馏TAG的溶剂体系为氯仿/丙酮(90/10 v/v)。各脂质类别通过将平板暴露于碘蒸气而显色,并通过在相同的TLC平板上运行平行可信标准品而鉴定。将平板过夜暴露于磷成像屏,通过Fujifilm FLA-5000磷屏成像仪进行分析,之后液闪计数以进行DPM定量。
[1483] 来自营养组织的脂质的总脂质分离和分馏
[1484] 通过直接甲基化冻干样品中的脂肪酸来确定叶和其他营养组织样品中总脂质的脂肪酸组成。对于总脂质定量,将已知重量的冻干样品中具有17:0 FFA的脂肪酸直接甲基化。为了确定叶样品中的总TAG水平,通过TLC从提取的总脂质分馏TAG,并且在17:0 TAG内部标准的存在下将其甲基化,因为叶中存在大量的极性脂质。这如下进行。如Bligh and Dyer(1959)所述将包括叶样品的组织冷冻干燥、称重(干重)并提取总脂质,或者通过使用氯仿:甲醇:0.1M KC1(CMK;2:1:1)作为溶剂。在冻干后,通过在每1cm直径叶样本加入900μL的氯仿/甲醇(2/1 v/v)混合物来从本氏烟草叶样品提取总脂质。在要进行TLC-FID分析时,每0.5mg干叶重量加入0.8μg的DAGE作为内部标准。使用IKA ultra-turrax组织分解器将样品匀浆,之后加入500μL的0.1M KC1。将样品涡旋,离心5min并收集下方的相。通过加入600μL的氯仿、涡旋并离心5min来将余下的上方的相进行第二次提取。回收下方的相并将其与前次的收集物汇集。在氮气流下将脂质干燥并在每mg叶干重2μL的氯仿中重悬。如上所述(有一些修改)提取红花烟草叶或叶样品的总脂质。如果组合了4个或6个叶片(每个约1cm2表面积),使用1.6ml的CMK溶剂,而如果组合了3个或更少的叶片,则使用1.2ml的CMK。在含有金属球的Eppendorf管中用Reicht组织分解器(Qiagen)将冻干的叶组织匀浆3分钟(20频次/sec)。经TLC和转甲基化分离中性脂质
[1485] 将已知体积的总叶提取物(例如,30μL),载入至TLC硅胶60平板上(1x20cm)(Merck KGaA,Qermany)。将中性脂质分馏为不同类型,并且在经平衡的含有己烷/DEE/乙酸(70/30/1 v/v/v/)溶剂体系的进展槽(development tank)中通过TLC分离中性脂质与极性脂质。通过樱草灵喷洒来将TAG条带显色,在UV下标记,将其从TLC平板中刮下,转移至2mL的GC小管并用N2干燥。将750μL的1N甲醇-HCl(Supelco analytical,USA)与作为内部标准的已知量的C17:0 TAG一起加入至每个小管,取决于每个样品中TAG的量。通常,对于低TAG样品,添加
30μg的内部标准,而在高TAG样品的情况下,使用多达200μg的内部标准。
[1486] 通过将混合物在80℃下于甲醇-HCl的存在下温育2小时来将用于通过GC分析脂肪酸组成的脂质样品转甲基化。在将样品冷却至室温之后,通过加入350μL的H2O来使反应终止。通过加入350μL己烷、涡旋并以1700rpm离心5min来从混合物提取脂肪酰甲基酯(FAME)。收集上部的己烷相并转移至具有300μl圆锥形插入管(conical insert)的GC小瓶中。蒸发之后,将样品在30μL的己烷中重悬。将1μL注射入GC。
[1487] 通过GC对脂质部分中存在的个别和总的脂肪酸(TFA)的量进行定量,这是通过确定每个峰下的面积并通过与已知量的内部标准的峰面积比较来计算的。使用如下方程将叶中的TAG含量计算为甘油与脂肪酰基部分的和:重量%TAG=lOOx((41x总FAME的mol/3)+(总FAME的g-(15x总FAME的mol)))/叶干重的g,其中41和15分别是甘油部分和甲基的分子量。
[1488] 毛细管气-液色谱(GC)
[1489] 使用Agilent Technologies 7890A GC(Palo Alto,California,USA)来分析FAME,其装配有SGE BPX70(70%氰丙基聚硅亚苯基硅氧烷)柱(30m x0.25mm i.d.,0.25μm膜厚度)、FID、分流/无分流注射器和Agilent Technologies 7693系列的自动取样器和注射器。氦被用作载体气体。以分流模式(50:1比率)在150℃的烘箱温度下注射样品。注射后,将烘箱温度保持在150℃1min,然后以30℃·min-1升至210℃以及最终以50℃·min-1升至240℃。使用Agilent Technologies ChemStation软件(Rev B.04.03(16),Palo Alto,California,USA)来对峰定量,其中是基于已知量的外部标准GLC-411(Nucheck)和C17:0-Me内部标准的反应。
[1490] 通过Iatroscan对TAG定量
[1491] 将1μL的脂质提取物装载至用于TLC-FID IatroscanTM(Mitsubishi Chemical Medience Corporation-Japan)的一个Chromarod-SII上。继而将色谱棒架(Chromarod rack)转移至经平衡的进展槽中,所述进展槽含有70mL的己烷/CHCl3/2-丙醇/甲酸(85/10.716/0.567/0.0567 v/v/v/v)的溶剂体系。温育30min之后,将色谱棒架在100℃下干燥
3min并立即于Iatroscan MK-6s TLC-FID分析仪(Mitsubishi Chemical Medience Corporation-Japan)上扫描。使用SIC-480II整合软件(版本:7.0-E,SIC 
Systeminstruments Co.,LTD-Japan)整合DAGE内部标准和TAG的峰面积。
[1492] 以两个步骤进行TAG定量。首先,在所有样品中扫描DAGE以纠正提取产率,之后选择经浓缩的样品并稀释。接下来,在稀释的样品中以第二次扫描来对TAG进行定量,其中所述扫描是依照使用三硝酸甘油(Sigma-Aldrich)作为外部标准的外部校准。
[1493] 通过GC对叶样品中的TAG定量
[1494] 首先在市售标准GLC-411(NU-CHEK PREP,Inc.,USA)中存在的已知量的相同FAME的峰面积响应的基础上将单个FAME的峰面积进行了修正。通过与内部标准比较,经修正的面积用来计算样品中每种FAME的量。由于油主要以TAG的形式储存,基于每个样品中FAME的量来计算油的量。通过计算FAME的摩尔数并将FAME的总摩尔数除以3来确定甘油的总摩尔数。使用如下方程将TAG的量计算为甘油与脂肪酰基部分的和:油的重量%=100x((41x总FAME的mol/3)+(总FAME的g-(15x总FAME的mol)))/叶干重的g,其中41和15分别是甘油部分和甲基的分子量。
[1495] 可溶性蛋白质提取和定量
[1496] 从10-20mg研磨的新鲜植物组织中提取可溶性蛋白质。简而言之,叶绿素和可溶性糖在80℃下在pH7.5的2.5mM HEPES缓冲液中在50-80%(v/v)乙醇中提取,保留沉淀用于可溶性蛋白质测定。将沉淀物在蒸馏水中洗涤,重悬于400μl0.1M NaOH中并在95℃下加热30分钟。使用Bradford测定法(Bradford,1976)确定上清液中的可溶性蛋白质。还在含有100mM Tris-HCl pH 8.0和10mM MgCl2的缓冲液中从新研磨的组织中提取可溶性蛋白质。
通过Bradford测定法对可溶性蛋白质的定量给出与使用NaOH提取获得的结果类似的结果。
[1497] SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
[1498] 通过在Laemmli缓冲液(1:3w/v)中于95℃加热样品10分钟,从冷冻的研磨叶组织中提取总蛋白质。根据Laemmli(1970),在10%丙烯酰胺凝胶上分离标准化至鲜重(FW)的上清液的等分试样。
[1499] 叶氮含量
[1500] 使用具有ANCA制备系统的Europa20-20同位素比质谱仪测定2-2.2mg冷冻干燥的叶组织的总氮含量(%干重,DW),所述ANCA制备系统包括在1000℃下操作的燃烧和还原管和分别为600℃。
[1501] 碳和能量含量
[1502] 基于野生型和转基因叶组织中的TAG、淀粉和总碳水化合物的量(%叶干重)计算碳和能量含量。淀粉水平(%叶干重)首先通过乘以因子180/162转化为葡萄糖当量,以考虑由于链连接引起的水损失。可溶性糖定义为总碳水化合物和淀粉水平之间的差异。分别根据三油酰甘油酯(35114kJ/mol;885.4g/mol;57mol C/mol)和葡萄糖(28.3kJ/mol;180g/mol;6mol C/mol)的能量密度、分子量和碳含量计算TAG和可溶性糖的碳和能量含量。如上所述计算淀粉-葡萄糖当量的碳和能量含量用于可溶性糖部分。总之,用于获得不同碳代谢库的碳含量和能量密度的公式如下:
[1503] TAG的碳含量(mmol C/g叶干重)=(%TAG×57mol C/mol TAG×1000)/(100×885.4g/mol TAG)
[1504] 可溶性糖的碳含量(mmol C/g叶干重)=[(%碳水化合物总量-(%淀粉x 180/162))×6mol C/mol葡萄糖*1000]/(100*180g/mol葡萄糖)
[1505] 淀粉的碳含量(mmol C/g叶干重)=[(%淀粉x 180/162))×6mol C/mol葡萄糖*1000]/(100*180g/mol葡萄糖)
[1506] TAG的能量含量(kJ/g叶干重)=(%TAG×39.66kJ/g TAG)/100
[1507] 可溶性糖的能量含量(kJ/g叶干重)=[(%碳水化合物总量-(%淀粉x 180/162))x 15.57kJ/mol葡萄糖]/100
[1508] 淀粉的能量含量(kJ/g叶干重)=[(%淀粉×180/162))×15.57kJ/mol葡萄糖]/100。
[1509] 实施例2,在叶组织中积累高水平的TAG的植物中沉默TAG脂肪酶
[1510] 已经证明糖依赖性1(SDP1)TAG脂肪酶在拟南芥的非种子组织中以及在种子萌发期间在TAG转换中起作用(Eastmond等人,2006;Kelly等人,2011;Kelly等人,2013)。SDP1在发育中的种子中表达,并且SDP1多肽也存在于与油体结合的成熟种子中。沉默编码SDP1的基因导致拟南芥根和茎中TAG水平的小幅但显著的增加(基于干重<0.4%),而在叶组织中观察到更小的增加(Kelly等,2013)。
[1511] 为了确定相对于AtWRI1和AtDGAT1的共表达,在叶和茎组织中TAG水平是否可以进一步增加,设计了一个实验来沉默红花烟草植物中的内源SDP1基因,所述植物对于具有用于转基因表达WRI、DGAT1和油质蛋白多肽的基因的T-DNA是纯合的(Vanhercke等,2014)。使用AtSDP1核苷酸序列作为查询对本氏烟草转录组(Naim等人,2012)进行BLAST搜索,鉴定了与拟南芥SDP1基因具有同源性的转录物(Nbv5tr6385200,SEQ ID NO:173)。选择713bp区域(SEQ ID NO:174)用于发夹介导的基因沉默。基于pHELLSGATE12载体设计3.903kb合成片段,其依次包含enTCUP2组成型启动子、正义方向上的713bp本氏烟草SDP1片段(侧翼为attB1和attB2位点)、Pdk内含子、反向方向上的cat内含子序列、第二个713bp本氏烟草SDP1片段(侧翼为反向(反义)方向的attB1和attB2位点),以及OCS3'区域终止子/多腺苷酸化位点(图2)。使用SmaI和KasI限制性位点将插入物亚克隆到pJP3303中,并且得到的表达载体命名为pOIL051。该嵌合DNA含有潮霉素抗性选择标记基因。
[1512] pOIL051用于通过农杆菌介导的转化产生转化的红花烟草植物。起始植物细胞来自转基因植物,所述转基因植物对pJP3502的T-DNA是纯合的(Vanhercke等,2014)。通过潮霉素抗性选择含有来自pOIL051的T-DNA的转基因植物,并将其转移到温室中的土壤中或在受控环境箱中继续生长。在植物发育的开花前、开花期和结实期,从确认的双转化体(T0植物)收获叶样品,并测定各自的TAG水平。通过从叶样品中提取脂质的手段鉴定仅含有低水平叶TAG或与对照相同水平的TAG的转基因植物,并通过点TLC分析并丢弃。如实施例1中所述,通过GC定量剩余转化体群体中的TAG水平。在开花之前,这些植物中的大多数在其叶组织中表现出大大增加的TAG水平(>5%的叶干重),而4个植物含有超过10%的TAG水平(表3)。在开花前,这些植物的叶子中观察到的最大TAG水平是在植物51-13中的11.3%。作为比较,表达AtWRI1、AtDGAT1和油质蛋白的亲本红花烟草植物的转基因植物在开花前显示出约
2%的TAG水平,在开花期显示出约6%的TAG水平(Vanhercke等,2014)。因此,向AtWRI1加AtDGAT1组合添加SDP1抑制构建体对于增加这些植物中的TAG水平具有协同作用。令人惊讶的是,在开花阶段从双重转化的植物收获的叶子中的TAG含量大大增加,在干重基础上观察到为30.5%(表4),相对于未对SDP1沉默的植物增加5倍。令发明人惊讶的是,在结种期,TAG水平在衰老叶片(绿色和黄色)的样品中达到惊人的70.7%(干重的%)(表5)。当使用NMR测量来自烟草植物在结实期的整个叶子的油含量时,已经开始衰老的一些绿叶中的TAG含量为约43%,并且在一些褐色干燥叶中的TAG含量为42%。当在两个棕色纸过滤器之间挤压这种叶片时,渗出的油浸入纸中并使其半透明,而对照烟叶则不会这样,提供了用于检测具有高油含量的植物的简单筛选方法。
[1513] 使用潮霉素基因特异性引物对通过数字PCR(ddPCR)分析含有来自pJP3502和pOIL51的每种T-DNA并显示高TAG水平的两个原代转化体(#61,#69)以确定pOIL51T-DNA插入的数量。命名为#61的植物含有来自pOIL51的一个T-DNA插入,而植物#69含有来自pOIL51的三个T-DNA插入。通过ddPCR再次筛选两个株系的T1后代植物,以鉴定纯合的、杂合的和空的植物。选择不含来自pOIL51的插入的植物#61的子代植物(空;总共7个)或含有2个T-DNA插入的植物#61的子代植物(即该T-DNA纯合;总共12个)用于进一步分析。类似地,保持含有来自pOIL51的零T-DNA插入(空;总共2个)或含有2个这样的插入(总共15个)或4或5个插入(总共5个)的株系#69的后代植物用于进一步分析。
[1514] 选择的T1植物在温室中与对照植物同时并在与对照植物相同的条件下生长。将来自T1植物的绿叶组织样品在开花前干燥,并通过GC分析确定总脂肪酸(TFA)和TAG含量。含有两种T-DNA的植物的TFA含量基于干重为4.6%至16.1%的范围,包括基于干重的相同叶中的TAG水平为1.2%至11.8%(图3)。与仅含有来自pJP3502的T-DNA并在相同条件下一起生长并在相同生长阶段分析的植物相比,这更加显著,再次显示降低TAG脂肪酶活性与WRI1加DGAT组合之间的协同作用。仅含有pJP3502 T-DNA的植物含有4.2%-6.8%TFA,包括基于干重的TAG水平为1.4%至4.1%(图3)。野生型植物平均含有约0.8%TFA,包括基于干重的小于0.5%TAG。来自#61和#69系的每一个的叶子的总脂肪酸含量和TAG含量中的脂肪酸组成与仅含有来自pJP3502(亲本)的T-DNA的叶子中的组成相似。与野生型对照叶相比,含有来自pOIL51和pJP3502的两种T-DNA的植物表现出增加水平的C16:0、C18:1和C18:2脂肪酸。脂肪酸组成的这种显著变化主要是以C18:3为代价,其占总脂肪酸含量的百分比从约50-
55%降低至约20-30%。
[1515]
[1516]
[1517]
[1518]
[1519]
[1520]
[1521] 在整个植物发育过程中保持TFA水平的大量增加,所述TFA水平包括仅含有pJP3502 T-DNA的植物和含有来自pOIL51和pJP3502两者的T-DNA的植物之间的TAG水平。仅含有来自pJP3502的T-DNA的对照植物在开花期间含有7.7%至17.5%TAG,而在结种期基于干重的TAG水平为14.1%至20.7%。含有pJP3502和pOIL51两者T-DNA的植物叶片中的TAG含量在开花期间变化在6.3%和23.3%之间,在结种期变化在12.6%和33.6%之间。如前所述,营养性生长阶段检测到TAG部分的脂肪酸组成在两个阶段的类似变化。
[1522] 还发现TAG水平在转基因植物(例如根和茎)的其他营养性组织中进一步增加。基于干重,用pOIL051的T-DNA转化的转基因红花烟草植物的一些根组织含有4.4%TAG,并且一些茎组织含有7.4%TAG(图4)。野生型植物和仅含有来自pJP3502的T-DNA的红花烟草在两种组织中表现出低得多的TAG水平。为了降低内源性TAG脂肪酶的表达而添加发夹SDP1构建体显然与编码转录因子和TAG生物合成的基因(WRI1和DGAT)协同,所述编码转录因子和TAG生物合成的基因为了增加茎和根中的TAG含量的。值得注意的是,与同一植物中的茎组织相比,根中的TAG水平较低,而在野生型植物和仅含有来自pJP3502的T-DNA的红花烟草中观察到相反的趋势。如先前在转基因叶组织中观察到的,根和茎组织的TAG组成在C18:1和C18:3脂肪酸中表现出类似的变化。与野生型对照相比,转基因茎组织中TAG中C18:2水平降低,而C16脂肪酸在转基因根组织中通常降低。
[1523] 因此,本发明人得出结论,在植物生长的所有阶段将用于使内源性SDP1基因沉默的外源基因添加至WRI1和DGAT的组合增加了总脂肪酸含量,包括TAG含量,并且使内源性SDP1基因沉默的外源基因与WRI1和DGAT(特别是在茎和根中)协同作用。
[1524] 将来自转基因植物的T1种子在室温下体外铺在组织培养基上以测试萌发的程度和时间。与仅用来自pJP3502的T-DNA转化的转基因植物的种子相比,来自三个独立转化的株系的T1种子的萌发是相同的。此外,早期幼苗活力似乎不受影响。考虑到SDP1在拟南芥种子中的萌发中的作用以及观察到的SDP1突变体中萌发的缺陷,这是令人惊讶的(Eastmond等人,2006)。为了克服任何萌发缺陷(如果发生这种情况),设计了第二种构建体,其中SDP1抑制性RNA表达自种子中基本上不表达或低水平表达的启动子(例如来自光合基因的启动子,比如SSU)。发明人认为降低对种子萌发或早期幼苗活力的有害影响的风险是有益的,以避免组成型启动子或至少避免种子中表达的启动子驱动SDP1抑制性RNA的表达。
