粉棒束孢Kill Protion4基因、重组蛋白及应用
阅读：558发布：2020-05-12
专利汇可以提供粉棒束孢Kill Protion4基因、重组蛋白及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于分子 生物 学领域，具体涉及粉棒束孢Kill Protion4基因、基因和重组蛋白的制备方法、重组蛋白及应用。本发明从一株具有较强杀虫活 力 的粉棒束孢FTRSY-2菌株出发，首次从粉棒束孢基因组中克隆出2条粉棒束孢Kill Protion4基因，命名为Ifkp4-1和Ifkp4-2，以该基因为出发点，通过分子生物学的手段构建重组载体、工程菌、重组KP4蛋白等，并通过构建Ifkp4-1基因敲除与回复株验证该基因的功能。本发明得到的重组KP4蛋白性质稳定，产量和纯度较高，并具有广谱杀 真菌 效力和药理活性，还能显著增强植株的抗逆性能，有潜力开发成为生防制剂、抗菌药品、保健产品等。，下面是粉棒束孢Kill Protion4基因、重组蛋白及应用专利的具体信息内容。
1.粉棒束孢的Kill Protion4基因，其特征在于，所述的Kill Protion4基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示和/或其中的片段；所述的Kill Protion4基因的核苷酸序列还包括SEQ ID NO.2所示和/或其中的片段。
2.权利要求1所述的Kill Protion4基因的制备方法，其特征在于，根据粉棒束孢全基因组序列预测得到SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示序列，根据所述SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2序列设计若干引物对；提取粉棒束孢总RNA，反转cDNA，进行PCR扩增，获得如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的Kill Protion4基因。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述引物对包括如序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的一组引物对。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述引物对还包括如序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的一组引物对。
5.重组质粒载体，其特征在于，所述重组质粒载体包含权利要求1所述的任一核苷酸序列和原核表达质粒；所述核苷酸序列与原核表达质粒连接。
6.重组质粒载体转化得到的产重组Kill Protion4蛋白的基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述重组Kill Protion4蛋白在所述基因工程菌的包涵体和培养上清液中表达。
8.粉棒束孢的重组Kill Protion4蛋白，其特征在于，所述重组Kill Protion4蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示和/或其中的片段；所述重组Kill Protion4蛋白的氨基酸序列还包括SEQ ID NO.8所示和/或其中的片段。
9.粉棒束孢的重组Kill Protion4蛋白，其特征在于，所述重组Kill Protion4蛋白由权利要求1所述的SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2核苷酸序列翻译得到。
10.一种多克隆抗体，其特征在于，所述多克隆抗体包括权利要求8或9所述的重组Kill Protion4蛋白。
11.权利要求8或9所述的重组Kill Protion4蛋白在制备用于防治林业害虫的生防制剂中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述林业害虫包括油松毛虫、松梢螟、苹果蠹蛾、美国白蛾、落叶松卷蛾、黄刺蛾幼虫、板栗象甲、松墨天牛、柑桔粉蚧中的一种或多种。
