通常设计杀虫剂和杀真菌剂来治理或除去宿主植物或材料上侵染的 生物体。将通常所用的杀虫剂和杀真菌剂用于生物体集落化的植物或植 物部分表面。集落化生物体包括吸汁的昆虫和病原体真菌；这两种生物 均能够严重地破坏宿主植物，包括抑制宿主植物的生长和降低植物的生 产力，从而杀死宿主植物。
侵染植物的病原体昆虫包括与细菌共生的那些昆虫种，例如蚜虫， 叶蝉，粉虱；宿主昆虫没有共生体不能存活。例如，蚜虫(homoptera)在 血腔内称为菌细胞(mycetocytes)的细胞中有Buchnera属的共生细菌。 细菌从母体蚜虫直接传播到其后代，脱共生的蚜虫不能天然产生。细菌 可以提供宿主昆虫胚胎发生所需的脂类，这些脂类在受昆虫感染的植物 韧皮部的汁中没有或浓度很低。
植物病原体还包括葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae)，一种 蚜虫类昆虫，和线虫。根瘤蚜原产于落基山脉东部的美国，以已经进化 了对昆虫摄食的抗性的天然野生型葡萄为生。用于生产葡萄酒的欧洲葡 萄(Vitis vinifera)是在西亚进化的，但对根瘤蚜没有抗性。已经在所 有加利弗尼亚的主要农业区报道了茎和球线虫(Ditylenchus dipsaci)。 这种广泛的分布可能反映了其在侵染植物材料，如蒜小鳞茎上的传播。 无论所述侵染材料在何处生长，均可能导入线虫。Ditylenchus dipsaci可 以寄生在各种栽培和野生植物中。线虫在感染的组织中生成虫瘿。除由 线虫本身的虫瘿干扰植物外，由寄生真菌给感染植物带来的损伤也会增 加，所述真菌很容易黏附到变弱的根组织和肥大的，未分化的虫瘿细胞 上。此外，有些真菌例如腐霉属，镰孢属和丝核菌属在虫瘿中比在根的 其它区域中生长并繁殖的更快，由此在根组织中诱发较早崩溃。
大部分真菌均对植物有致病性。锈菌(锈菌目，多孢锈菌属)，白 粉菌(白粉菌科，单丝壳属)和霜霉(霜霉科)是于特异性宿主植物相 关的专性寄生物，所述宿主植物产生病原体所需的营养。另外，曲霉属， 链格孢属，镰孢属和青霉属的真菌可以污染粮食作物和其它产品，已知 所有这些真菌均生产真菌毒素如黄曲霉毒素，fumonisins，萎蔫酸， TA/AAL毒素，zearalenone，和单端孢菌素(trichothecene)，5-丁 基吡啶甲酸和相关植物毒性的吡啶衍生物。这些真菌毒素对包括植物和 人的不同种有很高的毒性，而且可发现于包括牛奶，牛奶制品，豆，谷 类食物，椰子，花生，番薯的商业制备食品和商业上制备的动物食品。
各种杀虫剂和杀真菌剂用于控制植物病原体。例如当环境条件有利 于锈病和白粉病的发展时，以6-7天的疗程喷洒保护性的杀真菌剂是 典型的控制方法。两种常用的系统杀真菌剂是苯菌灵和嗪氨灵。较早的 杀真菌剂还包括无机化合物如铜和硫以及有机保护剂如福美双， captom，mameb和chlorotholonil。这些化合物只在植物表面起作用， 而且为了防止感染必须是在真菌病原体出现时或之前存在。这些较早的 杀真菌剂是多位点抑制剂，即它们影响真菌的许多代谢活性。
较新的杀真菌剂一般是系统性高效有机物，如苯并咪唑酮，甾醇生 物合成抑制剂，carboxanilide，和苯甲酰胺类，它们在植物内部和表面 起作用。与较早的表面保护剂相比，系统性杀真菌剂通常在低许多的剂 量时就有效，而且可以治愈已确立的真菌感染，是病害治理中的重要因 素。系统性杀真菌剂通常在真菌的单个位点发挥作用，干扰特定的代谢 过程，这些过程是生产真菌生物生长，保持和致病力所需的所有新细胞 物质所必需的。这些制剂通常只对真菌病原体有效。
杀虫剂，杀真菌剂和化学防腐剂的广泛使用已经导致抗性病原体的 发展和进化。由于环境和保健日益为人们所关心，所以必需鉴定和/或研 制新的杀虫剂和杀真菌剂以符合未来的环境标准，特别是由动物消费的 天然产品，从而有较低的动物和环境毒性。因此需要开发新方法和制剂 以控制植物和动物病原体并降低在可消费产品和主要由病原体组成的环 境中有毒代谢产物的水平。皂苷是一种广泛分布于植物中的甾醇糖苷。 皂苷有各种不同的生物活性，可以作为杀真菌剂，杀虫剂，抗癌剂，化 妆品，食品防腐剂和具有促进生长和杀虫剂作用的肥料。还用皂苷从日 用产品中除去胆甾醇并作物家畜，如鸡的饲料添加剂以降低在鸡蛋中的 胆甾醇水平以及降低粪尿气味。除皂苷的这些许多不同用途外，皂苷与 其它具有杀虫和/或杀真菌活性的物质组合的作用还有许多尚未得到开 发。 相关文献
在英国专利申请9203522中描述了在组合物中龙舌兰的皂苷保护人 和其它动物抗害虫如蚊子和蜱的用途。在加拿大专利申请90100605公开 了有促进生长和杀虫作用的肥料，含有皂苷，木质素，磷，氮，钾和稀 土金属。在日本专利申请61065802中公开了含芦荟皂苷和对-羟基苯甲 酸酯的食品防腐剂。
在美国专利5290557中公开了含来自Yucca schidigera或Y.Hedera helix的皂苷的组合物抗非水生软体动物如蜗牛和蛞蝓的用途。由 Westcott等人1992)美国昆虫学会年报，85(3)：304-309公开了皂苷对 蝗虫蛹的作用。在日本专利申请2157205中公开了从石刁柏中提取含载 体的抗真菌药物。在日本专利申请91106370中公开了含有一种或多种来 自各种植物压榨汁和/或乙酸组合溶剂提取物或其浓缩物之试剂的抗微 生物特性。从水果浆，烟草和种子中分离的皂苷的抗微生物和害虫活性 分别由Okunji等人(国际生药研究杂志，(1990)28(3)：193-199)， Gruenweller等人(光化学(Oxf)，(1990)29(8)：2485-2490)和Lalithat等 人(国际昆虫控制，(1988)30(2)：42-45)进行了描述。在日本专利申请 61007290描述了用山茶叶中的皂苷控制anthrose，稻瘟病和稻长蠕孢叶 斑点的用途。在德国专利申请3724595中还报道了皂苷的抗微生物特性。
美国专利2465854描述了含肉桂醛衍生物的杀虫剂组合物。用肉桂 醛控制蘑菇生长底物中的轮枝孢菌属公开在美国专利5149715中。美国 专利4402950描述了通过使用从芳香植物中用蒸汽得到的萜烯使活的人 和动物生物体内的病毒失活。引述的萜烯是：黑胡椒油，肉桂芳香油， 小豆蔻油，乙酸里哪酯，肉桂醛，黄樟脑，香芹酮(carvon)和顺/反柠 檬醛(citrao)。美国专利4477361描述了含抗微生物表面活性剂的肉 桂化合物，该表面活性剂使得表面得以洗涤。
Bowles和Miller(食品保护杂志，(1993)56：788-794)描述了各种芳 香和脂族醛的抗肉毒杆菌毒素(antibotulinal特性。已经报道了包含肉桂 醛的其它制剂可以保护作物抵御致病微生物的攻击。参见美国专利 4978686和5149715以及法国专利申请2529755。
发明概述
本发明涉及含皂苷的制剂和其在控制材料上的植物动物病原体之集 落化和/或生长的方法中的用途。提供了控制植物以及种子和秧苗上致病 生物的方法并提供了基本上没有植物病原体的植物种子和秧苗。所述方 法包括步骤将有病害植物的或对病原体攻击敏感的植物的一或多部分或 组织与足以控制靶致病生物生长量的含皂苷制剂接触。还提供了控制在 各种可消费的产品中毒性代谢产物水平的方法和含皂苷的组合物，所述 消费产品是由生产毒素的微生物集落化的或可能由所述微生物集落化。 这些方法包括步骤将可消费产品或其前体与含抗致病皂苷和/或降低毒 性的物质接触，所述物质限制于可消费物质或前体并生产毒素的一种或 多种微生物的集落化，并杀灭或置换(displace)它们。本发明发现了 治理农业作物的致病生物和控制由植物材料得到的可消费产品的毒性代 谢产物水平以及降低真菌毒素和毒性代谢产物对食物链的污染方面的用 途。所用的组合物除包含皂苷外，还可包含类黄酮醛如肉桂醛，α-己 基肉桂醛和松柏醛。还发现皂苷制剂有杀灭线虫的用途。 优选实施方案的简要描述
提供基本上控制在材料，如植物，植物部分和农业产品上的植物和 动物病原体，如真菌，昆虫，蛛形纲和非两栖类/非水生软体动物集落化 和/或生长的方法和用作为协同剂的皂苷和天然产物，如一种或多种类黄 酮的组合制剂，所述材料能够支持病原体的生长或由病原体集落化并受 其侵染。优选皂苷起天然产物的协同剂的作用。在植物收获前将所述组 合物用于植物或在收获和/或加工后用于植物或其它材料。更优选在收获 前将所述组合物用于植物，植物部分或组织。优选所述组合物是生物可 降解的，而且最优选以水溶液或生物可降解的水溶性无水离子表面活性 剂，如吐温80的乳剂形式提供。可以在体外或体内评价特定病原体对所 述组合物的敏感性。“协同剂”指提高至少一种存在于制剂中的其它化 合物的作用的化合物，所述的组合作用大于其分别的，单独作用的总和。 “天然产物”指一中生物特有的或少数相近生物共有的天然来源的有机 化合物，包括真菌的二级代谢产物和由植物产生的化学物质。例如将在 植物部分表面如叶，根或花部分或组织，如木质部或韧皮部集落化的真 菌和/或昆虫与天然产物接触以杀灭，置换或延缓或消除病原体的生长。 “集落化”指微生物或昆虫与病原体营养物质，通常是必需的营养物质 如氨基酸，特别是甲硫氨酸所来自的材料如植物部分或组织相连。“生 长”指由于材料的利用而带来的生物体不可逆转的改变，导致体积，干 重或蛋白质含量增加和/或群落或集落增加。“病原体”指使生物学宿主 受到损害或产生病害的生物如真菌，细菌，昆虫，蛛形纲动物，蠕虫和 非两栖类/非水生软体动物。“材料”指能够支持靶病原体集落化和/或生 长的物质。生物控制病原体侵染到植物上的方法是使用含一种或多种皂 苷和类黄酮醛，特别是使用天然产生的化合物如芳香醛肉桂醛，α-己 基肉桂醛和松柏醛的制剂。“生物控制”指经宿主植物对病原体侵染的 直接抗致病活性和/或诱导的抗性来控制植物病原体。
本发明的组合物和方法与现有的组合物和方法相比具有几种优点。 通过鉴定和探索皂苷的抗病原特性，可调整一种或多种其它制剂成分的 有效量和浓度，特别是通过降低已知制剂中的一种或多种其它成分的浓 度，同时降低制剂的植物毒性作用并保留或提高其抗致病效果。例如， 虽然据报道类黄酮醛和肉桂醛表现出抗真菌特性，但以前却不曾将其与 皂苷联合用于植物。仅使用含肉桂醛的皂苷乳剂就足以长期使植物宿主 免受病原体生物，包括锈病和白粉病的侵袭，并且在比先前报道的浓度 更低时就可产生效果。本发明的制剂还可有效地对抗已知对常规方法产 生抗性的害虫，这类害虫包括蓟马虫和棉铃虫。制剂的植物毒性还由于 所用醛的浓度较低，所需的应用量少，而且使用的皂苷的甾体部分的量 少而得以降低。因此，具有重要价值和环境保护意义。另外，与未处理 的植物相比对病原体的长期控制可获得更有益于健康的植物，并且能提 高宿主植物的产量；抗致病物质的低浓度和单次剂量可降低对植物或其 收成谷物的危害以及可降低对杀虫剂使用工人的副作用，或者对摄入处 理植物组织或部分的动物、鱼类或家禽的副作用。
本发明的制剂还可有效地控制真菌和昆虫，消除需应用多种药剂的 弊端。在特定的情形下，例如当昆虫侵害植物部分或组织，又形成继发 性真菌病时，本发明的制剂尤其有益。另一个优点是可避免对可消费农 严品的污染并使其明显降低到消费安全水平。再者，通过用杀灭或替代 产生霉菌毒素的真菌的物质处理田地植物，可明显降低收获作物的毒素 污染水平。
皂苷是一类由皂苷配基部分和糖部分组成的化合物。S.Budavari编 辑，The Merck Index，第十一版，Merck&Co.，Inc.，Rahway，N.J.，1990， 第1328页。本发明中使用的皂苷是一类广泛分布在植物中的甾醇糖苷， 其中每个皂苷由皂苷配基和至少一个糖结构部分组成。皂苷配体包含甾 体或三萜，糖部分可包含葡萄糖、半乳糖、戊糖或甲基戊糖。更优选用 于本发明的皂苷是丝兰属植物衍生的，最优选的是Schidigera丝兰或 Valida丝兰的皂苷提取物。各种结构相关的皂苷是已知的，结构上差异 最大的是糖基化类型。见上。皂苷还可带有另外的修饰物，例如洋菝契 混皂苷在甾体上连有修饰物，皂苷结构可通过任意数种本领域已知的 酶、化学和/或机械手段进行修饰。由Schidigera丝兰得到的皂苷包含甾 体皂苷，其主要的皂苷配基是洋菝契皂苷配基和提果皂苷配基 (tigogenin)。洋菝契混皂苷经水解得到洋菝契皂苷配基 (sarsasapogeinm)(5-β，20-βF，22-δF，25-βF洋菝契皂苷配基； 也称为螺旋甾-3-β01和洋菝契皂角苷配基)，葡萄糖和半乳糖。洋 菝契皂苷配基的分子式为C27H44O3。Nobel，Park S.，龙舌兰，牛津大学 出版社，纽约，1994。
用于本发明的皂苷可从天然资源分离，可全合成或部分合成，或者 可通过重组技术生产。例如，它们可采用本领域已知的方法，从各种植 物的各部分，包括果实、叶、种子和/或根生产和/或分离；所述各种已知 可生产它们的资源，包括从丝兰、皂树属、龙舌兰、烟草、甘草、大豆、 人参和芦笋到芦荟的植物。用于本发明的皂苷在使用浓度时优选是对人 类和高级动物无毒的。最优选用于本发明的皂苷是无毒的食品级的，来 源于丝兰属植物。更为优选的皂苷来源于Schidigera丝兰或Valida丝兰 和它们的等同物。考虑到植物毒性的控制及毒理学安全性，优选的皂苷 来源于丝兰属，不与胆固醇结合的优选皂苷包括那些源于芦笋的皂苷。 皂苷一般通过冷却加压提取法制备，所得提取物经HPLC分析皂苷浓度。 丝兰纤维也可加以利用；它通常是晒干、粉碎的并过筛。
