一种新型G蛋白偶联受体GPR84抑制剂及其应用
阅读：164发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种新型G蛋白偶联受体GPR84抑制剂及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 属于 肿瘤 防治技术领域，具体涉及一种新型G蛋白偶联受体GPR84 抑制剂 及其应用的 专利 申请事宜。该抑制剂化学名称为：6-[（4-乙基苯基） 氨 磺酰基]-N-（2-甲基环己基）-4- 氧 代-1H-喹啉-3-羧酰胺,与GPR84可有效结合,通过在肿瘤微环境中发挥作用来发挥肿瘤抑制、肿瘤 预防 或 治疗 效果。 发明 人 通过对GPR84蛋白结构分析，对可以与GPR84结合的小分子抑制剂进行了进一步筛选。初步验证结果表明，筛选所得小分子抑制剂ZINC09680069，可以抑制MDSCs产生和功能，改善肿瘤微环境。而进一步食管癌动物模型饲喂结果也表明，该小分子抑制剂可以在肿瘤预防或治疗中发挥较好效果。，下面是一种新型G蛋白偶联受体GPR84抑制剂及其应用专利的具体信息内容。
1.一种新型G蛋白偶联受体GPR84抑制剂，其化学名称为：6-[（4-乙基苯基）氨磺酰基] -N-（2-甲基环己基）-4-氧代-1H-喹啉-3-羧酰胺，分子式为C25H29N3O4S，分子量为467.591，其与GPR84有效结合，结构式如下：
。
2.利用权利要求1所述GPR84抑制剂所制备肿瘤治疗或预防用药剂，其特征在于，包括可人体接受的生理盐水和/或稳定剂和/赋形剂。
3.权利要求1或2所述GPR84抑制剂在制备肿瘤药剂中的应用，其特征在于，通过在肿瘤微环境中发挥作用来发挥肿瘤抑制、肿瘤预防或治疗效果。
4.如权利要求3所述GPR84抑制剂在制备肿瘤药剂中的应用，其特征在于，所述肿瘤，具体例如为与食管癌相关肿瘤。
5.如权利要求3所述GPR84抑制剂在制备肿瘤药剂中的应用，其特征在于，GPR84抑制剂特异性与G蛋白偶联受体GPR84有效结合，通过抑制G蛋白偶联受体GPR84活化，来发挥肿瘤抑制、肿瘤治疗或预防作用。
一种新型G蛋白偶联受体GPR84抑制剂及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 食管癌是一种常见的恶性肿瘤性癌症，全球每年新发食管癌约50万例，其中大约50%发生在中国，5年生存率不到20%。食管癌是一种极具中国人特色的恶性肿瘤，在流行特征、发病危险因素及组织病理类型等方面与西方发达国家存在巨大的差异，因此需要以中国地区食管癌患者为研究对象，探明其发病的机制及进展因素，为中国食管癌的精准治疗提供可靠的手段。
[0003] 就食管癌的治疗而言，传统的食管癌治疗手段包括手术、化疗、放疗及辅助支持治疗，但疗效有限。基于癌症发病机制即癌基因驱动子的突变，靶向治疗在肺癌、乳腺癌等治疗中取得了较好的治疗效果。但是，食管癌组织的特性阻碍了靶向治疗在食管癌患者中的开发与应用。
[0004] 近年来，随着免疫系统在肿瘤的发生及发展中的角色被逐渐诠释清晰，研发出来以免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）疗法和基因工程T细胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T，T cell receptor engineered T cell，TCR-T）为代表的免疫疗法，并且在临床应用中显示了巨大的潜力。然而，CAR-T细胞疗法在肺癌、肝癌、结直肠癌及乳腺癌等实体肿瘤中的治疗效果普遍较差，研究分析认为这与实体肿瘤局部的肿瘤免疫抑制微环境密切相关。而就相关免疫疗法在食管癌治疗中应用而言，筛选并鉴定调控食管癌免疫微环境的关键分子，则可为免疫治疗手段在食管癌治疗过程中的应用奠定良好理论和应用基础。
[0005] 现有研究中，G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptor，GPCRs，GPCR）是介导许多细胞外信号如小分子、光子和蛋白质的细胞应答的七次跨膜结构域受体；其在包括代谢调节、发育、激素稳态、炎症反应和摄食行为等各种生理过程中发挥着重要作用。因此，GPCR被认为是开发相关人类疾病药物的靶点。现有研究中，针对G蛋白偶联受体尽管已有较多研究，但就该蛋白与食管癌相关性以及部分特定蛋白受体如何在食管癌预防、评估中加以应用，目前尚未见到较好报道。发明内容