13.权利要求8或9所述的重组Kill Protion4蛋白在制备抗真菌药物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述真菌包括柑桔褐斑病菌(Alternaria alternata)；层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)；胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；烟管菌(Bjerkandera adusta)；球黑孢(Nigrospora sphaerica)；赭绿青霉(Penicillium ochrochloron)中的一种或多种。
15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述重组Kill Protion4蛋白可以为任意药学可接受剂型，所述抗真菌药物还包括药学上可接受的载体和/或助剂。
16.权利要求8或9所述的重组Kill Protion4蛋白在增强植株抗逆性能中的应用。
17.权利要求8或9所述的重组Kill Protion4蛋白在制备多克隆抗体中的应用。
18.权利要求8或9所述的重组Kill Protion4蛋白在制备提高人体免疫功能的保健品中的应用。
19.权利要求8或9所述的重组Kill Protion4蛋白在增强虫草抗逆性能中的应用。
粉棒束孢Kill Protion4基因、重组蛋白及应用
技术领域
背景技术
[0002] 粉棒束孢(Isaria farinosa)，是丝状真菌棒束孢属(Isaria Fries)模式种，是一种主要的昆虫病原真菌，同时也是一种极具开发价值和商业利用价值的真菌，具体表现在：1)现有研究表明，粉棒束孢对多种类型的害虫具有良好的杀虫效果；2)粉棒束孢作为蝙蝠蛾幼虫的定殖真菌，其药用活性也越来越多地被研究和发现；3)已从粉棒束孢培养菌丝体中分离得到包括多糖、虫草酸、生物碱、吡啶酮、天然苯腙、喹唑啉酮、环状五肽、蒽醌类化合物等多种新化合物；4)研究证明粉棒束孢菌的代谢产物中具有类似生长素和细胞分裂素的物质等。然而目前针对粉棒束孢的研究主流还停留在宏观层面上，主要以粉棒束孢的代谢产物或孢子悬液或菌丝体作为研究对象，其微观分子层面的研究才刚刚起步，且现有的利用分子生物学手段对粉棒束孢进行的深入和系统研究，主要都集中在真菌分类及作为生防菌的角度进行。
[0003] 申请号为201610476131.6的发明专利公开了一株粉棒束孢的发酵培养物在制备预防林业害虫的生防制剂中的应用，该发明主要是利用了菌株的发酵培养液。杨俊媛等学者从粉棒束孢培养菌丝体中分离得到多种有价值的化合物，但其研究依然停留在宏观层面。因此，有必要在全面、系统研究活性代谢产物的基础上深入开展粉棒束孢药理活性与基因功能之间的关系，以便构建出能够产生特定活性成分的超级生产菌株。
[0004] KP4蛋白是由玉米黑穗病病毒UMV4产生的一种多肽片段，大量研究已表明kp4基因及其分泌的KP4蛋白能影响真菌的生长。
[0005] 本发明团队前期在培养过程中发现，粉棒束孢FTRSY-2菌株对一些真菌具有明显的抑制作用，因此推测是否由于粉棒束孢FTRSY-2能分泌某些毒素蛋白或产生某些次级代谢产物才导致对某些病原菌出现抑制现象。鉴于此，本发明从粉棒束孢基因组中分析发现了两条与编码真菌毒素(Kill Protion4)KP4蛋白相似的基因，并首次从粉棒束孢基因组中克隆出粉棒束孢KP4基因，命名为Ifkp4-1和Ifkp4-2。以该基因为出发点，通过分子生物学的手段构建重组载体、工程菌、重组KP4蛋白等，并通过构建Ifkp4-1基因敲除与回复株验证该基因的功能。为进一步研究粉棒束孢功能基因及其潜在的药用价值奠定了基础，具有重要的研究意义和潜在的商业价值。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明的目的之一，在于提供一种粉棒束孢Kill Protion4基因。
[0007] 粉棒束孢的Kill Protion4基因，所述的Kill Protion4基因核苷酸序列包括SEQ ID NO.1所示和/或其中的片段；所述Kill Protion4基因核苷酸序列还包括SEQ ID NO.2所示和/或其中的片段。该基因由本发明的课题组首次从粉棒束孢基因组中克隆得到，命名为Ifkp4。
[0008] 本发明的目的之二，在于提供上述粉棒束孢Kill Protion4基因的制备方法。