生严制剂的这些化合物的衍生物应具有本发明所需的抗致病和/或 植物毒性。根据其结构，已知的皂苷具有特定特性，发现其可应用于本 发明。一般说来，皂苷可应用于广泛的制剂中，例如杀虫剂、杀真菌剂、 一般的杀生物的有毒化合物、表面活性剂、乳化剂、调味剂和食物添加 制品中。这些不同活性归因于皂苷的特定化学结构，通常还取决于获得 皂苷的来源。例如从日本山茶得到的皂苷控制蚊幼虫的生长。从除丝兰 属植物外的来源得到的皂苷可作为杀虫组合物的活性物质。由丝兰属植 物得到的皂苷被用于除去食物中的胆固醇并用于杀生(biocidal)处理 和作为废渣和其它生物体系抗粘结/乳化剂。还发现从龙舌兰得到的洋菝 契混皂苷，例如可用作润湿剂，并且与其它化合物联合可治疗人类真菌 病害。
令人感兴趣的是，皂苷可作为协同剂，用以提高制剂中的至少另一 种化合物对各种病原体、生产毒素的微生物或它们的毒性代谢物的对抗 作用，由此，制剂成分的组合作用要比它们的分别作用之和、单独作用 强和/或活性范围大。协同剂的作用是降低给定制剂中一种或多种其它组 分的浓度，而基本上保持制剂的原有功效。这种组分与制剂中其它成分 的组合可分一步或多步完成并在任何适宜的阶段混合和/或应用。优选选 择一种可理想提高制剂的抗致病作用并降低毒素作用的皂苷。一般说 来，皂苷的有效量是约0.3-3％，更优选约0.25％v/v10°白利皂苷提取 物的水溶液。10°白利是糖化学领域的术语。白利糖度等于溶液中糖的重 量百分数。Hawley编辑，简明化学辞典，第10版，Van Nostrand Rernhold， 纽约，1981，第149页。
可提供所需活性的皂苷最优选与至少一种醛，尤其是芳香醛组合， 它们可直接杀灭真菌或昆虫病原体和/或诱发植物对各种真菌或昆虫病 原体的系统性抗性。因此，这些抗致病物质优选包括至少一种病原体生 长抑制的类黄酮醛，其量是应足以控制靶病原体微生物的生长。“控制 生长”的目的在杀灭病原体和/或降低或遏制其繁殖。病原体包括昆虫、 真菌和其它集落的对植物生长不利的微生物。
本发明的制剂除皂苷外，还优选包括下式(1)所示的病原体生长抑制 化合物。 其中 R代表-CH2OH或-CHO；n是0到3的整数；每个R1分别代表OH或含有1-10个碳原子和0-5个杂原子的有机取代基，所述化合物的 R1取代基中碳原子和杂原子数之和不超过15，R4代表氢或包含1-10 个碳原子的有机基团。这些类黄酮醛化合物包括天然产物，如肉桂醛。 还注意到了α取代的醛，如α-己基肉桂醛(HCA)，松柏醛和与其密切 相关的化合物。
已知许多芳香醛和脂肪醛可用于本发明，它们通常被认为是安全的 人工调味剂，例如苯甲醛、乙醛、肉桂醛、胡椒醛和香草醛(21CFR§ 172.515)。早在本世纪五十年代HCA就为大众所公用，今天更是被广 泛应用于化妆品(皂类、去污剂、霜剂、洗剂、香水)(香料原料专论， 食物调料毒理学，12：增补，915，1974)。1965年，HCA被FEMA(香 料提取制造协会，香料成分使用准则概况，第2569期，食物技术学， Champaign，19：(第2部分)155，1965)认可具有GRSA(通常被认为是 安全的)并为美国FDA批准可应用于食物。欧洲理事会(欧洲理事会， 天然和人工香料，关于社会和公共卫生领域的部分协议，Strasbourg，A 列(1)，第1部分129号，第55页，1970)将HCA列入可接受的人工香 料(浓度为1ppm)。据报道这些化合物对C.botulinum孢子萌发具有 抑制活性。Bowles和Miller，普通食物保存，(1993)56：788-794。
本发明的优选化合物如下式(2)所示： 其中R1代表-CHO，R2代表-OH或包含1-10个碳原子的有机取代基， R3代表甲氧基或包含1-10个碳原子的有机取代基且R4代表氢或包含1 -10个碳原子的有机取代基。其中特别重要的类黄酮醛，尤其是芳香醛。 可用于本发明的芳香醛的例子是肉桂醛(下式(3))： 和松柏醛(下式(4))：
其它重要的化合物包括式(1)化合物的类似物，如α-位被烷基，如己 基或者被支链烷基，如戊基取代的化合物。通常在α-位的基团是从C-5 到C-10的。这类化合物包括α-己基肉桂醛和α-戊基肉桂醛。α-己基肉桂 醛(HCA)的化学结构如(5)(下)所示：
HCA的化学文摘服务手册(CAS)名称是2-(苯基亚甲基)辛醛， CAS登记号为[101-86-0]。该化合物还有化学名称2-己基-3-苯基-2-丙烯 醛。该化合物的分子式是C15H20O，分子量为216.3。HCA是一种低度至 中度的挥发性化合物，25℃时，其蒸气压为70×10-5mmHg。其母体化 合物，肉桂醛的蒸气压比它要高约40倍(25℃时为2970×10-5 mmHg)。本发明的芳香醛和脂肪醛可采用本领域已知的各种方法。例 如，参见J.March编辑的高等有机化学：反应，机理和结构，附录B， 第2版，McGraw-Hill，纽约，1977。肉桂醛可通过合成方法，如将 肉桂醇氧化(Traynelis等，美国化学会志，(1964)86：298)或通 过苯乙烯与甲酰基甲基苯胺缩合(英国专利504，125)制备。还可以 通过从天然来源分离得到目的醛。例如，肉桂醛可以从腐木真菌， Stereum subpileatum中分离。Birkinshaw等人，生物化学杂志，(1957) 66：188。
例如可以按照USPN5055621中的描述合成HCA。以实验室规模， 通过在氮气下，将苯甲醛与辛醇(octanal)反应合成HCA(醇醛缩合) (Personal Communication，Eric Walborsky，Firmenich Chemical Manufacturing Center，Port Newark，New Jersey)。该反应在盛有甲 醇，309ppm二苯基胺，氢氧化钾和苯甲醛的搅拌烧瓶中进行。在缓慢 加入辛醇后，用乙酸使反应混合物的pH达到7.5-9.5。蒸发掉甲醇并用 水洗涤反应混合物后，将有机相转移到蒸发仪中。除去约20-24％的 罐配料是苯甲醛和“轻物质”，剩下的蒸馏物组成α-己基肉桂醛“中 心馏份”。使“中心馏份”再分馏，根据其中气味评价，除去该物质中 1-5％(重)的轻馏份物质。终产物是浅黄色油，在20℃的比重为 0.955-0.965，在20℃的折射率为1.548-1.562，在1个大气压下，沸点 为305℃，熔点为26℃。
还可以从Firmenich得到HCA；其产物主要含有(E)-顺式异构 体(最大值93.8％)，和(Z)-反式异构体(最多6％)。少量组分是 辛醇的自身醇醛缩合产物(1-1.5％(Personal Communication，June Burkhardt，Firmenich，Plainsboro，New Jersey)。加入0.04％2， 6-二叔丁基-对甲酚(丁基化的羟基甲苯或BHT)(作为抗氧化剂 (Technical Data Sheet，己基肉桂醛907600，Revision853，Firmenich Inc.，Plainsboro，New Jersey))来稳定市售产物。可以从已经报道天然 产生HCA的稻米中分离HCA。(Givaudan-Roure Index，Givaudan- Roure Corporation，Clifton，New Jersey，1994，p.89)。
可以将皂苷和醛化合物组合物单独使用或于其它活性或失活的物质 一起使用。在一些情况下，通过将一种或多种组分，即除皂苷或式(1) 化合物以外的化合物加入到制剂中可以提高制剂的效力。优选的是加入 组分将特定的制剂的植物毒性减到最低，同时又可提高制剂的抗致病作 用。特别感兴趣的是将佐剂加到制剂中。“佐剂”指加入到制剂中有助 于主要成分发挥作用的物质。在农业化学物质的应用中，喷雾佐剂完成 所述功能。可以配制有效的喷雾佐剂以含有一种或多种表面活性剂，溶 剂或共溶剂。含表面活性剂，水和油性组分的系统有许多其它形成有序 相的可能性表面活性剂自由可以凝集为不同的相以产生微粒，一种可能 性是一级相(first order phase)。表面活性剂还集中在油和水相的互 渗透界面，形成微乳。例如通过包含乳化剂，如吐温80可以直接提供制 剂。可以使用的其它去污剂包括阴离子去污剂入在美国专利申请4978686 中描述的那些。通常，在制剂中在用的去污剂和其它试剂不会损害类黄 酮醛的杀虫剂特性，反而会提高制剂的实质特性(参见例如美国专利申 请4477361)并可以改善杀虫剂特性。
在制剂中可以任选地包含其它组分，如多元酸的盐如碳酸氢钠，硫 酸钠，磷酸钠或磷酸氢二钠水溶液以提高制剂的抗真菌或杀虫特性。将 所得的乳剂稀释到适宜的浓度进行使用。
用例如实施例中描述的方案和本领域专业人员熟知的其它方法可以 确定含皂苷和式(1)，(2)，(3)，(4)和/或(5)化合物的 组合物的最有效配方。通过包含至少一种除皂苷外的化合物以提高制剂 中至少另一种其它化合物的作用就可以达到各制剂最优化的目的。根据 其对特定害虫和/或植物宿主的作用，评价使用皂苷和式(1)的任何化 合物以及其它制剂组分如吐温80和/或碳酸氢钠的各制剂，同时评价适 用于特定应用以使植物毒性最小同时又保持或提高了制剂的抗致病作用 的各组分的组合和有效量。
特别需要的是优化制剂以提高对广谱病原体的平均病害抗性。通过 系统改变试验制剂中组分的量，用试验制剂处理所需的植物，然后监测 与未处理的对照植物相比的害虫侵染水平可以确定各组分的有效量。例 如，在应用中可以用各种浓度的皂苷分别喷雾给植物，其中使用含不同 量类黄酮醛和/或其它组分的系列制剂。将试验组分的有效量定义为控制 病原体在植物宿主上生长，由此降低植物发病率的量。可以计算各特定 应用的平均病害抗性(MPDC)。MPDC的定义公式为： 和 $\mathrm{MPDC}=\frac{(\mathrm{MDIC}-\mathrm{MDIT})}{\mathrm{MDIC}}\times 100$ MDIC＝在未处理对照中病害发生的平均％ MDIT＝在处理植物中病害发生的平均％ 通常，为了进行有效的病原体控制，病害控制的平均百分比(MPDC) 要大于60％，优选至少约70％。通常测定的有效量的皂苷活性大致与 Y.Schidigera皂苷提取物(对照)相当，所述提取物包含约0.05％-3％，优 选0.25％v/v10°白利糖度的皂苷提取水溶液。
还要评价制剂的植物毒性；因此至少评价制剂在活植物变化上的一 种毒性是重要的。按照毒性增加的严重程度，按如下评价植物毒性等级： 0-植物没有任何症状；1-很轻微变褐色的胚轴(没有其它症状)； 2-植物有些枯萎，较下部的叶子发干，维管系统有些变褐色；3-完整 植物枯萎，叶子发干，有外和内症状的胚轴；4-茎坏死，植物干枯。 优选的是所用的制剂有2级或较低级的植物毒性，更优选的是1级或更 低的。例如，评价0.1ppm到25000ppm的肉桂醛对白粉病的作用。通过 使用更高剂量的肉桂醛和/或加入式(1)的其它化合物或通过经加入去 污剂等来提高制剂的实质作用可以改善平均病害控制。
可以将试验组分的有效生长调节量确定为通过杀灭害虫或防止其繁 殖而降低害虫在宿主植物上集落化程度的量。式(1)，(2)，(3)， (4)或(5)的一种或多种化合物的有效生长调节量通常为约0.01g/l -25g/l，更优选的是约1g/l-20g/l，最佳为约5g/l-10g/l。在优 选的实施方案中，在含吐温80作为乳化剂和任选的碳酸氢钠的制剂中， 所述制剂包含皂苷和有效生长调节量的α-己基肉桂醛，肉桂醛和/或松 柏醛。优选的制剂通常是含有皂苷和α-己基肉桂醛，肉桂醛和/或松柏 醛(按重量计0.5％-10％)并可以包含质子惰性酸(按重量计8％- 12％)和余量的水的乳剂。含6-12％质子惰性酸的制剂是优选的。通 常制剂中醛的总量为5％或更少。处理白粉病菌，锈菌和孢子以及蚜虫 的优选制剂是含有α-己基肉桂醛，肉桂醛和/或松柏醛(按重量计0.001 ％-10％)，多元酸的盐(按重量计4％-12％)，乳化剂(按重量 计1％-4％)和余量的水的乳剂。不使用除具有内在抗氧化剂特性的 特定醛，例如松柏醛以外的抗氧化剂的制剂也是有效的。
可以单独或与组合物一起使用其它化合物，如H2O2，已知它杀灭特 定的真菌如在碱性环境中的A.flavus。也可以包含抗冷冻组分如甘油， 丙二醇，乙二醇和/或异丙醇，胶和胶样物质如黄原增胶，阿拉伯胶，明 胶，羟丙基甲基纤维素等(如在美国专利5290557中描述的那些)只要 所用的量不会损害植物和/或任何收获物，如水果。另外，为了在收获前 使用，可以使用诱导非系统或系统植物抗性的化合物以控制在大田条件 下特定真菌的集落化和/或生长。
可以用各种方法，包括其中将待检制剂在一定时间内暴露于升高的 温度的加速试验来评价制剂的稳定性。以规则的间隔取制剂样品，然后 用本领域专业人员已知的方法化学分析以确定降解的速率和性质。例 如，可以通过气液层析(CLC)，使用30m的非极性聚二甲基硅氧烷 毛细柱(如Hp-1，Hewlett-Packard，或SPB-1，Supelco)和火焰 离子检测仪分析HCA。用氦作为载气(8ml/分)和约240℃的柱，(E) -顺式异构体(主要组分)保留时间为约6.0分，(Z)-反式异构体 (微量组分)的保留时间为约6.3分。
为了应用，若用制剂制备用于种植对特定病原体敏感的宿主植物的 基础或其它生长底物，应用于已经受到侵染的生长底物或收获的物质， 可以将本发明的制剂直接加到根际，底物或收获的物质，或将它们与固 体支持物结合或用使用定时释放物质包囊。若使用固体载体，应避免可 能导致活性醛氧化的物质。释放体系的实例包括淀粉葡聚糖等。参见 Yuan等.，基础与应用毒理学(1993)20：83-87，有关运载体系的实例。 还可参见Kawada等.，(1994)10：385-389。
