技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，涉及一种病毒的定量检测方法，具体地，本发明涉及一种昆虫颗粒体病毒的计数方法。
背景技术
[0002] 昆虫颗粒体病毒隶属杆状病毒科Beta杆状病毒属(Beta baculovirus)，以
蛋白质包涵体的形式存在，每个病毒包涵体内部含有1个病毒粒子，病毒包涵体呈长椭圆形颗粒状，长约300-511nm，宽约119-350nm。
病毒感染力主要由DNA和蛋白衣壳的完整性决定，病毒粒子外包裹了致密晶格的颗粒体蛋白，形成病毒的包涵体。病毒包涵体可以加工成环保安全的生物
杀虫剂，用于防治宿主昆虫。
[0003] 在生物杀虫剂的制备中，病毒包涵体的含量测定一直是产品
质量控制的关键指标。但是，昆虫颗粒体病毒包涵体显著小于核型多
角体病毒，不能以血球计板在光学
显微镜下计数。使用
电子显微镜计数的方法和基于
荧光定量的分子生物学方法，操作复杂，且需要特定的设备，仪器价格昂贵。通过生物测定确定病毒浓度的方法，根据昆虫死亡率确定病毒浓度的方法耗时费力。使用分光光度法，由于形成的是非均一溶液导致结果不稳定，误差较大。也就是说，当前实际生产中所书体部分的昆虫颗粒体病毒的计数方法普遍存在操作复杂、培养时间长、结果重复性差或过度依赖价格高昂的仪器等问题。
[0004] 因此，当前对简便快捷、经验依赖性低、重复性好的昆虫颗粒体病毒的计数方法存在需求。
发明内容
[0005] 因此，本发明的目的是提供一种昆虫颗粒体病毒的计数方法，本发明的方法包括昆虫颗粒体病毒的样品预处理和使用细菌计数板计数。本发明提供的计数方法操作方便，易于判断，结果准确，可以广泛地推广应用到
农药生产、农业
病虫害防治等领域。
[0006] 本发明的内容包括以下技术方案：
[0007] 一种昆虫颗粒体病毒的计数方法，所述方法包括以下步骤：
[0008] 1)使用
染色试剂将昆虫颗粒体病毒样品稀释2～1000倍并使其染色；
[0009] 2)使用脱色试剂将步骤1)染色后的样品再稀释2～1000倍并使其脱色；
[0010] 3)使用细菌计数板对步骤2)脱色后的样品计数，并根据公式计算昆虫颗粒体病毒的颗粒浓度。
[0011] 优选地，所述昆虫颗粒体病毒为
小菜蛾颗粒体病毒或
苹果蠹蛾颗粒体病毒[0012] 优选地，在步骤1)中，所述染色试剂选自台盼蓝、亚甲蓝伊红或考
马斯亮蓝G250。
[0013] 更优选地，在步骤1)中，所述染色试剂为考马斯亮蓝G250；进一步优选地，所述考马斯亮蓝G250的浓度为0.1～10g/L；更进一步优选地，所述考马斯亮蓝G250的浓度为0.5～5g/L；最优选地，所述考马斯亮蓝G250的浓度为1g/L；
[0014] 优选地，在步骤1)中，所述染色包括在95～100℃下，使用染色试剂处理昆虫颗粒体病毒样品至少5min；优选地，所述染色试剂处理时间为至少5min、至少6min、至少7min、至少8min、至少9min、至少10min；更优选地，所述染色试剂处理时间为至少10min；
[0015] 优选地，在步骤1)中，所述稀释倍数为2-100倍，进一步优选地为2-50倍，最优选地为10倍。
[0016] 优选地，在步骤2)中，所述脱色试剂选自蒸馏
水、
冰醋酸或者甲醇、冰醋酸和水的混合溶液；
[0017] 优选地，所述脱色试剂为甲醇、冰醋酸和水的混合溶液；
[0018] 更优选地，所述混合溶液中甲醇、冰醋酸和水的体积比为(1～5)：(1～5)：(1～10)；
[0019] 进一步优选地，所述混合溶液中甲醇、冰醋酸和水的体积比为1:1：(1～10)；
[0020] 更进一步优选地，所述混合溶液中甲醇、冰醋酸和水的体积比为1：1：8。
[0021] 优选地，在步骤2)中，所述脱色试剂稀释时间为1-10分钟。。
[0022] 优选地，在步骤2)中，所述脱色试剂稀释倍数为2-100倍，进一步优选地为2-50倍，最优选地为10倍。
[0023] 优选地，在步骤3)中，所述计数使用
光学显微镜，更优选地为相差光学显微镜；
[0024] 优选地，在步骤3)中，所述显微镜的放大倍数为目镜4～20倍，物镜40-100倍；更优选地为目镜20倍，物镜63倍。
[0025] 计算公式：
