苹果蠹蛾特异性SS-COII引物及其应用
阅读：855发布：2020-05-13
专利汇可以提供苹果蠹蛾特异性SS-COII引物及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于农业 生物 技术领域，具体涉及 苹果蠹蛾 特异性SS-COII引物及其应用。本发明的特异性引物只对苹果蠹蛾具有扩增能 力 ，扩增产物大小为262bp，对单粒卵及成虫残体亦有良好的检测效果，本发明提高了苹果蠹蛾检测的准确性，节约了检测时间，适宜以 试剂 盒 的形式在进境 植物 检疫、国内植物检疫和田间防治中推广。，下面是苹果蠹蛾特异性SS-COII引物及其应用专利的具体信息内容。
苹果蠹蛾特异性SS-COII引物及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 苹果蠹蛾Cydia pomonella L.，别称苹果小卷蛾、苹果食心虫，属鱗翅目Lepidoptera、卷蛾科Tortricidae、小卷蛾亚科Olethreutinae、小卷蛾属Cydia，是一种世界性检疫害虫，被列为世界仁果类水果最严重的蛀果害虫之一，是我国重要的对外和对内检疫对象。苹果蠹蛾的寄主范围广泛，因此，加强对苹果蠹蛾的监测检测，是保障水果产业以及干果/坚果产业健康发展的必要前提。
[0003] 苹果蠹蛾幼虫为钻蛀型昆虫，常隐蔽发生，尤其在发生初期很难及早发现，传统形态学鉴定方法的难度大，准确性低，加强检疫和监测必需建立一套快速准确的分子检测方法。目前国际上用于苹果蠹蛾鉴定的方法主要有：1)形态特征鉴定；2)PCR技术等。但目前国内针对苹果蠹蛾尚没有标准的检测方法。
[0004] COI和COII技术曾用于鉴别苹果蠹蛾及其近缘种。mtDNA COI和mtDNA COII技术检测是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，然后将PCR产物回收、纯化、测序，根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果。而靶标种特异性SS-COII PCR检测技术是在mtDNA COII技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无及大小来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性好和稳定性强等优点。
[0005] 特异性引物的设计依赖于数据库中已有的序列信息。目前，数据库中蛀果类害虫的已知COII序列较少，其中相关的物种数量仅为11种，加上香梨优斑螟Euzophera pyriella Yang、枇杷暗斑螟Euzophera bigella(Zeller)和3种未知的物种，现有所掌握的序列信息共16种。同时，分析显示，上述不同物种间的碱基序列的同源性比较高，难以找到靶向苹果蠹蛾的特异性区段。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一对苹果蠹蛾特异性SS-COII引物。
[0007] 本发明的再一目的在于提供苹果蠹蛾特异性检测方法。
[0009] 根据本发明的具体实施方式的苹果蠹蛾特异性SS-COII引物，引物序列为：
[0010] CPZWF1：5′-ACCATCATTACGTTTATTATAC-3′；
[0011] CPZWR1：5′-AATTGTTCAGGAATGGATG-3′。
[0012] 使用上述苹果蠹蛾特异性SS-COII引物扩增获得苹果蠹蛾特异性基因片段，其核苷酸序列为：
[0013]
[0014] 根据本发明具体实施方式的苹果蠹蛾特异性检测方法，所述方法包括使用上述苹果蠹蛾特异性SS-COII引物进行PCR扩增的步骤。
[0015] 根据本发明具体实施方式的苹果蠹蛾特异性检测试剂盒，所述试剂盒包括上述苹果蠹蛾特异性SS-COII引物。
[0016] 本发明的有益效果：
[0017] (1)检测准确性高，本发明的根据苹果蠹蛾种特异性SS-COII标记设计的引物CPZWF1和CPZWR1，在PCR快速检测苹果蠹蛾时，可扩增出262bp的片段，不仅对苹果蠹蛾的单头成虫、2-5龄幼虫可以进行检测，对于单粒卵和单头初孵幼虫也能准确检测；