除皂苷和前述式(1)，(2)，(3)，(4)和(5)的特定 化合物外，任何这些化合物的衍生物等同于本发明的化合物，所述衍生 物在生物系统作用下产生上述鉴定的分子式的化合物。因此将前体化合 物应用于植物部分或组织或收获的物质应等同于本发明的实施。在美国 专利申请5139715和其中引述的参考文献中描述了前体化合物向类黄酮 醛的生物转变。还可参见Casey and Dobb Enzyme Microb.Techol. (1992)14：739-747。前体化合物的实例包括在与对植物病原体(如在氨基 酸氨裂解酶途径中的那些)获得的和/或系统抗性的植物抗性有关途径中 的那些，包括苯丙氨酸(生产肉桂酸)。所需的其它前体化合物包括在 用于生产木质素和香豆素的生物途径中的那些，例如生产对香豆酸的酪 氨酸。因此认为产生具有所需抗致病和毒素降低作用的这些化合物的前 体和衍生物是本发明的等同物。
通过将充足量的抗致病剂引入到靶致病生物体中以破坏靶致病生物 体的生长和/或活力来完成本发明的方法。在收获前或收获后，将含有抗 致病剂的制剂引入到植物组织或部分中。应用方法包括喷雾，喷洒，浸 渍，注射等，活性成分呈浓缩液，溶液，悬浮液，粉末等形式。例如将 制剂作为湿或干制剂喷雾到植物病原体侵染的植物叶子的或对植物病原 体侵染敏感的植物的叶子表面和/或下表面或其它植物组织或部分，当使 用湿制剂时，优选是喷雾到试验点。可以在侵染前或后喷雾植物，优选 是在侵染前。但是，为了使对宿主植物的损害最小，若可行，优选是处 理较老的植物，由于新叶一般对植物毒性更敏感。另外，若可以接触根 和在根部集落化的相关致病生物体时，可以将干或湿制剂作为灌溉过程 的部分或单独应用于根际。在一些情况下，可以使用定时释放制剂，特 别是用于根际或收获后的物质。可以用于植物本身或根际的量取决于侵 染程度和使用制剂和在制剂中所用的特定化合物后所达到的程度，因此 以实验为基础确定最佳结果。
将制剂的活性成分引入到靶生物体中的方法可以通过使处理植物表 面的害虫生物体直接摄食或饲喂提供营养的宿主整体表面上的害虫生 物，所述靶害虫生物在宿主上集落化，所述宿主含有或在其表面有抗致 病剂。在提供营养的宿主植物表面上的抗致病剂的存在可以是抗致病剂 于植物部分直接接触的结果，或可以是由宿主植物加工的，作为在用抗 致病剂处理植物前引入作为二级作用的系统抗性的结果或作为宿主植物 遗传修饰的结果。
根据靶生物，可以将所用的皂苷和/或醛微囊包埋或与固体支持物， 任选地通过一连接物如从多糖中衍生的结合区相连，其中固体支持物是 多糖如纤维素，特别是微晶体纤维素。在美国专利5340731；5202247 和5166317中描述了纤维素结合区的制备。也可以使用来自支架 (Scaffold)蛋白质的结合区。参见Shoseyev等.，(PCT申请PCT/0594 /04132)。使用本领域专业人员熟知的方法，用或不用可裂解键可以将皂 苷和/或醛与结合区或其它固体支持物相连。活性成分的固体或微囊形式 对于处理或防止土壤病原体是特别有用的。用分析化学技术确定活性成 分从固体或微囊形式中的释放和最佳速率。为了达到定量的目的，可以 用气相层析技术确定所释放的醛量。例如将包囊(颗粒化的)产物的样 品与所选类型的土壤混合，在不同的时期取样以测量释放。也可以分析 从制剂中释放的挥发性气体。用本领域专业人员熟知的方法，用GC层 析也可以评价叶状和滴灌应用制剂随时间的活性和稳定性。还可以制备 制剂的甲醇或乙醇提取物进行HPLC分析。
本发明制剂的一种或多种组分可以通过调节一种或多种基因的表达 而在植物中进行生产，所述基因编码控制所需化合物在植物，植物部分， 植物细胞，特定植物组织和/或水平所需的和/或与植物生长的特定阶段相 关的一种或多种酶或酶途径或簇。所述酶可以是分别在生物合成途径或 降解途径中的，所述调节可以分别是上升调节或下降调节，以调节内源 性植物基因或外源供给植物的转基因的表达。天生的植物基因是属于宿 主植物基因组所天生的基因。内源性植物基因是存在于所需野生型植物 宿主的基因组中的基因。它可以是天生的基因或由于植物感染而存在的 或其它自然插入到植物基因组中的基因(如病毒基因)。还可以用重组 方法或传统的植物育种方法修饰宿主植物以便将一种或多种外源基因导 入到宿主植物中，所述外源基因编码控制所需化合物水平的酶，这样的 酶是在皂苷或一种或多种式(1)，(2)，(3)，(4)或(5) 的化合物的合成途径中。基因表达的调节是为了在转录，翻译和/或翻译 后控制所需基因产物的生产。通过调节编码合成化合物所需的一种或多 种酶的一种或多种内生基因或转基因来控制所述化合物的水平。
在植物中调节基因表达的方法是本领域已知的。改变生长条件或将 化合物外源用于植物可以影响基因表达。例如，通过调节内源性基因表 达可以用本发明的制剂诱导系统植物抗性。在分子水平，基因表达基本 上取决于转录，翻译和终止控制区，它们调节结构基因编码区的表达。 通过研究调节这些控制区的植物信号或直接重组所述控制区，可以调节 例如编码控制皂苷水平所需的酶之基因的表达。若转基因是对于植物宿 主是外源的，则所述转基因应包含所选的和所设计的控制区，以达到所 需的基因表达水平和使基因表达的时间选择。适宜的控制区于所述基因 同源(天然的)或不同源(非天然的)。“同源”指所述控制区来自或 基本上相似于与所研究基因正常相关的控制区。“不同源”指所述控制 区源自不同的核苷酸源或序列或基本上不同于与所研究基因正常相关的 控制区。例如若与所述控制区相比，所述酶的编码序列在来源上是不同 源的，为了在所要求的植物细胞中表达基因，就要将在这些植物细胞中 有功能的转录和翻译启始调节区或启动子于所述编码序列可操作相连。 在这些植物细胞中有功能的转录和翻译启始信号包括来自植物宿主或其 它植物天生或内源性的并指导在植物宿主中的组成性或选择性表达之基 因的那些，并包括来自感染植物之病毒如CaMV的序列。
特别需要的是在植物，植物部分，植物细胞，特定植物组织和/或选 择性调节结构基因表达和/或与植物生长的特定阶段相关的基因控制 区。优选的是本领域已知的那些控制区和/或于植物生长的特定阶段相关 的，特别是可用于调节基因表达的转录控制区或启动子，所述基因编码 控制皂苷和/或式(1)，(2)，(3)，(4)或(5)的组分在植 物，植物部分，植物细胞或特定植物组织中的水平所需的酶，或与特定 的植物生长阶段相关。例如在USPN4,943,674和5，175,095描述的用于 水果中的不同表达方式的启动子；在USPN5,315,001中见到的；和在 USPN5,177,011中快速发育组织和嫩秧苗中的启动子。
在植物宿主中生产本发明制剂所需组分的优选方法是通过重组DNA 方法，特别是通过用本领域已知的重组技术，构建转基因植物，改进皂 苷和/或至少式(1)，(2)，(3)，(4)，(5)的一种化合物 在特定植物组织中的水平。所述方法包括用在植物有功能的表达盒转化 所述植物细胞，所述表达盒含有5’到3’方向的转录可操作连接的组分， 转录和翻译启始调节区，连接在阅读框架中DNA序列的5’，所述DNA 序列编码能够调节生产的和/或生产所述化合物所需的一种或多种酶，以 及翻译和转录终止区。由于改变了在所述化合物生物合成中酶的浓度， 所以表达生产所述化合物所需的酶可以提高所述化合物的生产。特别是 在植物组织如叶，根，水果和种子中皂苷，肉桂醛和/或松柏醛生产的选 择性控制。
为了在特定的组织中选择性控制皂苷的生物合成，用表达盒转化植 物细胞，所述表达盒含有编码一种或多种酶的结构基因，所述酶是合成 皂苷所需的而且能够提高所述化合物在所述组织中的含量。相似地，为 了在特定的组织中生物合成肉桂醛，用表达盒转化植物细胞，所述表达 盒含有编码一种或多种酶的结构基因，所述酶是合成肉桂醛所需的而且 能够提高肉桂醛在所述组织中的含量。特别需要的是编码能够代谢前体 化合物的一种或多种酶的那些基因，所述化合物对于从在植物细胞中正 常发现的底物合成皂苷，肉桂醛和/或松柏醛化合物是必需的。更需要的 是转基因表达至少一种(1)，(2)，(3)，(4)或(5)的化 合物和皂苷。
制备用于表达基因的DNA构建体，它可以使表达盒整合到植物宿主 的基因组中。用本领域已知的转化系统如农杆菌，电穿孔或高速率的微 颗粒介导的转化可以完成整合。根据应用，可以在特定的组织和/或特定 的细胞器中优先表达皂苷和一种前体化合物。利用具有所需表达方式的 转录调节区达到组织特异性。用适宜的转移肽转移特定细胞器的酶。已 经描述了DNA构建体组织和细胞器特异性表达的方法，而且是本领域已 知的。
为了证实所述基因的调节和表达，现有各种技术可用于确定存在于 植物细胞中的所需DNA序列是否整合到基因组中并被转录。可以用例如 Northern印迹技术检测编码所需酶的信使RNA。还可以通过检测酶活性 或蛋白质产物的免疫测定来检测表达。最优选的是用本领域已知的方法 测量在植物宿主中所述化合物的水平。例如与对照植物相比一种所需的 表型，就是证明了因所述基因的表达而使植物组织中皂苷和/或类黄酮醛 的含量和在植物宿主中皂苷水平增加。
为了将一种或多种本发明制剂的化合物导入到靶生物体中，表达编 码酶的基因的植物宿主会使靶生物体暴露于至少一种抗致病制剂组分 中，所述酶是控制所述化合物的水平所必需的。在另一实施方案中，选 择性地表达所述基因诱导全株植物宿主对病原体攻击或集落化的抗性。 可以由植物宿主表达抗致病制剂的至少一种组分，将抗致病制剂的其它 组分外源用于所述植物宿主以便当所述组合直接用间接导入到靶生物体 时，可以引发所需的抗致病作用。除抗植物病原体的自体保护外，积累 皂苷能力提高的转基因植物可以用作提取皂苷的来源，随后用作活性杀 虫剂。
通过下降调节编码酶的特异性植物基因的表达可以积累类黄酮醛， 所述酶要么使所需醛进一步代谢要么从使代谢中间产物远离所需的醛。 例如在肉桂醛的情况下，这包括下降调节肉桂酸4-羟化酶(CA4H) 和肉桂醇脱氢酶(CAD)的表达。CA4H通常使一些肉桂酸不形成肉桂 醛而产生对香豆酸，其自身的代谢中间产物。通常仅降低CA4H活性并 不能足以积累肉桂醛，因为CAD能够迅速地将肉桂醛转变成肉桂醇，后 者然后掺入到木质素中或作为糖苷积累。同时降低CA4H和CAD的活性 可以增加从肉桂酸到肉桂醛的代谢流动并减少肉桂醛向肉桂醇的转变。 一些肉桂醛掺入到木质素中，但肉桂醛(游离的或作为糖苷)也积累会 高于正常水平，特别是当肉桂酸的生物合成增加时。当苯丙氨酸氨裂解 酶(PAL；在正常phenylpropanoid代谢中的第一和速率限制步骤， Hahlbrock and Scheel，(1989)植物生理学与分子生物学年度综述， 40：347-369)活性高时会发生，这是在植物这自然产生的一种状态以应 答包括真菌病原体侵入和与受伤和昆虫取食相关的机械损伤的广泛的刺 激。
已经克隆了大量的植物CA4H和CAD基因而且其序列可从GenBank 得到。可以将包括不同植物种之间保守核苷酸序列的这些基因的部分直 接用在植物表达载体(反义或有意义方向)中以抑制相应的内源基因(如 Pear等.，(1993)抗过敏研究与进展3：181-190，Napoli等.，(1990)植物 细胞2：279-289。参见USPN5107065)。更优选的是用这些保守基因序 列从待修饰的植物种的cDNA文库中分离CA4H和CAD cDNA克隆。然 后将所得的cDNA克隆或其部分导入植物表达载体(发义和有意义)并 用于转化所需的植物。本发明的DNA构建体优选含有至少50个碱基的 序列，所述序列与内源CA4H或CAD基因同源。
通过将载体于有用的DNA片段操作相连形成可用于植物转化的质 粒来生产重组DNA分子。本文将能够指导来自基因克隆部分的RNA表 达的载体称为“表达载体”。所述表达载体含包括启动子的表达控制元 件。用于在高等植物中表达基因的典型载体是本领域熟知的，包括由 Rogers等人(酶学方法(1987)153：253-277)描述的从根癌农杆菌的Ti 质粒衍生的载体。用于使导入基因产生强组成性表达的常用的启动子是 花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子(可从Pharmacia Piscataway， NJ得到)。可以使用组成性启动子(如CaMV35S启动子)或可诱导或 发育调节的启动子(如来自PAL或内源CA4H或CAD基因的启动子)。 用组成性启动子可以影响植物所有部分的功能，而用诱导或发育调节的 启动子的优点在于只在所需组织和其所需的条件下产生发义或有义 RNA。使用发育调节的启动子是优选的，因为已知phenylpropanoid生物 合成的下降调节能够对含异源PAL基因的转基因植物的发育产生不必要 的副作用(Elkind等.，(1990)国立科学院学报，87：9057-9061)。
可以用许多不同的转化方法常规转化各种植物。对于将DNA转移到 双子叶植物中的特别有效的一种方法包括使用农杆菌。在该方法中，将 所需的基因插入在T-DNA区的边界之间，所述T-DNA区基因被剪 接成有选择性标记基因(如编码新霉素磷酸转移酶Ⅱ或phosphinothricin 乙酰转移酶)的小重组质粒。然后通过转化或三亲配对将重组质粒导入 农杆菌。然后用携带所需基因的农杆菌菌株通过共培养细菌和适宜的植 物组织(如叶盘)来转化植物组织。用适宜的选择试剂在组织培养中筛 选转化的相比，然后再生植物(参见Horsch等.，(1985)科学，227：1229 -1231)。已经在植物细胞转化，特别是在更recalcitrant作物植物中使 用的其它方法包括biolistics和电穿孔(有关详细方法参见Sanford等.， (193)酶学方法217：483-509和Potter(1993)酶学方法217：461-478)。