[0009] 上述Kill Protion4基因的制备方法，根据粉棒束孢全基因组序列预测得到SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示序列，根据所述SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2序列设计若干引物对；提取粉棒束孢总RNA，反转cDNA，进行PCR扩增，获得如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的Kill Protion4基因。两条基因分别命名为Ifkp4-1和Ifkp4-2。Ifkp4-1 cDNA ORF全长为387bp，该基因编码128个氨基酸，分子量约为12.9kDa；Ifkp4-2 cDNA ORF全长为396bp，该基因编码131个氨基酸，分子量约为13.2kDa。多序列比对结果显示粉棒束孢KP4氨基酸序列和其他真菌KP4氨基酸序列相似度不高，序列较特异。
[0010] 本研究是第一个从粉棒束孢中克隆出与抗菌肽KP4相关基因，并借助分子生物学手段得到稳定高产的重组KP4蛋白，具有突破性的意义。
[0011] 进一步，所述引物对包括如序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的一组引物对。所述序列SEQ ID NO.3命名为Ifkp4-1F；所述序列SEQ ID NO.4命名为Ifkp4-1R。
[0012] 进一步，所述引物对还包括如序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的一组引物对。所述序列SEQ ID NO.5命名为Ifkp4-2F；所述序列SEQ ID NO.6命名为Ifkp4-2R。
[0013] 本发明的目的之三，在于提供一种重组质粒载体。
[0014] 重组质粒载体，所述重组质粒载体包含上述SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2的任一核苷酸序列和原核表达质粒；所述核苷酸序列与原核表达质粒连接。
[0015] 作为一种优选，所述原核表达质粒采用SUMO-pET28a质粒。
[0016] 本发明的目的之四，在于提供一种基因工程菌。
[0017] 重组质粒载体转化得到的产重组Kill Protion4蛋白的基因工程菌。
[0018] 进一步，所述重组Kill Protion4蛋白在所述基因工程菌的包涵体和培养上清液中表达。本发明的基因工程菌采用大肠杆菌BL21(DE3)制备。
[0019] 本发明的目的之五，在于提供一种重组KP4蛋白。
[0020] 粉棒束孢的重组Kill Protion4蛋白，所述重组Kill Protion4蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示和/或其中的片段；所述重组Kill Protion4蛋白的氨基酸序列还包括SEQ ID NO.8所示和/或其中的片段。
[0021] 粉棒束孢的重组Kill Protion4蛋白，所述重组Kill Protion4蛋白由所述的SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2核苷酸序列翻译得到。
[0022] 本发明的目的之六，在于提供一种多克隆抗体。
[0023] 一种多克隆抗体，所述多克隆抗体包括上述重组Kill Protion4蛋白。
[0024] 本发明的目的之十，在于提供一系列重组KP4蛋白的应用。
[0025] 上述的重组Kill Protion4蛋白在制备用于防治林业害虫的生防制剂中的应用。所述应用还可以由上述SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2核苷酸序列和上述重组质粒载体得到。
[0026] 进一步，所述林业害虫包括油松毛虫、松梢螟、苹果蠹蛾、美国白蛾、落叶松卷蛾、黄刺蛾幼虫、板栗象甲、松墨天牛、柑桔粉蚧中的一种或多种。传统的生防制剂主要是以菌株或菌株代谢产物为基础制备，而以本发明的重组KP4蛋白为基础来制备，效力更强，可控性更高。
[0027] 上述的重组Kill Protion4蛋白在制备抗真菌药物中的应用。所述应用还可以由上述SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2核苷酸序列和上述重组质粒载体得到。
[0029] 进一步，所述真菌包括柑桔褐斑病菌(Alternaria alternata)；层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)；胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；烟管菌(Bjerkandera adusta)；球黑孢(Nigrospora sphaerica)；赭绿青霉(Penicillium ochrochloron)中的一种或多种。