[0018] (2)操作简便快捷，本发明采用PCR技术，整个过程可在5个小时内完成，操作过程简单、快速、高效；
[0019] (3)特异性强，本发明设计的引物可特异性检测苹果蠹蛾，在其近缘种、属蛀果蛾中无扩增产物。
[0021] 图1显示特异性引物CPZWF1/CPZWR1对苹果蠹蛾及其近缘种、属蛀果蛾的PCR扩增结果，其中，M:分子量标准Trans2KTM；1:苹果蠹蛾Cydia pomonella L.；2:梨小食心虫Grapholita molesta Busck；3:沙果小食心虫Grapholita dimorpha(Komai)；4:桃小食心虫Carposina sasakii Matsumura；5:香梨优斑螟Euzophera pyriella Yang；6:枇杷暗斑螟Euzophera bigella(Zeller)；7:Lepidoptera sp.1；8:Lepidoptera sp.2；9:头细蛾Scrobipalpa sp.；10:阴性对照(超纯水)；
[0022] 图2显示引物CPZWF1/CPZWR1对苹果蠹蛾不同虫态和不同幼虫龄期的PCR扩增结TM果，其中，M:分子量标准Trans2K ；1:卵(单粒)；2:1龄幼虫(单头)；3:2龄幼虫；4:3幼若虫；
5:4龄幼虫；6:5龄幼虫；7:蛹；8:成虫(雌性)；9:成虫(雄性)；
5:4龄幼虫；6:5龄幼虫；7:蛹；8:成虫(雌性)；9:成虫(雄性)；
[0023] 图3显示引物CPZWF1/CPZWR1对苹果蠹蛾成虫残体的检测结果，其中，M:分子量标准Trans2KTM；1:头部；2:胸部；3:腹部；4:触角(1根)；5:前足(1条)；6:中足(1条)；7:后足(1条)；8:前翅(1只)；9:后翅(1只)；10：阴性对照(超纯水)；
[0024] 图4显示引物CPZWF1/CPZWR1对采自不同地区的苹果蠹蛾的PCR扩增结果，其中，M:分子量标准Trans2KTM；1:甘肃酒泉；2:甘肃兰州；3:甘肃武威；4:甘肃张掖；5:内蒙古额济纳旗；6:内蒙古阿左旗；7:内蒙古乌海；8:宁夏青铜峡；9:宁夏中卫；10:新疆阿拉尔；11:吉林珲春；12:德国；13:巴基斯坦；14:阴性对照(超纯水)；
[0025] 图5为特异性引物CPZWF1/CPZWR1对苹果蠹蛾最低检测阈值的测定，[0026] M:分子量标准Trans2KTM；1-13:分别为658.33±61.66×103,329.17×103,164.58×103,82.29×103,41.15×103,20.57×103,10.29×103,5.14×103,2.57×103,1.29×103,642.90,321.45,160.73,80.36pg/μL，14:阴性对照(超纯水)。
具体实施方式
[0027] 实施例1苹果蠹蛾特异性引物的制备
[0028] 以苹果蠹蛾线粒体mtDNA COII基因序列中特异性区段为目标序列，设计苹果蠹蛾特异性引物(CPZWF1/CPZWR1)，其序列为：
[0029] Primer CPZWF1：5’-ACCATCATTACGTTTATTATAC-3’
[0030] Primer CPZWR1：5’-AATTGTTCAGGAATGGATG-3’。
[0031] 本发明以苹果蠹蛾DNA为模板，进行退火温度为48-53℃的温度梯度PCR，以确定最佳扩增条件。对于CPZWF1/CPZWR1引物对，各退火温度下均能得到262bp的单一条带，且退火温度为51℃时扩增得到的条带最为清晰明亮，故此，选用退火温度为51℃。
[0032] 实施例2引物对苹果蠹蛾的特异性扩增效果
[0033] 利用引物primer CPZWF1/CPZWR1以苹果蠹蛾DNA为模板，以梨小食心虫、沙果小食心虫、桃小食心虫、香梨优斑螟、枇杷暗斑螟、Lepidoptera sp.1、Lepidoptera sp.2和头细蛾Scrobipalpa sp.等8种其他常见种类的蛀果蛾为对照进行SS-COII PCR扩增。