一旦生产了转基因植物，就可以使用用于CA4H和CAD的常规酶检 测方法确定不同转化体中酶活性的抑制水平。可能只有少量生产的转化 体有足够低的残留的酶活性，从而可以积累类黄酮醛，而且对植物发育 没有不利的副作用。出于该原因，生产CA4H和CAD均受到抑制的转化 体的优选方法是将两种基因分别导入到不同的转化体中，然后通过标准 有性杂交将其组合。这可以同时得到大量组合的待评估的基因抑制水 平。
另一种在转基因植物中过量生产皂苷或类黄酮醛的方法是将植物基 因赋予能够合成特定类黄酮醛和/或皂苷的微生物宿主。然后在发酵系统 中可以用所得微生物生产所述类黄酮醛，或可以用所得微生物作为活或 非活微生物制品中类黄酮醛的天然释放体系。酵母，特别是啤酒酵母是 用于该目的优选的生物，因为已经对其进行了加工用于高水平表达PAL (Faulkener等.(1994)基因，143：13020)，而且已经表明植物肉桂酸 4-羟化酶在酵母中有功能(Urban等.(1994)欧洲生物化学杂志，222： 843-850)。
PAL的表达诱导了从苯丙氨酸生产肉桂酸的能力。从苯丙氨酸生产 肉桂醛还需要另外两个酶促步骤。在植物中，这些步骤由酶肉桂酸：CoA 连接酶(CL)和肉桂基CoA还原酶(CCoAR)催化，但是由于4-香 豆酸(coumarate)CoA连接酶(4CL)也可以用肉桂酸作为底物 (Knobloch，and hahlbrock(177)Arch.Biochem.Biophys.184：237 -248)，所以可以用4CL代替CL。在许多地方(Genbank)已经描 述了20以上的克隆PAL基因和5个以上4CL基因以有利于其在本发明 中的实施。用来自纯化蛋白质N-末端的氨基酸序列，或肽片段作为探 针序列，通过标准基因克隆技术分离cDNA克隆，可以得到CCoAR的基 因。已经从大豆栽培作物(Wengenmayer等.(1976)欧洲生物化学杂 志，65：529-536；Luderitz和Grisebach(1981)欧洲生物化学杂志， 119：115-124)，云杉形成层(Luderitz和Grisebach，同上文)，杨 树木质部(Sarni等.(1984)欧洲生物化学杂志，139：259-265)和 Eucalyptus gunnii正在分化的木质部(Goffner等.(1994)植物生理学， 106：625-632)中纯化并部分表征了CCoAR。纯化的优选方法是Goffner 等人(同上文)的，因为该方法在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上得到单个蛋 白质带，从而用于蛋白质测序。为了表达α-己基肉桂醛，也可将表达 催化α-己基加到肉桂醛上的酶的基因插入到微生物宿主或植物中。例 如可以从水稻植物中克隆所述基因。
用标准转化技术，如电穿孔(Becker和Guarante(1991)酶学方 法，194：182-187)将克隆的基因导入到标准表达载体中，然后用于转化 微生物宿主，优选酵母。用标准酶检测方法确定被操作基因的功能性表 达，并使用用于类黄酮醛的检测方法筛选有最大生产力的菌株。因为类 黄酮醛有抗微生物特性，所以优选使用的表达载体是使导入的基因只在 生长循环晚期或应答合成诱导剂时才表达。也可以在固定化的全细胞反 应器(如Evans等.(1987)生物技术与生物基因工程，30：1067-1072)中 生长工程化的微生物宿主以防止在培养基中积累醛。
所述配方和方法用于处理被致病生物体集落化的植物。这些包括正 在开花的植物，草，包括观赏草皮，小糠草，蔬菜，谷物和水果，包括 西红柿，马铃薯，洋蓟，草莓，玉米，谷类，洋葱，黄瓜，莴苣，烟草， 柑橘属如橘子，柠檬，柚子和葡萄柚，以及风铃属(bell)胡椒和葡萄，和 果树如桃，苹果和樱桃，观赏植物如玫瑰和树，特别是松树。还包括直 接或间接由鱼，禽和动物，包括人消费的作物。“直接或间接”指作物 例如可以被人(直接消费)摄取，或指非人动物或禽类摄食谷物，然后 它们又可以被人摄取(间接消费)。用于消费的作物包括烟草，鱼，动 物和禽饲料，用于加工成酒或食物如玉米浆等的作物。
靶致病生物包括在植物或植物部分，特别是植物部分的表面集落化 的真菌。施用所述制剂的最佳时间和方法根据制剂集落化的植物的特定 部分和在植物生活周期中，特定侵染发生或可能发生的时间来确定。例 如为了治理白粉菌，锈菌和在宿主植物叶上集落化的其它病原体，用本 发明的制剂喷洒所述宿主植物来除去病原体。式(1)化合物的使用量 部分随靶病原体和宿主植物的不同而不同，而且可以通过评估靶生物体 对所示制剂的敏感性以及制剂或宿主植物的植物毒性作用，根据经验来 确定。可以在侵染之前或之后喷洒植物，优选是在侵染之前。然而，为 了使对宿主植物的损伤降到最小，若可行，优选的是处理较老的植物， 因为嫩绿叶对植物毒性更敏感。另外，可以使用转基因作物，它们以足 以抑制病原体生长和/或杀灭所述病原体的量表达了一种或多种制剂组 分。优选在所述病原体集落化的组织，如叶中表达所述组分。
特别需要的是治理受白粉病影响的植物，这种病是由白粉菌科的真 菌靶生物引起的。例如下列种在所说明的植物中引起白粉病：二孢白粉 菌：秋海棠属，菊属，大波斯菊，南瓜，大丽花，亚麻，莴苣和百日菊； 禾白粉菌：谷类和草；蓼白粉菌：菜豆，大豆，三叶草和其它豆科植物， 甜菜，甘蓝和其它十字花科植物，黄瓜和罗马甜瓜，飞燕草和绿球花； Microshphaera alni：乌饭树，梓树，榆树，丁香，栎树，杜鹃花和香豌 豆；Phyllactinia sp：梓树，榆树，槭树和栎树；苹果白粉病柄球菌：苹 果，梨和榅桲；P.oxyacanthae：杏，樱桃，桃和李；Spaelrotheca macularis：草莓；S.mors-uvae：醋栗和茶镳子；S.pannosa：桃和玫瑰； 和葡萄白粉病钩丝壳霉：葡萄，七叶树和椴树。
还需要治理因担子菌纲，特别是夏孢锈菌目引起的锈病而受到影响 的植物。约有4000种锈病真菌。最重要的锈病真菌和受影响的植物包括： 柄锈菌属：许多宿主如小麦和所有其它矮小谷物的锈病(禾柄锈菌)； 黄或条锈病：小麦，大麦和黑麦(条形柄锈菌)；叶或褐锈病：小麦和 黑麦(隐匿柄锈菌)；大麦的叶或褐矮锈病(大麦柄锈菌)；燕麦褐锈 病(禾冠柄锈菌)；玉米锈病(高粱柄锈菌)南方或热带玉米锈病(多 堆柄锈菌)；高粱锈病(紫色柄锈菌)；和甘蔗锈病(P.sacchari和屈恩 氏柄锈菌)。
柄锈菌属还在田地作物如棉花(P.stakmanii)，蔬菜如刁柏(天冬 门柄锈菌)和花如菊花(菊柄锈菌)，蜀葵(P.malvacearum)和snapdragon (P.antirrhini)中引起严重的锈病。胶锈菌属引起重要的胶锈菌瘿 (G.juniperivirginianae)和山楂胶锈菌瘿(G.globosum)。Hemileia 引起致命的咖啡叶锈病。(H.vastatrix)。多胞须菌属在玫瑰上引起锈 病，在覆盆子上引起黄锈病。
引起锈病并用本发明制剂可治理的其它真菌包括单胞锈菌属：豆科 植物(菜豆，蚕豆和豌豆)(数个单胞锈菌)和石竹属植物 (U.caryophyllinus)；柱锈菌属：松树，栎树和其它宿主的严重锈病，如白 松树锈泡病(C.ribicola)松树和栎树的纺锤形锈病(栎柱锈菌tusiforme 特异型)；东方疵斑病或松树-栎树锈病(栎柱锈菌virginianae特异型)； pine-sweet fern锈泡病(茶柱锈菌)；pine-Comandra锈病(C. comandrae)；和南方玉米锈病(C.strobilinum)。其它包括栅锈病属， 它引起亚麻的锈病(亚麻栅锈病)；鞘孢锈菌属，它引起松针的锈泡病 (紫菀孢锈菌)；裸双胞锈菌属，它引起黑浆果植物和覆盆子的橙锈病； 层锈菌属，引起强烈的破坏型的大豆锈病(豆薯层锈菌)；和疣双胞锈 菌属，引起桃的锈病。
还可以用本发明的制剂和方法预防并治理因在植物其它部分，如根 和果实集落化的生物体引起的侵染。对于影响植物根的真菌，如镰孢菌 属，曲霉属和轮枝孢属(包括棉黄萎轮枝孢和大丽花轮枝孢)，优选通 过叶应用本发明的制剂，通过转移使活性成分到达根或通过诱导系统获 得的抗性(SAR)来治理侵染。为了治理果实侵染，如黑斑，在果实发 育过程中或之后应用本发明的制剂，优选制剂施用到正在发育的果实 上。其它靶真菌生物包括Phragmidium spt；玫瑰双壳柄锈菌属； Sphaerotheca tannosa；Oibiapsis sicula；Phytophoya taraesitica；柄锈菌属； 链格孢属；Susaium spp；灰色葡萄孢；Sclerotinia Homoeocarca；Dutch Elm病害(Ceratocystis ulmi)和栎树枯萎(C.fagacearum)。还包括蓝 绿藻(Cyanobacteria)。特别需要治理产生fumonisins，富马酸和/或其 结构类似物的真菌。
本发明的制剂还用于抗昆虫，特别是直翅目；包括蓟马的缨翅目；包 括蚜虫，叶蝉，粉虱，蚧，蝉和介壳虫的同翅目的那些。本发明的理论 是对用本发明制剂处理敏感的昆虫是在其食管中有共生细菌的那些。因 此，用本发明制剂也可以控制除上述所列以外的有共生物质的昆虫。其 它靶生物体包括蜘蛛，特别是叶螨(节肢动物门)。其它昆虫靶包括鞘 翅目的那些，如南瓜十二星叶甲和棉花棉铃虫；和鳞翅目，包括苹果蠹 蛾。
特别需要治理葡萄中的根瘤蚜属侵染。葡萄根瘤蚜属的根形式 (Daktulosphaira vitifoliae Fitch)的一种毁坏性的葡萄昆虫。植物损伤 不仅是由于根瘤蚜属的取食，而且更主要的是由于二级真菌的攻击，所 述二级真菌不受杀虫剂的控制。通常在于宿主植物根一样深的地方发现 根瘤蚜属，这可能有8英尺或更深。因此为了治理葡萄中的根瘤蚜属侵 染，可以将制剂直接释放到植物根，例如通过将液体或固体制剂注射到 根周围的土壤中。另外，可以将所述制剂用于植物的叶或其它易接近的 部分，然后通过植物维管系统转移到根区或通过有SAR的诱导。如治理 白粉病和锈病一样，可以用转基因作物治理根瘤蚜属；表达式(1)化 合物的优选组织是根。
可以在不同的生长阶段，用式(1)的化合物治理根瘤蚜属。可以 将所述化合物配制成或分别施用于根瘤蚜属生长的靶特定阶段如，卵， 幼虫和成虫阶段。在田地和/或实验室条件下，用任何方法，如在处理后 评价根瘤蚜属的死亡率，取食，和/或弄空取食位点，或通过侵染藤的改 善情况均可以评价特定制剂和处理方法的效力。另外，通过本领域已知 的方法，分析代谢、转移和/或对制剂处理的反应中藤生理学状况，可以 评价特定制剂和处理方法的效力。也考虑正常试验的剂量，制剂和处理 时间以外的因素以确定根瘤蚜属物候学，植物物候学，植物健康，嫁接 愈合和栽培孪种(插枝和根茎)出现的情况。
本发明的方法和制剂也用于处理草皮的侵染。非感染病害的某些生 物通过竞争损伤草皮。在感染性病害使草皮变薄后，藻类经常通过占据 空地而损伤草皮。蓝-绿草藻(Ajanobacterla种)在过湿土壤的表面发 展成黑菌膜(scum)。藻类降低了空气和土壤之间的气体交换，而且还 可能在植物中诱发萎黄病。黑层是主要与高尔夫比赛绿化有关的生理病 害。草皮的沙含量高的应注意。另外，可以用本发明的制剂处理草皮真 菌病害。Sclerotinia dollarspot，腐霉属枯萎病和丝核菌属枯萎病是各种 草皮的致命病害，特别是小糠草。通过改变制剂的组分，应用方案，应 用体积和/或应用速率可以确定所述制剂对草皮的处理效力。可以在田地 和/或实验室条件下完成评估，考虑给定的环境条件，如湿度，温度，光 的质量和数量和强度，土壤类型和肥力，含水量灌溉等情况。通过比较 向顶转移和每天割草的保持和草叶的去除也可以确定制剂的保持能力或 活性。可以以不同的应用速率和浓度以及施用方案施用制剂以得到所需 的病害控制和植物毒性水平。含皂苷和式(2)和(5)的化合物的制 剂对于所述应用是优选的，式(3)，(4)和(5)的化合物更优选。
特别需要的是施用本发明制剂控制Sclerotinia dollarspot(Sclerotinia homeocarpa)。Sclerotinia dollarspot是一种在世界各地的的大多数草皮 种上均会发生的广泛的，持久且花费高的病害。有利于dollar spot的环 境条件包括高湿度和过滤水分的时间长。与这些环境条件相关的低氮肥 也会增加dollar spot的发病率。形成致密生长态的精致叶的草地的危险 特别大，dollar spot主要威胁深入细致管理的高尔夫比赛草地。还特别 需要用所述制剂控制因腐霉属引起的病害。由腐霉属引起的病害通常称 为腐霉属枯萎病，油斑，班枯萎病，冠枯和根枯。腐霉属也会引起种子 病害。所有草皮对腐霉属的攻击均很敏感，包括蔓生小糠草，用于高尔 夫比赛的大多数流行草地，和美国南部生长的新的小糠草。腐霉属的抗 性生物型通常对传统杀真菌剂的施用没有反应。通常在首次出现促进腐 霉属生长的条件之前或出现后叶面喷洒含皂苷的制剂。对于腐霉属枯萎 病，当气候很热而且潮湿，而且夜间也很热时，就特别需要。
本发明方法和组合物的另一优选用途是控制丝核菌枯萎病，通常称 为褐斑。当环境条件有利于其生长时，丝核菌枯萎病是一种特别迅速和 破坏性的病害。因此当气候炎热、潮湿，高氮肥率，致密叶生长和/或降 水频繁时，通常应施用所用的制剂。在草皮上控制丝核菌枯萎病很难， 而且传统杀真菌剂不能控制这种病。用本发明的制剂可以控制 St.Augustine草的丝核菌枯萎病。