[0026] 16格×25格的细胞计数板计算公式：细胞数/ml＝100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数；
[0027] 1、25格×16格的细胞计数板计算公式：细胞数/ml＝80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数。
[0028] 本发明的
发明人发现，在常规方法中，计数时判断显微镜下的颗粒是否为病毒颗粒，需要根据实际经验，其经验的依赖性非常大。而使用本发明的方法，使用特定浓度的染色试剂处理病毒样品，并使用脱色试剂进行特定倍数稀释后，病毒颗粒被着色，易于判断，从而可以在光学显微镜下直接对昆虫颗粒体病毒样品进行定量检测。
[0029] 与
现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0030] 1)本发明提供的方法操作方便，易于判断，结果准确。
[0031] 2)本发明提供的方法不仅可以定量检测昆虫颗粒体病毒，而且可以提高检测的准确性、可靠性。
[0032] 3)本发明提供的方法操作简单，使用到的仪器简易，可以广泛地推广应用到农药生产、农业病虫害防治等领域。
附图说明
[0033] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0034] 图1为使用考马斯亮蓝G250染色试剂处理小菜蛾颗粒体病毒样品，并使用脱色试剂稀释后，在显微镜下使用细菌计数板计数的图片，从图1中可以看出，使用本发明的方法处理的小菜蛾颗粒体病毒样品在显微镜下更易于观察到；
[0035] 图2为未经处理的小菜蛾颗粒体病毒样品在显微镜下使用细菌计数板计数的图片，从图2中可以看出，未经处理的小菜蛾颗粒体病毒样品在显微镜下不易观察到；
[0036] 图3为使用染色试剂染色后的小菜蛾颗粒体病毒样品，使用水稀释后在显微镜下使用细菌计数板计数的图片，从图3中可以看出，该图片中的样品不如使用脱色试剂稀释的样品更清晰可见。
[0037] 图4为使用本发明的方法处理苹果蠹蛾颗粒体病毒样品后，在显微镜下使用细菌计数板计数的图片，从图4中可以看出，使用本发明的方法处理的苹果蠹蛾颗粒体病毒样品在显微镜下更加清晰可见。
具体实施方式
[0038] 本
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0039] 除非特别说明，本发明所用的试剂均为实验纯或分析纯，并且可以商购获得。
[0040] 实施例1小菜蛾颗粒体病毒样品的计数方法
[0041] 1)取浓度为1×1012OB/ml的小菜蛾颗粒体病毒样品(样品1)，使用本发明的染色试剂将样品1稀释10倍，即取原液样品0.1ml，加入0.9ml染色试剂。所述染色试剂配方：考马斯亮蓝G250浓度为1g/L，0.22μm
膜过滤。样品1选取三个样品重复。
[0042] 然后，将样品在100℃放置10min，冷却至室温。
[0043] 2)将步骤1)处理后的样品用脱色试剂稀释100倍后计数。所述脱色试剂为甲醇：冰醋酸：水，体积比为1：1：8。
[0044] 3)在光学显微镜下计数测定
[0045] 使用细菌计数板，计数池厚度0.02μm。
[0046] 相差光学显微镜，目镜20倍，物镜40倍或者63倍。
[0047] 样品浓度通过以下公式计算
[0048] 根据稀释倍数和待测样品浓度计算公式：
[0049] 原液样品浓度(OB/ml)＝80个小方格病毒颗粒数之和×5×50000×稀释倍数[0050] 1.4结果分析
[0051] 小菜蛾颗粒体病毒样品经染色后，并使用脱色试剂稀释后在显微镜下清晰可见(图1)，与不染色样品可见度差异较大(图2)，使用水稀释的样品可见度也较小(图3)。病毒颗粒使用本方法的染色剂染色后，再使用脱色试剂计数浓度为：6.5×1011OB/ml，不染色不使用脱色剂计数浓度(估计)浓度为1.23×1011OB/ml-1.5×1011OB/ml，使用Guava easyCyte微毛细管细胞分析仪测定，为3.86×1010OB/ml。这是由于不染色不使用脱色剂计数的方法，由于病毒颗粒直径仅200nm，而细菌计数板的计数室高度为0.1mm，相差近200倍，并且聚焦等成像因素产生的误差。而毛细管细胞分析仪测定时样品需要过滤除去杂质，以及仪器自动识别超过预设大小粘连在一起的病毒颗粒团，导致颗粒测定终浓度偏低。