[0006] 基于特定G蛋白偶联受体GPR84与食管癌关系，本申请目的在于提供一种针对G蛋白偶联受体GPR84的新型抑制剂，从而为食管癌的预防、治疗奠定一定技术基础。
[0007] 本申请所采取的技术方案详述如下。
[0008] 一种新型G蛋白偶联受体GPR84抑制剂，其化学名称为：6-[（4-乙基苯基）氨磺酰基] -N-（2-甲基环己基）-4-氧代-1H-喹啉-3-羧酰胺，分子式为C25H29N3O4S，分子量为467.591，其与GPR84可有效结合，结构式表示为：
或者 。
或者 。
[0009] 所述GPR84抑制剂在制备肿瘤药剂中的应用，特异性与G蛋白偶联受体GPR84有效结合，通过抑制G蛋白偶联受体GPR84活化，来发挥肿瘤抑制、肿瘤治疗或预防作用；所述G蛋白偶联受体GPR84，研究认为，G蛋白偶联受体GPR84属于一种跨膜蛋白，该蛋白特异性表达于肿瘤免疫抑制微环境中，是肿瘤免疫抑制微环境形成的基础，通过靶向该受体，抑制该受体蛋白表达生成，可增强免疫治疗手段在肿瘤治疗中的治疗效果。
[0010] 所述GPR84抑制剂在制备肿瘤药剂中的应用，所述肿瘤，具体例如为与食管癌相关肿瘤。
[0011] 本申请中，发明人基于前期对G蛋白偶联受体GPR84在肿瘤微环境免疫状态调控中作用研究，通过对GPR84蛋白结构分析，对可以与GPR84结合的小分子抑制剂进行了进一步筛选。初步验证结果表明，筛选所得小分子抑制剂ZINC09680069，可以抑制MDSCs产生和功能，改善肿瘤微环境。而进一步食管癌动物模型饲喂结果也表明，该小分子抑制剂可以在肿瘤预防或治疗中发挥较好效果。附图说明
[0012] 图1为GPR84蛋白的3D结构虚拟模型；图 2为筛选所得9种小分子抑制剂对MDSCs功能分子NCF4表达的影响；
图3为不同小分子抑制剂对MDSCs的TGF-β和IL10分泌能力的调控作用；实验过程中，利用GM-CSF联合G-CSF诱导的MDSCs，然后分别加入编号为32、36、48和84的小分子抑制剂处理
48h，收集上清，用ELISA检测TGF-β和IL10的分泌水平；A图为TGF-β检测结果，B图为IL10检测结果；
图4为小分子抑制剂对MDSCs分化影响和胞内Ca+流水平测定结果；实验过程中，分析小分子抑制剂对MDSCs分化影响时，收集C57BL/6小鼠骨髓细胞，加入GM-CSF和G-CSF诱导MDSCs产生，同时加入编号为32等4种小分子化合物，72h后收集细胞，流式检测MDSCs比例，并进行统计分析；检测胞内Ca+流水平时，收集不同处理组MDSCs，标记Ca+流探针Fluo 3-AM，流式检测FITC荧光强度以评估MDSCs胞内Ca+流水平；A图为小分子抑制剂对MDSCs分化影响情况，B图为胞内Ca+流水平测定结果；
图5为编号32号抑制剂与GPR84结合特异性的检测；实验过程中，收集食管癌患者肿瘤组织，利用磁珠分选方法获得GPR84+MDSCs和GPR84-MDSCs，加入GM-CSF和G-CSF维持的同时，给予32号小分子抑制剂处理48h，流式检测MDSCs凋亡情况，并作统计学分析；A图左侧为32号小分子抑制剂结构式，右侧为与GPR84结合情况的3D模型；B图为与细胞结合后的流失检测结果；
图6为编号32号抑制剂对T细胞影响情况；实验过程中，收集食管癌患者外周血，利用淋巴细胞分离液和密度梯度离心法获取单细胞悬液，计数后进行培养，加入32号小分子，48h+ + + + + +
后收集细胞，流式检测CD4T细胞、CD8T细胞、CD8PD-1 T细胞、CD8TIM3T细胞比例变化，并进行统计学分析；
图7为抑制剂对MDSCs功能分子表达情况分析；实验过程中，收取C57BL/6小鼠来源的骨髓细胞，取出1×107作为新鲜骨髓细胞对照，剩余细胞加入GM-CSF和G-CSF诱导MDSCs生成，之后取得MDSCs后加入32号小分子和商品化GPR84拮抗剂（antagonist）进行处理48h，收集细胞，利用荧光定量PCR检测MDSCs功能分子的表达情况；
图8为食管癌小鼠体重变化情况；实验过程中，4-NQO作用第112天，将诱导食管癌成功的小鼠随机分为3组，分别通过饮水的方式费用DMSO、商品化GPR84拮抗剂和32号小分子处理，动态监测小鼠体重变化以评估食管癌的进展情况。
图3为不同小分子抑制剂对MDSCs的TGF-β和IL10分泌能力的调控作用；实验过程中，利用GM-CSF联合G-CSF诱导的MDSCs，然后分别加入编号为32、36、48和84的小分子抑制剂处理
48h，收集上清，用ELISA检测TGF-β和IL10的分泌水平；A图为TGF-β检测结果，B图为IL10检测结果；