[1525] 值得注意的是,具有最高TAG水平的T0植物在受控环境室(500微摩尔光照强度,16小时光照/26℃-8小时黑暗/18℃白天循环)的高光条件下生长,并且与野生型对照植物相比看起来更小(相对于用来自pJP3502的T-DNA转化的植物的高度的约70%)。发明人得出结论,用于“推”、“拉”、“保护”和“包装”方法的转基因和/或遗传修饰的组合特别有利于在营养性植物部分中实现高水平的TAG。在这个例子中,WRI1提供了“推”,DGAT提供了“拉”,SDP1的沉默提供了“保护”,而油质蛋白提供了TAG的“包装”。
[1526] 实施例3,转录因子的衰老特异性表达
[1527] 已报道胚胎和种子发育的主要调节子如LEC2的异位表达提高非种子组织中的TAG水平(Santos-Mendoza et al.,2005;Slocombe et al.,2009;Andrianov et al.,2010)。但是,用35S-LEC2基因转化的植物中LEC2的组成型过量表达导致不需要的对植物发育和形态学的多效性作用,包括体细胞胚胎发生和异常的叶结构(Stone et al.,2001;Santos-Mendoza et al.,2005)。为了测试对植物发育的叶衰老阶段(即植物已完全长大并达到它们的完全生物质之后)限制LEC2表达是否会最小化不可取的表型效应但仍提高叶脂质水平,设计并制备嵌合DNA用于在来自SAG12基因的拟南芥衰老特异性启动子的控制下表达LEC2(U37336;Gan and Amasino,1995)。
[1528] 为了制备遗传构建体,制备3.635kb合成DNA片段,其顺序包含拟南芥SAG12衰老特异性启动子、LEC2蛋白编码序列和大豆凝集素基因终止子/多腺苷酸化区。将这个片段插入pJP3303的SacI和NotI限制性位点之间。将这个构建体命名为pOIL049,并且在用编码WRI1、DGAT1和油质蛋白多肽的基因稳定转化的包含来自pJP3502的T-DNA的红花烟草植物的叶中测试。利用农杆菌介导的转化方法,将pOIL049构建体用来转化对于pJP3502的T-DNA是纯合的红花烟草植物细胞。通过潮霉素抗性选择包含来自pOIL049的基因的转基因植物并使其在温室中生长至成熟。在生长的不同阶段(包括在叶衰老时)从转基因叶组织采集样品,所述样品与红花烟草pJP3502亲本系相比包含提高的TAG水平。
[1529] 获得总计149株独立的T0植物(即原代转化体)。在植物发育的结实阶段将所有植物的上部绿叶和所选事件的下部褐色、完全衰老的叶采样并通过TLC-GC定量TAG含量。利用潮霉素基因特异性引物对通过ddPCR确定所选植物中pOIL49 T-DNA插入的数量。在结实阶段收获的绿叶组织中观察到在干重基础上30.2%的TAG水平。在大多数采样的植物中,褐色叶中的TAG水平较低。但是,3株植物(#32b、#8b和#23c)在褐色衰老叶中表现出比绿色展开叶中大的TAG水平。这些植物包含来自pOIL49的1、2或3个T-DNA插入。
[1530] 通过ddPCR筛选植物#23c和#32b的T1子代以鉴定来自pOIL049的T-DNA的空、杂合和纯合植物。选择包含0个来自pOIL049的T-DNA插入(空;总计7个)或2个来自pOIL049的T-DNA的T-DNA插入(纯合;总计4个)的植物#23c的子代植物用于进一步分析。相似地,维持包含0个插入(空;总计6个)或2个插入(纯合;总计9个)的植物#32b的子代植物用于进一步分析。在开花之前采样绿叶组织并通过GC确定TFA和TAG含量。野生型植物和用来自pJP3502的T-DNA转化的植物与之前相同(实施例2),并且使其在相同温室中一起生长。在开花之前包含来自pOIL049的T-DNA的转化体叶中的TFA水平范围为在干重基础上5.2%-19.5%(图5)。相同组织中的TAG水平范围为在干重基础上0.8%-15.4%。这比仅包含来自pJP3502的T-DNA的植物中大很多。包含来自pJP3502和pOIL049的T-DNA的植物中的TAG水平在开花和结实期间分别提高至38.5%和34.9%。当分析对于来自pOIL049的T-DNA纯合的叶的总脂肪酸含量的脂肪酸组成时,观察到升高水平的C18:2和降低水平的C18:3(图5),同时C16:0和C18:1的百分比相对于仅用来自pJP3502的T-DNA转化的叶保持不变。这些数据证实添加非组成型启动子控制下的第二转录因子基因以提供发育调节的表达能够进一步提高植物的营养组织中的TAG水平。数据还表明衰老特异性启动子SAG12在叶衰老之前在绿色组织中有一些表达。
[1531] 当与野生型红花烟草植物和单独包含来自pJP3502的T-DNA的转基因植物相比时,茎组织中的TAG水平升高很多。在干重基础上,用来自pOIL049的T-DNA转化的转基因红花烟草植物的一些茎组织包含4.9%TAG(图6)。在另一方面,根组织中的TAG水平在3个pOIL049植物之间表现出大变化,一些根组织包含3.4%TAG。值得注意的是,在相同植物内根中的TAG水平与茎组织相比较低,但是在野生型植物和仅包含来自pJP3502的T-DNA的红花烟草中观察到相反趋势。根和茎组织的TAG组成表现出与以前在转基因叶组织中观察到的相似的C18:1和C18:3脂肪酸变化。当与野生型对照相比时,TAG中的C18:2水平在转基因茎组织中降低,而C16脂肪酸通常在转基因根组织中降低。
[1532] 制备相应的遗传构建体,其编码SAG12启动子控制下的其他转录因子,即LEC1、LEC1样、FUS3、ABI3、ABI4和ABI5等(参见实施例9)。例如,制备额外的构建体用于在拟南芥SAG12启动子的单子叶植物驱动的同系物如玉米SEE1启动子(Robson et al.,2004)的控制下表达单子叶植物转录因子玉米LEC1(Shen et al.,2010)或两色高粱LEC1(Genbank登录号XM_002452582.1)。制备其他构建体用于在发育控制的启动子下表达转录因子,例如在开花时优先表达的启动子(例如日长敏感启动子),光敏色素启动子,隐花色素启动子,或者在二次生长期间在植物茎中如来自CesA基因的启动子。将这些构建体用来转化植物,并且选择在营养性部分中产生至少8%TAG的植物。
[1533] 实施例4.转基因植物的分析
[1534] 植物材料和生长条件
[1535] 在受控条件下,在生长箱或温室中培养三株TAG积累的转基因株系的植物:
[1536] 1.过量表达编码WRI1、DGAT和油质蛋白的基因的植物(Vanhercke等,2014),在此称为HO植物,是T2代的植物,其对于引入的来自pJP3052的T-DNA是纯合的。
[1537] 2.用RNAi构建体(沉默SDP1 TAG脂肪酶)以及来自pJP3502的T-DNA(编码WRI1、DGAT和油质蛋白多肽)转化的T1植物,来自两个独立的转化系。参见实施例2。这些植物命名为SDP1。
[1538] 3.用用于从SAG12启动子过表达转录因子LEC2的遗传构建体以及编码WRI1,DGAT和油质蛋白多肽的来自pJP3502的T-DNA转化T1植物。参见实施例3。这些植物命名为LEC2,并且是来自单个T0植物的后代。
[1539] 野生型植物(WT,栽培品种Wisconsin38)用作对照植物,并在与转基因植物相同的条件下同时生长。对于营养性样品,WT和HO烟草植物在环境CO2浓度下,在来自荧光灯泡的250-450μmolm-2s-1光照下在PGC20/PGC20FLEX植物生长箱(Conviron)中生长。植物在12小时光照/25℃:12小时黑暗/20℃的每日循环下生长。在播种后49天(播种后天数,DAS)从其收获样品的植物在具有osmocote肥料的土壤中的1.25升盆中生长。将在69DAS下收获样品的植物在土壤中的4升盆中生长,并用aquasol肥料每14天浇一次。对于所有测定,从每种基因型的四种植物中取样。对于在生长的结种期收获的样品,WT、HO、SDP1和LEC2植物在没有人工光的温室中生长(分别为n=3、3、8、6)。对于所有分析,在具有光的生长期结束时从叶中收获叶盘,快速冷冻并储存在-80℃直至分析。
[1540] TAG水平和脂肪酸组成
[1541] 在成熟WT、HO、SDP1和LEC2植物的叶中测量TAG水平。还确定了叶子TAG中的脂肪酸组成。表6中显示了LEC2和SDP1植物的数据。
[1542] 淀粉和糖水平
[1543] 在从野生型以及转基因HO、SDP1和LEC2植物采样的叶组织中测量淀粉和可溶性糖水平。一般来说,在具有两种T-DNA的叶中在干重基础上在叶组织中的TAG和淀粉水平之间发现负相关(图7和图8)。相反,相对于野生型,叶可溶性糖水平在转基因植物中几乎相同,表明从糖转化至TAG没有显著瓶颈。在野生型植物中观察到植物中叶位置的影响,其中淀粉水平倾向于从较低的叶向更高的叶位置升高。在转基因植物中未检测到这样的影响。
[1544] 碳和能量含量
[1545] 测量HO、SDP1和LEC2植物的叶中TAG、淀粉和糖含量中的碳和能量,并基于干重与野生型植物进行比较。数据(表7)显示相对于WT植物,HO植物中每个的碳和能量含量增加,并且SDP1和LEC2植物中的碳和能量含量进一步增加。观察到TAG、淀粉和可溶性糖的总和以及TAG和淀粉的总和的增加。结论是,通过增加TAG含量来增加碳含量,而不是补偿降低的淀粉含量。因此,转基因植物基于干重表现出增加的总碳含量和增加的总能量含量。
[1546] 氮和可溶性蛋白质含量
[1547] 对于69DAS的植物,如实施例1所述,在转化植物和对照植物的叶子样品中测量氮和蛋白质含量。每个WT和HO烟草植物从顶部的第三片叶子具有约为DW的3.0%的相同的氮含量,其中所述植物的叶子尚未完全展开并因此仍然生长。还分析了每株植物上的较老(较低处)叶。在WT植物中,叶氮含量随着叶龄而降低,而在较老的HO叶中氮含量相对保持,与WT植物相比具有较少的下降。例如,与WT植物中的相应叶子(1.3%)相比,较老的叶子(例如来自HO植物顶部的叶子11)具有超过两倍的氮(2.9%)(图9a)。对于总可溶性蛋白质观察到类似的趋势,与WT相比,在较老的HO叶中检测到两倍的可溶性蛋白质(HO和WT分别为10.4和5.0μg/mg FW;图9B)。当根据叶子鲜重标准化样品加载后,通过SDS-PAGE电泳可溶性蛋白质样品时观察到相同的趋势。
[1548]
[1549]
[1550] 在WT和HO植物中,叶蛋白含量随植物年龄而增加(图10,表8)。在较年轻的植物(49DAS)中,与WT相比,来自HO植物的老叶中的可溶性蛋白质含量略微但不显著地更高。通过69DAS,与WT相比,这种差异显著(老HO叶片增加87%(p<0.05,t-检验))。结论是HO植物的叶子相对于WT植物中的相应叶子具有显著增加的氮和蛋白质含量。在这种情况下,“相应的叶子”是指在相同条件下生长的相同年龄的植物的叶子。
[1551] 表8.WT和HO烟草中的叶可溶性蛋白质含量(μg/mg FW)。范围包括较年轻(49DAS)和较老(69DAS)植物的幼叶、成熟叶和较老叶。
[1552]
[1553] SDP1和LEC2植物中的氮含量
[1554] 与整个生长期间的HO植物(实施例2和3)相比,命名为LEC2和SDP1的转基因植物随着植物年龄而增加表现出增加的TAG积累。测定在生长箱或温室中生长的转基因植物的叶样品的氮、蛋白质和碳含量。相对于WT植物,LEC2和SDP1植物表现出增加的叶碳含量、叶氮含量和可溶性蛋白含量(表9)。在生长的结实期,LEC2和SDP1叶子比WT叶子具有多50%至100%的氮。相对于WT叶,LEC2和SDP1叶中叶可溶蛋白含量分别增加40%至87%。叶碳含量也增加了。与WT叶片相比,尽管在LEC2和SDP1株系中叶片碳含量适度增加(16%至21%),但叶片氮含量的相对增加更多,使得碳氮比率降低多达40%。
[1555] 总膳食纤维(TDF)
[1556] WT、SDP1和LEC2在开花时获得的成熟叶中的总膳食纤维的分析显示WT叶具有27%的TDF含量,SDP1叶具有15.9%的TDF含量(与WT相比减少59%),和LEC2叶具有17.9%的TDF含量(与WT相比减少34%)。
[1557] 表9.WT、LEC2和SDP1烟草叶片的TAG含量(%干重)、碳含量、氮含量和可溶性蛋白质含量。对于TAG分析,n=3-8,并且对于C、N和可溶性蛋白质分析,n=2-5。
[1558]
[1559] 上调参与光合作用的基因
[1560] 上述关于转基因植物中碳和能量含量增加的观察结果,使发明人考虑植物是否在光合能力表现出增加与淀粉和TAG之间改变的碳分配有关。因此,确定HO植物的转录组并与来自在相同条件下生长的WT植物的转录组进行比较。从开花阶段从植物分离RNA,转化为cDNA并确定全转录组。当比较所得序列文库中各个基因的呈现的频率时,观察到许多参与光合作用的基因在HO植物中上调(过表达)。表10列出了上调的代表性基因。由此可以得出结论,转基因植物的光合作用能力增加。
[1561] 修饰光周期和光强度的效果
[1562] 与上述那些相比,改变生长条件,以测试从12小时增加或减少光周期以及增加光强度的效果。在使用高光强度和长光周期的一个生长室中,CO2浓度也增加到高于环境的CO2浓度。测试以下条件,在每种情况下,植物在光照期间25℃下、黑暗期间20℃下在PGC20/PGC20FLEX植物生长箱(Conviron)中生长,并且在从每个植物的底部计数的叶片Nos.9、15和20的生长的结种期收获叶子样品。因此,叶9是采样叶中最老的叶,中间的是叶15,叶20是最年轻的叶。如实施例1中所述测定叶子的总脂肪酸(TFA)含量。
[1563]
[1564]
[1565]
[1566] 1.对照条件:8株植物在荧光灯泡照射300μmolm-2s-1,12小时光周期生长;
[1567] 2.增加光照强度:7株植物在荧光灯泡照射700μmolm-2s-1,12小时光周期生长;
[1568] 3.减少光周期:9株植物在荧光灯泡照射700μmolm-2s-1,8小时光周期生长;
[1569] 4.增加光照强度和光周期:10株植物在荧光灯泡照射700μmolm-2s-1,12小时光周期,CO2浓度700ppm生长。
[1570] 每种基因型的叶9、15和20的平均数据绘制在图11中。单独增加的光强度不显著影响TFA水平。将光周期从12小时减少到8小时降低了TFA的水平,但是意外地是在很小程度上降低了。也就是说,即使将每24小时接收的光量减少33%也具有非常小的效果。观察到的最显著的结果来自于在增加的光强度和增加的CO2浓度下使用增加的光周期的测试。TFA水平显著增加,达到LEC2植物叶片的50%(w/w干重)及以上。由于TFA测定仅测量脂质的脂肪酸组分,这意味着这些叶中的总脂质水平甚至更高。
[1571] 实施例5:在单子叶植物的营养部位修饰性状的方法
[1572] 设计嵌合DNA构建体以通过在转基因植物中表达编码WRI1、玉米LEC1(登录号AAK95562;SEQ ID NO:155)、DGAT和油质蛋白的组合来增加单子叶植物如C4植物两色高粱(高粱)中的油含量。如下,设计用于基因枪共转化的几对构建体,并且通过限制性酶-连接克隆产生。
[1573] 遗传构建体pOIL136是包含3个单子叶植物表达盒的二元载体,即用于植物选择的编码草胺膦乙酰基转移酶(PAT)的选择标记基因,用于表达DGAT的第二个盒以及用于表达油质蛋白的第三个。首先产生pJP136,通过扩增来自水稻的肌动蛋白基因启动子(McElroy et al.,1990)并将其作为平端-ClaI片段插入pORE04(Coutu et al.,2007)产生pOIL094。然后通过在KpnI位点将已为单子叶植物表达而密码子优化的芝麻油质蛋白基因的一个版本插入pOIL094产生pOIL095。通过将拉曼伞形霉(Umbelopsis ramanniana)DGAT2a基因(Lardizabal et al.,2008)的一个单子叶植物密码子优化版本作为SmaI-KpnI片段插入包含玉米泛素基因启动子的载体产生pOIL093。然后通过将来自pOIL093的NotI DGAT2a表达盒在NotI位点克隆入pOIL095产生pOIL134。通过将编码PAT的选择标记基因作为BamHI-SacI片段插入包含玉米泛素启动子的载体产生pOIL141。最后,通过将玉米泛素::PAT表达盒作为平端-AscI片段克隆入pOIL096的ZraI-AscI产生pOIL136。遗传构建体pOIL136因此包含以下表达盒:启动子水稻(O.sativa)肌动蛋白::芝麻(S.indicum)油质蛋白、启动子玉米泛素::拉曼伞形霉(U.ramanniana)DGAT2a和启动子玉米泛素::PAT。
[1574] 通过将来自pUKN的玉米泛素::NPTII盒作为HindIII-SmaI片段亚克隆入pJP3343的AscI(平端)和HindIII位点构建包含NPTII代替PAT的相似载体pOIL197。然后用HindIII(平端)和AgeI消化所得的载体pOIL196。将所得的3358bp片段克隆入pOIL134的ZraI–AgeI位点,获得pOIL197。
[1575] 设计并制备包含在不同启动子控制下的编码玉米WRI1(ZmWRI)或LEC1(ZmLEC1)转录因子的基因的一套构建体用于与pOIL136或pOIL197组合基因枪共转化,以便测试在C4植物如高粱的营养组织中表达时启动子强度和细胞特异性对WRI1或LEC1或者两者(如果组合)的功能的影响。这套单独的构建体不含选择标记基因,除了pOIL333,其包含NPTII作为选择标记。测试的不同启动子如下。玉米泛素基因启动子(pZmUbi)是强组成型单子叶植物启动子,而据报道具有重复增强子区的增强的CaMV 35S启动子(e35S)导致较低的转基因表达水平(在Girijashankar and Swathisree,2009中综述)。虽然玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pZmPEPC)基因启动子在叶肉细胞中活化(Matsuoka and Minami,1989),C4植物物种中光合作用的部位,但是玉米Rubisco小亚基(pZmSSU)基因启动子是维管束鞘细胞层特异性的(Nomura et al.,2000;Lebrun et al.,1987),C4植物中发生碳固定的细胞。