[0035] 取5μL PCR产物用含有Gold view的1.0％(重量/体积)琼脂糖凝胶进行电泳分离，然后于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
[0036] 如图1所示，在1泳道的苹果蠹蛾中扩增出了262bp的目的条带，在其他8种近缘属、种的蛀果蛾中均无扩增产物，因此，本发明筛选的来自苹果蠹蛾线粒体DNA的SS-COII PCR扩增引物的特异性强。
[0037] 实施例3引物CPZWF1/CPZWR1对苹果蠹蛾不同虫态和幼虫龄期的扩增效果[0038] 利用引物CPZWF1/CPZWR1以不同虫态和不同幼虫龄期的苹果蠹蛾DNA为模板进行PCR扩增。
[0039] 取不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、雌性成虫和雄性成虫)的单头/单粒苹果蠹蛾(其中3-5龄幼虫取1/2体长，成虫取腹部)，提取DNA，于-20℃保存，备用。
[0040] 结果如图2所示，泳道1～9均显示262bp的目的条带，说明苹果蠹蛾的单粒卵以及单头初孵幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫、5龄幼虫、蛹、苹果蠹蛾的雌性成虫和雄性成虫均可成功扩增出目的基因，因此，本发明的特异性引物的准确率高。
[0041] 实施例4引物CPZWF1/CPZWR1对苹果蠹蛾成虫残体的扩增效果
[0042] 利用引物CPZWF1/CPZWR1，以苹果蠹蛾成虫不同残体的DNA为模板进行PCR扩增。
[0043] 将不同成虫残体(雌性，包括头部、胸部、腹部、触角、前足、中足、后足、前翅和后翅)分别获取残体的DNA。
[0044] 结果如图3所示，头部、胸部、腹部、触角、前足、中足、后足、前翅和后翅对应的泳道上均扩增出了262bp目的条带，因此，本发明的特异性引物CPZWF1/CPZWR1对成虫残体的检测准确率高。
[0045] 实施例5引物CPZWF1/CPZWR1对不同地区的苹果蠹蛾的扩增结果
[0046] 将采自田间(甘肃酒泉、甘肃兰州、甘肃武威、甘肃张掖、内蒙古额济纳旗、内蒙古阿左旗、内蒙古乌海、宁夏青铜峡、宁夏中卫、新疆阿拉尔、吉林珲春)和来自德国和巴基斯坦的苹果蠹蛾幼虫(除吉林珲春为性诱雄性成虫(腹部)外，其他种群均为3龄，约1/2体长)，提取DNA，并进行PCR扩增。
[0047] 结果如图4所示，不同地区对应的泳道上菌扩增出了262bp的目的条带，其条带清晰，表明引物CPZWF1/CPZWR1对不同地区的苹果蠹蛾均具有很好的检测鉴定效果。
[0048] 实施例6测定引物CPZWF1/CPZWR1对苹果蠹蛾检测阈值
[0049] 以不同稀释倍数的苹果蠹蛾的DNA为模板进行PCR扩增，苹果蠹蛾的DNA，将获得的原模板溶液以2倍递减梯度稀释至浓度为80.36pg/μL，相当于由1/200，1/400，1/800，1/1600，1/3200，1/6400，1/12800，1/25600,1/51200，1/102400，1/204800，1/409600，1/
819200头5龄幼虫；，取1μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。
819200头5龄幼虫；，取1μL作为PCR扩增的模板，直接加到PCR反应体系中。
[0050] 结果如图5所示，9泳道对应的2.57×103ng/μL能扩增出262bp的目的条带，因此，本发明能检测到的最低模板DNA浓度为2.57ng/μL，相当于1/51200头5龄幼虫，具有较高的灵敏度。
[0051] 实施例7不同引物的筛选比较
[0053] 表1苹果蠹蛾特异性SS-COII引物的筛选与评价
[0054]
[0055] 结果显示，软件设计提供的3对引物的特异性不强，特异性区段与靶标种苹果蠹蛾的同源性只有93-96％，而与其他近缘种的同源性依据不同的引物对不足90-93％，重叠现象严重，无法进行特异性区段的扩增。相对于软件设计提供的引物，本发明引物的特异性强，扩增的特异性区段与靶标种苹果蠹蛾COII基因序列的同源性达到98-100％，与其他近缘种的同源性<93％。
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