图4为小分子抑制剂对MDSCs分化影响和胞内Ca+流水平测定结果；实验过程中，分析小分子抑制剂对MDSCs分化影响时，收集C57BL/6小鼠骨髓细胞，加入GM-CSF和G-CSF诱导MDSCs产生，同时加入编号为32等4种小分子化合物，72h后收集细胞，流式检测MDSCs比例，并进行统计分析；检测胞内Ca+流水平时，收集不同处理组MDSCs，标记Ca+流探针Fluo 3-AM，流式检测FITC荧光强度以评估MDSCs胞内Ca+流水平；A图为小分子抑制剂对MDSCs分化影响情况，B图为胞内Ca+流水平测定结果；
图5为编号32号抑制剂与GPR84结合特异性的检测；实验过程中，收集食管癌患者肿瘤组织，利用磁珠分选方法获得GPR84+MDSCs和GPR84-MDSCs，加入GM-CSF和G-CSF维持的同时，给予32号小分子抑制剂处理48h，流式检测MDSCs凋亡情况，并作统计学分析；A图左侧为32号小分子抑制剂结构式，右侧为与GPR84结合情况的3D模型；B图为与细胞结合后的流失检测结果；
图6为编号32号抑制剂对T细胞影响情况；实验过程中，收集食管癌患者外周血，利用淋巴细胞分离液和密度梯度离心法获取单细胞悬液，计数后进行培养，加入32号小分子，48h+ + + + + +
后收集细胞，流式检测CD4T细胞、CD8T细胞、CD8PD-1 T细胞、CD8TIM3T细胞比例变化，并进行统计学分析；
图7为抑制剂对MDSCs功能分子表达情况分析；实验过程中，收取C57BL/6小鼠来源的骨髓细胞，取出1×107作为新鲜骨髓细胞对照，剩余细胞加入GM-CSF和G-CSF诱导MDSCs生成，之后取得MDSCs后加入32号小分子和商品化GPR84拮抗剂（antagonist）进行处理48h，收集细胞，利用荧光定量PCR检测MDSCs功能分子的表达情况；
图8为食管癌小鼠体重变化情况；实验过程中，4-NQO作用第112天，将诱导食管癌成功的小鼠随机分为3组，分别通过饮水的方式费用DMSO、商品化GPR84拮抗剂和32号小分子处理，动态监测小鼠体重变化以评估食管癌的进展情况。
具体实施方式
[0013] 下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。
[0014] 实施例1发明人在前期对GPR84蛋白功能及其结构初步研究基础上，发明人进一步对GPR84的3D结构进行了分析，并就具体小分子抑制剂进行筛选和验证，具体过程简要介绍如下。
[0016] 基于此3D结构，就小分子抑制剂可能结合位点进行了选择和设计，然后依据胞外区的两个可能结合位点和现有河南省功能生物大分子重点实验室的小分子结构库，发明人初步筛选获得了9个选择结合力较高、氢键较稳定的、可能的用于抑制GPR84活化的小分子化合物，具体筛选结果如下表所示：。
[0017] 实施例2实施例1中，由于相关抑制剂仅是依据3D模拟结构进行的初步筛选，因此对于筛选所得抑制剂尚需进行进一步验证和分析后，才能对其是否可以发挥实际抑制功能进行进一步确认，本实施例就相关验证过程简要介绍说明如下。
[0018] （1）不同抑制剂对MDSCs（Myeloid-derived suppressor cells，骨髓来源的抑制性细胞）功能分子NCF4（Recombinant Human Neutrophil Cytosolic Factor 4，重组人中性粒细胞胞浆因子 4）的调控作用参考现有技术（Effective combinatorial immunotherapy for castration-resistant prostate cancer, Nature, 2017），利用GM-CSF（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）联合G-CSF（粒细胞集落刺激因子）诱导小鼠骨髓细胞向MDSCS转化后，分别加入实施例1中筛选所得9种小分子抑制剂（购自公开渠道，或者由发明人委托其他单位加工制备成纯品），以NCF4表达情况作为评价指标，用来评价抑制剂对MDSCs功能分子表达的调控作用。具体操作参考如下：
收集6周龄C57BL/6小鼠的骨髓细胞，加入GM-CSF（10ng/mL）联合G-CSF（10ng/mL）诱导
72h后，收集悬浮MDSCs细胞；
继续加入GM-CSF和G-CSF的同时，分别加入实施例1中9种不同的抑制剂（加入后终浓度均为10μM）进行处理48h后，收集MDSCs，应用荧光定量PCR检测NCF4的表达。