[1576] 据鉴定在植物发育期间编码SEE1半胱氨酸蛋白酶的玉米基因(登录号AJ494982)的表达与拟南芥SAG12衰老特异性启动子相似。因此还选择来自SEE1基因的1970bp启动子(SEQ ID NO:207)驱动编码玉米WRI1和LEC1转录因子的基因的表达。此外,还选择来自编码马伴草(Aeluropus littoralis)锌指蛋白AlSAP的基因的启动子(Ben Saad et al.,2011;登录号DQ885219;SEQ ID NO:208)、来自编码甘蔗杂种DIRIGENT(DIR16)的基因的启动子(Damaj等人,2010;登录号GU062718;SEQ ID NO:246)、来自编码甘蔗杂种O-甲基转移酶(OMT)的基因的启动子(Damaj等,2010;登录号GU062719;SEQ ID NO:247)、来自编码甘蔗杂种R1MYB1的基因的A1启动子等位基因(Mudge等,2009;登录号JX514703.1;SEQ ID NO:
248)、来自编码甘蔗杂种载入茎基因Gene5(LSG5)的基因的启动子(Moyle和Birch,2013;登录号JX514698.1;SEQ ID NO:249)和来自发根农杆菌的蔗糖反应性ArRolC基因的启动子(Yokoyama et al.,1994;登录号DQ160187;SEQ ID NO:209)用于在茎组织中表达ZmWRI1。
因此,如下将这些启动子中的每个单独连接在ZmWRI1或ZmLEC1编码区的上游。
[1577] 首先通过将侧翼为AscI-NcoI位点的玉米WRI1编码序列和转录终止子/多腺苷酸化区克隆入二元载体pJP3343中的相同位点产生中间载体pOIL100。用于WRI1表达的不同版本的构建体是基于这个载体并通过将各种启动子克隆入pOIL100产生。通过将包含具有重复增强子区的e35S启动子的XhoI-SalI片段克隆入pOIL100的XhoI位点产生pOIL101。通过将包含玉米泛素基因启动子的HindIII-AvrII片段克隆入pOIL100的HindIII-XbaI位点产生pOIL102。通过将包含玉米PEPC基因启动子的HindIII-Nco片段克隆入pOIL100的HindIII-NcoI位点产生pOIL103。通过将包含玉米SSU基因启动子的HindIII-AvrII片段克隆入pOIL100的HindIII-AvrII位点产生pOIL104。
[1578] 合成包含侧翼为HindIII-XhoI独特位点的玉米SEE1启动子区的合成片段。利用pOIL100中的HindIII-XhoI位点将这个片段克隆在玉米WRI1蛋白编码区的上游。将所得的载体命名为pOIL329。合成包含侧翼为XhoI-XbaI独特位点的马伴草AlSAP启动子区的合成片段。利用pOIL100中的XbaI-XhoI位点将这个片段克隆在玉米WRI1编码区的上游。将所得的载体命名为pOIL330。合成包含侧翼为PspOMI-XhoI独特位点的发根农杆菌ArRolC启动子区的合成片段。利用pOIL100中的PspOMI-XhoI位点将这个片段克隆在玉米WRI1编码区的上游。将所得的载体命名为pOIL335。最后,在三个步骤中获得包含玉米SEE1::ZmLEC1表达盒的二元载体(pOIL333)。首先,通过用包含AvrII和KpnI位点的侧翼引物扩增GUS编码区来构建35S::GUS表达载体。随后将所得的片段克隆入pJP3343的SpeI-KpnI位点。将所得的载体命名为pTV111。然后,用玉米SEE1启动子取代pTV111的35S启动子区。为此,利用包含HindIII和XhoI独特位点的侧翼引物扩增玉米SEE1序列。用各自的限制性酶切割所得的片段并亚克隆入pTV111的SalI-HindIII位点。将所得的载体命名为pOIL332。然后,利用包含NotI和EcoRV位点的侧翼引物扩增ZmLEC1编码序列。将这个所得的片段亚克隆入pOIL332的各位点,获得pOIL333。
[1579] 合成了含有侧翼为HindIII-XbaI位点的甘蔗DIR16启动子区的2673bp合成片段。使用pOIL100中的HindIII-XbaI位点将该片段克隆到玉米WRI1蛋白编码区的上游。将所得载体命名为pOIL337。合成了含有侧翼为XhoI-XbaI位点的甘蔗OMT启动子区的2947bp合成片段。使用pOIL100中的XhoI-XbaI位点将该片段克隆到玉米WRI1蛋白编码区的上游。将所得载体命名为pOIL339。合成了含有侧翼为HindIII-XhoI位点的甘蔗R1MYB1启动子区的
1181bp合成片段。使用pOIL100中的HindIII-XhoI位点将该片段克隆到玉米WRI1蛋白编码区的上游。将所得载体命名为pOIL341。合成了含有侧翼为XbaIII-SmaI位点的甘蔗LSG5启动子区的4482bp合成片段。使用pOIL100中的StuI-NheI位点将该片段克隆为玉米WRI1蛋白编码区上游的XbaIII-SmaI片段。将所得载体命名为pOIL343。
[1580] 从pOIL101、pOIL102、pOIL103、pOIL104、pOIL197和pOIL136制备全质粒DNA用于基因枪转化。然后将pOIL197 DNA与pOIL101、pOIL102、pOIL103或pOIL104混合,并如实施例1中所述通过基因枪介导的转化转化到分化的两色高粱(谷粒高粱TX430)胚胎愈伤组织(DEC)组织中。可选地,用于表达相同的基因组合的构建体被单独转化或通过农杆菌介导的转化而共转化(Gurel等人,2009;Wu等人,2014)到DEC组织中。
[1581] 再生二十五至五十个转基因植物并通过对包含pOIL197各自与pOIL102(pZmUbi::WRI1)、pOIL103(pZmPEPC::WRI1)和pOIL104(pSSU::WRI1)的构建体对的抗生素抗性进行选择。也单独用pOIL197和单独用pOIL102或pOIL103进行转化,并用“空载体”对照进行转化。
通过PCR证明了在对选择剂具有抗性的植物中存在所需的转基因。每个转基因的拷贝数也通过数字PCR确定。
[1582] 在将它们从MS培养基转移到土壤之前,在第一亚组转基因双色高粱植物中定量总叶脂。该初步筛选表明在这个非常早期阶段的一些事件的叶组织中的总脂质水平略微升高。通过薄层色谱(TLC)进一步分析具有最高总脂质含量的株系pOIL136(2),以确定转基因表达对TAG积累的影响。在转移到温室中的土壤后,在营养阶段对该特定株系的叶组织取样。当与野生型和空载体阴性对照比较时,pOIL136(2)在TLC分离和碘染色后在叶组织中表现出增加的TAG水平。随后的定量显示,与阴性对照相比,转基因株系中的TAG增加10倍。TAG谱以多不饱和脂肪酸亚油酸和α-亚麻酸占主导。
[1583] 将确认的转基因植物转移到温室盆中的土壤中后,在以下阶段从原代转化体中取样全叶:在生长的营养性阶段(即在靴叶出现之前)、在靴叶阶段(定义为随着靴叶已完全出现,靴叶是植物上形成的最后一片叶子并且穗(顶部)从靴叶出现)、以及在成熟的结实期。如实施例1中所述,通过TLC-GC定量总脂肪酸(TFA)和三酰基甘油(TAG)含量(%叶干重)。
[1584] 野生型和空载体阴性对照中的TFA水平在植物发育期间降低(表11),并且在0.7-3.3%(重量/干重)的范围内。在靴叶出现之前检测到最高的TFA水平(称为生长的营养性阶段)并且不高于3.3%。在整个植物生命周期中,相同植物中的TAG水平始终低至0-0.2%的范围内(表11)。TFA含量和TAG含量均具有主要为C16:0、C18:2Δ9,12(LA)和C18:3Δ9,12,15(ALA)的脂肪酸组成。特别地,ALA以TFA含量的约50-75%存在,反映了该脂肪酸在野生型质体膜中的用途。ALA也是野生型叶中存在的极少量TAG中的主要脂肪酸。
[1585] 在营养、靴叶和成熟结种期分析已经用pOIL197或pOIL136转化的35种经证实的转基因植物,除了选择标记基因外,每种载体包含pZmUbi:DGAT和pZmUbi:油质蛋白基因。数据列于表12-14中。通常,与阴性对照品系相比,pOIL197和pOIL136原代转化体显示出增加的TFA和TAG积累,但与对照相比,TFA水平仅增加约两倍。在生长的营养性阶段检测到最高的TFA水平(表12)。与野生型和阴性对照品系类似,TFA水平随着植物年龄的增长而降低(表13和14)。营养、靴叶和成熟结实期的最大TFA水平分别为5%、4.5%和2.1%。检测到的最高TAG水平在0.9和1.9%之间变化,取决于采样时植物的年龄(表13),因此相对于野生型叶片中的极低水平增加至10倍(表11)。TFA组成在不同阶段基本保持不变,并且由ALA主导。TAG组成在不同转基因品系之间显示出更高程度的变异。与TFA含量的脂肪酸组成相比,在所研究的所有植物阶段中,硬脂酸、油酸和LA(18:2Δ9,12)的水平在TAG中持续增加。
[1586] 通过用含有NPTII选择标记基因的pOIL102和pUKN的共轰击产生通过用pOIL102(pZmUbi:WRI1)转化制备的九种原代转基因植物。表15-17显示了在三个生长阶段测量的TFA和TAG含量和脂肪酸组成的数据。当与用编码DGAT2和油质蛋白(pOIL197或pOIL136)的构建体转化的植物相比时,pOIL102转基因事件中的TFA和TAG水平通常较低。实际上,TFA和TAG的水平与野生型和阴性对照植物中的水平相似。营养、靴叶和成熟结实期的最大TFA水平分别为2.6%、2.5%和2.0%(表15-17)。观察到的营养、靴叶和成熟结实期的最大TAG水平分别为0.2%、0.4%和0.9%。
[1587] 对用pOIL197(pZmUbi:DGAT和pZmUbi:油质蛋白)和pOIL102(pZmUbi:WRI1)两者共同轰击制备并且证实已整合两种遗传构建体的36个原代转基因植物,分析其在三个成长阶段的TFA和TAG含量和脂肪酸组成。数据见表18-20。与单个pOIL197、pOIL136或pOIL102载体的转化相比,一些植物表现出显著增加的TFA和TAG水平。pOIL102+pOIL197群体中营养、靴叶和成熟结实期的最大TFA水平分别为7.2%、6.4%和6.1%(表18-20)。重要的是,在植物发育期间观察到的最大TAG水平从2.7%(营养性阶段)增加到3.5%(靴叶阶段)和4.3%(成熟结实期)(表18-20)。与用DGAT和WRI1转基因单独转化获得的数据相比,这举例说明了共表达DGAT和WRI1转基因以增加营养性植物组织中非极性脂质积累的协同作用。在大多数情况下,高水平的TAG和TFA与C18:3Δ9,12,15含量的显著降低相关,C18:3Δ9,12,15含量在具有最高TAG水平的株系中降低了约50%。
[1588] 在植物发育的三个阶段期间,分析含有pOIL197(pZmUbi:DGAT和pZmUbi:油质蛋白)和pOIL103(pZmPEPC:WRI1)的36个原代转化体的TFA和TAG含量和脂肪酸组成。数据列于表21-23中。具有该基因组合的一些植物显示出在该实验系列中检测的最高的TFA和TAG水平。在pOIL103+pOIL197群体中的营养、靴叶和成熟结实期阶段观察到TFA水平分别为8.3%、8.3%和4.5%(表21-23)。在营养、靴叶和成熟结种期观察到TAG水平分别为2.3%、
6.6%和3.0%(表21-23)。值得注意的是,在靴叶阶段的事件TX-03-31中检测到所有转基因株系中最高的TAG(6.6%)和TFA(8.3%)水平。虽然C18:3Δ9,12,15通常在TFA的部分中占据主导,但该群体中的TAG组合物显示出高度的可变性。值得注意的是,一些事件表现出以ALA为代价的棕榈酸(C16:0)和/或亚油酸(LA,C18:2Δ9,12)水平的增加。实际上,在一些事件中,TFA和TAG含量中的ALA水平均降低至40%以下,在所选事件中低于30%。在一些选定的事件中,TAG中的ALA水平低于20%。
[1589] 通过分离分蘖并将它们移植到新盆中的土壤中来繁殖含有较高水平的TFA和TAG的植物。分蘖产生了新的根,并继续增长。当分析新植物的叶样品时,观察到9.3%TFA水平中8.3%的TAG水平。
[1590] 分析含有pOIL197(pZmUbi:DGAT和pZmUbi:油质蛋白)和pOIL104(pSSU:WRI1)两者的16个原代转化体的TFA和TAG含量和脂肪酸组成。在营养生长阶段取样的含有pOIL197和pOIL104两者的T-DNA区的原代转化体的叶中观察到4.1%和5.9%的TFA(表24)。令人惊讶的是,在该群体中检测到的最高TFA水平伴随着相对低的TAG含量。植物和靴叶阶段的pOIL104+pOIL197转基因植物中的TAG水平仅达到0.6%和2.8%。增加的TAG水平通常与C18:3Δ9,12,15的减少和棕榈酸和LA两者的增加有关。
[1591] 许多独立转化植物中的TFA和TAG水平示例性如图19所示。
[1592] 通过RT-PCR方法测量许多植物中WRI1和DGAT1基因的表达水平。观察到具有相对高TTQ的植物TX-03-31在测试植物中具有最高水平的DGAT表达。结论是高水平的DGAT表达有利于增加TAG水平以及也有利于增加TTQ。
[1593] 从本实施例中的大量数据中得出的最令人惊讶和意外的结论可能是除了少数特殊植物如植物TX-03-31,TFA含量相对较高伴随着低水平的TAG(表22)。也就是说,尽管发生了大量增加的脂肪酸合成,但大部分增加的脂肪酸并未表现为TAG。该结论与对于烟草属(包括烟草)的WRI1+DGAT转基因植物观察到的结果完全相反。为了在高粱植物中对其进行定量,计算所有上述转基因高粱种群的TAG与TFA水平的商(表11-24)。TAG/TFA商(TTQ)参数计算为TAG(%)的水平除以TFA(%)的水平,TAG(%)的水平和TFA(%)的水平各自作为植物材料(在这种情况下为叶)的干重的百分比。据观察,对于许多高粱株系,TTQ在0.01至0.6的范围内。向植物添加一种或多种进一步的遗传修饰以提供SDP1、TGD或TST水平的降低,或PDAT,PDCT或CPT多肽中一种或多种的水平增加,对于植物株系的大部分使TTQ增加至0.6以上。特别是,植物中TAG脂肪酶的减少使TTQ增加至0.95。
[1594] 由于许多转基因株系中绝对TFA和TAG水平的巨大差异,本发明人选择了两个pOIL102+pOIL197事件用于定量主要中性和极性脂质类别,以确定其中存在的高水平脂肪酸的脂质类型。通过TLC分离脂质类型并定量。在生长的营养性阶段,TX-02-8和TX-02-19分别含有4.5%和7.2%TFA(表18)。TX-02-8叶中的TAG含量仅略微增加,而磷脂酰胆碱(PC,磷脂)和半乳糖脂MGDG的水平与阴性对照相当。TX-02-19表现出增加的TAG、PC和MGDG水平,表明中性和极性脂质类别均增加。
[1595] 对TX-03-8植物(靴叶期)和TX-03-28(营养期)进行更详细的脂质分析(图13)。野生型(开花)和空载体转化体(营养性阶段)用作比较对照。尽管在取样时植物年龄存在差异,但两种转基因植物的叶子都含有增加的TFA和总极性脂质水平。TX-03-28在营养性阶段含有高达3.4%的TAG,而TX-03-8中的TAG水平仅在开花期阶段略微增加。两种转基因株系都表现出令人惊讶的半乳糖脂MGDG和DGDG量的大幅增加。不同极性脂质类别,磷脂PC、PG、PE、PA、PS、PI的增加不太明显但仍然显著(图13B)。通过LC-MS进一步研究发现两种转基因株系的游离脂肪酸部分中C18:0、C18:2Δ9,12和18:3Δ9,12,15的水平均增加,表明在脂肪分解之前通过酰基编辑产生经过PC的通量。转基因叶组织中增加的DAG分子种类包括34:2(可能是C16:0/C18:2Δ9,12)、34:3(可能是C16:0/C18:3Δ9,12,15)、36:4(可能是C18:2Δ9,12/C18:2Δ9,12和C18:1Δ9/C18:3Δ9,12,15)和36:5(可能是C18:2Δ9,12/C18:3Δ9,12,15)。DAG级分中多不饱和脂肪酸的富集与TAG组成匹配,并且提出PC衍生的DAG作为TAG合成的前体。在两种转基因植物中观察到PC和PE分子种类的类似变化,而PI种类主要具有C16:0和C18脂肪酸。PG分子种类在C16:0中高度富集,通过原核途径反映其质体合成。两种转基因系中的半乳糖脂主要来源于真核脂质途径,即富含C18脂肪酸。主要的MGDG分子种类为36:6(可能是C18:3Δ9,12,15/Δ9,12,15C18:3 ),作为DGDG36:6合成的底物。两个转基因株系中的第二个主要DGDG物种,34:3(可能是C16:0/C18:3Δ9,12,15),也可能来自质外来源。在转基因叶组织中,由C16/C16/C18(48:X)、C16/C16/C18(50:X)和C16/C18/C18(52:x)组成的TAG分子种类增加。有趣的是,与阴性对照相比,54:8(可能是C18:2Δ9,12/C18:3Δ9,12,15/C18:3Δ9,12,15)和54:9(可能是C18:3Δ9,12,15/C18:3Δ9,12,15/C18:3Δ9,12,15)减少。总之,这些结果表明转基因系中通过PC增加了酰基链到TAG的通量,而半乳糖脂生物合成主要通过真核途径发生。这些数据还使发明人理解,除了本发明的转基因之外,植物中TGD活性的降低或PDCT和/或CPT的增加可能会增强TFA和TAG水平。
[1596] 如Gould et al.,(1991)所述将用于农杆菌介导的转化的嵌合DNA构建体用来转化玉米。简单地说,将茎尖外植体与转基因农杆菌共培养2天,然后转移至包含卡那霉素和羧苄西林的MS盐培养基上。几轮亚培养之后,转化的新枝和根自发形成并移植至土壤。所述构建体相似地用来利用对这些物种已知的转化方法转化大麦和燕麦。简单地说,对于大麦,农杆菌培养物用来根据公开的方法(Tingay et al.,1997;Bartlett et al.,2008)转化大麦(cv.Golden Promise)的未成熟胚中的细胞,所述方法有一些修改,其中从未成熟的颖果分离长度为1.5-2.5mm的胚胎并去除胚轴。将所得的外植体与转基因农杆菌共培养2-3天,然后在包含特美汀和潮霉素的培养基上于黑暗中培养4-6周以产生胚性愈伤组织,然后移至过渡培养基在弱光中2周。然后将愈伤组织转移至再生培养基以允许新枝和根的再生,之后将再生的植株转移至土壤。获得转化的植物并使其在温室中生长至成熟。
[1597] 表11.在植物发育的不同阶段期间野生型(WT)和空载体(EV)阴性对照中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。
[1598]
[1599] Veg:营养性;BL,生长的靴叶阶段;MSS,成熟结种期。