特别需要的是治理和预防观赏花的蓟马，白粉病菌，黑斑，叶枯病 和甜瓜蚜虫侵染以及受这些害虫感染的其它植物。本发明的制剂特别用 于预防或处理玫瑰，圣诞树(如松树)和果树和果实。例如，所述制剂 用于处理桃抗蛀孔和使苹果树抗苹果蠹蛾侵染，使葡萄免于卷叶虫，根 瘤蚜，叶蝉，叶枯病，蓟马和白粉病菌的侵染。优选的制剂包括皂苷和 式(2)和(5)的芳香类黄酮醛，式(3)，(4)和(5)是优选 的。
一个实例是治理棉花中的棉芽侵染。最重要的种是棉蚜(Aphis gossypii Glover)。几乎棉花一生长出叶子，就有小、软体的淡绿色植物 虱飞到其上，然后开始繁殖。因此，应在棉花发育早期将本发明的制剂 施用到棉花上。喷小叶是优选的，因为蚜虫饲喂在地上。进行治理最重 要的时间是在冷，湿季节之前和/或期间，这时蚜虫很多足以阻碍植物并 使植物变形。
本发明还用于治理和预防晚期枯萎病。晚期枯萎病影响西红柿，马 铃薯，茄子和其它马铃薯科植物而且是因Phytophthora infestans侵染而 产生的。本发明制剂优选是在适中温度的潮湿期间施用，这时通常由于 孢子落在植物表面而开始发病。另外，也需要控制棉铃象鼻虫 (Anthonomus grandis Boheman)。损伤是由成象鼻虫和其幼或蛴螬引 起的。成虫通过咀嚼来刺棉蕾和棉铃。应将本发明制剂直接施用到植物 的该部分(棉蕾和棉铃)。
含皂苷的制剂也用于控制开花植物的授粉时间。例如为了防止或延 迟授粉，以足以驱走蜜蜂和其它授粉昆虫的量施用所述制剂。通过调整 制剂的残留性，可以控制抑制授粉过程的时间长短。另一方面，在需要 交叉授粉以施肥的植物中，如果授粉昆虫被所述制剂驱走或杀灭，应避 免在该期间施用所述制剂。特别是授粉种属的Vespidae包括群居的黄 蜂，马蜂，大黄蜂和胡蜂对本发明制剂敏感。
还需要用本发明的化合物处理Dermaptera(欧洲Earwigs(Forticula aureculatia))。蠼螋有极广泛的食物，而且以许多不同类型的植物物质， 包括花，蔬菜和果实(收获之前和之后的)为食。花簇，玉米穗丝珠心 和新蔬菜秧苗特别易受伤害。因此，例如通过叶喷洒到正在生长的植物 和/或被蠼螋感染后收获的植物部分，施用本发明的制剂。
特别需要用本发明的制剂控制微生物的生长，如在花瓶溶液中发现 的那些，收获后处理切花。含皂苷的制剂还可延长切花的花期，所述花 期部分取决于对花瓶溶液微生物，如细菌和真菌的控制，无论茎是在水 中，还是在向花(flours)提供营养源的部分上。用适宜于特定目的的任何 丰富可以完成切花的处理，如将切下的茎浸在本发明的所述制剂中和/或 将制剂加到花瓶溶液中或将整个切花浸在所述制剂中。可以在收获后控 制的生物体的实例包括因Botrytis cinerea Pers引起的Botrytis花枯萎病： Fr切花，特别是在温室生长的玫瑰和许多其它切花作物以及葡萄，因 B.cinerea引起的灰霉，延迟因B.cinerea，Rhizopus和Penicillium expansum引起的花以及水果如木莓，草莓，苹果，梨枯萎。含皂苷与式 (2)和(5)化合物的制剂是优选的。具体地说，含皂苷，肉桂醛和/ 或α-己基肉桂醛和吐温80的制剂是优选的。通过花、叶或柄的枯萎， 再水合，细菌生长和茎污染，以及收获后微生物和生理学堵塞的控制可 以评价制剂对于促进或防止切花花期的效力。
可以在其进入果实之前施用本发明化合物，攻击靶苹果蠹蛾(Cydia pomonella)的三个阶段，成虫，卵和新幼虫。为了这一应用，必需研制这 些生命阶段的敏感性图，以确定应用本发明制剂的最佳时间。这要试验 卵，新幼虫和成虫对制剂的敏感性，在初次施用后，新鲜施用保留的残 余物。
本发明的皂苷和类黄酮醛还用于控制San Jose介壳虫，它是一种奇 形的固定昆虫。象蚧一样，介壳病害生物比动物更相近。有两个蚧科： 软蚧(球虫亚纲)倾向于以花园植物为食，而盾蚧(盾蚧科)更喜欢果 园作物。球虫亚纲亚科的成员，它们使自己粘附在许多不同植物的叶， 果实和树皮上。因此，本发明的制剂优选施用于敏感植物的叶，果实和 树皮上。
本发明的方法和组合物还用于控制粉蚧，它们与蚜虫，木虱和根瘤 蚜相似。粉蚧从植物中吸取汁并传播病害，它们分泌的蜜露引起影响光 合作用的烟真菌的生长。通过叶施用控制烟真菌，所用的量应足以在植 物中诱导SAR以便控制在昆虫食用的植物的远区域吸汁昆虫的生长。
除治理宿主植物外，还可以用本发明的制剂处理种子。还可以将粉 末制剂洒在种子上(参见美国专利4978686，例如制剂可吸收的无机材 料)或将种子混在植物底物如蛭石中。种子也可从转基因作物获得，其 中式(1)的成分可在种子中表达，优选优先在种子中。从处理过的种 子在无菌条件下生长的秧苗不易感染真菌和昆虫。另外秧苗也可用本发 明的制剂处理。在某些情况下，需要调整处理制剂以降低与处理有关的 植物毒性，由于嫩枝更可能表现产植物毒性症状。
下列实施例用于说明本发明，但不具有限制性。
                   实施例 材料和方法
下列实施例中所用的化学品来源于：肉桂醛，Spectrum化学公司， 新泽西；松柏醛，ANPI化学公司，英国；土温80和碳酸氢钠，Spectrum 化学公司，格林纳达，加拿大；α-己基肉桂醛，Firmenich，Plainsboro，新 泽西；皂苷，Danco公司，Fresno，加拿大。
                  实施例1
             栽培玫瑰白粉病的治理
A.盆栽玫瑰.对八株栽培玫瑰进行试验，观察肉桂醛/碳酸氢钠制剂 对锈病和白粉病的效果。所用栽培作物包括未命名Moss(Moss)，Galica， Rosette Delize(Hybrid Tea)，Rosa Rugosa Rubra(Rugosa)，Abel Morrison (Hybrid perpetual)，John Laing，Betty Prior和Rosw de Roi。选择五株(5) 盆栽玫瑰(Moss，Galica，Hybrid Tea，Rugosa，和Hybrid perpetual)，按照 Parlrs和Nelson(上述)估算白粉病、锈病和孢子病(仅对Moss，Galica 和对照植物评价孢子病)的等级。在0-5等级(其中0＝没有白粉病锈 病/孢子病害，1＝1-25，2＝26-50，3＝51-75，4＝76-90，5＝＞90％染有病害的总 叶数/丛)中，Moss和Galica作物是5。Hybrid Tea和Hybrid perpetual 的等级估算为3，Rugosa的等级估算为1。蜗牛和Galica还染有相当于 5级的锈病。
每株作物接受100毫升肉桂醛制剂的叶面喷施，该1000克制剂含5 克肉桂醛，80克碳酸氢钠，10克土温80，剩余为水。此外，还从第一 次用肉桂醛/碳酸氢钠治理的当天开始，将250毫升0.01％(v/v)的10°白利 糖度皂苷提取液水溶液施用于每株盆栽植物，施用一周。对照植物则不 接受治理。通过八周后一整周的观察，发现单次治理就根除了白粉病、 锈病和孢子病，但相比之下，对照植物的白粉病、锈病和孢子病的病害 等级仍分别为5、3和4。并且，处理似乎还诱发了系统性抗性。未观 察到植物毒性。
B.田地生长的玫瑰.设计的另一个试验是在同一时期(季节)和相 同环境条件下评价肉桂醛/碳酸氢钠对田地生长的切花玫瑰的白粉病控 制作用。试验田中的白粉病和锈病害率较高，无需另外接种提供疾病压 力。在该研究中，使用John Laing，betty Prior和Rose de Roi栽培品种。 从一行十六株中选择八株John Laing加以治理。其它各种植物从各行的 第一株植物开始治理。类似地，从六株Betty Prior植物中选择三株加以 治理，同样从四株Rose de Roi植物中选择两株加以治理。对选定的每株 作物进行单次叶面喷施(约100毫升)治理，所喷施制剂每1000g含肉 桂醛(5g)、土温80(80g)、碳酸氢钠(8g)，剩余为水。植物的平均间距是 0.86米。病害等级与评价盆栽作物的白粉病相同。对照植物未进行治理。 无风和确实受到保护的喷雾方法控制了喷雾的飘流。John Laing作物是 幼嫩的，45天的植物，白粉病等级为5。Betty Prior作物是较老的(≥240 天)，白粉病等级为3，并预先喷施了Eagle(120天前)；Rose de Roi 是240天的植物，白粉病等级是2，锈病等级也为2(常用上述相同标 准)。通过与未治理的对照组相比较，观察治理后每株植物形成的白粉 病和锈病害，测定诱发的系统性抗性。对各株植物进行每周评述。在最 后的田地里观察每株植物，测定该治理方案对生长率的影响。
在五周试验结束时，除未治理的对照组和再感染的三株Betty Prior 植物的白粉病等级为3外，所有植物都没有白粉病。也未观察到植物毒 性作用。所有植物的新生长都超过了未治理的对照组。
计算每组植物的疾病控制平均百分数(MPDC)。对白粉病的结果 如下：John Laing，98.3％；Betty Prior，64.3％；Rose de Roi，100％。三种玫 瑰对白粉病的平均百分数是90.7％。仅对Rose de Roi评价了锈病，该平 均百分数是85.0％。在温室和田地条件下，对白粉病的有效杀真菌剂提 供的MPDC应≥70％，而对锈病的MPDC应≥65％。
喷施含肉桂醛和碳酸氢钠的溶液并同时喷施皂苷可维持盆栽玫瑰或 田地玫瑰不得白粉病和锈病的时间达56天，而仅喷施水的则无此效果。 经治理的植物还可保持没有蚜虫。据报道平均喷施Rubigon约20天可诱 发玫瑰对白粉病的系统性抗性。对玫瑰喷施肉桂醛和松柏醛的溶液或含 碳酸氢钠和肉桂醛和/或松柏醛的乳液测得的平均疾病控制率约为70％。 在平行实验中，Benomyl给出的平均疾病控制率约为80％。
                  实施例2
          用皂苷和松柏醛治理玫瑰上的真菌和昆虫
使用实验玫瑰园中感染玫瑰的六株。用两种松柏醛制剂中的一种治 理John Laing(Hybrid perpetual)和两株Londonderry的Marchionese(Hybrid Perpetual)。低剂量治理(T1)使用的制剂每1000g含松柏醛(5g)，皂苷(0.86 毫升10°白利糖度的皂苷溶液)(10g)和H2O。高剂量治理(T2)使用的制剂 每1000g含100g松柏醛，皂苷(0.86毫升10°白利糖度的皂苷溶液)，余 量为H2O。见表1(下)。
采用Paulus和Nelson(上述)等级体系评定植物的白粉病和锈病等 级。每株植物(P1至P6)接受约100毫升下表所示的治理喷施制剂。 对照植物仅喷施水。计算治理前和治理后等级的变化，以此作为上述的 疾病控制平均百分数(MPDC)。            表1      植物-治理/剂量安排 治理/剂量          植物  T1-低          P1，P4，P6  T2-高          P2，P3，P5
                   实施例3
                 对玫瑰白粉病的治理
用肉桂醛制剂，皂苷及肉桂醛和皂苷组合制剂进行三次治理实验， 评价它们对已知易得白粉病的田地生长玫瑰的作用。在用杀真菌剂治理 前通过变种随机阻断植物。在下列三次实验中，每次使用两种植物。在 实验1中，使用Reichsprasident von Hindenbburg(Bourbon)和Ostar Cordel (Hybrid Perpetual)；在实验2中，使用Rosa Gallica(Apothecary Rose)和 Deuil de Paul Fontaine(Hybrid Moss)。在实验3中，使用Comte de Chambord(Portland)Madame Pierre Oger(Bourbon)。实验1评价肉桂醛的 作用，实验2评价皂苷的作用，实验3评价肉桂醛与皂苷的组合作用。 每株植物接受单次叶面喷施100毫升，然后采用Paulus/Nelson等级标准 (同上文)评价白粉病。在临治理前和治理后4天采用该标准评价植物。
                     实施例4
     仅用皂苷和/或肉桂醛或α-己基肉桂醛治理葡萄根瘤蚜 取食位点定位实验
通过成虫和蛹死亡实验和卵孵化实验测定生理过程破坏导致的死亡 率。孵化后，新昆虫需保证有安全可靠合适的取食地。如要昆虫的生命 循环继续，该活动必须成功。研究表明约80％葡萄根瘤蚜的死亡发生在 该活动中。低剂量浓度的制剂通过破坏昆虫的“寻求和识别取食地”的 行为可保护葡萄根。采用下列方案评价全部三种类型的作用。 成虫和蛹的死亡实验
使约24枚葡萄根瘤蚜卵在普通切除的葡萄根上生长30天。在约30 天时，一些昆虫仍是蛹，而另一些已是成虫。在该过程中，取走新的卵。 将感染昆虫的根在实验制剂中浸泡6秒钟，然后在空气中晾干。5天后 测定活昆虫(通过生长、产卵或肢体运动)的百分数。如果昆虫弃离其 取食地，则认为死亡。在起始实验中，在肉桂醛或α-己基肉桂醛水溶 液(即2％肉桂醛)中，皂苷剂量为20,000ppm。使用不含其它添加剂 的水为阴性对照，使用250ppm马拉硫磷(malation)水溶液为阳性对 照。 卵孵化实验
在用100μl溶液处理过的50×9mm密封塑料培养皿中的滤纸 (Whatman#1，直径5.5cm)上分设60枚混合年龄组的葡萄根瘤蚜。将 400μl选定浓度的实验制剂加到滤纸皿中，盖上培养皿的盖并放在塑料 盒中。6小时后，将盒子放在24℃的隔离室中。每组10枚卵。一周后， 测定孵化百分数。在起始实验中，在各种剂量下，用一组卵评价在6％ NaCHO3和2％土温80中含肉桂醛的皂苷(0.86ml 10°白利糖度的皂苷 溶液)。实验重复进行三次。7天后评价制剂的作用，计数死在壳中的 蛹(DIS)或未孵化完全的卵(IH)数(即总死亡数)。100ppm肉桂醛时，有 88％的卵死在壳中，剩余12％未孵化完全。往100ppm的制剂加入皂苷 可将死在壳中蛹数提高到93％。仅用水处理的葡萄根瘤蚜卵全部孵化； 那些用Carbofuran(10ppm)或马拉硫磷(250ppm)处理的组，100％的蛹都 死在壳中。
