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一种乙酰氨基 葡萄糖产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

阅读：830发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌通过敲除谷氨酸棒杆菌的L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh得到；重组谷氨酸棒杆菌中还表达有来源于秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖脱乙酰化酶编码基因GNA1。本发明的重组谷氨酸棒杆菌发酵葡萄糖72h的乙酰氨基葡萄糖产量可高达28.6g/L。，下面是一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述重组谷氨酸棒杆菌通过敲除谷氨酸棒杆菌的L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh得到；所述重组谷氨酸棒杆菌中还表达有来源于秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖脱乙酰化酶编码基因GNA1。
2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA。
3.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA。
4.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh如NCBI-Gene ID:1020853所示。
5.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于：所述氨基葡萄糖脱乙酰化酶编码基因GNA1通过表达载体pJYW-4表达。
6.一种权利要求1-5中任一项所述的提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh的基因敲除框；
(2)经同源重组，用步骤(1)中的基因敲除框敲除组谷氨酸棒杆菌基因组中的L-乳酸脱氢酶编码基因ldh；
(3)克隆秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖脱乙酰化酶编码基因GNA1，连接到质粒pJYW-4-ceN上，得到重组质粒，然后将所述重组质粒转化进已敲除L-乳酸脱氢酶编码基因ldh的谷氨酸棒杆菌，得到所述提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组谷氨酸棒杆菌。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述基因敲除框中含有卡那霉素抗性基因kana，在步骤(2)中，所述卡那霉素抗性基因kana代替谷氨酸棒杆菌基因组中的L-乳酸脱氢酶编码基因ldh。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述谷氨酸棒杆菌敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA。
9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA。
10.权利要求1-5中任一项所述的提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组谷氨酸棒杆菌在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

说明书全文

一种乙酰氨基 葡萄糖产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及代谢工程领域，尤其涉及一种一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其应用。

背景技术

[0002] N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)作为葡萄糖的一种衍生物，是在葡萄糖的二号位经基由一个乙酰氨基所替代而成，在自然界中广泛存在。其主要应用于医药、食品、保健等领域。可有效治疗关节炎，参与肝肾解毒和护肝等作用。在诸多发达国家，GlcNAc已经作为食品配料而被广泛应用。对于GlcNAc的生产方法目前主要有甲壳素水解法、生物转化法和微生物合成法。相对前两者，微生物合成法具有生产时间短，产量高，效率高，对环境污染小等诸多优点，从而受到广大学者的青睐。

[0003] 微生物发酵法具有可持续性、绿色环保的社会经济效益，采用微生物发酵法生产葡萄糖胺(GlcN)和GlcNAc是解决上述问题的有效途径。由于GlcNAc在弱酸性条件下可以转化为GlcN所以生产GlcNAc的工程菌也可以在微生物发酵得到GlcNAc后，进一步将GlcNAc转化为GlcN，用于GlcN生产。GlcNAc比GlcN具有更强的稳定性，因此本研究以GlcNAc为最终目标产品进行代谢调控。目前，己有若干微生物发酵法生产GlcN和GlcNAc的相关报道，但相关方法依然存在诸多问题，限制了相关方法在工业生产中的应用，新的生产方法函待开发。

[0004] 谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性菌，它作为一种食品级的微生物已经应用于诸多氨基酸的工业化发酵生产中，如谷氨酸、缬氨酸、赖氨酸等等。近年来学者们开始研究利用谷氨酸棒杆菌生产非氨基酸物质。相比于大肠杆菌来说，谷氨酸棒杆菌具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌体污染的概率较低等优点，因此它也在基因工程领域发挥着重要作用。然而GlcNAc合成途径的副产物乳酸的积累对细胞生长是有毒的，并且与GlcNAc的合成竞争碳源。为了加强GlcNAc合成，目前人们使用基因敲除来阻断乳酸的形成。如CN 110195036A通过敲除乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA并表达来源于秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)的氨基葡萄糖脱乙酰化酶编码基因GNA1来提高谷氨酸棒杆菌的乙酰氨基葡萄糖产量。文献“谷氨酸棒杆菌ldh基因的敲除，生物技术通报，2012(2)，伍展红等”公开了敲除谷氨酸棒杆菌ldh基因后会对菌株的生长速度造成影响，但是否会导致其乙酰氨基葡萄糖产量发生变化，该文献却并未公开。