[0030] 进一步，所述重组Kill Protion4蛋白可以为任意药学可接受剂型，所述抗真菌药物还包括药学上可接受的载体和/或助剂。
[0031] 上述的重组Kill Protion4蛋白在增强植株抗逆性能中的应用。所述应用还可以由上述SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2核苷酸序列、重组质粒载体得到。本发明课题组分别构建了KP4基因敲除株和回复株，与野生株对照，基因敲除株对刚果红极为敏感，生长受到完全抑制，对碱性环境敏感，菌丝生长速率减慢；而所有抗逆性能差异在基因的回补菌株中得到良好恢复，与野生株表现一致，证明了KP4基因对植株抗逆性能具有显著影响。
[0032] 上述的重组Kill Protion4蛋白在制备多克隆抗体中的应用。所述应用还可以由上述SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2核苷酸序列和上述重组质粒载体得到。
[0033] 上述的重组Kill Protion4蛋白在制备提高人体免疫功能的保健品中的应用。所述应用还可以由上述SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2核苷酸序列和上述重组质粒载体得到。通过对重组KP4蛋白的系统进化分析发现粉棒束孢与冬虫夏草菌的KP4同源性为97％，而冬虫夏草被公认为具有调节免疫、抗疲劳等多种功效。因此本发明的重组Kill Protion4蛋白及相应菌株具备了与冬虫夏草相当的开发成保健品的潜力。
[0034] 上述的重组Kill Protion4蛋白在增强虫草抗逆性能中的应用。所述应用还可以由上述SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2核苷酸序列和上述重组质粒载体得到。
[0035] 本发明的有益效果在于：
[0036] 1)本发明从一株具有较强杀虫活力的粉棒束孢FTRSY-2菌株出发，首次从粉棒束孢基因组中克隆出粉棒束孢KP4基因，命名为Ifkp4-1和Ifkp4-2。以该基因为出发点，通过分子生物学的手段构建重组载体、工程菌、重组KP4蛋白等，并通过构建Ifkp4-1基因敲除与回复株验证该基因的功能。从而为粉棒束孢功能基因的研究及其对寄主、环境互作分子机制的阐明、药用价值的深入研究奠定理论基础，同时为构建产生特定功能的活性成分的超级菌株奠定了基础。
[0038] 图1：Ifkp4基因的DNA序列及所对应的氨基酸序列(框中为信号肽；A：Ifkp4-1；B：Ifkp4-2)。
[0039] 图2：重组KP4蛋白二级结构预测。
[0040] 图3：重组KP4蛋白三维结构图(A：Ifkp4-1；B：Ifkp4-2)。
[0041] 图4：粉棒束孢重组KP4蛋白与其他真菌KP4的氨基酸序列相似性分析(*标注为活性位点)。
[0042] 图5：粉棒束孢重组KP4蛋白与其他真菌KP4蛋白的系统进化树。
[0043] 图6：粉棒束孢Ifkp4基因扩增。
[0044] 图7：Ifkp-1基因同源敲除及回复载体构建过程图。
[0045] 图8：Ifkp-1基因同源敲除载体图谱(左)及PCR验证(右)。
[0046] 图9：Ifkp-1基因回复载体图谱(左)及PCR验证(右)。
[0047] 图10：Ifkp-1基因同源敲除转化子bar基因PCR验证(M：DL2000marker；1-3：Ifkp4-1基因敲除转化子；4-6：Ifkp4-1基因回复转化子)。
[0048] 图11：Ifkp-1基因同源敲除、回复转化子PCR验证(左)及回复转化子荧光观察(右)(M:DL2000marker；1-3:Ifkp-1基因敲除转化子；4-6:Ifkp-1基因回复转化子)。
[0049] 图12：Ifkp4-1基因同源敲除、回复转化子菌落形态及逆境胁迫下的生长情况(WT：野生菌株；△Ifkp4：Ifkp4基因敲除突变株；RC：回复突变株；1-7：PDA正常培养基；刚果红；
NaC；山梨醇；pH11；UV；35℃)。
NaC；山梨醇；pH11；UV；35℃)。
[0050] 图13：Ifkp4-1(A)及Ifkp4-2(B)基因在感病大蜡螟不同时间及不同组织中的表达量。
[0051] 图14：Ifkp4-1基因扩增、表达载体酶切验证及重组蛋白表达(A、B:M:2000marker；1:Ifkp4-1扩增产物；2:BamH I/Sal I酶切验证；C:1:上清；2:上清2(2M尿素溶解包涵体)；