[1600] 表12.在生长的营养性阶段期间以pOIL197或pOIL136(pZmUbi:DGAT;pZmUbi:油质蛋白)转化的高粱叶中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。各行是以TFA水平增加的顺序列出的。
[1601]
[1602]
[1603] 表13.在生长的靴叶阶段期间以pOIL197或pOIL136(pZmUbi:DGAT;pZmUbi:油质蛋白)转化的高粱叶中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。各行是以TFA水平增加的顺序列出的。
[1604]
[1605]
[1606] 表14.在生长的成熟结种期期间以pOIL197或pOIL136(pZmUbi:DGAT;pZmUbi:油质蛋白)转化的高粱叶中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。各行是以TFA水平增加的顺序列出的。
[1607]
[1608] 表15.在生长的营养性阶段期间以pOIL102(pZmUbi:WRI1)转化的高粱叶中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。
[1609]
[1610]
[1611] 表16.在生长的靴叶阶段期间以pOIL102(pZmUbi:WRI1)转化的高粱叶中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。
[1612]
[1613] 表17.在生长的成熟结种期期间以pOIL102(pZmUbi:WRI1)转化的高粱叶中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。
[1614]
[1615]
[1616] 表18.在生长的营养性阶段期间以pOIL102(pZmUbi:WRI1)和pOIL197(pZmUbi:DGAT和pZmUbi:油质蛋白)转化的高粱叶中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。各行是以TFA水平增加的顺序列出的。
[1617]
[1618]
[1619] 表19.在生长的靴叶阶段期间以pOIL102(pZmUbi:WRI1)和pOIL197(pZmUbi:DGAT和pZmUbi:油质蛋白)转化的高粱叶中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。各行是以TFA水平增加的顺序列出的。
[1620]
[1621]
[1622]
[1623] 表20.在生长的成熟结实期期间用pOIL102(pZmUbi:WRI1)和pOIL197(pZmUbi:DGAT和pZmUbi:油质蛋白)转化的高粱叶中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。
[1624]
[1625]
[1626] 表21.营养性生长阶段pOIL103+pOIL197原代转化体中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。
[1627]
[1628]
[1629] 表22.靴叶阶段的pOIL103+pOIL197原代转化体中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。
[1630]
[1631]
[1632]
[1633] 表23.在成熟结种期的pOIL103+pOIL197原代转化体中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。
[1634]
[1635]
[1636] 表24.营养生长阶段pOIL104(pSSU:WRI1)+pOIL197(pZmUbi:DGAT和pZmUbi:油质蛋白)原代转化体中的TFA和TAG水平、脂肪酸组成和TTQ。
[1637]
[1638] 如Gould et al.,(1991)所述将用于农杆菌介导的转化的嵌合DNA构建体用来转化玉米。简单地说,将茎尖外植体与转基因农杆菌共培养2天,然后转移至包含卡那霉素和羧苄西林的MS盐培养基上。几轮亚培养之后,转化的新枝和根自发形成并移植至土壤。所述构建体相似地用来利用对这些物种已知的转化方法转化大麦和燕麦。简单地说,对于大麦,农杆菌培养物用来根据公开的方法(Tingay et al.,1997;Bartlett et al.,2008)转化大麦(cv.Golden Promise)的未成熟胚中的细胞,所述方法有一些修改,其中从未成熟的颖果分离长度为1.5-2.5mm的胚胎并去除胚轴。将所得的外植体与转基因农杆菌共培养2-3天,然后在包含特美汀和潮霉素的培养基上于黑暗中培养4-6周以产生胚性愈伤组织,然后移至过渡培养基在弱光中2周。然后将愈伤组织转移至再生培养基以允许新枝和根的再生,之后将再生的植株转移至土壤。获得转化的植物并使其在温室中生长至成熟。
[1639] 实施例6.在双子叶植物中修饰性状
[1640] 通过在营养性部分中表达WRI1、DGAT和油质蛋白基因的组合增加双子叶植物物种白三叶草(Trifolium repens)(三叶草)(常用作牧草物种的豆科植物)中的油含量。构建体pJP3502用来通过农杆菌介导的转化来转化白三叶草(T.repens)(Larkin et al.,1996)。简单地说,通过标准电穿孔程序将遗传构建体pJP3502引入根癌农杆菌。二元载体还包含T-DNA内的35S:NptII选择标记。使转化的农杆菌细胞在补充了卡那霉素(50mg/L)和利福平(25mg/L)的固体LB培养基上生长并在28℃下温育2天。将单一集落用来开始新鲜培养。48小时旺盛培养之后,将农杆菌细胞用来处理如Larkin et al.(1996)所述从吸涨的种子解剖的白三叶草(cv.Haifa)子叶。共培养3天之后,将外植体暴露于25mg/L卡那霉素以选择转化的新枝,然后转移至生根培养基以形成根,之后转移至土壤。
[1641] 获得包含来自pJP3502的T-DNA的6株转化的植物并转移至温室中的土壤。在一些植物的非种子组织中观察到油含量增加,一株植物表现出叶中的TAG水平增加大于4-倍。这类植物可用作动物饲料,例如通过使植物在牧场中生长,提供具有增加的能量含量/单位重量(能量密度)的饲料并导致动物的生长速度增加。
[1642] 构建体pJP3502还用来通过Wright et al.(2006)的方法转化其他豆科植物如紫花苜蓿和蒺藜苜蓿(M.truncatula)以获得在营养性部分中具有增加的TAG含量的转基因植物。转基因植物可用作牧草物种或者用作草料或青贮饲料作为动物的饲料来源,例如,牛、羊和马,提供饲料中增加的能量密度。
[1643] 实施例7.质体GPAT表达的俢改
[1644] 植物细胞中质体GPAT的过量表达
[1645] 进行许多实验以测试这样的假设,植物中高度活跃的16:3原核途径的存在(即所谓的16:3植物)在引入pJP3502上的基因组合时会在营养组织中提供相对于18:3植物低很多的TAG水平。这些实验在以下实施例中描述。最初,发明人测试是否可以通过质体GPAT的过量表达,增加原核途径中的通量来破坏转基因本氏烟草中观察到的高水平TAG积累。
[1646] 通过RT-PCR从拟南芥总RNA扩增用于表达拟南芥质体GPAT,ATS1的编码区(Nishida et al.,1993),并且作为EcoRI-PstI片段克隆入35S启动子控制下的二元表达载体pJP3343以产生组成型表达载体pOIL098。通过将嵌合载体pOIL098渗透入高油叶组织来确定在高油叶背景中过量表达质体GPAT的效果。通过WRI1和DGAT二元表达载体的共渗透(实施例1)或者通过将pOIL098渗透入用来自pJP3502的T-DNA或另一高油载体稳定转化的烟草属植物的叶产生高油叶组织。预期在共表达ATS1-编码基因的渗透叶斑中油含量减少。
这通过分析TFA和TAG作为样品干质量的比例确定。这还通过观察标记的乙酸盐掺入制备自渗透叶斑的微粒体或叶裂解物的脂肪酸来确定。
[1647] 拟南芥的质体GPAT突变体中的油积累
[1648] 拟南芥的ats1突变体在编码质体GPAT的基因中具有破坏性突变,其将质体GPAT活性降低至仅野生型的3.8%的水平(Kunst et al.,1988)。测试并比较亲本和ats1突变体拟南芥中的非种子TAG积累水平(至少叶、茎和根中)。通过转化将用于过量表达编码WRI1、DGAT和油质蛋白的基因组合的pJP3502构建体的T-DNA引入两种基因型的植物。在两种植物背景下pJP3502的T-DNA中的基因组合均增加脂肪酸合成。但是,由于质体GPAT活性减少以及因此减少的脂肪酸进入质体原核途径的通量,预期ats1突变体中TAG的积累平均显著高于源自野生型(亲本)基因型的转基因植物。在转化和未转化的ats1突变体的叶中脂肪酸C16:3比C18:3的比例均显著减少。
[1649] 沉默植物细胞中编码质体GPAT的基因
[1650] 除了通过在编码质体GPAT的基因中引入突变来遗传修饰植物,通过沉默质体GPAT可以减少脂肪酸通过原核16:3途径的通量,从而增加营养性部分中的油含量。这通过产生具有表达RNA发夹(对应于编码来自所选物种的质体GPAT的基因区)的组成型或叶特异性启动子的转基因盒来确定。作为实例,利用拟南芥质体GPAT cDNA序列(NM_179407,SEQ ID NO:177)的581bp SalI-EcoRV片段产生RNAi发夹表达盒。与NM_179407的核苷酸序列具有高度序列相同性的编码质体GPAT的任何基因区也可以用来构建用于表达发夹RNA的基因用于沉默内源质体GPAT基因。设计包含侧翼为SmaI和KasI独特位点的本氏烟草质体GPAT的732bp片段(SEQ ID NO:210)的hpRNAi构建体用于稳定转化入红花烟草。将合成的本氏烟草质体GPAT片段亚克隆入pJP3303的SmaI-KasI位点,导致pOIL113。预期减少质体脂肪酸保留会导致TAG积累增加,特别是在与“推”组分如过量表达转录因子如WRI1,或者通过“拉”组分如DGAT或PDAT,和/或减少的SDP1或TGD活性组合时。
[1651] 利用CRISPR/Cas9方法可以实现编码质体GPAT的基因或实际上任何基因的失活。例如,可以通过CRISPR/Cas9/sgRNA介导的基因破坏和随后通过非同源末端连接(NHEJ)DNA修复诱变进行编码拟南芥质体GPAT的基因(登录号NM_179407)的失活。靶向DNA切割之前,Cas9刺激DNA链分离并允许sgRNA与靶向基因中的特异性20nt序列杂交。这将靶DNA以相对于PAM(串联苷核苷酸)结合位点正确的方向定位入Cas9的活性位点。这个定位允许Cas9的不同核酸酶结构域独立地在PAM位点上游3-nt的点切割靶DNA序列的每条链。然后双链断裂进行错误倾向的NHEJ DNA修复,期间一些核苷酸的缺失或插入发生并导致质体GPAT基因的失活。通过使用CRISPRP网络工具(Xie et al.,2014)鉴定并选择靶向拟南芥GPAT基因的SgRNA序列。20nt靶序列可以是靶基因内的任何20nt序列,包括基因的非编码区如启动子或内含子内,只要其是基因组内的特异性序列。可以将该序列插入包含CRISPR/Cas9/sgRNA表达盒和卡那霉素植物选择标记的二元载体(Jiang et al.,2013)并通过农杆菌介导的转化来转化入植物细胞。可以通过PCR扩增和DNA测序筛选转基因T1植物的质体GPAT基因中的突变。
[1652] 实施例8.增加植物细胞中硫酯酶的表达
[1653] 从头脂肪酸合成发生在真核细胞的质体中,在这里合成脂肪酸同时结合至酰基载体蛋白如酰基-ACP缀合物。链延长至C16:0和C18:0酰基然后去饱和为C18:1同时连接至ACP之后,通过硫酯酶从ACP切割脂肪酸,并且脂肪酸通过从质体输出并转运至ER来进入真核途径,在ER中它们参与膜和储存脂质生物发生。在叶绿体中,输出过程具有两个步骤:首先,通过酰基-ACP硫酯酶(脂肪酰基硫酯酶;FAT)的酶促活性,酰基链释放为游离脂肪酸,第二通过与CoA反应形成酰基-CoA酯,所述反应通过长链酰基-CoA合成酶(LACS)催化。拟南芥包含3种脂肪酰基硫酯酶,可以基于它们的酰基链特异性区分。FATA1和FATA2优先水解不饱和的酰基-ACP,而饱和的酰基-ACP链通常由FATB切割。
[1654] 为了研究共表达硫酯酶和编码WRI1和/或DGAT多肽的基因对脂肪酸含量、TAG含量和脂肪酸组成的影响,通过将编码区插入pJP3343二元表达载体对3种拟南芥硫酯酶的每种制备嵌合基因用于在本氏烟草叶细胞中从35S启动子瞬时表达。利用包含EcoRI和PstI位点的引物从长角果cDNA扩增拟南芥FATA1(登录号NP_189147.1,SEQ ID NO:193)和FATA2(登录号NP_193041.1,SEQ ID NO:194)硫酯酶的编码区,随后利用相同的限制性位点克隆入pJP3343。将所得的表达载体分别命名为pOIL079和pOIL080。利用包含NotI和SacI侧翼位点的引物扩增拟南芥FATB基因(登录号NP_172327.1,SEQ ID NO:195)的编码区并克隆入pJP3343的相应限制性位点,导致pOIL081。将构建体pOIL079、pOIL080和pOIL081渗透入本氏烟草叶组织,单独或者与包含拟南芥WRI1转录因子(AtWRI1)(pJP3414)和/或DGAT1酰基转移酶(AtDGAT1)(pJP3352)基因的构建体组合。为了比较,将编码椰子FatB1(CnFATB1)(pJP3630)、椰子(C.nucifera)FatB2(CnFATB2)(pJP3629)的嵌合基因与拟南芥硫酯酶平行引入本氏烟草叶组织,以便比较具有MCFA特异性的FatB多肽与没有MCFA特异性的拟南芥硫酯酶的效果。所有渗透均包括如实施例1所述的用于表达p19沉默抑制子的嵌合基因。阴性对照仅渗透p19 T-DNA。
[1655] 在硫酯酶表达与WRI1和/或DGAT过量表达之间观察到对本氏烟草叶中的TAG水平的协同效应。表达硫酯酶基因而没有WRI1或DGAT基因在阴性对照(单独的p19)中的低水平之上显著提高TAG水平。例如,表达椰子FATB2硫酯酶导致与阴性对照相比叶中的TAG水平提高8.2-倍。与AtWRI1对照相比,拟南芥WRI1转录因子与每种硫酯酶的共表达进一步提高TAG水平。椰子硫酯酶CnFATB1和CnFATB2中每种与WRI1的共表达导致比具有WRI1的3种拟南芥硫酯酶中的每种高的TAG水平。有趣的是,当拟南芥DGAT1酰基转移酶与硫酯酶和WRI1组合共表达时观察到相反的情况。这表明拟南芥硫酯酶和拟南芥DGAT1酰基转移酶的酰基-链特异性的较好匹配,导致从酰基-ACP进入TAG的较大通量的酰基-链。非MCFA硫酯酶在提高叶中的总脂肪酸含量中的油酸百分比中也更有效。AtWRI1、AtDGAT1和AtFATA2的共表达导致叶中最高水平的TAG,提供比共表达AtWRI1和AtDGAT1而没有硫酯酶时高1.6-倍的水平。这些实验证实当WRI1和DGAT共表达时油合成和积累的协同增加,以及表明通过将硫酯酶加入组合获得进一步的协同增加。
[1656] 构建3种不同的二元表达载体以测试共表达编码WRI1、DGAT1和FATA的基因对稳定转化的红花烟草叶中的TAG水平和脂肪酸组成的影响。载体pOIL121包含用于从SSU启动子表达AtWRI1的SSU::AtWRI1基因,用于从35S启动子表达AtDGAT的35S::AtDGAT1基因,以及用于从组成型启动子enTCUP2启动子表达AtFATA2的enTCUP2::AtFATA2基因。通过首先用NotI消化DNA以去除编码芝麻油质蛋白的基因来从pOIL38衍生这些遗传构建体。利用pOIL80 DNA作为模板扩增拟南芥FATA2基因的蛋白编码区,侧翼为NotI位点。然后将这个片段插入pOIL38的NotI位点。然后将pOIL121用作pOIL122的亲本载体,pOIL122包含额外的enTCUP2::SDP1发夹RNA盒用于转基因植物中内源SDP1基因的RNAi介导的沉默。为此,从pOIL51(实施例2)分离整个本氏烟草SDP1发夹盒为SfoI-SmaI片段,并且克隆入pOIL121的SfoI位点,产生pOIL122(图14)。以相似方式通过将作为SfoI-SmaI片段的enTCUP2::SDP1发夹RNA盒克隆入pOIL36的SfoI位点获得包含SSU::WRI1和35S::DGAT1基因以及enTCUP2::SDP1发夹RNA基因的第三载体pOIL123。
[1657] 总的来说,载体包含以下基因组合:
[1658] pOIL121:SSU::AtWRI1,35S::AtDGAT1,enTCUP2::AtFATA2。
[1659] pOIL122:SSU::AtWRI1,35S::AtDGAT1,enTCUP2::AtFATA2,enTCUP2::SDP1发夹。
[1660] pOIL123:SSU::AtWRI1,35S::AtDGAT1,enTCUP2::SDP1发夹。
[1661] 将3个构建体每个用来通过农杆菌介导的转化产生转化的红花烟草植物(栽培种Wi38)。共表达拟南芥FATA2硫酯酶或沉默内源SDP1 TAG脂肪酶与AtWRI1和AtDGAT1表达组合各自导致与在硫酯酶基因或SDP1-沉默基因不存在的情况下表达AtWRI1和AtDGAT1相比进一步升高的TAG水平。利用pOIL122通过所有4个嵌合基因的共同作用获得最大的TAG收率。
[1662] 注意本氏烟草是18:3植物。将相同的构建体pOIL079、pOIL080和pOIL081用来转化16:3植物拟南芥。
[1663] 发明人设想这样的模型,如通过增加的脂肪酰基硫酯酶活性增加质体脂肪酸输出会减少质体中的酰基-ACP积累,从而因为减少的对乙酰基-CoA羧化酶(ACCase)的反馈抑制增加脂肪酸生物合成(Andre et al.,2012;Moreno-Perez et al.,2012)。硫酯酶过量表达增加酰基链从质体输出进入ER,从而提供所谓的“推”和“拉”代谢工程化策略之间的有效连接。
[1664] 实施例9.不同转录因子多肽对植物性状的影响