发明内容

[0005] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种一种乙酰氨基葡萄糖产量提高的重组谷氨酸棒杆菌及其应用，本发明的重组谷氨酸棒杆菌敲除了L-乳酸脱氢酶基因ldh，并表达了来源于秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖脱乙酰化酶编码基因GNA1，使得谷氨酸棒杆菌的乙酰氨基葡萄糖产量提高。

[0006] 本发明的技术方案如下：

[0007] 本发明的一种提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌通过敲除谷氨酸棒杆菌的L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh得到；重组谷氨酸棒杆菌中还表达有来源于秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖脱乙酰化酶编码基因GNA1。

[0008] 进一步地，谷氨酸棒杆菌敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA。

[0009] 进一步地，谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA。谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA的构建方法参照CN 110195036A。

[0010] 进一步地，L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh如NCBI-Gene ID:1020853所示。

[0011] 进一步地，氨基葡萄糖脱乙酰化酶编码基因GNA1通过表达载体pJYW-4表达，以启动子Ptac控制葡萄糖乙酰化酶基因的表达。氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1如NCBI-Gene ID:179437所示。

[0012] 启动子Ptac由PTrp启动子和Plac启动子杂合而成，具有更高的转录效率。启动子Ptac的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0013] 本发明还提供了一种上述提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括以下步骤：

[0014] (1)构建L-乳酸脱氢酶的编码基因ldh的基因敲除框；

[0015] (2)经同源重组，用步骤(1)中的基因敲除框敲除组谷氨酸棒杆菌基因组中的L-乳酸脱氢酶编码基因ldh；

[0016] (3)克隆秀丽隐杆线虫的氨基葡萄糖脱乙酰化酶编码基因GNA1，连接到质粒pJYW-4-ceN上，在GNA1基因的3’非翻译区插入重复性回文序列基因的3’非翻译区插入重复性回文序列，构建重组质粒pJYW-4-ceN-REP，通过代谢工程改造，得到重组质粒，然后将重组质粒转化进已敲除L-乳酸脱氢酶编码基因ldh的谷氨酸棒杆菌，得到提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组谷氨酸棒杆菌。

[0017] 进一步地，在步骤(1)中，基因敲除框中含有卡那霉素抗性基因kana，在步骤(2)中，卡那霉素抗性基因kana代替谷氨酸棒杆菌基因组中的L-乳酸脱氢酶编码基因ldh。

[0018] 进一步地，在步骤(2)中，谷氨酸棒杆菌敲除了乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶编码基因NagA和乙酰氨基葡萄糖脱氨基酶编码基因GamA。

[0019] 进一步地，在步骤(2)中，谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌C.glutamicum S9114ΔnagA-ΔgamA。

[0020] 本发明还公开了上述提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组谷氨酸棒杆菌在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

[0021] 进一步地，生产N-乙酰氨基葡萄糖时，将本发明所构建的重组谷氨酸棒杆菌的种子液以8％的接种量接种至以葡萄糖为碳源的无菌培养基，在30℃条件下通气发酵72小时。

[0022] 进一步地，发酵过程中，转速为220rpm。

[0023] 借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

[0024] 本发明通过敲除编码催化由丙酮酸形成乳酸的L-乳酸脱氢酶的ldh基因，来阻断宿主菌谷氨酸棒杆菌合成副产物乳酸的途径。本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌可实现乙酰氨基葡萄糖在胞外积累，其浓度最高为28.6g/L，比起未改造菌株提升16.7％。为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。