3:包涵体2倍稀释(8M尿素溶解包涵体)；4:包涵体5倍稀释(8M尿素溶解包涵体)；5:包涵体
10倍稀释(8M尿素溶解包涵体)；6:0.4mg/mL BSA；7:marker)。
3:包涵体2倍稀释(8M尿素溶解包涵体)；4:包涵体5倍稀释(8M尿素溶解包涵体)；5:包涵体
10倍稀释(8M尿素溶解包涵体)；6:0.4mg/mL BSA；7:marker)。
[0052] 图15：KP4重组蛋白特异性检测及感病大蜡螟血液中Ifkp4-1基因表达量测定(A：多克隆抗体特异性及灵敏度检测；B：感病大蜡螟血液中KP4蛋白表达量检测；(M：marker；1-
2：FTRSY-2野生株总蛋白；3：CK；4-8：0h、12h、24h、48h、72h感病大蜡螟血液总蛋白；9：阴性对照)。
2：FTRSY-2野生株总蛋白；3：CK；4-8：0h、12h、24h、48h、72h感病大蜡螟血液总蛋白；9：阴性对照)。
具体实施方式
[0053] 以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0054] 本发明的实验材料
[0055] 1.实验材料
[0056] 1.1供试菌株及昆虫
[0057] 粉棒束孢FTRSY-2菌株；大肠杆菌BL21(DE3)；大蜡螟幼虫
[0058] 1.2质粒载体
[0059] pCambiaMX9质粒(GenBank accession number：KX755248，具kana抗性)；
[0060] pGapneoR12质粒(GenBank accessionnumber：KY363244，具G418抗性)。
[0061] 实施例1
[0062] 1.基因组DNA提取
[0064] 2.基因组RNA提取
[0065] 基因组RNA提取采用天根植物基因组提取试剂盒，按说明书步骤提取。
[0066] 3.微量快速PCR验证
[0067] 采取微量菌丝PCR扩增：无菌牙签挑取少量粉棒束孢菌丝至EP管中，液氮速冻研磨后，加入50μL Lysis Buffer，混合均匀，95℃，10min；取菌丝裂解液2μL进行常规PCR扩增。
[0068] 4.生物信息学分析
[0070] 5.生物信息学分析结果
[0071] Ifkp4-1 cDNA ORF全长为387bp，该基因编码128个氨基酸(图1A)，分子量约为12.9kDa，等电点为7.53，平均疏水性为-0.084，且稳定性比较好；信号肽预测结果表明该序列具有信号肽，其切割位点在N端第19和20个氨基酸之间；Ifkp4-2 cDNA ORF全长为396bp，该基因编码131个氨基酸(图1B)，分子量约为13.2kDa，等电点为8.47，平均疏水性为-
0.002，稳定性比较好；信号肽预测结果表明该序列具有信号肽，其切割位点在N端第18和19个氨基酸之间；二级结构预测如图2所示，表明该蛋白序列由α螺旋、β折叠、β转角及无规则卷曲构成；三级结构预测可以看出，两条粉棒束孢的KP4蛋白三维结构相似，共含有7个β片状结构和3个α螺旋结构，其中两个反平行的α螺旋与五链反平行β折叠形成约45°的夹角(图
3)。多序列比对结果显示粉棒束孢KP4氨基酸序列和燕麦镰孢菌、寄生曲霉、弯颈孢等真菌KP4氨基酸序列相似度不高，序列较特异(图4)；系统进化树分析发现Ifkp4-1蛋白与虫草棒束孢(Cordyceps fumosorosea)的KP4同源性为97％(图5)。
0.002，稳定性比较好；信号肽预测结果表明该序列具有信号肽，其切割位点在N端第18和19个氨基酸之间；二级结构预测如图2所示，表明该蛋白序列由α螺旋、β折叠、β转角及无规则卷曲构成；三级结构预测可以看出，两条粉棒束孢的KP4蛋白三维结构相似，共含有7个β片状结构和3个α螺旋结构，其中两个反平行的α螺旋与五链反平行β折叠形成约45°的夹角(图
3)。多序列比对结果显示粉棒束孢KP4氨基酸序列和燕麦镰孢菌、寄生曲霉、弯颈孢等真菌KP4氨基酸序列相似度不高，序列较特异(图4)；系统进化树分析发现Ifkp4-1蛋白与虫草棒束孢(Cordyceps fumosorosea)的KP4同源性为97％(图5)。
[0072] 实施例2
[0073] 基因cDNA ORF全长克隆：
[0074] 查找粉棒束孢全基因组序列得到预测的Ifkp4-1及Ifkp4-2基因全长序列，分别设计扩增两条基因全长cDNA序列的引物Ifkp4-1F/R及Ifkp4-2F/R。提取粉棒束孢总RNA，反转cDNA，进行PCR扩增，获得Ifkp4-1及Ifkp4-2基因cDNA ORF全长。取PCR扩增产物进行电泳验证。