在实验室生物鉴定中还使用含或不含肉桂醛(CNMA)的皂苷(0.86 ml 10°白利糖度溶液)处理葡萄根瘤蚜卵。以不能使卵壳开始破裂表示 死亡。评价带蛹和成虫的根浸泡处理7天后的EC50和LC50。
                   实施例5
           蚜虫，叶螨和粉虱的治理方案
如下测定皂苷与肉桂醛和/或松柏醛对抗黑豆蚜虫，fabae蚜虫，两 点叶螨，红叶螨和银叶粉虱，Bemisia argentifolii的活性。 培养皿的生物测定
每个培养皿(60mm直径)用溶于水的特级类黄酮醛(如10- 100ppm)水溶液和/或从Y.schidigera提取的10°白利糖度皂苷系列稀释 液(0.001％-1％(v/v)水溶液)处理，然后使其干燥。在每个培养皿中放 入每只节肢动物的20份样品(重复10次)。将和处理过的盘接触3小 时后的死亡率与仅用稀释液处理的培养皿中的节肢动物相比较。 植物叶面的生物测定
植物生长于温室中的7.5mm盆中的盆栽土壤中。棉花作物用于鉴定 螨和白蝶，甜菜用于鉴定蚜虫。当植物达到3叶阶段时，用60只确定的 节肢动物侵染(重复6次)。使昆虫/螨安居并喂养。向植物喷施100- 2000ppm的肉桂醛或α-己基肉桂醛或者0.1-2g/l的Y.schidigera的10°白 利糖度的皂苷提取物0.05％-1％(v/v)水溶液，所述水溶液含或不含100- 2000ppm的肉桂醛或α-己基肉桂醛，或者0.1-2g/l。植物用高塑料笼(5 mm高×10mm直径)覆盖。3天后，测定喷施了试验制剂的植物上昆 虫/螨的死亡率，并将其与仅喷施水的植物上昆虫/螨的死亡率进行比较。
                   实施例6
                线虫侵染的治理
各种线虫都会侵染植物组织，包括茎和球茎线虫(Ditylenchus dipsaci) 和根结线虫(Meloidogyne spp.)。用各种含皂苷和/或肉桂醛的制剂治理茎 线虫(Ditylenchus dipsaci)的试验如下。 1.茎线虫
通过将组织切下放到网底烧杯中并将网底烧杯悬浮于盛水的烧杯中 从小球茎大蒜获取茎线虫。线虫从组织中移出并通过网沉到烧杯底部。 除去上层的水，将剩在杯中的线虫转移到可透明玻杯中，实施如下治理 方案。测量出20mm×20mm×20mm的空间，将透明塑料盒划分为开 放的顶室。在室温(19℃)，将0.5ml的自来水吸移到各室中。使用粘 在解剖针上的睫毛处置每只动物，在每个室中放入十条线虫。然后往各 室中加入一半体积的测试溶液(含或不含肉桂醛或α-己基肉桂醛(100- 2000ppm)的0.05％-1％(v/v)的10°白利糖度的皂苷提取水溶液)。将水加 到对照池中。使用双目显微镜观察，监视各室中的线虫存活。加入溶液 后1，5，10，20，30和60分钟记录存活的动物数。若线虫不动并 对触动没有反应，则认为是死亡。该试验重复进行三次。 2.根线虫
a.培养皿的测定
在双盲研究中，测试含或不含肉桂醛的皂苷对抗根结线虫， Meloidogyne javanica的活性。使线虫直接与制剂接触，并在24小时的时 间内用肉眼和探针估计死亡率。采用溶液栽培学生产Meloidogyne javanica。收获线虫并在24小时内使用。
将0.07ml水中的约100条线虫吸移到syracuse培养皿(Fisher)并立即 将1ml测试制剂吸移到各培养皿中。然后将培养皿放在塑料袋内以保持 润湿，防止蒸发。对每种测试制剂溶液使用4个syracuse培养基。7天 内，每隔24小时，测定溶液，根据线虫的形态学完整性和触动情况，评 价最早计数的10条线虫的存活或死亡。运动的线虫计为存活。
载体(2％土温80，6％NaCHO3)中肉桂醛浓度超过100ppm时，在 24小时，100％的线虫死亡。该浓度为10ppm时，在24，48，72，96，108，132 和156小时，分别有0％，15％，17.5％，22.5％，27.5％，52.5％和52.5％的线 虫死亡。载体中肉桂醛浓度在1ppm和0.1ppm时对死亡率没有影响。 在所测试的载体中浓度最低(0.1ppm)的肉桂醛中，加入Yucca shidigera 皂苷的10白利糖度浓缩液的1∶60的稀释度的溶液，则在24小时，线虫 的死亡率为100％。但仅使用皂苷时，没有相同的作用。EtOH(95％)在24 小时全部杀灭线虫。观察到载体对死亡率的最小影响为：在72小时， 2.5％；在108小时，5％。
b.植物叶面的生物测定
试验本发明的制剂降低葡萄藤经根结、环、残根和包缠损害线虫侵 染的能力。将葡萄园中的葡萄藤(Harmony根茎)用1000ppm或3000ppm 肉桂醛的皂苷(0.86ml 100白利糖度溶液)溶液，市售的抗线虫剂 Nemacur或空白配方处理。在处理时和处理后30和60天时测定线虫的 侵染程度。
                  实施例7
    对草莓红核病(Phytophthora Fragariae)的治理
草莓红核病是由草莓红根腐病真菌引起的，该种真菌通过感染的种 植材料或感染碎片的长期生存的卵孢子侵染的土壤传播。如下试验各种 含皂苷和肉桂醛或α-己基肉桂醛的制剂。将Phytophthora Fragariae感染 的浸渍草莓根与侵染堆肥充分混合并使其腐败4-6周，产生十分腐败 的接种物以供治理。将接种物分为1kg每份并与不同浓度的1500ml试 验制剂混合。治理10分钟后，将堆肥放在25mm目的筛中在流动自来 水下漂洗，以除净试验制剂。然后将堆肥放入9-cm塑料盆中，在每盆中 种植4株草莓。每次治理使用5盆。使植物生长于控制在15℃和日长为 18小时的环境中；使堆肥保持潮湿，促进其感染。将盆放在格子中以避 免在治理中交叉感染。
9周后，洗去草莓根的堆肥，通过纵向切开根部寻找红色中柱和发腐 或变棕色的根来检查感染迹象。经显微镜检查根部切片确认Phytophthora Fragariae卵孢子存在。
                  实施例8
            玉米上真菌病原体的治理
评价用含或不含肉桂醛或α-己基肉桂醛的皂苷进行的三次治理试 验。所用皂苷是0.05％-1％v/v的10°白利糖度的Y.schidigera皂苷提取 液水溶液。对已知易被病原性真菌侵染的田地生长玉米进行试验。在杀 真菌剂处理前，用变种随机阻断植物。每株植物接受单次叶面喷施至流 溢，然后评价真菌感染(在Paulus和Nelson下)。根据Paulus/Nelson(上 述)等级标准记录每株植物的变化，评定真菌感染。在临治理前和治理后 4天依该标准评定植物。
                   实施例9
                  Pitch Canker病
Pitch Canker病，由真菌Fusarium subglurinans引起，特征为被侵染 树的嫩枝、树枝、外露根和树干有树脂样渗出。自1986年在加利福尼亚 发现Pitch Canker病原体开始，该病原体的宿主和地域范围扩大了许多。 最近在墨西哥和日本又发现了该病原体。
使用不同浓度和配制的含或不含肉桂醛的皂苷进行双盲生物测定。 测定是基于对Fusarium subglurinans f.sp.pini放射性生长的抑制。将8ml 制剂(浓度未知的)吸移到200ml融化的2％土豆葡萄糖琼脂(PDA)中， 并将该混合物分配到五只塑料培养皿中(25ml皿)。在四只培养皿的中央 分别用琼脂塞转移接种生长Fusarium subglurinans f.sp.pini的PDA培养 基，作为对照的第五只培养皿未进行接种。对每种肉桂醛制剂重复该些 步骤。如上述接种的四只PDA培养皿补加5ppm苯菌灵作为阳性对照； 阴性对照是四只接种F.subglurinans但未进行处理的PDA培养皿。将所 有接种和未接种的培养皿在18℃培养五天，之后测量菌落直径。
表10显示了生物测定的菌落直径的原始数据平均值，表11比较了 含或不含皂苷(0.86ml 10°白利糖度的Yucca schidigera提取物)的各种浓 度的CNMA对菌落直径的影响。
                表10
  Fusarium subglurinans f.sp.pini的放射性生长
                   (平均值)*
     治理剂                        菌落直径(cm)
   PDA(未补加)                     4.038
   10ppmCNMA                       4.363
   100ppmCNMA                      4.238
   100ppmCNMA+皂苷                 4.300
   戊二醛2％                       3.663
   5,000ppmCNMA+皂苷               2.913
   10ppmCNMA+皂苷                  3.600
   H2O                            3.738
   2,500ppmCNMA                    3.513
   2,500ppmCNMA+皂苷               3.600
   皂苷                            4.138
   5,000ppmCNMA                    2.908
   空白配方                        4.380
   12,500CNMA+皂苷                 0.000
   25,000CNMA                      0.000
   5ppm苯菌灵(阳性对照)            0.000
   12,500ppmCNMA                   0.000
   25,000ppmCNMA+皂苷              0.000
               表11
        F.f.sp.pini的放射性生长
                治理剂
                 CNMA         CNMA+皂苷(.86ml)
   ppm           菌落直径(cm)      菌落直径(cm)
    10           4.36         3.60
   100           4.24         4.30
 2,500           3.51         3.60
 5,000           2.91         2.91
12,500              0            0
25,000              0            0
    对照            菌落直径(cm)
 2％戊二醛             3.66
 H2O                  3.74
 5ppm苯菌灵            0
 PDA(未补加)           4.04
                  实施例10 协同剂的生物测定
按照本文所述方案测定化合物的协同作用。将有效量的协同剂试验 化合物单独应用或加入与系列稀释度和浓度配制的已知制剂混合，所述 浓度范围是从不含协同剂试验化合物的对照水平到超过最佳浓度许多的 浓度。基本按照上述实施例的方案，对给定的病原体和/或植物宿主，测 定含或不含协同剂化合物系列稀释液的每种制剂和组成的抗致病和/或 植物毒性作用。由对照剂量水平和饱和剂量水平计算体外和体内最佳剂 量范围，该范围在可调节变化过程中会有所增加，但所得作用不会增强。 通过与不含协同剂试验化合物的对照进行比较，测定每种试验制剂的有 效性并计算MDIC和MDIT。对协同剂化合物的测定得出：特定制剂的 评价疾病抗性至少为约60％或更高，最佳为约70％或更高；和/或植物 毒性等级为2或更低，最佳为1或更低。 皂苷的生物测定
将皂苷或皂苷提取物单独应用或与已知制剂稀释液混合，所述稀释 液浓度范围是从0％皂苷和100％其它组分的对照水平到各组分的饱和 水平。按照上述实施例的方案，测给定的病原体和/或植物宿主对含或不 含协同剂化合物系列稀释液的每种制剂和组成的抗致病和/或植物毒性 作用来检测制剂的协同作用。通过与含0.05％-1％v/v10°白利糖度皂苷提 取物的皂苷提取液对照的相当活性比较，测定皂苷的有效量。计算体外 和体内最佳剂量范围。通过与不含皂苷的对照进行比较，测定每种试验 制剂的有效性并计算MDIC和MDIT。对具协同作用的皂苷的测定得出： 特定制剂的评价疾病抗性至少为约60％或更高，最佳为约70％或更高； 和/或植物毒性等级为2或更低，最佳为1或更低。
                  实施例11
         皂苷和/或肉桂醛对蜗牛的作用 材料和方法 实验1：