[1665] 以前报道的关于WRI1和DGAT的实验(Vanhercke et al.,2013)使用编码拟南芥AtWRI1的合成基因(登录号AAP80382.1)和编码AtDGAT1的合成基因,也来自拟南芥(登录号AAF19262;SEQ ID NO:1)。为了比较其他WRI多肽与AtWRI1的稳定性以与DGAT组合增加油含量,鉴定其他WRI编码序列并用来产生用于在本氏烟草叶中表达的构建体。合成编码拟南芥WRI3(登录号AAM91814.1,SEQ ID NO:196)和WRI4(登录号NP_178088.2,SEQ ID NO:197)转录因子(To et al.,2012)的核苷酸序列并作为EcoRI片段插入35S启动子控制下的pJP3343。将所得的二元表达载体分别命名为pOIL027和pOIL028。利用包含额外的EcoRI位点侧翼引物从Sten Stymne教授(瑞典农业科学大学)提供的载体PCR扩增燕麦WRI1
(AsWRI1,SEQ ID NO:198)的编码序列。将扩增的片段插入pJP3343,导致pOIL055。在NCBI服务器上利用玉米WRI1氨基酸序列(登录号NP_001137064.1,SEQ ID NO:200)作为询问通过BLASTp搜索鉴定来自两色高粱的WRI1候选序列(登录号XP_002450194.1,SEQ ID NO:199)。
合成两色高粱WRI1基因(SbWRI1)的蛋白编码区并作为EcoRI片段插入pJP3343,获得pOIL056。从乌桕(乌臼;TsWRI1,SEQ ID NO:201)转录物组(Uday等提交)鉴定了编码WRI1的基因候选物。合成蛋白编码区并作为EcoRI片段插入pJP3343,导致pOIL070。包含用于表达拟南芥WRI1和DGAT1多肽的编码序列的pJP3414和pJP3352二元载体如Vanhercke et al.(2013)所述。
[1666] 如实施例1所述将包含各种WRI编码序列的治疗引入本氏烟草叶组织用于瞬时表达,在所有接种中使用编码p19病毒抑制子蛋白的基因。编码WRI多肽的基因单独测试或DGAT1酰基转移酶基因组合测试,后者提供更大的TAG生物合成和积累。这个实验中的阳性对照是编码拟南芥WRI1转录因子和AtDGAT1的基因的组合。如实施例1所述利用3株不同植物一式三份进行所有渗透并分析TAG水平。在不存在外源添加的DGAT1下大多数单独WRI多肽的表达导致渗透的叶斑中与仅具有p19构建体的对照相比增加但仍然低的TAG水平(在干重基础上<0.23%)(图15)。TsWRI1是例外,其本身看来不显著提高TAG水平。此外,通过表达不同WRI转录因子产生的TAG水平的差异本身并不大。AsWRI1和SbWRI1获得与AtWRI1本身相似的TAG水平。TAG脂肪酸组成的分析显示在渗透的叶组织中仅有细微改变,除了从AtWRI3表达升高的C18:1Δ9水平(表25)。
[1667]
[1668] 相反,来自不同WRI多肽表达的TAG收率的差异在与AtDGAT1酰基转移酶共表达时更明显。这再次证实如Vanhercke et al.(2013)报道的,在渗透的本氏烟草叶组织中WRI1和DGAT共表达对TAG生物合成的协同效应。当共表达DGAT1与AtWRI3、AtWRI4和TsWRI1表达载体时观察到中间TAG水平,而用AsWRI1和AtWRI1获得的水平显著较低。在不能事先预测的结果中,用DGAT与SbWRI1共表达获得了最高TAG收率,即使测定在双子叶植物细胞中进行。TAG脂肪酸组成分析显示在SbWRI1、AsWRI1和AtWRI1阳性对照的情况下升高水平的C18:1Δ9和降低水平的C18:3Δ9,12,15(ALA)。但是,不像AtWRI1,AsWRI1和SbWRI1的表达均表现出与p19阴性对照相比升高的C16:0水平。有趣的是,AtWRI3渗透的叶样品表现出不同的TAG谱,其中C18:1Δ9富集而C16:0和ALA仅略微受到影响。
[1669] 这个实验表明当与DGAT共表达以提高营养性植物部分中的TAG水平时,两色高粱WRI1转录因子SbWRI1优于AtWRI1。发明人还得出结论,来自单子叶植物的转录因子如WRI1可以在双子叶植物细胞中正常工作,实际上可能甚至具有与来自双子叶植物的相应转录因子相比更好的活性。同样地,来自双子叶植物的转录因子可以在单子叶植物细胞中正常工作。
[1670] 其他转录因子的使用
[1671] 制备遗传构建体用于在植物细胞中表达14个不同转录因子中的每个,以便测试它们与参与TAG生物合成和积累的其他基因组合为提高TAG水平发挥作用的能力。这些转录因子是作为WRI1的替换物的候选物,或者用于添加至包括WRI1、LEC1和LEC2转录因子中的一种或多种的组合用于植物细胞,特别是营养性植物部分。它们的选择主要是基于报道它们参与胚胎发生(在Baud and Lepiniec(2010)和Ikeda et al.(2006)中进行了综述),与LEC2相似。因此进行实验以测定它们的功能,使用本氏烟草表达系统(实施例1),如下。
[1672] 将以下转录因子的蛋白编码区的核苷酸序列密码子优化用于在本氏烟草和红花烟草中表达,合成并作为NotI-SacI片段克隆入pJP3343的各位点:拟南芥FUS3(pOIL164)(Luerssen et al.,1998;登录号AAC35247;SEQ ID NO:160)、拟南芥LEC1L(pOIL165)(Kwong et al.2003;登录号AAN15924;SEQ ID NO:157)、拟南芥LEC1(pOIL166)(Lotan et al.,1998;登录号AAC39488;SEQ ID NO:149)、栽培大豆MYB73(pOIL167)(Liu et al.,2014;登录号ABH02868;SEQ ID NO:212)、拟南芥bZIP53(pOIL168)(Alonso et al.,2009;
登录号AAM14360;SEQ ID NO:213)、拟南芥AGL15(pOIL169)(Zheng et al.,2009;登录号NP_196883;SEQ ID NO:214)、拟南芥MYB118(登录号AAS58517;pOIL170;SEQ ID NO:215)、MYB115(Wang et al.,2002;登录号AAS10103;pOIL171;SEQ ID NO:216)、拟南芥TANMEI(pOIL172)(Yamagishi et al.,2005;登录号BAE44475;SEQ ID NO:217)、拟南芥WUS(pOIL173)(Laux et al.,1996;登录号NP_565429;SEQ ID NO:218)、拟南芥BBM(pOIL174)(Boutilier et al.,2002;登录号AAM33893,SEQ ID NO:145)、欧洲油菜GFR2a1(登录号AFB74090;pOIL177;SEQ ID NO:219)和GFR2a2(登录号AFB74089;pOIL178;SEQ ID NO:220)(Liu et al.(2012))。此外,将参与适应高光磷饥饿条件的拟南芥PHR1转录因子的密码子优化版本相似地亚克隆入pJP3343(pOIL189)(Nilsson et al(2012);登录号AAN72198;SEQ ID NO:221)。这些转录因子在表26中总结。
[1673] 作为确定这些转录因子的功能的筛选测定,如实施例1所述将遗传构建体以及编码DGAT1的基因共渗透入本氏烟草叶细胞,有或无编码WRI1的基因。分析渗透后5天叶细胞的总脂质含量和脂肪酸组成。在测试的多种胚性转录因子中,当与DGAT以及DGAT1+WRI1对照渗透相比,只有过表达FUS3导致显著增加本氏烟草叶组织中TAG水平(表27)。
[1674] 表26.附加转录因子和用于它们表达的遗传构建体
[1675]质粒 转录因子 物种 长度(氨基酸) 登录号
pOIL164 FUS3 拟南芥 312 AAC35247
pOIL165 LEC1L 拟南芥 234 AAN15924
pOIL166 LEC1 拟南芥 208 AAC39488
pOIL167 MYB73 大豆 74 ABH02868
pOIL168 bZIP53 拟南芥 146 AAM14360
pOIL169 AGL15 拟南芥 268 NP_196883
pOIL170 MYB118 拟南芥 437 AAS58517
pOIL171 MYB115 拟南芥 359 AAS10103
pOIL172 TANMEI 拟南芥 386 BAE44475
pOIL173 WUS 拟南芥 292 NP_565429
pOIL174 BBM 拟南芥 584 AAM33803
pOIL177 GFR2a1 欧洲油菜 453 AFB74090
pOIL178 GFR2a2 欧洲油菜 461 AFB74089
pOIL189 PHR1 拟南芥 409 AAN72198
[1676] 表27.渗透的本氏烟草叶的TAG水平(%叶干重)和脂肪酸特性。
[1677]
[1678]
[1679]
[1680] 为了使用编码可选转录因子的基因稳定转化植物,制备以下二元构建体。用于表达转录因子的基因使用SSU启动子或SAG12启动子。已显示胚性转录因子如LEC1和LEC2的过量表达诱导在当前上下文中不可取的各种多效性作用,包括体细胞胚胎发生(Feeney et al.(2012);Santos-Mendoza et al.(2005);Stone et al.(2008);Stone et al.(2001);Shen et al.(2010))。为了最小化可能的对植物发育和生物质收率的负面影响,与组成型启动子相比优先使用组织或发育阶段特异性启动子以驱动胚胎发生的主要调节子的异位表达。
[1681] 实施例10.编码转录因子的基因的茎特异性表达
[1682] 表达编码WRI1、DGAT和油质蛋白的转基因的红花烟草植物的叶在发育的结实阶段包含约16%TAG。但是,TAG水平在植物的茎(1%)和根(1.4%)中低很多(Vanhercke et al.,2014)。发明人考虑茎和根中较低的TAG水平是否是由于用来在转基因植物中表达编码WRI1的基因的Rubisco SSU启动子的低启动子活性。pJP350的T-DNA中的DGAT转基因通过在茎和根中更强表达的CaMV35S启动子表达,因此不太可能是茎和根中TAG积累的限制因素。
[1683] 为了增加茎组织中的TAG生物合成,设计构建体,其中将编码WRI1的基因置于拟南芥SDP1启动子的控制下。合成3.156kb合成DNA片段,其包含1.5kb的拟南芥SDP1启动子(SEQ ID NO:175)(Kelly et al.,2013),然后是拟南芥WRI1多肽的编码区和栽培大豆凝集素终止子/多腺苷酸化区。将这个片段插入pJP3303的SacI和NotI位点之间。将所得的载体命名为pOIL050,然后将其用来通过农杆菌介导的转化,转化来自对于来自pJP3502的T-DNA是纯合的红花烟草植物的细胞。用潮霉素抗性选择植物,并且使总计86株独立的转基因植物在温室中生长至成熟。在结实阶段用转基因叶和茎组织采集样品,所述样品与用pJP3502转化的红花烟草亲本植物相比包含升高的TAG水平。
[1684] 实施例11.油体蛋白表达对植物性状的影响
[1685] 用pJP3502的T-DNA转化并表达编码拟南芥WRI1、DGAT1和芝麻油质蛋白的转基因的红花烟草植物在营养组织中具有升高的TAG水平。如上文实施例2所示,当编码SDP1 TAG脂肪酶的内源基因在那些植物中沉默时,叶TAG水平进一步升高,这对发明人表明在保留SDP1活性的植物中发生大量TAG转换。因此,确定植物中转基因的表达水平。虽然Northern杂交印迹证实强WRI1和DGAT1表达以及一些油质蛋白mRNA表达,但是通过数字PCR和qRT-PCR的表达分析仅检测到非常低水平的油质蛋白转录物。表达分析显示与WRI1和DGAT1转基因相比,编码油质蛋白的基因表达很差。从这些实验发明人得出结论,因为由pJP3502中的T-DNA编码时油质蛋白的生成不足,叶组织中的油体未受到完全保护免于TAG分解。为了改善整个植物发育中TAG的稳定积累,设计几个pJP3502修饰,其中将油质蛋白基因取代。这些修饰的构建体如下。
[1686] 1.pJP3502包含编码表达很差的芝麻油质蛋白基因(SEQ ID NO:176提供其补体的序列)。该基因具有可能降低表达水平的内部UBQ10内含子。为了测试这个,合成包含芝麻油质蛋白基因且缺少内部UBQ10内含子的502bp合成DNA片段并将其作为NotI片段插入pJP3502,以便取代pJP3502中包含内含子的油质蛋白基因。将所得的质粒命名为pOIL040。
[1687] 2.用组成型enTCUP2启动子取代驱动pJP3502中的油质蛋白基因表达的Rubisco小亚基(SSU)启动子。为此,合成包含enTCUP2启动子、油质蛋白编码区、栽培大豆凝集素终止子/多腺苷酸化区和驱动wri1表达的下游SSU启动子的前643bp的2321bp片段并将其亚克隆入pJP3502的AscI和SpeI位点,导致pOIL038。
[1688] 3.按照相似的策略表达工程化版本的芝麻油质蛋白基因,其包含6个引入的半胱氨酸残基(o3-3),在enTCUP2启动子的控制下(Winichayakul et al.,2013)。合成包含enTCUP2启动子、油质蛋白o3-3蛋白编码区、栽培大豆凝集素终止子/多腺苷酸化区和驱动wri1表达的下游SSU启动子的前643bp的2298bp片段并将其亚克隆入pJP3502的AscI和SpeI位点,导致pOIL037。
[1689] 4.将pJP3502中芝麻油质蛋白基因侧翼的NotI位点用来交换编码花生油质蛋白3的蛋白编码区(登录号AAU21501.1)(Parthibane et al.,2012a;Parthibane et al.,2012b)。合成侧翼为NotI位点的包含油质蛋白3基因的528bp片段并将其亚克隆入pJP3502的各位点。将所得的载体命名为pOIL041。
[1690] 5.相似地,合成包含编码拟南芥油体固醇蛋白(Arab-1)(登录号AAM10215.1)(Jolivet et al.,2014)的基因的1077bp NotI侧翼片段并将其亚克隆入pJP3502的NotI位点,导致pOIL043。
[1691] 6.将Nannochloropsis oceanic脂滴表面蛋白(LDSP)(登录号AFB75402.1)(Vieler et al.,2012)合成为504bp NotI侧翼片段并亚克隆入pJP3502的NotI位点,获得pOIL044。
[1692] 7.最后,将拟南芥油体钙蛋白(CLO3)(登录号O22788.1)(Shimada et al.,2014)合成为612bp NotI侧翼片段并亚克隆入pJP3502,导致pOIL042。
[1693] 如实施例1所述将这些构建体中的每个引入本氏烟草叶细胞。本氏烟草叶组织中pJP3502和pOIL040的瞬时表达导致升高TAG水平和TAG脂肪酸谱的相似变化,但是pOIL040提高TAG水平更多(与0.9%相比1.3%)。将构建体pOIL037、pOIL038、pOIL041、pOIL042和pOIL043中的每个用来通过农杆菌介导的方法稳定转化红花烟草植物(栽培种W38)。在卡那霉素抗性的基础上选择转基因植物,并且使其在温室中生长至成熟。在植物发育期间的不同阶段从转基因叶组织采集样品,所述样品包含与野生型红花烟草和用pJP3502转化的红花烟草植物相比提高的TAG水平。
[1694] 来自乌桕(Sapium sebiferum)的LDAP多肽的克隆和表征
[1695] 油质蛋白在非种子油积累植物组织如橄榄、油棕和鳄梨的中果皮不高表达(Murphy,2012)。反而,在这些组织中已鉴定脂滴相关蛋白(LDAP)可能起到与种子组织中的油质蛋白相似的作用(Horn et al.,2013)。因此发明人考虑可能油质蛋白不是最佳包装蛋白以保护植物的营养组织中来自TAG脂肪酶或其他胞质酶活性的积累的油。因此鉴定LDAP多肽并对TAG积累的增强进行评价,如下。
[1696] 大戟科的成员乌桕树,乌桕的果实令发明人特别感兴趣,因为其包含种子外的富含油的组织。最近的研究(Divi et al,提交发表)表明称作脂层的这种油质组织可能源自其果实的中果皮。因此,发明人查询了乌桕的转录物组的LDAP序列。果皮和种子组织中表达的基因的比较分析显示一组3种以前未鉴定的在脂层中高表达的LDAP基因。
[1697] 通过利用源自脂质组织的RNA使用3对引物RT-PCR获得编码3种LDAP的核苷酸序列。引物序列是基于3个基因中每个的整个编码区侧翼的DNA序列。引物序列为:LDAP1,5’-TTTTAACGATATCCGCTAAAGG-3’(SEQ ID NO:236)和5’-AATGAATGAACAAGAATTAAGTC-3’(SEQ ID NO:237)AT-3’;LDAP2,5’-CTTTTCTCACACCGTATCTCCG-3’(SEQ ID NO:238)和5’-AGCATGATATACTTGTCGAGAAAGC-3’(SEQ ID NO:239);LDAP3,5-’GCGACAGTGTAGCGTTTT-3’(SEQ ID NO:240)和5’-ATACATAAAATGAAAACTATTGTGC-3’(SEQ ID NO:241)。
[1698] 乌桕转录物组的分析显示LDAP基因中每个的多个直系同源物,包括8个LDAP1、6个LDAP2和6个LDAP3基因,在每个基因家族内具有少于10%序列分化。将推定的肽序列比对并利用Genious软件构建系统树(图16),连同来自其他植物物种的LDAP同系物,包括来自鳄梨的2个(Pam)、来自油棕的1个、来自胶菊(Parthenium argentatum)的1个(Par),来自拟南芥的2个(Ath)、来自短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)的5个(Tbr)、来自橡胶树(Hevea brasiliensis)的3个(Hbr),如图16所示。系统树显示SsLDAP3与来自鳄梨的LDAP1和LDAP2多肽和来自油棕的LDAP享有更大的氨基酸序列相同性,而SsLDAP1和SsLDAP2多肽更加不同。
[1699] 用于过量表达LDAP的遗传构建体
[1700] 为了测试来自乌桕的LDAP的功能,制备表达载体以在叶细胞中在35S启动子的控制下表达这些多肽中的每个。通过重组反应将全长SsLDAP cDNA序列插入pDONR207目的载体,用SsLDAP cDNA片段代替目的载体的CcdB和Cm(R)区。通过限制性消化分析和DNA测序证实之后,将构建体引入根癌农杆菌菌株AGL1并用于在本氏烟草叶细胞中瞬时表达和红花烟草的稳定转化。