[0025] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

[0026] 图1是本发明实施例2中重组谷氨酸棒杆菌在不同时间下的乙酰氨基葡萄糖产量测试结果。

具体实施方式

[0027] 下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0028] (一)本发明以下实施例中，所使用的培养基如下：

[0029] 种子活化培养基液体(LBG)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0，葡萄糖5.0，装液量20mL每250mL三角瓶。

[0030] 种子活化培养基固体(LBG固体)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，葡萄糖5.0，营养琼脂15.0-20.0。

[0031] 感受态培养基(g/L):蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0，甘氨酸30.0，异烟肼4.0，同时加入10mL的Tween 80,装液量50mL每500mL三角瓶。

[0032] 电击转化后恢复培养基LBHIS(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏2.5，NaCl 5.0，脑心浸液18.5，山梨醇91.0。

[0033] 转化子检出培养基固体(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏2.5，NaCl 5.0，脑心浸液18.5，山梨醇91.0，营养琼脂15.0-20.0。

[0034] 种子培养基(g/L)：葡萄糖25.0，玉米浆20.0，KH2PO4 1.0，(NH4)2SO4 0.5，尿素1.25，pH 7.0。

[0035] 发酵培养基(g/L)：葡萄糖40.0，玉米浆20.0，KH2PO4 1.0，(NH4)2SO4 20.0，MgSO40.5，CaCO3 20.0，pH 7.0。

[0036] 灭菌条件：115℃，20min，所有培养基用于转化子检出或用于重组菌培养时加入25mg/L硫卡那霉素。

[0037] (二)乙酰氨基葡萄糖的测定方法：

[0038] 高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260，RID检测器，HPX-87H柱(Bio-Rad Hercules,CA)，流动相:5mM H2SO4，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。

[0039] (三)谷氨酸棒杆菌电转感受态的制备

[0040] (1)将Corynebacteriumglutamicum接种于LBG培养基(需要在新鲜培养的斜面上进行挑选，否则会影响菌体的生长)，置于巡回式摇床(200rpm)上，30℃培养16h，OD562达到3.0。

[0041] (2)以10％的接种量将步骤(1)中的菌液转接入感受态培养基中OD562达到0.3，置于巡回式摇床(200rpm)上，30℃培养至OD562达到0.9(培养约3-5h，处于对数生长期即可，一般如果菌浓的持续较低约0.6左右也可以继续后续操作)。需要保证菌体浓度尽量要浓，一般浓缩倍数为100倍(50mL感受态培养基浓缩至0.5mL制备5管感受态细胞)。

[0042] (3)菌液冰水浴15min，4000rpm，4℃离心10min，弃去上清。

[0043] (4)用30mL预冷10％甘油充分悬浮菌体，4000rpm，4℃离心10min，弃去上清，重复洗涤四次。

[0044] (5)用500μL预冷10％甘油重悬细胞(浓缩100倍)，1.5mL无菌离心管分装，每管100μL。

[0045] (6)-80℃保存待用(为保证感受态的转化效率最好现用现做，不能放置超过1周，否则由于感受态细胞裂解细胞内容物释放，在后续电击转化过程中造成电转杯的击穿，同时影响转化效率)。

[0046] (四)谷氨酸棒杆菌的电击转化：

[0047] (1)-80℃保存的谷氨酸棒杆菌感受态，冰浴中融化。

[0048] (2)加入1-5.0μL质粒混匀(DNA总量约为1.0μg)，冰浴5-10min。

[0049] (3)加入于预冷的0.1cm电击杯中，1.8KV 电压5ms电击2次。

[0050] (4)迅速加入预热的恢复用培养基(LBWS)1.0mL混匀并转移到新的1.5mL无菌离心管中，46℃水浴6min，后放入冰浴中。

[0051] (5)将菌体置于巡回式摇床(100rpm)上，30℃后培养2h。

[0052] (6)6000rpm，常温离心1min，涂布到加入对应抗性的转化子检出平板中，于30℃恒温培养箱，培养2-3天。

[0053] (7)感受态效率验证:加入5.0μL无菌ddH2O作为阴性对照，无菌落，阳性对照加入1-5μL质粒pXMJl9(DNA总量约为1.0μg)，长出大量菌落。