采用底物接触法进行接触灭螺生物测定研究。对于液体制剂，将滤 纸片(直径15cm)在试验溶液中浸泡2秒钟，然后在空气中干燥。对于干 性制剂，将底物放在滤纸片上至厚度为0.5cm。干性底物(如普通皂苷 纤维)用10ml制剂润湿。将滤纸片放在纸板底部(直径25cm)，纸 板边缘用凡士林和NaCl封住，防止动物从板跑失。在每次重复试验中， 将从Connecticut Valley Biolgical购得的四只蜗牛(Sephia hortensis)和从 Carolina Science购得的两只蛞蝓(Deroceras reticulatum)蝓放在处理过的 或堆放有底物的滤纸片上(重复五次)。所设计的实验制剂为： 制剂和组合物编号 #1    F1＝2％肉桂醛，  2％T 80，  6％NaCHO3#2    F2＝皂苷(10°白利糖度)和F1(1∶9) #3    F3＝皂苷纤维+F1(润湿用-10ml) #4    F4＝皂苷纤维+普通小麦(50/50w) #5    F5＝皂苷(10°白利糖度)(润湿周-10ml)+小麦粉(Wheal Mill Run) #6    F6＝皂苷纤维 #7    F7＝空白配方(CNMA)(润湿用-10ml)和小麦粉(Wheal Mill Run) #8    F8＝H2O#9    F9＝Lilly Miller“SSIKB”(阳性对照-四聚乙醛产品) #10   F10＝CNMA(包囊的)的油性(Calgene cc-22F)乳液，包囊的
  CNMA@31.4+1.2％w/w淀粉蔗糖壳(85/15) 实验2：
如下评价肉桂醛制剂成分的活性。用产品或成分将直径7.5cm的滤 纸片完全润湿，并使其在空气中干燥。将滤纸片放在“Mason1/2品脱” 玻璃广口瓶的底部。在每个瓶中放2只蜗牛和1只蛞蝓蝓，共放5瓶。 瓶口用干酪布封住，但要留一小口以供呼吸。在48小时时进行观察。 结果和讨论
一般来说，正如表12所示，含肉桂醛的制剂是有效的灭螺剂，48 小时时，显示的死亡率为100％。使用F1制剂及基于皂苷的配方获得的 死亡率都比阳性对照(F9-“SSIKB”)要高。粗皂苷纤维(F3-含F1) 与CNMA结合在实验初期就可获得很高的百分死亡率，据第2位的是包 囊CNMA，它在30分钟内就可获得100％的死亡率，也是非常致命的。 表13显示实验2的制剂组成、阴性对照和相对百分活性数据。
                             表12
                   数据分析-蜗牛和蛞蝓             治理后的死亡百分率@小时     配方    0    .5      2.5     24     48   #1 F1(2％) 蜗牛 蛞蝓蝓    0    0    0    0     50     100    50    100    100    100   #2 10°B+F1 蜗牛 蛞蝓蝓    0    0    0    0     25     50    50    100    50    100   #3 皂苷纤维/F1 蜗牛 蛞蝓蝓    0    0    0   100     75     100    75    100    100    100   #4 皂苷纤维+ M.R. 蜗牛 蛞蝓蝓    0    0    0   50     100     100    100    100    100    100   #5 10°+M.R. 蜗牛 蛞蝓蝓    0    0    0    0     50      0    75    100    100    100   #6 皂苷纤维 蜗牛 蛞蝓蝓    0    0    0    0     75     100    75    100    75    100   #7 CNMA空白+ M.R. 蜗牛 蛞蝓蝓    0    0    0    0      0      0     0    100*     0    100*   #8 阴性对照 (H2O) 蜗牛 蛞蝓蝓    0    0    0    0      0      0     0     0     0    100*   #9 阳性对照 (SSIKB) 蜗牛 蛞蝓蝓    0    0    0    0      0      0    50    100    75    100  #10 包囊CNMA+ 油 蜗牛 蛞蝓蝓    0    0   100   100     100     100    100    100    100    100 *动物接触培养皿边缘(NACL) 实验3：
评价含或不含肉桂醛(10-25,000ppm)的皂苷(0.86ml 10°白利糖度 溶液)使苔藓干燥(dessication)的作用。将Whatman滤纸片(7.5cm)放 在每个培养皿的底部。把3ml水吸移到滤纸片上。从盆栽物核心取出苔 藓段(3.5cm×3.5cm)并将其放在每个培养皿的滤纸片上。在每张滤纸片上 喷施2ml试验溶液。将培养皿放在室温下，在施用后24，48和60小时 时观察干燥面积。表13显示了该结果。一般来说，用肉桂醛制剂处理的 苔藓显示的干燥百分数随时间而增大。无论仅是皂苷或皂苷与肉桂醛结 合都是有效的，但在仅施用肉桂醛时也确实观察到干燥面积的增加。
表14的数据显示了制剂成分的百分活性。
                   实施例12
     含肉桂醛和皂苷制剂的植物毒性和生物测定
A.植物毒性试验
对三种温室作物进行植物毒性试验，测定用皂苷(作表面活性辅助 剂)和CNMA替代聚山梨醇酯(如土温)的相容性。下面的概述分析结 果：
                 表13
             苔藓属植物(苔藓)
             干燥百分数(随时间的)
                       0 24小时.48小时.60小时.
苔藓：
DICRANUM         F1    0    15    40     90
                 F2    0    10    40     80
                 F3    0    15    50     85
                 F4    0     5    15     25
                 F5    0     6    18     26
SPAGNUM
(BOG苔藓)        F1    0    20    60     90
                 F2    0    15    55     75
                 F3    0    20    60     85
                 F4    0     8    12     20
                 F5    0     9    12     22
WOODLAND：       F1    0    20    60     85
                 F2    0    10    40     70
            F3    0    20    50    80
            F4    0    10    15    20
            F5    0    12    18    28   F1 CNMA2％   F2 SAP(10°白利糖度)   F3 CNMA2％+SAP   F4 -对照H2O   F5 空白配方
                   表14            苔藓(60hrs)        制剂 无    干燥％     70 T80     10 NaCHO3     20 T    80      + NaCHO3     25 配方     90 阴性对照     10
1.小玫瑰(Sunburst)分别采用三种治理方法对四株盆栽小玫瑰 (Sunburst)进行处理；0.5％CNMA加0.05％皂苷，0.25％CNMA加 0.025％皂苷和仅用水作为对照。在实验室使用喷雾塔对植物进行喷施， 将所有植物都喷至流溢。喷施后，观察植物五天。在老叶、新生叶或花 瓣上均未观察到植物毒性，表明该施用比例对小玫瑰是安全的。
2.菊花分别对三株盆栽菊花用0.5％CNMA加0.05％皂苷， 0.25％CNMA加0.025％皂苷和仅用水作为对照进行处理。按上述对植物 进行喷施。在之后的五天观察中，未观察到对叶和花瓣的植物毒性，表 明该施用比例是安全的。
3.一品红分别对两株盆栽一品红用0.5％CNMA加0.05％皂 苷，0.25％CNMA加0.025％皂苷和仅用水作为对照进行处理。在其后的 五天观察中，观察到高施用比例(0.5％CNMA，0.05％皂苷)对新生叶具有 植物毒性。未观察到低比例(0.25％CNMA，0.025％皂苷)对新生叶的毒性 症状，表明低比例是施用安全的。
B.有害昆虫的生物测定
1.两点叶螨通过将大约相同数量的受叶螨侵染的玫瑰叶放在底 部垫有Whatman滤纸的培养皿中测定螨。分别对放有螨的四个培养皿中 的玫瑰叶两面喷施三种处理液：0.5％CNMA加0.05％皂苷，0.25％ CNMA加0.025％皂苷和仅用水作为对照。将处理过的螨放置24小时， 然后计数并记录存活的螨数。结果如下：对照培养皿(仅喷施水)，53.25± 15.57(均值±标准偏差)；0.25％CNMA，6.75±1.18；0.5％CNMA，0.75± 0.48。该结果表明直接喷施含有CNMA和皂苷的制剂可高度有效地对抗 螨。
2.西部花蓟马虫通过将大约相同数量的受蓟马虫侵染的玫瑰叶 放在底部垫有Whatman滤纸的培养皿中鉴定蓟马虫。分别对放有螨的四 个培养皿中的玫瑰叶两面喷施三种处理液：0.5％CNMA加0.05％皂苷， 0.25％CNMA加0.025％皂苷和仅用水作为对照。将处理过的蓟马虫放置 6小时，然后计数并记录死亡的蓟马虫数。结果如下：对照培养皿(仅喷 施水)，1.4％±0.85％(均值±标准偏差)；0.25％CNMA，53.2％±11.8； 0.5％CNMA，87.2％±2.79。该结果表明直接喷施含有CNMA和皂苷的 制剂可高度有效地对抗蓟马虫。
3.棉芽使用整株未开花的菊花植物鉴定棉芽。用每种处理剂处 理两株植物，将两片叶子作为样品测定存活和死亡的棉芽数，所述两片 叶子一片摘自植物顶端，另一片摘自植物底部。施用的三种处理剂是： 1.0％CNMA和0.5％皂苷，0.5％VNMA和0.25％皂苷及仅是0.5％皂苷。 对整株植物进行喷施，直至顶端和底部的叶面流溢。结果以发现的死亡 棉芽比率表示。结果如下：对照植物(仅施用0.5％皂苷)14.8％±4.5； 0.5％CNMA48.3±16.1；1.0％CNMA72.0％±11.2。该结果表明直接喷 施CNMA可高度杀灭蚜虫。
                 实施例13
     皂苷，肉桂醛和α-己基肉桂醛的残留活性
两次独立的实验表明肉桂醛(CNMA)和α-己基肉桂醛(HCA)都具有 残留活性。在第一个实验中，将2毫升两种浓度的CNMA(0.3％和1％) 喷施在滤纸上。将2毫升水也喷施在滤纸上，作为阴性对照。24小时后， 将2毫升水喷施到处理和对照滤纸上，然后干燥30分钟。放上30条蓟 马(Frankliniella occidentalis)并在1小时后观察F.occidentalis的数目。 计算每种处理剂的死亡率。
72小时后，将处理过的滤纸翻转过来，仅对照滤纸1％CNMA处理 的滤纸喷施2ml水，并使其干燥30分钟。将30条蚜虫放在两片处理过 的滤纸上，1小时后观察死亡的F.occidentalis数并计算每种处理的平均 死亡率。使用α-己基肉桂醛进行类似的鉴定。再润湿的滤纸随时间的平 均死亡率比未再润湿滤纸的要高。这些实验表明处理过的滤纸的再润湿 在与蓟马接触的持续致命性作用中起一定作用。 持续接触试验
为进一步确定皂苷、CNMA和HCA的残留活性，将昆虫限制在两 种代表性的表面上。用玻璃代表无孔表面，滤纸代表有孔表面。将2ml 配方中含或不含类黄酮醛的五种不同浓度的皂苷喷施到滤纸片(直径9 cm)或玻璃培养皿的底部(直径9cm)。作为对照，施用2ml不含皂苷的 配方液。试验前放置24小时使干燥。在试验的第7，14，28和56天，将 一组培养皿和滤纸用2ml水再润湿，平行的另一组则不再润湿。将昆虫 持续限制在存放表面，按计划计数被存放表面杀灭的昆虫数。如果存放 表面在48小时内未杀灭昆虫，则不再继续其后的研究。
               实施例14
  在转基因植物中过度产生类黄酮醛
由生产肉桂醛的植物组织制备20μgpolyA RNA并合成cDNA。将它 们部分克隆到λ噬菌体-ZAPII载体(一种市售克隆载体)中。使用寡核苷 酸探针筛选至少500,000个重组体，所述探针是从得自GenBank克隆的 CA4H和CAD基因保守序列设计的，或从目标宿主植物纯化的蛋白肽序 列而设计的。选择高度杂交的克隆，用于再筛选cDNA文库。分析所得 克隆的序列以便能将适宜的基因序列引入以反义或有义方向植物表达盒 中。采用下面公开的直接转化方法将反义和有义构建体导入根癌农杆菌 LBA4404中。采用熟知的方法(Horsch等(1985)科学，277：1229-1231)转 化烟草(N.tabacum种Samsun)叶盘。采用PCR或杂交方法鉴定包含CA4H 或CAD构建体的植物，然后筛选用于下步分析。
采用公知的分析方法测定转化植物和未转化对照植物物质中的 CA4H和CAD酶活性。选择与对照植物的CA4H和CAD活性相比降低 不足20％的植物用于下步分析。将低CA4H活性植物与低CAD活性植 物进行杂交。并采用PCR选择遗传了两种基因构建体的子代。采用公知 的普通方法分析CA4H和CAD活性被抑制的植物的类黄酮醛产生。