[0075] 实验结果：
[0076] 扩增得到两条全长分别为387bp及396bp的片段，PCR扩增结果如图6所示。
[0077] 实施例3
[0078] 1.Ifkp4-1基因敲除盒的构建
[0079] (1)Ifkp4-1基因上、下游及草丁膦抗性基因片段克隆
[0080] 以野生型菌株FTRSY-2基因组为模板，使用引物Ifkp4-1qcup F/R扩增Ifkp4-1基因上游序列，产物命名为kp4U；使用引物Ifkp4-1qcdown F/R扩增Ifkp4-1基因下游序列，产物命名为kp4D；以pCambaregfp质粒为模板，使用引物Bar 3/4扩增草丁膦抗性基因，产物命名为B。PCR产物电泳检测后切胶回收，具体步骤按照试剂盒说明书进行。
[0081] (2)质粒pCambiaMX9-kp4U构建
[0082] 将质粒pCambiaMX9和Ifkp4-1基因上游回收片段kp4U进行EcoR I/XbaI双酶切，电泳检测后回收，具体步骤按照试剂盒说明书进行。
[0083] 将回收的线性化质粒pCambiaMX9和Ifkp4-1基因上游片段kp4U进行连接，并转化大肠杆菌，用引物MX9 F/R对进行菌液PCR验证；PCR检测结果为阳性的菌落，扩繁后提取质粒，用EcoR I/BamH I对质粒进行双酶切验证。
[0084] (3)质粒pCambiaMX9-kp4UD构建
[0085] 将提取的质粒pCambiaMX9-14U和回收的Ifkp4-1基因下游回收片段kp4D分别进行Xba I和BamH I双酶切，电泳检测后回收，具体步骤按照试剂盒说明书进行。
[0086] 将回收的线性化质粒pCambiaMX9-kp4U和Ifkp4-1基因下游片段14D进行连接转化大肠杆菌，用引物MX9F/R对进行菌液PCR验证；PCR检测结果为阳性的菌落，扩增后提取质粒，用EcoR I/BamH I对质粒进行双酶切验证。
[0087] (4)质粒pCambiaMX9-kp4UBD构建
[0088] 将提取的质粒pCambiaMX9-kp4UD和回收的草丁膦抗性基因片段B分别进行XbaI酶切，电泳检测后回收，具体步骤按照试剂盒说明书进行。
[0089] 将回收的线性化质粒pCambiaMX9-kp4UD和草丁膦抗性基因片段B进行连接转化大肠杆菌，用引物MX9F/R对进行菌液PCR验证；PCR检测结果为阳性的菌落，扩增后提取质粒，用EcoR I/BamH I对质粒进行酶切验证。
[0090] 实验结果：
[0091] 采用同源重组的原理，即用1.9kb大小的bar基因表达盒交叉互换粉棒束孢中Ifkp4-1基因387bp的区域，敲除载体构建及验证过程如图7所示，成功扩增获得Ifkp4-1基因左右壁侧翼序列和bar基因元件，测序正确后按顺序依次连接后形成Ifkp4-1基因敲除盒，并成功连接到敲除骨架载体pCambiaMX9上，载体图谱及验证结果见8。
[0092] 2.Ifkp4-1基因回补盒的构建
[0093] 采用同源重组方法构建基因回补盒。
[0094] (1)Ifkp4-1基因回补片段扩增回收
[0095] 以野生型菌株FTRSY-2基因组为模板，用引物HB 3/4扩增Ifkp4-1及其假定的启动子序列，产物命名为kp4H。PCR反应产物电泳检测后切胶回收。
[0096] (2)回补质粒pCapneokp4构建
[0097] 将提取的质粒pGapneoR12进行BamH I酶切线性化，PCR反应产物电泳检测后切胶回收。具体步骤按照试剂盒说明书进行。
[0098] 将回收的线性化质粒pGapneoR12和Ifkp4-1基因回补片段kp4H进行同源重组连接，转化大肠杆菌，用引物R12F/R对进行菌液PCR验证；PCR检测结果为阳性的菌落，扩增后提取质粒，用BamH I对质粒进行酶切验证。
[0099] 实验结果：
[0100] 用回复引物HB 1/2扩增Ifkp4-1及其假定的启动子序列，即Ifkp4-1基因OFR框上游2000bp及下游300bp左右非编码取全长约3.0kb，测序成功后连接到回复骨架载体pGapneoR12上，成功构建pGapneokp4回复载体，回复载体构建及验证过程如图9所示。
[0101] 实施例4
[0102] 1.Ifkp4-1基因突变株生长、产孢及抗逆性能测试
[0103] 参照文献常规方法进行。以农杆菌转化法获得粉棒束孢的敲除菌株，利用bar基因引物bar F/R微量快速PCR验证初筛敲除转化子，以pCambiaMX9为阳性对照，野生菌株为阴性对照。