[0052] 实施例2苹果蠹蛾颗粒体病毒样品的定量检测
[0053] 1)取浓度为1×1012OB/ml的苹果蠹蛾颗粒体病毒样品(样品2)，发明的染色试剂将样品2稀释2倍，即取原液样品0.1ml，加入0.1ml染色试剂。所述染色试剂配方：考马斯亮蓝G250浓度为5g/L，0.22μm膜过滤。样品2选取三个样品重复。
[0054] 然后，将样品在95℃放置5min，冷却至室温。
[0055] 2)将步骤1)处理后的样品用脱色试剂稀释1000倍后计数。所述脱色试剂为甲醇：冰醋酸：水，体积比为1：1：10。
[0056] 3)在光学显微镜下计数测定
[0057] 使用细菌计数板，计数池厚度0.02μm。
[0058] 相差光学显微镜，目镜20倍，物镜40倍或者63倍。
[0059] 样品浓度通过以下公式计算
[0060] 根据稀释倍数和待测样品浓度计算公式：
[0061] 原液样品浓度(OB/ml)＝80个小方格病毒颗粒数之和×5×50000×稀释倍数[0062] 1.4结果分析
[0063] 苹果蠹蛾颗粒体病毒样品经染色后，并使用脱色试剂稀释后在显微镜下清晰可见染色后的病毒颗粒在显微镜下清晰可见(图4)。不使用染色法计数浓度7.0×1010OB/ml，低11 11
于染色后的浓度2.1×10 OB/ml-2.6×10 OB/ml。
[0064] 实施例3小菜蛾颗粒体病毒样品的计数方法
[0065] 1)取浓度为1×1012OB/ml的小菜蛾颗粒体病毒样品(样品1)，使用本发明的染色试剂将样品1稀释1000倍，即取原液样品0.1ml，加入99.9ml染色试剂。所述染色试剂配方：台盼蓝浓度为0.1g/L，0.22μm膜过滤。样品1选取三个样品重复。
[0066] 然后，将样品在95℃放置6min，冷却至室温。
[0067] 2)将步骤1)处理后的样品用脱色试剂稀释2倍后计数。所述脱色试剂为甲醇：冰醋酸：水，体积比为1：1：1。
[0068] 3)在光学显微镜下计数测定
[0069] 使用细菌计数板，计数池厚度0.02μm。
[0070] 相差光学显微镜，目镜20倍，物镜40倍或者63倍。
[0071] 样品浓度通过以下公式计算
[0072] 根据稀释倍数和待测样品浓度计算公式：
[0073] 原液样品浓度(OB/ml)＝80个小方格病毒颗粒数之和×5×50000×稀释倍数[0074] 1.4结果分析
[0075] 小菜蛾颗粒体病毒样品经染色后，并使用脱色试剂稀释后在显微镜下清晰可见，与不染色样品可见度差异较大。
[0076] 实施例4苹果蠹蛾颗粒体病毒样品的定量检测
[0077] 1)取浓度为1×1012OB/ml的苹果蠹蛾颗粒体病毒样品(样品2)，发明的染色试剂将样品2稀释50倍，即取原液样品0.1ml，加入4.9ml染色试剂。所述染色试剂配方：考马斯亮蓝G250浓度为0.5g/L，0.22μm膜过滤。样品2选取三个样品重复。
[0078] 然后，将样品在95℃放置5min，冷却至室温。
[0079] 2)将步骤1)处理后的样品用脱色试剂稀释10倍后计数。所述脱色试剂为甲醇：冰醋酸：水，体积比为1：1：10。
[0080] 3)在光学显微镜下计数测定
[0081] 使用细菌计数板，计数池厚度0.02μm。
[0082] 相差光学显微镜，目镜20倍，物镜40倍或者63倍。
[0083] 样品浓度通过以下公式计算
[0084] 根据稀释倍数和待测样品浓度计算公式：
[0085] 原液样品浓度(OB/ml)＝80个小方格病毒颗粒数之和×5×50000×稀释倍数[0086] 1.4结果分析
[0087] 苹果蠹蛾颗粒体病毒样品经染色后，并使用脱色试剂稀释后在显微镜下清晰可见。
[0088] 最后说明，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案特点，在本领域的技术人员基于本方案的技术特点进行的
修改或等同替换，不脱离本方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明
权利要求书当中。