[1701] 在本氏烟草叶中在35S启动子的转录控制下3个SsLDAP基因中每个的表达与35S::AtDGAT1和35S::AtWRI1的表达组合获得相对于用35S::AtDGAT1和35S::AtWRI1基因浸润的没有LDAP构建体的细胞基本上更高水平的TAG积累。TAG水平在对照细胞中的TAG水平上升高约2-倍。相对于对照细胞,在接受基因组合的细胞中观察到α-亚麻酸(ALA)水平的显著升高和降低水平的饱和脂肪酸。
[1702] 叶细胞中YFP融合的LDAP多肽与脂滴的共定位
[1703] 为了体内表征SsLDAP并观察它们的动态行为,制备表达构建体用于表达由融合至黄色荧光蛋白(YFP)的LDAP多肽组成的融合多肽。对于每个融合多肽,将YFP框内融合至SsLDAP的C-末端。将在其3’端没有终止密码子的3个LDAP基因中每个的完整开发阅读课融合至YFP序列,并且将嵌合基因插入pDONR207。通过限制性消化和DNA测序证实之后,将构建体引入根癌农杆菌菌株AGL1并用于在本氏烟草叶细胞中瞬时表达和红花烟草的稳定转化。用LDAP-YFP构建体浸润叶吸管之后3天,将来自浸润区的叶片用阳性染色脂滴的尼罗红染色,并且在共聚焦显微镜下观察以检测红色染色(脂滴)和来自YFP多肽的荧光。观察到LDAP-YFP与脂滴的共定位,表明在叶细胞中LDAP与脂滴相关。
[1704] 实施例12.植物中TGD基因的沉默
[1705] Li-Beisson et al.(2013)估计在拟南芥叶(16:3植物)中,叶绿体中合成的约40%的脂肪酸进入原核途径,而60%输出进入真核途径。它们在ER中去饱和之后,大约一半的这些输出的脂肪酸返回质体以支持类囊体膜的半乳糖脂合成。脂肪酸作为DAG或磷脂输出(输入)质体包括叶绿体内被膜的通透酶样蛋白TGD1。包含TGD1、2和3蛋白的拟南芥ABC脂质转运蛋白由Benning et al.(2008 and 2009)和最近由Roston et al.(2012)鉴定。这种蛋白复合物定位在叶绿体内被膜中,并且提出其介导磷脂酸盐转移通过这个膜。TGD2多肽是磷脂酸结合蛋白,而TGD3是ATPase。通过遗传方法鉴定了一种新的拟南芥蛋白TGD4(Xu et al.,2008),并且TGD4基因的失活还阻断脂质从ER转移至质体。最近的生物化学数据表明TGD4是位于叶绿体外被膜中的磷脂酸结合蛋白(Wang and Benning,2012)。
[1706] Xu et al.(2005)描述了拟南芥中渗漏的tgd1等位基因导致减少的植物生长和胚胎败育的高发生率。拟南芥tgd1突变体的叶组织包含升高的TAG水平,如胞质油滴。此外,在tgd1突变体的根中也发现了升高的TAG水平。未检测到种子油含量的差异。对拟南芥tgd2(Awai et al.,2006)、tgd3(Lu et al.,2007)和tgd4突变体(Xu et al.,2008)已报道叶组织中相似的TAG积累。所有tgd突变体均足够渗漏或在植物发育中严重受损。
[1707] TGD1沉默
[1708] 基于在本氏烟草转录物组中鉴定的全长mRNA转录物产生针对TGD1质体输入蛋白(importer)的沉默构建体。从本氏烟草叶cDNA扩增685bp片段,同时在5’端并入PmlI位点。将TGD1片段首先克隆入pENTR/D-TOPO(Invitrogen),随后通过LR克隆(Gateway)插入pHELLSGATE12目的载体。将所得的表达载体命名为pOIL025,并且在本氏烟草中瞬时表达以评价TGD1基因沉默对叶TAG水平的影响。通过作为PmlI-EcoRV片段亚克隆入pOIL020的NheI(klenow)-SfoI位点将TGD1发夹构建体置于黑曲霉(A.niger)诱导型alcA启动子的控制下。
将命名为pOIL026的所得载体超级转化入纯合的红花烟草pJP3502系以进一步提高叶油水平。
[1709] 制备其他构建体用于表达减少TGD-2、-3、-4和-5基因表达的发夹RNA。利用这些构建体产生转化的植物,并且确定转化体中的油含量。将转化的植物与用pJP3502或如上文所述的基因的其他组成产生的转化体杂交。
[1710] 实施例13.在马铃薯块茎中表达基因组合
[1711] pJP3506的构建
[1712] 制备包含用于在马铃薯块茎中表达的3个基因的遗传构建体并用于马铃薯转化。将这个构建体命名为pJP3506,并且是基于现有载体pJP3502(WO2013/096993),置换启动子以提供块茎特异性表达。pJP3506包含(i)有具有重复增强子区的35S启动子(e35S)驱动的NPTII卡那霉素抗性基因作为选择标记基因,以及3个基因表达盒,其为(ii)编码拟南芥DGAT1的35S::AtDGAT1,(iii)编码拟南芥WRI1的B33::AtWRI1,和(iv)编码来自芝麻的油质蛋白的B33::芝麻油质蛋白。编码这些多肽的核苷酸序列如pJP3502中。patatin B33启动子(B33)是源自马铃薯的块茎特异性启动子,其由Dr Alisdair Fernie,Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology,Potsdam,Germany提供。pJP3506的环状质粒图在图17中示出。
[1713] pJP3506构建体中使用的马铃薯Patatin B33启动子序列是截短的版本,相对于GenBank登录号X14483,其从5’端缺失183个核苷酸且从3’端缺失261个核苷酸。如pJP3506中使用的patatin B33启动子的核苷酸序列给出为SEQ ID NO:202。
[1714] 马铃薯的转化
[1715] 在组织培养中无菌生长的栽培种Atlantic的马铃薯幼苗(Solanum tuberosum)购自Toolangi Elite,Victorian Certified Seed Potato Authority(ViCSPA),Victoria,Australia。在包含pJP3506的根癌农杆菌菌株LBA4404的悬浮液下将茎节间切为长度约1cm的段。农杆菌细胞已生长至0.2的OD,并且用等体积的MS培养基稀释。通过在无菌滤纸上短暂印迹茎段来去除过滤的农杆菌悬浮液,然后将其置于MS培养基上并维持在24℃下2天(共培养)。然后将节间转移至补充了200μg/L NAA、2mg/L BAP和250mg/L头孢噻肟的新鲜MS培养基上。10天后当将节间转移至补充了2mg/L BAP、5mg/L GA3、50mg/L卡那霉素和250mg/L头孢噻肟的新鲜MS培养基时开始转基因愈伤组织的选择。将再生自愈伤组织的新枝切除并置于简单MS培养基上用于根诱导,然后移植入包含盆栽混合土的15cm直径盆中并在温室中生长直至植物成熟(包括块茎生长)。
[1716] DNA提取和通过PCR分子鉴定转基因植物
[1717] 从来自温室中的植物的马铃薯叶获得直径约1cm的圆盘。将这些置于深孔微量滴定板中并冷冻干燥48hr。然后通过向每个孔添加轴承并将板在Reicht组织分解器(Qiagen)中以28/sec的最大频率振荡(微量滴定板的每侧2min),将冷冻干燥的叶样品研磨为粉末。将375μL的包含0.1M Tris-HCl pH8.0、0.05M EDTA和1.25%SDS的提取缓冲液添加至包含粉状叶组织的每个孔中。65℃下温育1hr后,将187μL的6M乙酸铵添加至每个孔中,并且将混合物在4℃下储存30min,然后将板以3000rpm离心30min。将来自每个孔的340μL上清液转移至包含220μL异丙醇的新深孔微量滴定板中,并且在室温下保持5min,然后以3000rpm离心30min。将沉淀的DNA颗粒用70%乙醇洗涤,空气干燥并重悬于225μL H2O/样品中。
[1718] 将来自每个叶样品DNA制品的2μL添加至使用HotStar PCR系统(Qiagen)的20μL PCR反应混合物中。在PCR反应中使用基于来自对马铃薯密码子优化的拟南芥WRI1基因的5’和3’序列的一对寡核苷酸引物。它们的序列为:Nt-Wri-P3:5’-CACTCGTGCTTTCCATCATC-3’(SEQ ID NO:203)和Nt-Wri-P1:5’-GAAGGCTGAGCAACAAGAGG-3’(SEQ ID NO:204)。在对每个DNA样品的单独PCR反应中还使用基于对马铃薯密码子优化的拟南芥DGAT1基因的一对寡核苷酸引物。它们的序列为:Nt-DGAT-P2:5’-GGCGATTTTGGATTCTGC-3’(SEQ ID NO:205)和Nt-DGAT-P3:5’-CCCAACCCTTCCGTATACAT-3’(SEQ ID NO:206)。扩增进行如下:在95℃15min的初始循环,然后95℃30sec、57℃30sec和72℃60sec的40个循环。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳以检测特异性扩增产物。
[1719] 马铃薯块茎的脂质分析
[1720] 将证实的转基因植物和未转化的对照的收获自再生马铃薯植物的块茎的薄片冷冻干燥72hr,并且分析脂质含量和组成。如下利用氯仿:甲醇:0.1M KCl(2:1:1 v/v/v)从干燥的块茎组织提取总脂质。将冷冻干燥的块茎组织首先在氯仿:甲醇(2:1,v/v)中在包含金属球的eppendorf管中利用Reicht组织分解器(Qiagen)以29/sec的频率匀浆3min。将每个匀浆物与Vibramax10(Heidolph)以2,000rpm混合15min之后,将1/3体积的0.1M KCl溶液添加至每个样品中并进一步混合。以10,000g离心5min之后,收集包含来自每个样品的脂质的下方的相并利用N2流完全蒸发。将每个脂质制品溶于3μL的CHCl3/毫克块茎干重中。将脂质制品的等分试样装载在薄层色谱(TLC)板(20cm x20cm,Silica gel60,Merck)上,并且在己烷:二乙醚:乙酸(70:30:1,v/v/v)中显影。将TLC板用樱草灵喷洒并在UV下可视化以显示脂质斑。通过刮适当条带的二氧化硅回收TAG和PL,并且通过将材料在80℃下于1N甲醇-HCl(Supelco,Bellefonte,PA)中温育2hr来将其转化为脂肪酸甲基酯(FAME),连同已知量的甘油三十七烷酸酯(Nu-Chek PREP,Inc.USA)作为内部标准用于脂质定量。如以前所述通过装有30m BPX70柱(0.25mm内径,0.25mm膜厚度,SGE,Austin,USA)的GC-FID(7890A GC,Agilent Technologies,Palo Alto,CA)分析FAME(Petrie et al.,2012)。用Agilent Technologies ChemStation软件(Rev B.04.03)整合峰。
[1721] 在再生的约100个单独转基因系中,源自直径约2cm的年轻马铃薯块茎的脂质分析显示在来自许多转基因植物的块茎中总脂质、TAG和磷脂级分的水平升高,观察到的范围在无升高至大幅度升高之间。马铃薯块茎脂质的第一分析显示处于其发育早期的典型的野生型马铃薯块茎(直径约2cm)包含在干重基础上约0.03%的TAG。
[1722] 在代表16个独立转化的品系的21个单独转基因植物的块茎中,总脂质含量增加至0.5-4.7重量%(干重)(表29)。品系#69的块茎表现出最高的TAG积累,在干重基础上平均
3.3%。相对于在相同发育阶段的野生型块茎,这是约100-倍增加。相同转基因系的块茎还积累最高的观察水平的磷脂,在年轻块茎中在干重基础上1.0重量%(表30)。增强的脂质积累还伴随有转基因块茎中改变的脂肪酸组成。转基因块茎始终在总脂肪酸含量和总脂肪酸含量的TAG级分中积累更高百分比的饱和和单不饱和脂肪酸(MUFA)以及较低水平的多不饱和脂肪酸(PUFA)(表29),特别是降低水平的18:3(ALA),其从野生型中的约17%降低至转基因块茎中的少于10%。总脂肪酸含量中的油酸(18:1)水平从野生型中的约1%升高至许多品系中的超过5%和一些块茎中的超过15%。虽然棕榈酸水平升高,但是硬脂酸(18:0)水平在最佳转基因系中降低(表28和29)。
[1723]
[1724]
[1725]
[1726] 将转基因马铃薯植物保持在温室中以允许块茎的持续生长。#69的较大块茎含有比直径约2cm的块茎更高水平的TFA和TAG。
[1727] 通过添加编码用于下调内源性SDP1基因表达的沉默RNA的嵌合基因,结合WRI1和DGAT基因,在马铃薯块茎中获得进一步增加的TFA和TAG水平。
[1728] 用于转化马铃薯的其他基因组合
[1729] 通过TRIzol方法(Invitrogen)提取来自新鲜发育的马铃薯(马铃薯L.cv.Atlantic)块茎的总RNA。使用以下引物通过RT-PCR获得编码马铃薯AGPase小亚基和SDP1的cDNA的选定区域:st-AGPs1:5'-ACAGACATGTCTAGACCCAGATG-3'(SEQ ID NO:242),st-AGPa1:5'-CACTCTCATCCCAAGTGAAGTTGC-3'(SEQ ID NO:243);st-SDP1-s1:5'-CTGAGATGGAAGTGAAGCACAGATG-3'(SEQ  ID  NO:244)和st-SDP1-a1:5'-
CCATTGTTAGTCCTTTCAGTC-3'(SEQ ID NO:245)。然后纯化PCR产物并连接到pGEMT Easy。
[1730] 通过DNA测序验证之后,将克隆的PCR产物直接用作靶基因序列制备发夹RNAi构建体,或者通过重叠PCR融合。随后将3个PCR片段(SDP1,AGPase,SDP+AGP)克隆入pKannibal载体,所述pKannibal载体包含特异性限制性位点以克隆正义和反义方向的期望基因。用于以正义方向克隆片段的所选限制性位点为BamHI和HindIII,而用于以反义方向插入片段的所选限制性位点为KpnI和XhoI。通过添加指导片段进入pKannibal的克隆位点的限制性位点来改变用于扩增3个靶基因片段的引物组。用Not1释放pKannibal中35S启动子和OCS终止子之间的包含靶DNA片段的表达盒,并且将其克隆入具有潮霉素作为植物选择标记的二元载体pWBVec2。如上文所述将这类二元载体引入根癌农杆菌AGL1菌株并用于马铃薯转化。
[1731] 实施例14.俢饰单子叶植物中的性状
[1732] 胚乳中的表达
[1733] 通过利用胚乳特异性启动子在谷粒发育期间在胚乳中表达编码WRI1、DGAT和油质蛋白的基因组合来增加单子叶植物物种小麦胚乳中的油含量,并且因此增加植物谷粒中的油含量。构建体(命名为pOIL-Endo2)包含嵌合基因:(a)二穗短柄草的Glu1基因的启动子::编码ZmWRI1多肽(SEQ ID NO:35)的玉米基因的蛋白编码区::来自大豆凝集素的终止子/多腺苷酸化区,(b)小麦的Bx17谷蛋白基因的启动子::编码AtDGAT1多肽(SEQ ID NO:1)的拟南芥基因的蛋白编码区::来自根癌农杆菌Nos基因的终止子/多腺苷酸化区,(c)水稻的GluB4基因的启动子::编码油质蛋白多肽的芝麻基因的蛋白编码区::来自大豆凝集素基因的终止子/多腺苷酸化以及(d)作为选择标记基因的35S启动子::潮霉素抗性编码区。通过农杆菌介导的转化,将构建体用来转化小麦(cv.Fielder)的未成熟胚。将接种的未成熟胚暴露于潮霉素以选择转化的新枝,然后转移至生根培养基以形成根,之后转移至土壤。
[1734] 获得30株转化的植物,其结出T1种子且包含来自pOIL-Endo2的T-DNA。从全部30株植物收获成熟种子,并且将每个家族的6个种子切成两半。将包含胚胎的一半储存用于以后萌发;将主要包含胚乳的另一半提取并测试油含量。插入小麦基因组的T-DNA在来自这些植物的T1种子中仍是分离的,因此T1种子是对于T-DNA纯合转化、杂合转化和空的混合物。在一些谷粒的胚乳中观察到增加的油含量,一些谷粒表现出TAG水平升高大于5-倍。与一些谷粒中2.5%的TAG含量相比,6个野生型谷粒(cv.Fielder)的胚乳一半具有约0.47重量%(范围0.37%-0.60%)的TAG含量。一些家族的全部6个谷粒具有超过1.7%的TAG;其他显然是分离的,具有野生型和升高含量的TAG。在具有升高的TAG含量的胚乳中,脂肪酸组成也改变,表现出油酸和棕榈酸百分比的增加,以及亚油酸百分比的减少(表31)。T1谷粒以与相应野生型谷粒相同的速度萌发没有困难,并且使来自14个T0家族的代表高油和低油个体的植物生长至成熟。这些植物是完全雄性和雌性可育的。
[1735] 表31.转基因小麦胚乳中TAG含量和总TAG含量(一半胚乳的重量%油)的脂肪酸组成(总脂肪酸的%)
[1736]样品 C14:0 C16:0 C16:1 C16:3 C18:0 C18:1 C18:1d11
对照1 0.3 16.9 0.1 0.0 1.6 15.6 0.6
对照2 0.3 16.0 0.1 0.1 1.6 15.1 0.6
F5.3 0.1 20.1 0.1 0.1 2.6 23.5 0.6
F16.3 0.1 19.1 0.1 0.1 2.8 24.2 0.6
样品 C18:2 C18:3n3 C20:0 C20:1 C22:0 C24:0 重量%油
对照1 60.4 4.0 0.1 0.4 0.0 0.0 0.5
对照2 61.3 4.3 0.1 0.3 0.0 0.0 0.49
F5.3 48.5 2.4 0.8 0.7 0.3 0.4 2.5
F16.3 48.1 2.9 0.7 0.5 0.3 0.4 1.8
[1737] 分析来自22个选定的T1植物的220个T2种子,加上来自3个不同亲本Fielder植物的40个植物。在大多数情况下,测试来自每个T1植物的10个T2种子。一些选定的T1植物具有野生型胚乳TAG水平而为空。胚乳半种子分析的一些结果如图18所示。高胚乳油T1植物产生T2谷粒,其中许多籽粒的胚乳油含量增加,而对照Fielder和零分离株T1植株则产生具有相似水平胚乳油(总脂肪酸,TFA)的谷粒。
[1738] 谷粒可用于制备供人食用的食品或作为动物饲料,为谷粒提供每单位重量的能量含量增加(能量密度),并导致动物(例如家禽、猪、牛、绵羊和马)的生长速度增加。
[1739] 构建体pOIL-Endo2还用来转化玉米和水稻以获得在胚乳中并且因此在谷粒中具有增加的TAG含量的转基因植物。
[1740] 叶和茎中的表达