收集6周龄C57BL/6小鼠的骨髓细胞，加入GM-CSF（10ng/mL）联合G-CSF（10ng/mL）诱导
72h后，收集悬浮MDSCs细胞；
继续加入GM-CSF和G-CSF的同时，分别加入实施例1中9种不同的抑制剂（加入后终浓度均为10μM）进行处理48h后，收集MDSCs，应用荧光定量PCR检测NCF4的表达。
[0019] 结果如图2所示。从图2可以看出，编号为32（ZINC09680069）和36（ZINC13356731）的抑制剂能够明显降低NCF4的表达，而编号为48和84的抑制剂虽然也表现出降低NCF4表达的趋势，但并无统计学差异（图2）。
[0020] 为进一步明确编号32、36、48和84的小分子抑制剂是否够有效抑制MDSCs功能分子TGF-β（transforming growth factor-β，转化生长因子β）和IL10的分泌，发明人进一步收集了上述抑制剂处理后上清，并对上清液中TGF-β、IL10含量情况进行了分析，结果如图3所示。
[0021] 分析可以看出，虽然编号为32（ZINC09680069）和48的小分子能够明显减少TGF-β的分泌（图3A），但只有编号为32（ZINC09680069）的小分子抑制剂能够抑制IL10的分泌（图3B）。
[0022] 尽管上述荧光定量PCR和ELISA的实验结果表明编号32的小分子抑制剂可能通过GPR84抑制MDSCs中功能分子的表达，但是其是否影响MDSCs分化尚不清楚。因此，慎重起见，发明人进一步对小分子抑制剂（编号32、36、48和84的小分子抑制剂）对MDSCs分化和胞内Ca+流水平情况进行了分析，具体过程简介如下。
[0023] 参考前述操作，在GM-CSF联合G-CSF诱导MDSCs产生的体系中，分别加入编号32、36、48和84这4种小分子抑制剂（加入后终浓度均为10μM）。72h后流式检测。
[0024] 结果如图4所示。分析可以看出，编号32和48的小分子抑制剂能够明显抑制骨髓细+胞向MDSCs分化（图4A）。而鉴于GPR84被活化后能够通过促进Ca内流改变细胞功能，因此我们通过检测小分子抑制剂对Ca+流的影响以鉴别能够有效抑制GPR84活性的小分子。而结果显示：32号和36号小分子均能明显降低MDSCs胞内Ca+流水平（图4B）。
[0025] 但综合上述各实验结果而言，可以初步确认编号为32（ZINC09680069）的小分子抑制剂是目标抑制剂，即，编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂能够明显抑制GPR84活性以降低MDSCs分化和免疫抑制功能。
[0026] （二）编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂的特异性分析进一步地，发明人对编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂与GPR84结合的空间结构进行了分析，结果如图5（图5A）所示。可以看出，该小分子抑制剂与GPR84具有多个结合位点，可以有效结合。
[0027] 为进一步验证编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂对GPR84结合的特异性，发明人利用磁珠分选方法（参考现有技术操作即可）获得了GPR84+MDSCs和GPR84-MDSCs，在加入GM-CSF和G-CSF维持的同时，给予32号小分子抑制剂（加入后终浓度为10μM）处理48h，然后进行流式检测。
[0028] 结果表明：32号抑制剂能够明显诱导GPR84+ MDSCs的凋亡，而对GPR84-MDSCs无明显影响（图5B），这一结果说明，编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂与GPR84结合具有特异性，可为其进一步应用奠定良好基础。
[0029] （三）编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂对T细胞影响由于MDSCs在肿瘤微环境中主要发挥免疫抑制功能，即通过抑制CD8+T细胞和CD4+T细胞的增殖和功能来促进肿瘤的生长，因此，为进一步明确编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂特异性，有必要对编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂对CD4+T细胞和CD8+T细胞的影响情况进行进一步分析。