                 实施例16
        在微生物体系中类黄酮醛的产生
使用从六周龄烟草茎中提取的RNA产生cDNA文库。制备20μg polyA RNA并合成cDNA。将它们部分克隆到λ噬菌体-ZAPII载体(一种 市售克隆载体)中。采用Goffner等在植物生理学(1994)106：625中所述的 方案，使用寡核苷探针筛选至少500,000个重组体，所述探针从六周龄烟 草茎组织纯化得到的CCoAr蛋白的肽序列而设计的。选择高度杂交的克 隆，用于再筛选cDNA文库。分析所得克隆的序列以确定全长度cDNA 插入序列并将适宜CCoAR基因序列引入酵母表达载体 pMTL8110(Faulkner等(1994)基因，143：13-20)。类似地，将Rhodosporidium toruloides苯丙氨酸氨裂解酶编码序列(PAL；基因库位点RHDPAL)和4- 香豆酸欧芹酯：CoA1连接酶(4CL；基因库位点PC4C1AA)引入相同的酵 母表达载体。采用公知的电穿孔方法(Becker和Guarente，酶学方法，194： 182-187；Simon(1993)酶学方法，217：478-483)，用PAL，4CL和CCoAR构 建体转化啤酒酵母。在缺乏亮氨酸的基本培养基中选择转化体。采用PCR 鉴定携带全部三种基因构建体的转化体，并筛选用于下步分析。
采用熟知的方法测定转化体和未转化体的提取物的PAL，4CL和 CCoAR酶活性。选择其中PAL，4CL和CCoAR活性大于对照的菌株用于 下步分析。采用公知的普通方法，分析所选择菌株的类黄酮醛产生，并 选择产生显著量肉桂醛的菌株确定最佳发酵条件。
                    实施例17
              构建产生HCA的酵母菌株
如下建立包含肉桂醛(CNMA)生物合成所必需的酶的酵母菌，如啤酒 酵母。首先，按照Faulkener等在(1994)基因143：13020中构建高水平表 达PAL的菌株。也可将植物肉桂酸4-羟化酶基因与适宜的控制信号可操 作连接，再插入菌株(参见Urban等(1994)欧洲生物化学杂志，222：843 -850)。应用普通基因克隆技术，使用由纯化蛋白的部分氨基酸序列得 到的核苷探针分离cDNA克隆，获得肉桂酰CoA还原酶(CCoAR)基因， 所述纯化蛋白是从数种植物中纯化得到的并被部分表征。该CCoAR基因 还与可控制信号可操作连接并插入酵母菌。
然后按如下克隆催化CNMA转化为HCA的酶编码基因。使用由稻 子植株获得的mRNA在酵母表达载体中建立cDNA文库。然后将cDNA 库转化到先构建的酵母菌株中并使用表达载体中存在的可选择标记选择 转化体。
为鉴定产生HCA的酵母菌株，将转化体转移到含酵母生长琼脂培养 基的微量滴定板中。然后将微量滴定板放置在有蚤的室中，蚤对HCA敏 感，但对CNMA不敏感。将微量滴定孔中含死亡蚤数与含未转化的对照 酵母菌的微量滴定孔相比具有统计学显著的酵母稀释，再将其重新平 铺在微量滴定板中，之后重复该筛选方法，得到由单个转化酵母细胞衍 生的克隆。
采用气液色谱(GLC)，使用30米非极性聚二甲硅氧烷柱(如HP-1， Hewlett-Packard或SPB-1，Supelco)和火焰离子检测器分析表现出增加 的蚤死亡率的由单细胞衍生的产生HCA的菌落。使用氦为载气(8ml/ 分)，柱温约是240℃，(E)-顺式异构体(主成分)的保留时间约是6.0分钟， (Z)-反式异构体(次要成分)的保留时间约是6.3分钟。
从生产HCA和已测定的插入片段的菌落中分离表达载体DNA以得 到催化CNMA转化成HCA之酶的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。
               实施例18
        构建产生HCA的转基因植物
采用转座子诱变由水稻植物克隆编码催化肉桂醛(CNMA)转化为α- 己基肉桂醛(HCA)的酶的基因。使用玉米Ac可转座单元克隆载体转化大 米原生质体，所述可转座单元插入到含插入潮霉素B(hygB)磷酸转移酶基 因中以破坏hygB基因的编码序列(参见，如Izawa等(1991)Mol.Gen.Genet. 227：391-396；Murao等(1991)核酸化学研究，19：617-622)。将转化的原生 质体平铺在含足量潮霉素B(防止非潮霉素抗性的原生质体再生长)的 生长培养基上。其中Ac转座单元由hygB基因跳到水稻基因组中的原生 质体对潮霉素B有抗性，因此可再生长形成愈伤组织。植物可由抗潮霉 素B的愈伤组织再生(参见Izawa等，同上)。
如上实施例所述，分析再生水稻植物中是否存在CNMA和HCA。 产生CNMA但不产生HCA的植物可能携带有插入HCA生物合成基因中 的AC转座子。从CNMA+/HCA-突变体分离DNA基因组并将其与标记 转座子DNA杂交。将与转座子DNA探针杂交的片断亚克隆到适当的克 隆载体中，以进行作图和序列分析。鉴定发现HCA生物合成基因是开放 阅读框架，是因已知的Ac转座子序列的插入而被破坏的。该基因片段可 用于探测cDNA文库以分离相应的cDNA。
将HCA生物合成酶的cDNA插入表达载体，该载体可与植物产生害 虫抗性所需的强表达启动子连接。采用本领域专业技术人员公知的转化 方法将表达载体插入植物。如上实施例17所述，分析转基因植物的HCA 产生和/或对害虫的驱避或杀虫活性。
上述结果表明，与仅喷施水的作物相比，喷施含肉桂醛和碳酸氢钠 并同时喷施皂苷乳液至流溢的盆栽玫瑰或田地生长玫瑰可持续达56天 不染白粉病和锈病。该植物也不长蚜虫。该结果还表明皂苷可增强肉桂 醛抗葡萄根瘤蚜、线虫、蛞蝓、蜗牛和真菌，如Fusarium subhlutinans。 皂苷和CNMA制剂还可有效地对抗螨、蓟马虫和棉蚜。本发明适于使种 子、秧苗、植物和植物部分，如果实，基本上不携带病原体，如真菌和 吸汁昆虫。本发明还适于在植物和/或植物部分收获期间和之后和/或消费 过程中，降低植物部分，如茎、叶、根、果实、种子和/或花上的霉菌毒 素和其它有毒的次级代谢产物。
本说明书所述的全部公开和专利申请内容对本发明相关领域的专业 技术人员是指导性的。如果说本文所引用参考文献的全部公开和专利申 请内容是指导性的，则本文也以相当深度和广度加以引用。
现已对本发明进行充分描述，在不背离附录权利要求的精神和范围 的情况下，本领域普通专业技术人员可对此进行许多改变和修正是显而 易见的。
权利要求书
               按照条约第19条的修改
1.一种控制病原体在植物体上生长的方法，该方法向植物表面提供 有效病原体生长控制量的一种或多种皂苷化合物和至少一种式(I)化合物 的组合， 其中所述量对所述植物不具有植物毒性，并且除式(I)外不含其它抗氧 剂，式(I)中R1代表-CHO，R2代表H、-OH或包含1-10个碳原子的 有机取代基，R3代表H、-O-CH3或包含1-10个碳原子的有机取代基 且R4代表H或包含1-10个碳原子的有机取代基。
2.权利要求1的方法，该方法是将所述植物与含0.01-50g/l的一种 或多种式(I)化合物的含水制剂接触。
3.权利要求1或2的方法，其中R1代表-CHO，R2代表H、-OH或包含1-10个碳原子的有机取代基，R3代表H、-O-CH3或包含1- 10个碳原子的有机取代基且R4代表H或包含1-10个碳原子的有机取 代基。
4.权利要求1或2的方法，其中R1代表-CHO，R2和R3代表H并 且R4代表-(CH2)5-CH3。
5.前述任一种权利要求的方法，其中所述植物是玫瑰、葡萄、苹果、 桃、草皮草、西红柿、风铃草属胡椒(bell pepper)、松或棉花。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中病原体包括至少一种真菌、细 菌、线虫、藻类、昆虫、蜘蛛和陆生软体动物。
7.权利要求5或6的方法，其中的病原体是引起白粉病、锈病、叶 枯病、pitch canker，Sclerotonia dollarspot，腐霉属(Phythium)凋枯病 和丝核菌属(Rhizoctonia)凋枯病的真菌。
8.权利要求1-6任一项的方法，其中病原体是至少一种蚜虫、叶蝉、 卷叶虫、茎和鳞茎(blub)线虫、蓝绿草藻、苹蠹(condling)蛾和蓟 马虫。
9.权利要求1-3和5-8任一项的方法，其中至少一种化合物是肉桂 醛或松柏醛。
10.一种用于前述任一项权利要求的方法的含水组合物，它包含一 种或多种皂苷化合物和0.01-50g/l的一种或多种式(I)化合物， 该组合物除上式外不含其它抗氧剂，式(I)中R1代表-CHO，R2代表H、 -OH或包含1-10个碳原子的有机取代基，R3代表H、-O-CH3或包含 1-10个碳原子的有机取代基且R4代表H或包含1-10个碳原子的有 机取代基。
11.权利要求10的组合物，其中R1代表-CHO，R2和R3代表H并 且R4代表-(CH2)5-CH3。
12.权利要求10的组合物，其中R1代表-CHO，R2代表H、-OH或包含1-10个碳原子的有机取代基，R3代表H、-O-CH3或包含1- 10个碳原子的有机取代基且R4代表H或包含1-10个碳原子的有机取 代基。
13.权利要求10的组合物，其中至少一种化合物是肉桂醛或松柏 醛。
14.权利要求10-13任一项的组合物在控制致病生物在植物体上生 长中的用途。
15.一种诱导植物对致病生物产生抗性的方法，该方法是使植物与 一定量的至少一种皂苷化合物和至少一种式(I)化合物接触， 所述量足以诱导植物对致病生物产生系统性抗性，式(I)中R1代表-CHO， R2代表H、-OH或包含1-10个碳原子的有机取代基，R3代表H、 -O-CH3或包含1-10个碳原子的有机取代基且R4代表H或包含1-10 个碳原子的有机取代基。
16.一种用于权利要求15方法的组合物，包括含至少一种皂苷化合 物和至少一种式(I)化合物的含水制剂， 两种化合物的量足以诱导产生系统性抗性，并且所述制剂除上式外不含 其它抗氧剂，式(I)中R1代表-CHO，R2代表H、-OH或包含1-10 个碳原子的有机取代基，R3代表H、-O-CH3或包含1-10个碳原子的 有机取代基且R4代表H或包含1-10个碳原子的有机取代基。
17.权利要求10-13或16的组合物在诱导植物对致病生物产生系统 性抗性中的用途。
18.一种组合物，它包含致病生物生长调节量的至少一种皂苷化合 物和至少一种式(I)化合物的组合， 还包含可农用载体，所述组合物对至少一种病原生物在一个或多个植物 表面集落化的平均病害抗性约高于70％，其中，式(I)中R1代表-CHO， R2代表H、-OH或包含1-10个碳原子的有机取代基，R3代表H、 -O-CH3或包含1-10个碳原子的有机取代基且R4代表H或包含1-10 个碳原子的有机取代基。
19.权利要求10-13，16或18的组合物的用途，该组合物为至少一种 病原体在一个或多个植物表面的集落化提供的平均病害抗性为约70％ 或更高。
20.采用权利要求1-9任一项的方法获得的基本上不带真菌的种子 和植物。
21.通过将所述种子和植物与权利要求18的组合物接触获得基本上 不带真菌的种子和植物。
22.一种筛选植物病原体对真菌生长调节剂敏感性的方法，所述调 节剂包含至少一种皂苷化合物和至少一种式(I)化合物， 式(I)中，式(I)中R1代表-CHO，R2代表H、-OH或包含1-10个碳原 子的有机取代基，R3代表H、-O-CH3或包含1-10个碳原子的有机取 代基且R4代表H或包含1-10个碳原子的有机取代基，所述方法包括：
将所述植物与一种真菌生长调节剂接触；和
测定所述制剂对真菌病原体的有效性。
23.一种控制病原体在植物体上生长的方法，该方法向植物表面提 供含有一种或多种皂苷化合物和至少一种式(I)化合物的制剂， 式(I)中R1代表-CHO，R2代表H、-OH或包含1-10个碳原子的有机 取代基，R3代表H、-O-CH3或包含1-10个碳原子的有机取代基且R4 代表H或包含1-10个碳原子的有机取代基；所述皂苷化合物协同增强 所述式(I)化合物控制致病生物在植物上的生长，使所述制剂中的式(I)化 合物的浓度较不使用皂苷的式(I)化合物浓度有所降低。
24.权利要求23的方法，其中所述制剂是含有0.01-50g/l的一种或 多种权利要求1的式(I)化合物的含水制剂。
25.权利要求23或24的方法，其中R1代表-CHO，R2代表H、 -OH或包含1-10个碳原子的有机取代基，R3代表H、-O-CH3或包含1 -10个碳原子的有机取代基且R4代表H或包含1-10个碳原子的有机 取代基。
26.权利要求23或24的方法，其中R1代表-CHO，R2和R3代表H并且R4代表-(CH2)5-CH3。
27.一种用于权利要求23-26的方法的含水组合物，包含一种或多种 皂苷和0.01-50g/l的一种或多种式(I)化合物， 式(I)中R1代表-CHO，R2代表H、-OH或包含1-10个碳原子的有机 取代基，R3代表H、-O-CH3或包含1-10个碳原子的有机取代基且R4 代表H或包含1-10个碳原子的有机取代基；所述组合物除上式外不含 其它抗氧剂。
28.一种权利要求27的组合物，其中R1代表-CHO，R2和R3代表 H并且R4代表-(CH2)5-CH3。
29.一种权利要求27的组合物，其中R1代表-CHO，R2代表H、 -OH或包含1-10个碳原子的有机取代基，R3代表H、-O-CH3或包含1 -10个碳原子的有机取代基且R4代表H或包含1-10个碳原子的有机 取代基。
30.权利要求27的组合物，其中至少一种化合物是肉桂醛或松柏 醛。