[0104] 为分析Ifkp4-1基因对粉棒束孢生长和产孢的影响，将野生型菌株及Ifkp4-1同源敲除和回复转化子分别接种到PDA培养基上，28℃培养7d后，测定其生长速率和产孢量。
[0105] 实验结果：
[0106] 野生菌株无扩增片段，而阳性质粒及随机挑选的阳性同源敲除突变子能够扩增出500bp左右的bar基因片段，证明bar基因已经成功插入，为进一步验证敲除转化子的准确性，同时采用原目的基因引物Ifkp4-1F/R进行PCR扩增，结果表明野生菌株能扩到约380bp左右的目的基因片段，而突变株由于目的基因破坏的缘故，没有扩增出条带，因此表明Ifkp4-1基因已经成功被敲除(图10)。采用原目的基因引物Ifkp4-1F/R进行PCR扩增，结果表明野生菌株及回复菌株均能扩到约380bp左右的目的基因片段，表明Ifkp4-1基因已经重新整合到基因组上，PCR验证结果如图所示，由于回复载体带有EGFP基因盒，可使用倒置荧光显微镜于400-500nm波长激发光下进行观察，突变株菌丝及孢子形态如图11所示。
[0107] 转化子的生长速率和产孢量果如表1所示，Ifkp4-1基因同源敲除化子的生长速率和产孢量均小于野生型，当Ifkp4-1基因回复后的生长速率和产孢量与野生型无较大差异；逆境胁迫实验结果如图12所示，与野生对照相比，两株敲除株对刚果红极为敏感，生长受到完全抑制，对碱性环境敏感，菌丝生长速率减慢，对NaCl、山梨醇等高渗条件胁迫不敏感，能正常生长和产孢，所有抗逆性能差异在基因的回补菌株中得到良好恢复，与野生株表现一致，紫外线照射1h和35℃处理时野生株和敲除株及回复株的生长速度菌受到抑制。
[0108] 表1转化子的生长速率和产孢量
[0109]
[0110] 2.Ifkp4-1基因敲除株毒力测定
[0111] (1)体表侵染
[0112] 以0.02％吐温-80为溶剂，使用新鲜活化的粉棒束孢孢子配制浓度为1×107分生孢子/mL的WT、敲除菌株分生孢子悬液。实验对象为4龄大蜡螟幼虫，接种方式为体表浸渍，每个处理3次重复，每个重复20头，浸于事先准备好的分生孢子悬浮液25S后取出，滤纸吸干体表水分并放入150mm培养皿中，置于28℃恒温培养箱保湿培养，逐日观察统计幼虫死亡数，及时清理病死幼虫，避免二次感染，将死亡个体挑出保湿培养，连续观察7d。
[0113] (2)体内注射
[0114] 以PBS为溶剂，使用新鲜活化的粉棒束孢孢子配制浓度为1×107分生孢子/mL的WT、敲除菌株分生孢子悬液。实验对象为4龄大蜡螟幼虫，接种方式为血腔注射，使用微量注射器从幼虫第三腹节气孔处注射孢悬液至幼虫血腔，接种量为10μL孢悬液/头虫(对照组为10μLPBS)，每处理30头虫，每12小时观察取样。直至幼虫全部死亡(或停止死亡)时停止取样。
[0115] 实验结果：
[0116] 结果如表2所示，分析数据可知，在采用浸渍法处理时，由于Ifkp4-1基因的敲除，导致粉棒束孢对大蜡螟侵染能力减弱，其校正死亡率虽然由24.44％增加到26.67％，但LT50值由26.53d增加到32.06d；采用注射法处理时，Ifkp4-1基因的敲除同样导致粉棒束孢对大蜡螟侵染能力减弱，其校正死亡率一致，LT50值增大到1.01d。由此表明Ifkp4-1基因影响粉棒束孢的致病力，可能是粉棒束孢杀虫毒力的正向调控因子。
[0117] 表2野生株与ΔIfkp4-1菌株处理大蜡螟幼虫的校正死亡率及致死中时间(LT50)[0118]
[0119] 3.Ifkp4基因在感病大蜡螟组织中表达分析
[0120] 配制浓度为1×107分生孢子/mL的WT菌株孢悬液，注射接种，28℃恒温培养箱保湿培养，接种0h、12h、24h、48h、72h之后取血淋巴、表皮、脂肪体及中肠组织，提RNA后，反转cDNA，进行RT-qPCR。
[0121] 实验结果：
[0122] 结果如图13所示：随侵染时间延长，Ifkp4-1及Ifkp4-2基因在各个组织中的表达量逐渐升高，并在侵染后24h表达量均达到最高；分析Ifkp4-1基因的表达情况可知，侵染12h能够在血液、中肠和脂肪体中检测到Ifkp4-1基因，侵染24h后Ifkp4-1基因在血液中的表达量最高，中肠及脂肪体中表达量次之，在表皮的表达量较少，之后随侵染时间延长，表达量降低，血液中表达量迅速下降，侵染后24h血液中几乎无Ifkp4-1基因表达，但侵染48h后在表皮、中肠和脂肪体中能检测大量Ifkp4-1基因表达，侵染72h后在表皮及脂肪体中依然能够检测到Ifkp4-1基因表达；分析Ifkp4-2基因的表达情况可知，侵染12h在表皮、血液及中肠中表达且在表皮中表达量最高，侵染24h后能够在表皮、血液、中肠及脂肪体检测到Ifkp4-2基因，且血液中表达量最高，随作用时间延长，不同组织中表达量均有不同程度的降低，Ifkp4-2基因在表皮、血液、中肠及脂肪体中表达量均显著低于Ifkp4-1基因。