[1741] 设计一系列二元表达载体用于高粱(两色高粱)和小麦的农杆菌介导的转化以增加营养组织中的油含量。构建的起始载体是pOIL093-095、pOIL134和pOIL100-104(见实施例5)。首先,利用pOIL104作为模板和包含KpnI限制性位点的引物通过PCR扩增编码玉米WRI1多肽的DNA片段。利用KpnI位点,将这个片段亚克隆至pOIL095的组成型水稻Actin1启动子下游。将所得的载体命名为pOIL154。将玉米泛素启动子(pZmUbi)控制下的编码拉曼伞形霉DGAT2a的DNA片段作为NotI片段从pOIL134分离并插入pOIL154的NotI位点,导致pOIL155。通过利用pJP3416作为模板扩增PAT编码区构建由pZmUbi启动子控制下的PAT编码区组成且3’端侧翼为根癌农杆菌NOS终止子/多腺苷酸化区的表达盒。设计引物以在5’和3’端分别并入BamHI和SacI限制性位点。BamHI+SacI双消化之后,将PAT片段克隆入pZLUbi1casNK的各位点。将所得的中间体命名为pOIL141。然后,将PAT选择标记盒引入pOIL155骨架。为此,首先将pOIL141用NotI切割,用DNA聚合物I的Klenow片段使其变平,随后用AscI消化。然后将这个2622bp片段亚克隆入pOIL155的ZraI–AscI位点,导致pOIL156。
最后,将pOIL156中驱动WRI1表达的Actin1启动子交换为玉米Rubisco小亚基启动子(pZmSSU),导致pOIL157。通过利用pOIL104作为模板以及包含AsiSI和PmlI限制性位点的侧翼引物PCR扩增玉米SSU启动子获得这个载体。然后将所得扩增子用SpeI+MluI切割并亚克隆入pOIL156的各位点。
[1742] 因此这些载体包含以下表达盒:
[1743] pOIL156:水稻Actin1启动子::玉米WRI1,玉米泛素启动子::U.rammaniana DGAT2a和玉米泛素启动子::PAT
[1744] pOIL157:玉米SSU启动子::玉米WRI1,玉米泛素启动子::U.rammaniana DGAT2a和玉米泛素::PAT。
[1745] 包含玉米SEE1衰老启动子(Robson et al.,2004,见实施例5)、玉米LEC1转录因子(Shen et al.,2010)和两色高粱SDP1 hpRNAi片段的第二系列的二元表达载体构建如下。首先,通过pDCOT的AatII+SnaBI消化和亚克隆入pORE04的AatII+EcoRV位点,将基质结合区(MAR)引入pORE04。将所得的中间载体命名为pOIL158。然后,将玉米泛素启动子控制下的PAT选择标记基因亚克隆入pOIL158。为此,首先将pOIL141用NotI消化,用DNA聚合物I的Klenow片段处理,最后用AscI消化。将所得片段插入pOIL158的AscI+ZraI位点,导致pOIL159。通过pJP3416的SwaI+SpeI限制性消化,然后亚克隆入pOIL159的SwaI+AvrII位点,将pOIL159中的原始RK2 oriV复制起点交换为RiA4起点。将所得的载体命名为pOIL160。合成包含以下表达盒的10.019kb“单子叶植物衰老部分1”片段:水稻Actin1::拟南芥DGAT1,为玉米表达密码子优化的,玉米SEE1::玉米WRI1,玉米SEE1::玉米LEC1。将这个片段作为SpeI-EcoRV片段亚克隆入pOIL160的SpeI-StuI位点,导致pOIL161。合成第二7.967kb“单子叶植物衰老部分2”片段并包含以下元件:MAR,玉米泛素::靶向两色高粱/小麦SDP1的hpRNAi片段,在水稻Actin1启动子控制下的空盒。通过用拟南芥SDP1序列(登录号NM_
120486)进行BLAST搜索获得2种两色高粱SDP1 TAG脂肪酶的序列(登录号XM_002463620;
SEQ ID NO.233和XM_002458486;SEQ ID NO:169)和一种小麦SDP1序列(登录号AK334547)(SEQ ID NO:234)。设计合成发夹构建体(SEQ ID NO:235),其包括与小麦SDP1序列表现出最高程度相同性的两色高粱XM_002458486序列的4个片段(67bp,90bp,50bp,59bp)。此外,包括源自两色高粱XM_002463620 SDP1脂肪酶的278bp片段以增加对两色高粱SDP1序列的沉默效率。将“单子叶植物衰老部分2”片段作为BsiWI-EcoRV片段亚克隆入pOIL161的BsiWI-FspI位点。将所得的载体命名为pOIL162。
[1746] 利用农杆菌介导的转化,将遗传构建体pOIL156 pOIL157、pOIL161和pOIL162用于转化两色高粱和小麦。用潮霉素抗性选择转基因植物,并且与未转化的对照植物相比,转基因植物在营养组织中包含升高水平的TAG和TFA。这类植物可用于为动物提供饲料作为草料或青贮饲料,以及产生谷粒,或者可以用来提取油。
[1747] 制备进一步的遗传构建体用于在单子叶植物(包括C4-光合作用植物两色高粱和玉米)的叶和茎中表达多肽组合。制备几种含有用于表达WRI1、DGAT和油质蛋白的基因的构建体,每个基因在组成型启动子(如玉米泛素基因启动子或水稻肌动蛋白基因启动子)的控制下,并含有NPTII基因作为选择标记基因。在一个特定的构建体中,WRI1是高粱WRI1。在另一个实施方案中,油质蛋白是SiOleosinL(参见实施例17)。在其他特定构建体中,油质蛋白基因被编码来自乌桕的LDAP2或LDAP3的基因取代(实施例11)。这些构建体被用作转化两色高粱和玉米的“核心构建体”,并且单独配置或与遗传构建体组合配置用于表达靶向高粱或玉米中的一个或多个SDP1基因的发夹RNA(参见以上)、在SEE1启动子(衰老特异性)控制下编码Lec2的构建体或两者。构建另一个构建体,其包含三个基因,即用于表达靶向内源TGD5基因以减少其表达的发夹RNA、FatA脂肪酰基硫酯酶和PDAT,其用于在用这种构建体转化的植物中增加TAG和/或TTQ参数的水平。
[1748] 实施例15.油的提取
[1749] 从叶提取脂质
[1750] 从夏季的几个月中在温室中生长的植物收获用来自pJP3502的T-DNA转化的转基因烟草叶。将叶干燥,然后在提取之前研磨为1-3mm大小的片。使研磨的材料用所选溶剂进行soxhlet(回流)提取24小时,如下文所述。在每个提取实验中使用5g干燥的烟草叶材料和250ml溶剂。
[1751] 己烷溶剂提取
[1752] 己烷常用作溶剂,商业上用于从压榨油种子如油菜提取油,提取中性(非极性)脂质,因此首先尝试。来自5g叶材料的提取的脂质质量为1.47g,29重量%的脂质回收率。进行DMSO中的己烷提取的脂质的1H NMR分析。分析显示长链甘油三酯脂肪酸的典型信号,不存在芳香产物。然后使脂质进行GCMS用于鉴定主要组分。己烷提取的脂质的直接GCMS分析证明是困难的,因为沸点太高,并且材料在GCMS分解。在这样的情况下,常用的分析技术是首先制备脂肪酸的甲基酯,其进行如下:将18mg脂质提取物溶于1mL甲苯中,添加3mL的干3N甲醇HCL并在60℃下搅拌过夜。将5mL的5%NaCl和5mL的己烷添加至冷却的小瓶并振荡。去除有机层并用另一5mL的己烷重复提取。将合并的有机级分用8mL的2%KHCO3中和,分离并用Na2SO4干燥。将溶剂在N2流下蒸发,然后补足至在己烷中1mg/mL的浓度用于GCMS分析。存在的主要脂肪酸是16:0(棕榈酸,38.9%)和18:1(油酸,31.3%)。
[1753]FA 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 20:0 22:0
%wt 38.9 4.6 6.4 31.3 2.5 1.5 0.6
[1754] 丙酮溶剂提取
[1755] 将丙酮用作提取溶剂,因为其溶剂特性应当从叶提取几乎所有脂质,即非极性和极性脂质。丙酮提取的油看来与己烷提取的脂质相似。来自5g烟草叶的提取的脂质质量为1.59g,即31.8重量%。进行DMSO中的脂质的1H NMR分析。观察到长链甘油三酯脂肪酸的典型信号,没有芳香产物的信号。
[1756] 热水溶剂提取
[1757] 尝试将热水作为提取溶剂以观察其是否适合从烟草叶获得油。水提取的材料外观是凝胶样的,并且在冷却时胶凝。提取的质量为1.9g,或者38重量%。这种材料像厚凝胶,并且可能包括来自叶的极性化合物如糖和其他碳水化合物。进行DMSO中的材料的1H NMR分析。分析显示长链甘油三酯脂肪酸的典型信号,没有提取的芳香产物。将剩余的固体材料用己烷提取,获得20重量%的脂质,表明水提取未高效提取非极性脂质。
[1758] 乙醇溶剂提取
[1759] 将乙醇用作提取溶剂以观察其是否适合从烟草叶获得油。乙醇提取的脂质在外观上与水和己烷提取的脂质相似,颜色为黄色-红色,具有凝胶样外观,并且在冷却时胶凝。来自5g烟草的提取的脂质质量为1.88g,或者37.6重量%。乙醇溶剂还会提取烟草叶中的一些极性化合物。
[1760] 醚溶剂提取
[1761] 尝试将二乙醚作为提取溶剂,因为认为其可能提取比其他溶剂少的杂质。提取获得1.4g,或者28重量%。醚提取的脂质在外观上与己烷提取的材料相似,颜色为淡黄色,并且其的确看来比己烷提取物干净一些。虽然二乙醚提取看来给出最干净的油,但是NMR分析显示更多有机化合物的混合物。
[1762] 实施例16,奶牛的饲料配给
[1763] 收获包含增加的TAG和TFA含量的高粱或玉米植物的叶和茎,并切成1-2cm大小的块。将加工的植物部分青贮至少两周,并然后与其他组分混合以生产用于奶牛的饲料。用于奶牛的饲料混合物包括:7.5-10kg包括增加的TAG和TFA的高粱或玉米青贮饲料、4-5kg苜蓿干草、1kg啤酒糟(约67%可消化干物质)、1-2kg籽粕(油菜籽或大豆)或棉籽、0.5kg糖蜜和矿物质补充剂(如钙、磷、镁和硫)。脂质最佳以5-7%存在于总干物质。根据总蛋白质含量,可以添加额外的氨基酸(例如赖氨酸和甲硫氨酸)或非蛋白氮供应(例如尿素)。相对于用等量的野生型高粱或玉米青贮饲料制成的相应饲料,饲料具有增加的能量密度、增加的饲料价值、增加的营养价值和增加的消化率。高油高粱或玉米青贮饲料中的脂质增加导致每天额外产奶量高达3升,并且每公斤食用脂质的乳脂增加0.33%。
[1764] 小母牛每天吃的体重相当于她体重的2.3%,并且而成年干奶牛每天吃的体重相当于她体重的1.5%左右。例如,一只300公斤的小母牛可以吃掉多达7公斤的干物质,并且一头重达470公斤的成年干奶牛会吃掉大约相同的量。泌乳奶牛的采食量较高,每天最多可达体重的4%。实际上,基于饲料质量和适口性,以重量为基础的采食量倾向于增加。
[1765] 实施例17,油体蛋白质在植物营养性组织中的表达
[1766] 编码红球菌TadA脂滴相关蛋白的蛋白质编码区(MacEachran等人2010;登录号HM625859)作为NotI-SpeI DNA片段合成,该蛋白质编码区经过密码子优化用于在双子叶植物(例如本氏烟草)中表达。使用NotI-SpeI位点将片段插入pJP3343中的35S启动子的下游。得到的质粒命名为pOIL380。编码芝麻油质蛋白L脂滴相关蛋白的蛋白质编码区(Tai等人,
2002;登录号AF091840;SEQ ID NO:305)作为NotI-SacI DNA片段合成,并使用相同的位点插入pJP3343中35S启动子的下游。所得质粒命名为pOIL382。编码芝麻油质蛋白H1脂滴相关蛋白的蛋白质编码区(Tai等,2002;登录号AF302807)作为NotI-SacI DNA片段合成,并使用相同位点克隆到pJP3343中35S启动子的下游。所得质粒命名为pOIL383。通过定向诱变产生编码具有三个氨基酸取代以去除泛素化位点(K130R,K143R,K145R)(Hsiao和Tzen,2011)的芝麻油质蛋白H1的蛋白质编码区的变体。将编码区作为NotI-SacI片段插入pJP3343中35S启动子的下游。所得质粒命名为pOIL384。编码香草叶油质蛋白U1脂滴相关蛋白的蛋白质编码区(Huang和Huang,2016;登录号SRX648194)经密码子优化以在本氏烟草中表达,合成为SpeI-EcoRI DNA片段并使用相同位点插入在pJP3343中的35S启动子的下游。所得质粒命名为pOIL386。编码鳄梨中果皮油质蛋白M脂滴相关蛋白的蛋白质编码区(Huang和Huang 
2016;登录号SRX627420)经密码子优化以在本氏烟草中表达,合成为SpeI-EcoRI DNA片段并使用相同的限制性位点插入在pJP3343中的35S启动子的下游。所得质粒命名为pOIL387。
编码花生油质蛋白3脂滴相关蛋白的蛋白质编码区(Parthibane等,2012a;登录号AY722696)经密码子优化以在本氏烟草中表达,侧翼为NotI位点并插入二元表达载体pJP3502中。得到的质粒pOIL041用NotI消化,得到的520bp DNA片段插入pJP3343的35S启动子的下游。所得质粒命名为pOIL190。类似地,拟南芥油体钙蛋白3脂滴相关蛋白的蛋白质编码区(Shen等人,2014;Laibach等人,2015;登录号AK317039)经密码子优化以在本氏烟草中表达,侧翼为NotI位点并插入pJP3502。用NotI消化所得质粒pOIL042,将得到的604bp DNA片段插入pJP3343的35S启动子的下游。所得质粒命名为pOIL191。编码拟南芥油体固醇蛋白脂滴相关蛋白(登录号AT081653)的蛋白质编码区经密码子优化以在本氏烟草中表达,侧翼为NotI位点并插入pJP3502中。用NotI消化所得质粒pOIL043,并将得到的1069bp DNA片段插入pJP3343的35S启动子的下游。所得质粒命名为pOIL192。编码微拟球藻LSDP油体蛋白的蛋白质编码区(Vieler等,2012;登录号JQ268559)经密码子优化以在本氏烟草中表达,侧翼为NotI位点并插入pJP3502二元表达载体中。用NotI消化所得质粒pOIL044,并将496bp DNA片段插入pJP3343的35S启动子的下游。所得质粒命名为pOIL193。编码里氏木霉HFBI疏水蛋白的蛋白质编码区(Linder等人,2005;登录号Z68124)经密码子优化以在本氏烟草中表达,侧翼为NotI位点并插入pJP3502中。得到的质粒pOIL045用NotI消化,并将313bp的DNA片段插入pJP3343的35S启动子的下游。所得质粒命名为pOIL194。通过修饰KDEL ER保留肽至C-末端来产生ER-靶向的里氏木霉HFBI疏水蛋白变体(Gutierrew等,2013)。对该变体进行密码子优化以在本氏烟草中表达,并作为NotI片段克隆到pJP3502中,得到pOIL046。随后,用NotI消化pOIL046,并将325bp片段插入pJP3343中。将所得载体命名为pOIL195。
[1767] 将编码脂滴相关多肽的每种遗传构建体与编码WRI1、DGAT1和p19的遗传构建体组合引入本氏烟草叶中,如实施例1中所述,并进行一些微小修改。将含有编码p19沉默抑制蛋白的基因和目的嵌合基因的根癌农杆菌培养物混合,使得每种培养物的最终OD600在渗透之前等于0.125。被比较的样品位于同一叶子上。在渗透之后,使本氏烟草植物再生长5天,然后收获叶盘,汇集来自相同植物的三片叶子,冷冻干燥,称重并在-80℃下储存。使用氯仿:甲醇:0.1M KCl(2:1:1 v/v/v)从冷冻干燥的组织中提取总脂质,并将等分试样装载在薄层色谱(TLC)板上并在己烷:乙醚:乙酸酸(70:30:1,v/v/v)中展开。回收TAG,在作为脂质定量的内标的已知量的三十七烷酸(Nu-Chek PREP,Inc.USA)存在下转化为FAME,并通过GC-FID分析。
[1768] 与WRI1+DGAT1对照相比,该测定显示了TAG水平的范围。编码脂滴相关多肽的一些构建体在一些测定中相对于对照增加了TAG水平,而其他构建体则没有。当引入表达SiOleosinL(pOIL382)的构建体时,观察到TAG含量的一致的以及统计学的显著的增加(图20);该构建体优于在这些测定中测试的所有其他构建体。相对于p19+WRI1+DGAT1对照,在该构建体的TAG中也观察到C18:2和C18:1水平的增加和C16:0的减少(图20)。用于可视化表达SiOleosinL的叶细胞中的脂滴的显微镜分析显示,与对照相比,脂滴尺寸减小并且丰度增加。
[1769] 使用放射性标记的[14 C]-乙酸盐进行进一步的测定,以测量包括每种脂滴相关多肽的不同基因组合的TAG合成速率。在遗传构建体渗透后3天,即在基因表达3天后,将[14 C]-乙酸盐渗入相同的叶组织中。3小时后,收获叶盘并提取组织中的总脂质并通过TLC分馏。使用Fujifilm FLA-5000磷成像仪定量不同脂质类型中的放射性量。这些测定证明表达SiOleosinL(pOIL382)的叶子中TAG合成速率的增加以及表达SiOleosinL的叶子中3小时内PC和PA合成速率的增加。相反,编码SiOleosinH、香草叶和鳄梨中果皮油质蛋白的遗传构建体对TAG合成速率或含量没有显示出显著影响。
[1770] 本领域技术人员会理解,如具体实施方案所示,可以对本发明进行许多变化和/或修改而不背离广泛描述的本发明的精神或范围。因此在各方面均认为目前的实施方案是说明性而不是限制性的。
[1771] 本文讨论和/或引用的所有出版物均整体加入本文。
[1772] 本说明书中已包括的文件、条例、材料、装置、文章等的任何讨论仅为了提供本发明的上下文的目的。不应视作承认任何或所有这些事项因为其在本申请权利要求项的优先权日之前已存在而构成了现有技术基础的一部分或是本领域中与本发明相关的常见性一般知识。
[1773] 参考文献
[1774] Alemanno et al.(2008)Planta 227:853–866.
[1775] Almeida and Allshire(2005)TRENDS Cell Biol.15:251-258.
[1776] Alonso et al.(2009)Plant Cell21:1747-1761.
[1777] Alonso et al.(2010)Green Chem.12:1493-1513.
[1778] Alvarez et al.(2000)Theor.Appl.Genet.100:319-327.
[1779] Andre at al(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109:10107-10112.
[1780] Andrianov et al.(2010)Plant Biotech.J.8:277-287.
[1781] Awai et al(2006)_Biochem.Soc.Trans.34:395-398.
[1782] Bartlett et al.(2008)Plant Methods4:22.
[1783] Bates(2016).Biochim et Biophys Acta 1961:1214-1225.