[0030] 为此，发明人收集了相关食管癌患者外周血样品，利用淋巴细胞分离液和密度梯度离心法获取了单细胞悬液，计数后进行培养，培养过程中加入编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂（加入后终浓度为10μM），48h后收集细胞，流式检测CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD8+ + + +PD-1T细胞、CD8TIM3T细胞比例变化，并进行统计学分析。
[0031] 结果如图6所示。编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂对CD4+T细胞和CD8+T细胞比例无明显影响，且对CD8+T细胞功能相关分子PD-1和TIM-3表达也无明显影响（图 6）。
[0032] （四）与现有GPR84拮抗剂抑制效能的差异针对GPR84蛋白，现有技术中，已有商品化的GPR84拮抗剂（antagonist），因此，从实际应用前景角度而言，有必要就本申请中编号32（ZINC09680069）的小分子抑制与现有商品化GPR84拮抗剂（antagonist）的抑制效果进行对比分析。这种效果分析主要包括分子层面和生理生长两个方面，简要介绍如下。
[0033] （1）功能分子层面参考前述操作，利用骨髓细胞诱导形成MDSCs后，分别加入本申请中编号32
（ZINC09680069）的小分子抑制和商品化的GPR84拮抗剂（antagonist）（加入后终浓度均为
10μM），然后对ARG1、NCF4、IL10和TGF-β等MDSCs功能分子表达情况进行检测，结果如图7所示。
（ZINC09680069）的小分子抑制和商品化的GPR84拮抗剂（antagonist）（加入后终浓度均为
10μM），然后对ARG1、NCF4、IL10和TGF-β等MDSCs功能分子表达情况进行检测，结果如图7所示。
[0034] 对比可以看出，本申请中编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂相较商品化的GPR84拮抗剂（antagonist），能够更加明显抑制ARG1、NCF4、IL10和TGF-β等MDSCs功能分子的表达，换言之，本申请中编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂对于GPR84蛋白，具有更好抑制GPR84活性的效果。
[0035] （2）生理生长层面现有技术及发明人前期研究过程中，利用4-NQO（4-硝基喹啉氮氧化物）通过饮水方式可诱导C57BL/6小鼠食管癌的形成，基于此食管癌模型，发明人分别利用本申请中编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂和商品化的GPR84拮抗剂（antagonist）进行了饲喂。
[0036] 具体应用时，在4-NQO作用第112天，将诱导食管癌成功的小鼠随机分为3组，分别通过饮水的方式饲喂DMSO（空白对照）、商品化GPR84拮抗剂和32号小分子抑制剂。
[0037] 饲喂过程中，通过饮水方式，给予剂量按10mg/kg计，持续使用3周后，改为正常饮水。
[0038] 饲喂过程中，通过检测体重的变化程度来评估食管癌进展情况。统计结果如图8所示。
[0039] 从图8可以看出，本申请中编号32（ZINC09680069）的小分子抑制剂较之商品化的GPR84拮抗剂（antagonist），能够更加明显抑制食管癌的进展，延缓小鼠体重的下降速度，即，能够发挥更好的食管癌预防或治疗效果。
[0040] 综合上述结果可以看出，本申请中筛选所得小分子抑制剂ZINC09680069，可以抑制MDSCs产生和功能，改善肿瘤微环境，进而为改善细胞免疫治疗技术在肿瘤中的治疗效果奠定基础。而进一步食管癌动物模型饲喂结果也表明，该小分子抑制剂可以在肿瘤预防或治疗中发挥较好效果。
[0041] 基于前期研究成果，发明人认为，由于G蛋白偶联受体GPR84在肿瘤微环境免疫状态调控中具有关键性作用，针对以此靶点为基础的药剂开发可为免疫疗法在肿瘤治疗中应用效果奠定基础，对于延长病人生存质量和生存期具有重要应用价值，同时由于该靶点表达的特异性，可为治疗的安全性奠定基础，因此使得本申请具有较好实用价值和进一步推广开发的应用意义。
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