[0123] 4.Ifkp4基因原核表达及多克隆抗体制备
[0124] (1)原核表达载体SUMO-pET28a-kp4构建
[0125] 提取SUMO-pET28a质粒，以引物Ifkp4F/R扩增Ifkp4-1基因cDNAORF全长，命名为kp4。PCR反应产物电泳检测后切胶回收。将提取的质粒SUMO-pET28a和回收的Ifkp4-1基因cDNA回收片段kp4分别进行BamH I/Sal I双酶切，切胶回收后将质粒SUMO-pET28a和Ifkp4-1基因cDNA回收片段kp4进行连接。
[0126] (2)KP4蛋白诱导表达及表达形式鉴定
[0127] 将含Ifkp4基因的重组大肠杆菌BL21(DE3)菌液在液体LB培养基中按1％接种量接种，37℃摇床振荡过夜培养至对数生长期，OD600值为0.5-0.6范围时，加入终浓度为1mM/L的ITPG诱导剂，再培养5-8h后离心收集菌体，ddH2O重悬后破碎，8000rpm离心10min，沉淀用5mL ddH2O重悬。取10μL上清液及沉淀重悬液进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝R-250染色4h后进行脱色，鉴定表达产物的存在形式。纯化蛋白并制备相应多克隆抗体。
[0128] (3)抗原及内源KP4蛋白Western Blot检测
[0129] 以制备的多克隆抗体(1：1000)为一抗、羊抗兔IgG-HRP(1：5000)为二抗，采用Western-blot方法分析多克隆抗体的特异性；分别提取粉棒束孢侵染大蜡螟不同时期各组织的总蛋白，检测感病大蜡螟组织中粉棒束孢KP4蛋白的表达量。
[0130] 实验结果：
[0131] PCR产物电泳鉴定大小正确(图14A)，测序成功后克隆到SUMO-pET28a载体上，酶切鉴定(图14B)后诱导表达。经SDS-PAGE分析，结果如图14C所示，目标蛋白大小大约为32kDa，在上清液中检测到少量目标蛋白的表达，但大多数以包涵体形式存在，表明在大肠杆菌BL21(DE3)中KP4蛋白表达在包涵体和上清中。
[0132] 如图15A所示，表达的重组蛋白能与多克隆抗体发生特异性血清学反应，在32kDa可见明显的免疫反应条带，其大小与预测Ifkp4-1基因重组蛋白分子量相近，同时抗体灵敏度高，1：1000稀释后可检测到500pg抗原。以多克隆抗体检测粉棒束孢侵染后的大蜡螟幼虫血液总蛋白(图15B)，结果显示侵染后12h及24h时可检测到KP4蛋白。
[0133] 实施例5
[0134] 重组KP4蛋白抑菌活性检测
[0135] 由于KP4对真菌具有广谱抗性，因此Ifkp4-1基因重组蛋白体外抑菌活性检测，采用生长速率法进行：重组蛋白采用1×PBS稀释后均匀涂布在事先备好的倒有PDA的24孔板上，使其终浓度为100μg/mL的重组蛋白，用双蒸水作空白对照，以43％戊唑醇乳油、50％多菌灵可湿性粉剂为阳性对照。28℃的条件下，将柑桔褐斑病菌(Alternaria alternata)；层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)；胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；烟管菌(Bjerkandera adusta)；球黑孢(Nigrospora sphaerica)；赭绿青霉(Penicillium ochrochloron)等从土壤及环境中分离到的多种真菌培养5d后，接种至24孔板中央，每个测试菌株三次重复；28℃保湿培养2d，采用十字交叉法量取菌落直径，以正常PDA培养基上菌落长满24孔板为对照，观察记录重组蛋白的抑菌情况。
[0136] 实验结果：
[0137] 如表3所示，终浓度为100μg/mL下，粉棒束孢KP4蛋白毒素对同样分离自蝙蝠蛾幼虫的青霉属真菌赭绿青霉具有较强的抑制作用，抑制率为29.37％，其次对烟管菌、球黑孢等土壤常见菌也具有一定的抑制作用，对胶孢炭疽菌等植物病原菌的抑制作用较弱，对柑桔褐斑病菌几乎无抑制作用，由此推测粉棒束孢KP4蛋白毒素对环境尤其是腐生土壤真菌具有一定的抑制作用，这可能与粉棒束孢的生长环境有关。
[0138] 表3 KP4重组蛋白对不同真菌的抑制率
[0139]
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