[1784] Bates and Browse(2011).Plant J.68:387-399.
[1785] Baud et al.(2007)Plant J.50:825-838.
[1786] Baud and Lepiniec(2010)Progr.Lipid Res.49:235-249.
[1787] Baumlein et al.(1991)Mol.Gen.Genet.225:459-467.
[1788] Baumlein et al.(1992)Plant J.2:233-239.
[1789] Belide et al.(2013)Plant Cell Tiss.Org.Cult.DOI10.1007/s11240-013-0295-1.
[1790] Ben Saad et al.(2011)Transgenic Res20:1003-1018.
[1791] Benning et al(2008)Prog.Lipid Res.47:381-389.
[1792] Benning et al(2009)J.Biol.Chem 284:17420-17427.
[1793] Bibikova et al.(2002)Genetics 161:1169-1175.
[1794] Bihmidine et al.(2015)BMC Plant Biology15:186.
[1795] Bihmidine et al.(2016)Plant Signaling&Behaviour11:e1117721.
[1796] Bligh  and  Dyer(1959)Canadian Journal  of Biochemistry and Physiology37:911-917.
[1797] Bourque(1995)Plant Sci.105:125-149.
[1798] Boutilier et al.(2002)Plant Cell 14:1737–1749.
[1799] Bouvier-Nave et al.(2000)European Journal of Biochemistry/FEBS 267:85-96.
[1800] Bradford(1976)Anal.Biochem.72:248-254.
[1801] Braun&Slewinski(2010),Plant Physiol 153:1940.
[1802] Broothaerts et al.(2005)Nature 433:629-633.
[1803] Broun et al.(1998)Plant J.13:201-210.
[1804] Browse et al.(1986)Biochem J 235:25-31.
[1805] Buchanan-Wollaston(1994)Plant Physiol.105:839-846.
[1806] Busk et al.(1997)Plant J.11:1285-1295.
[1807] Cao et al.(2007)J.Lipid Res.48:583-591.
[1808] Capuano et al.(2007)Biotechnol.Adv.25:203-206.
[1809] Chen et al(2011)Plant Physiol.155:851-865.
[1810] Chikwamba et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:11127-11132.
[1811] Christie(1993)Advances in Lipid Methodology–Two,Oily Press,Dundee,pp195-213.
[1812] Chung et al.(2006)BMC Genomics 7:120.
[1813] Comai et al.(2004)Plant J 37:778-786.
[1814] Cong et al.(2013)Science 339:819-823.
[1815] Corrado and Karali(2009)Biotechnol.Adv.27:733-743.
[1816] Coutu et al.(2007)Transgenic Res.16:771-781.
[1817] Dahlqvist et al.(2000),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:6487-6492.
[1818] Damaj et al.,(2010)Planta 231:1439-1458.
[1819] Dandik and Aksoy(1998)Fuel Process Technol.57:81-92.
[1820] Dauk et al(2007)Plant Sci.173:43-49.
[1821] Dulermo and Nicaud(2011)Metab.Eng.13:482-491.
[1822] Durrett et al.(2008)Plant J.54:593-607.
[1823] Dyer et al.(2002)Plant Physiol.130:2027-2038.
[1824] Eastmond et al.(2006)Plant Cell 18:665-675.
[1825] Ellerstrom et al.(1996)Plant Mol.Biol.32:1019-1027.
[1826] Endalew et al.(2011)Biomass and Bioenergy 35:3787-3809.
[1827] Fan et al.(2013)Plant Cell 25:3506-3518.
[1828] Fan et al.(2013)Plant Journal 76:930-942.
[1829] Fan et al.(2014)Plant Cell 26:4119-4134.
[1830] Fan et al.(2015)Plant Cell 27:2941-2955.
[1831] FAO Animal Production and Health Proceedings(2002)Protein sources for the animal feed industry,Expert Consultation and Workshop,Bangkok.
[1832] Feeney et al.(2012)Plant Physiol 162:1881-1896.
[1833] Finkelstein et al.(1998)Plant Cell 10:1043-1054.
[1834] Froissard et al.(2009)FEMS Yeast Res 9:428-438.
[1835] Gan(1995)Molecular characterization and genetic manipulation of plant senescence.PhD thesis.University of Wisconsin,Madison.
[1836] Gan and Amasino(1995)Science 270:1986-1988.
[1837] Gazzarrini et al.(2004)Dev.Cell 7:373-385.
[1838] Ghosal et al.(2007)Biochimica et Biophysica Acta 1771:1457-1463.[1839] Ghosh et al.(2009)Plant Physiol.151:869-881.
[1840] Gidda et al(2013)Plant Signaling Behav.8:e27141.
[1841] Girijashankar and Swathisree,(2009)Physiol.Mol.Biol.Plants 15:287-302.
[1842] Gong and Jiang(2011)Biotechnol.Lett.33:1269-1284.
[1843] Gould et al.(1991)Plant Physiol.95:426-434.
[1844] Greenwell et al.(2010)J.R.Soc.Interface 7:703-726.
[1845] Guan et al.(2015)Lipids 50:407–416.
[1846] Gurel et al.(2009)Plant Cell Rep.28:429-444.
[1847] Gutierrez et al.(2013)BMC Biotechnol.13:40.
[1848] Hedrich et al.(2015)Curr Opin Plant Biol 25:63-70.
[1849] Hershey and Stoner(1991)Plant Mol.Biol.17:679–690.
[1850] Hinchee et al.(1988)Biotechnology 6:915-922.
[1851] Hom et al.(2007)Euphytica 153:27-34.
[1852] Hong et al.(2016).Progr Lipid Res 62:55-74.
[1853] Horn et al.(2013).Plant Physiol 162:1926-1936.
[1854] Horvath et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:1914-1919.
[1855] Hsiao and Tzen(2011)Plant Physiol.Biochem.49:77-81.
[1856] Hu et al.(2012)Plant Physiol.158:1944–1954.
[1857] Huang(1996)Plant Physiol.110:1055-1061.
[1858] Huang et al.(2010).In Vitro Biology Meeting and IAPB 12th World Congress 2010,S93-S211
[1859] Huang and Huang(2016)Plant Physiol.171:1867-1878.
[1860] Ichihara et al(1988)Biochim.Biophys.Acta 958:125-129.
[1861] Ikeda et al.(2006)Pl Biotech J.23:153-161.
[1862] Iwabuchi et al.(2003)J.Biol.Chem.278:4603-4610.
[1863] James et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:17833-17838.
[1864] Jepson et al.(1994)Plant Mol.Biol.26:1855-1866.
[1865] Jiang,et al.(2013)Nucleic Acids Research 41(20)e188.
[1866] Jolivet et al.(2014)Plant Physiol.Biochem.42:501-509.
[1867] Jones et al.(1995)Plant Cell 7:359-371.
[1868] Karmakar et al.(2010)Bioresource Technology 101:7201-7210.
[1869] Kelly et al.(2011)Plant Physiol.157:866-875.
[1870] Kelly et al(2013a)Plant Biotech.J.11:355-361.
[1871] Kelly et al.(2013b)Plant Physiol.162:1282-1289.
[1872] Kereszt et al.(2007)Nature Protocols 2:948-952.
[1873] Kim et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-1160.
[1874] Kim et al.(2016),Plant Physiol 171:1951-1964.
[1875] Klemens et al.(2013)Plant Physiol 163:1338-1352.
[1876] Koziel et al.(1996)Plant Mol.Biol.32:393-405.
[1877] Kuhn et al.(2009)J.Biol.Chem.284:34092-102.
[1878] Kunst et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:4143-4147.
[1879] Kwong et al.(2003)Plant Cell 15:5-18.
[1880] Lacroix et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:15429-15434.
[1881] Laemmli(1970)Nature 227:680-685.
[1882] Laibach et al.(2015).J.Biotechnol.201:15-27.
[1883] Lardizabal et al.(2008)Plant Physiol.148:89-96.
[1884] Larkin et al.(1996)Transgenic Res.5:325-335.
[1885] Lebrun et al.(1987)Nucl.Acids Res.15:4360.
[1886] Laux et al.(1996)Development 122:87-96.
[1887] Lazo et al.(1991)Bio/Technology 9:963-967.
[1888] Lee et al.(1998)Science 280:915-918.
[1889] Lee et al.,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100:2152-2158.
[1890] Li-Beisson et al(2013)_The Arabidopsis Book,2013.
[1891] Li et al.(1996)FEBS Lett.379:117-121.
[1892] Li et al.(2006)Phytochemistry 67:904-915.
[1893] Li et al.(2016).Inter.J.Agric.Biol.doi:10.17957/IJAB/15.0075.
[1894] Lin et al.(2005)Plant Physiol.Biochem.43:770-776.
[1895] Linder et al.(2005).FEMS Microbiol.Rev.29:877-896.
[1896] Liu and Godwin(2012).Plant Cell Reports 31,999-1007.
[1897] Liu et al.(2010)Plant Physiol.Biochem.48:9-15.
[1898] Liu et al.(2012)J Exp Bot 63:3727-3740.
[1899] Liu et al.(2014)BMC Plant Biol.14:73.
[1900] Liu et al.(2015).South African Journal of Botany 98,157-160.
[1901] Liu et al.(2015b).Plant Cell 27:1512-1528.
[1902] Lotan et al.(1998)Cell 93:1195-1205.
[1903] Lu et al(2007)_J.Biol.Chem.282:35945-35953.
[1904] Lu et al.(2009)Proc Natl Acad of Sci USA 106:18837–18842.
[1905] Luerssen et al.(1998)Plant J.15:755-764.
[1906] Lui et al.(2009)J.Agric.Food Chem.57:2308-2313.
[1907] Ma et al.(2016)Plant Journal doi:10.1111/tpj.13244.
[1908] MacEachran et al.(2010).Appl.Environ.Microbiol.76:7217-7225.
[1909] Maher and Bressler(2007)Bioresource Technology 98:2351-2368.
[1910] Matsuoka et al.(1994)Plant J.6:311-319.
[1911] Matsuoka and Minami(1989)Eur.J.Biochem.181:593-598.
[1912] McCleary et al.(2013)J AOAC Int 93:221-233.
[1913] McCleary et al.(2015)Starch 67:860-883.
[1914] McElroy et al.(1990)Plant Cell 2:163-171.
[1915] McKinley et al.(2016)Plant Journal:doi:10.1111/tpj.13269.
[1916] Meier et al.(1997)FEBS Lett.415:91-95.
[1917] Millar and Waterhouse(2005).Funct Integr Genomics 5:129-135.
[1918] Miller(1984).Crop Sci 24:1224–1224.
[1919] Mizuno et al.,(2016)Biotechnol Biofuels 9:127.
[1920] Mojica et al.(2000)Mol Microbiol 36:244-246.
[1921] Mongrand et al.(1998)Phytochemistry 49:1049-1064.
[1922] Morelle et al.,(2005).Eukaryot Cell 4:1308-1316.
[1923] Moreno-Perez(2012)PNAS 109:10107-10112.
[1924] Moyle and Birch(2013)Theor.Appl.Genet.126:1775-1782.
[1925] Mu et al.(2008)Plant Physiol.148:1042-1054.
[1926] Mudge et al.,(2013)Plant Biotechnol.J.11:502-509.
[1927] Murashige and Skoog(1962).Physiol Plant 15:473–497.
[1928] Murphy et al.(2012).Protoplasma 249:541-585.
[1929] Naim et al.(2012)PLoS One 7:e52717.
[1930] Nakamura et al.,(2005).J Biol Chem 280:7469-7476.
[1931] Needleman and Wunsch(1970)J.Mol Biol.45:443-453.
[1932] Nilsson et al.(2012)Physiol.Plantarum 144:35-47.
[1933] Nishida et al(1993)Plant Mol.Biol.21:267-277.
[1934] Nomura et al.(2000)Plant Mol.Biol.44:99-106.
[1935] Ohlrogge and Browse(1995)Plant Cell 7:957–970.
[1936] Padidam(2003)Curr.Opin.Plant Biol.6:169-77.
[1937] Padidam et al.(2003)Transgenic Res.12:101-9.
[1938] Parthibane et al.(2012a)J.Biol.Chem.287:1946-1965.
[1939] Parthibane et al.(2012b)Plant Physiol.159:95-104.
[1940] Pasquinelli et al.(2005).Curr.Opin.Genet.Develop.15:200-205.
[1941] Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-2448.
[1942] Perez-Vich et al.(1998)J.A.O.C.S.75:547-555.
[1943] Perrin et al.(2000)Mol.Breed.6:345-352.
[1944] Petrie et al.(2012)PLOS One 7:e35214.
[1945] Phillips et al.(2002)Journal of Food Composition and Analysis 12:123-142.
[1946] Pokotylo et al.,2013.Progr Lipid Res.52:62-79.
[1947] Potenza et al.(2004)In Vitro Cell Dev.Biol.Plant 40:1-22.
[1948] Prosky et al.(1985)J AOAC Chem 68:677-679.
[1949] Qazi et al.(2012)Journal of Plant Physiology 169:605-613.
[1950] Qiu et al.(2001)J.Biol.Chem.276:31561-3156.
[1951] Robson et al.(2004)Plant Biotechnol J 2:101-112.
[1952] Rossell and Pritchard(1991)Analysis of Oilseeds,Fats and Fatty Foods.Elsevier Roston et al(2012)J.Biol.Chem.287:21406-21415.
[1953] Ruuska et al.(2002)Plant Cell 14:1191-1206.
[1954] Saha et al.(2006)Plant Physiol.141:1533-1543.
[1955] Sanjaya et al.(2011)Plant Biotechnol J 9:874-883.
[1956] Santos-Mendoza et al.(2005)FEBS Lett.579:4666-4670.
[1957] Santos-Mendoza et al.(2008)Plant J.54:608-620.
[1958] Schneider et al.(2012)Plant Biol 14:325-336.
[1959] Schnurr et al.(2002)Plant Physiol 129:1700-1709.
[1960] Scott et al.(2010)Plant Biotechnol.J.8:912-27.
[1961] Shaw et al.(1959)J Soil Sci 10:316-326.
[1962] Shen et al.(2010)Plant Phys.153:980-987.
[1963] Shen et al.(2014).Biochem.Biophys.Res.Comm.448:365-371.
[1964] Semwal et al.(2011)Bioresource Technology 102:2151-2161.
[1965] Senior(1998)Biotech.Genet.Engin.Revs.15:79-119.
[1966] Shen et al.(2010)Plant Physiol.153:980-987.
[1967] Shiina et al.(1997)Plant Physiol.115:477-483.
[1968] Shimada and Hara-Nishimura(2010)Biol.Pharm.Bull.33:360-363.
[1969] Shimada et al.(2014)Plant Physiol.164:105-118.
[1970] Shockey et al.(2002)Plant Physiol 129:1710-1722.
[1971] Singh et al.,(2013).PLoS One 8,e62494.
[1972] Slade and Knauf(2005)Transgenic Res.14:109-115.
[1973] Slocombe et al.(2009)Plant Biotechnol.J.7:694-703.
[1974] Smith et al.(2000)Nature 407:319-320.
[1975] Somerville et al.(2000)Lipids.In BB Buchanan,W Gruissem,RL Jones,eds,Biochemisty and Molecular Biology of Plants.American Society of Plant Physiologists,Rockville,MD,pp 456–527.
[1976] Srinivasan et al.(2007)Planta 225:341-51.
[1977] Stalker et al.1988 Science 242:419-423.
[1978] Stone et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:11806-11811.
[1979] Stone et al.(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105:3151-3156.
[1980] Tai et al.(2002).Biosci.Biotechnol.Biochem.66:2146-2153.
[1981] Tan et al.(2011)Plant Physiol.156:1577-1588.
[1982] Taylor(1997)The Plant Cell 9:1245-1249.
[1983] Thillet et al.(1988)J.Biol.Chem 263:12500-12508.
[1984] Tingay et al.(1997)Plant J.11:1369-1376.
[1985] Titball 1993.Microbiol Rev 57:347-366.
[1986] To et al.(2012)Plant Cell 24:5007-5023.
[1987] Ulmasov et al.(1995)Plant Physiol.108:919-927.
[1988] van de Loo et al.(1995)Proc Natl Acad Sci U S A.92:6743-6747.
[1989] Vanhercke et al.(2013)FEBS Letters 587:364-369.
[1990] Vanhercke et al.(2014).Plant Biotech.J.12:231-239.
[1991] Vieler et al.(2012)Plant Physiol.158:1562-1569.
[1992] Voinnet et al.(2003)Plant J.33:949-956.
[1993] Wang and Benning(2012)Plant J 70:614-623.
[1994] Wang et al.,(2001).Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52:211-231.[1995] Wang et al.(2002)Plant J 32:831-843.
[1996] Wang(2005).Plant Physiol 139:566-573.
[1997] Waterhouse et al.(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:13959-13964.[1998] Weissbach and Weissbach,(1989)Methods for Plant Mol Biol,Academic Press.
[1999] Weissbach et al.,In:Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,San Diego,Calif.,(1988).
[2000] Winichayakul et al.(2013)Plant Physiol.162:626-639.
[2001] Wood et al.(2009)Plant Biotech.J.7:914-924.
[2002] Wormit et al.(2006)Plant Cell 18:3476-3490.
[2003] Wright et al.(2006)Methods Mol Biol.343:120-135.
[2004] Wu et al.(2014)In Vitro Cellular and Dev.Biol.-Plant 50:9-18.
[2005] Xie et al.(2014)Mol.Plant 7:923-926.
[2006] Xu et al(2010)Plant and Cell Physiol.51:1019-1028.
[2007] Xu et al(2005)Plant Cell 17:3094-3110.
[2008] Xu et al(2008)Plant Cell 20:2190-2204.
[2009] Yamagishi et al.(2005)Pl Physiol 139:163-173.
[2010] Yamasaki et al.(2004)Plant Cell 16:3448-3459.
[2011] Yang et al.(2003)Planta 216:597-603.
[2012] Yang et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:12040-12045.
[2013] Yen et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:8512-8517.
[2014] Yen et al.(2005)J.Lipid Res.46:1502-1511.
[2015] Yokoyama et al.(1994)Mol Gen Genet 244:15-22.
[2016] Zale et al.(2016),Plant Biotech J.14:661-669.
[2017] Zheng et al.(2009)Pl Physiol 21:2563-2577.
[2018] Zienkiewicz et al.(2017)Biotechnology for Biofuels 10 doi:http://dx.doi.org/10.1186/s13068-016-0686-8
[2019] Zolman et al(2001)Plant Physiol.127:1266-1274.
[2020] Zulu et al.(2017)Biotechnology for Biofuels,10 doi:https://doi.org/10.1186/s13068-017-0874-1.
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台,是提供专利分析,专利查询,专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据,免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析,涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度,系统通过AI智能系统对图表进行解读,只需1分钟,一键生成行业专利分析报告。

申请试用

QQ群二维码
意见反馈