[0054] 实施例1敲除L-乳酸脱氢酶编码基因(ldh)

[0055] 根据NCBI上公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032)L-乳酸脱氢酶编码基因(ldh)(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)上下游序列，设计敲除同源臂扩增引物，左臂上、下游引物分别为LdhloxPUF(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)和LdhloxPUR(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)；右臂上、下游引物分别为LdhloxPDF(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)和LdhloxPDR(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)；分别以谷氨酸棒杆菌S9114菌株基因组DNA为模板，通过PCR将左臂和右臂扩增下来。

[0056] 根据质粒pDTW-202(由江南大学王小元博士提供)上loxp-kana-loxp基因的核苷酸系列设计引物KanloxpldhF(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)和KanloxpldhR(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)，以质粒pDTW-202为模板将loxp-kana-loxp基因扩增loxp基因和卡那霉素抗性基因。通过酶切连接的方法，用快切酶XhoI/XbaI酶切2小时后的左臂、用快切酶XbaI/BamHI酶切2小时后的loxp-kana-loxp基因片段、用快切酶BamHI/EcoRI酶切2小时的右臂、用快切酶XhoI/EcoRI酶切2小时的质粒pBluescriptIISK(+)(由江南大学王小元博士提供)用T4连接酶于16℃过夜连接。

[0057] 将构建好的带有ldh敲除框的pBluescriptIISK(+)连接体系转化E.coli JM109感受态细胞(感受态制备方法详见Takara大肠杆菌感受态试剂盒说明书；货号：9128)，挑选菌落PCR正确的转化子进行测序验证，得到重组质粒pBluescriptIISK(+)-ldh。提取重组质粒pBluescriptIISK(+)-ldh电转化谷氨酸棒杆菌S9114-ΔNagA-GamA，通过卡那霉素抗性平板筛选，菌落PCR验证，确认敲除框左右臂均结合到S9114基因组上，确认L-乳酸脱氢酶编码基因ldh敲除，得到谷氨酸棒杆菌S9114-ΔNagA-GamA-Δldh，经过72h发酵培养后该菌株的GlcNAc产量为24.7g/L。

[0058] 实施例2重组谷氨酸棒杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖

[0059] 按照CN 110195036 A的方法构建重组质粒PJYW-4-ceN-REP，将重组质粒PJYW-4-ceN-REP通过电击转化法转化到谷氨酸棒杆菌S9114-ΔNagA-GamA-Δldh菌株中，测序结果正确的即为重组谷氨酸棒杆菌。

[0060] 将测序结果正确的分别含有将质粒PJYW-4-ceN-REP的重组谷氨酸棒杆菌菌株S9114-ΔNagA-GamA-Δldh于甘油管接种划线LBG平板(添加硫卡那霉素25mg/L)，30℃下220rpm培养18h后再挑选单菌落重新划线LBG平板直至长出大量菌落。

[0061] 接种一环单菌落至种子培养基，30℃下220rpm培养16至18h至细胞生长对数前期。按起始OD562为1.7-1.8的接种量将种子培养液接种至发酵培养基中，30℃220rpm培养100h。
每隔12h取一次菌液，测量OD562，葡萄糖剩余量及GlcNac生成量。72h后GlcNac产量为28.6g/L(图1)。通过在已敲除L-乳酸脱氢酶编码基因ldh的宿主菌中过表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因(GNA1)，实现了乙酰氨基葡萄糖在重组谷氨酸棒杆菌胞外产量的提高。

[0062] 以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

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