miR-146a作为潜在生物标志物在多发性肌炎/皮肌炎中的应用
阅读：787发布：2020-05-11
专利汇可以提供miR-146a作为潜在生物标志物在多发性肌炎/皮肌炎中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了miR-146a作为一种潜在 生物 标志物在开发多发性肌炎/皮肌炎诊断 试剂 或防治药物中的应用。通过从健康供体的人 外周血单个核细胞 中分离腹膜巨噬细胞，并用miR-146a模拟物、miR-146a 抑制剂 、靶向IL-17受体A和REG3A的小干扰RNA处理，揭示了miR-146a的表达与多发性肌炎/皮肌炎的发病密切相关，下调miR-146a的表达可提高巨噬细胞的迁移能 力 ，促进PM/DM患者的炎性浸润。本发明为诊断多发性肌炎/皮肌炎提供了新的潜在血清学标识物；也为多发性肌炎/皮肌炎的防治提供了新的靶点。，下面是miR-146a作为潜在生物标志物在多发性肌炎/皮肌炎中的应用专利的具体信息内容。
miR-146a作为潜在生物标志物在多发性肌炎/皮肌炎中的
应用
技术领域
背景技术
[0002] 特发性炎性肌炎是一组以四肢近端肌肉受累为突出表现的异质性疾病，其中以多发性肌炎(polymyosit，PM)和皮肌炎(dermatomyositis，DM)最为常见。大多数PM/DM患者经历肌肉无力，皮肤损伤，疲劳和呼吸困难，这主要影响他们的日常生活质量。早期的研究发现缺乏基于证据的理论来确定PM/DM的适当治疗方案，因为这些病症的病理学不明确。然而，作为特发性炎性肌炎，已经假定炎症是这些疾病的上述症状的主要潜在机制。多年来，医生经验和经验数据在选择PM/DM治疗方面发挥了关键作用，但是，由于疾病的类似症状导致的PM/DM的及时诊断困难，仍然妨碍了这种做法。临床上显示皮质类固醇仅产生适度的益处，而硫唑嘌呤和甲氨蝶呤在35项试验中仅有8项被证实有效。因此，了解PM/DM的体征和症状的详细机制将有助于鉴定药理学生物标志物和开发治疗这些疾病的有效治疗方法。
[0003] 已有研究表明，miRNA在多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)的发生发展中扮演了重要的角色。然而，PM/DM发病机制中与蛋白regenerating islet-derived protein 3-alpha(REG3A)及巨噬细胞的相关性研究未见报道。这项研究旨在剖析PM/DM患者群体中miR-146a与REG3A之间的关系，并探究其对巨噬细胞迁移中的功能作用。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供了miR-146a的潜在临床应用价值，具体是miR-146a作为一种潜在生物标志物在开发诊断或治疗多发性肌炎/皮肌炎中的应用。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术手段：
[0006] 本发明从健康供体的人外周血单个核细胞(PBMC)中分离腹膜巨噬细胞，并用miR-146a模拟物(mimics)，miR-146a抑制剂、靶向IL-17受体A(IL-17RA)和REG3A的小干扰RNA(siRNA)处理，进行Transwell测定以研究细胞迁移。采用实时PCR和蛋白质印迹分析以确定miR-146a，IL-1RA，IL-17RA和REG3A的表达水平。
[0007] 与健康对照组相比，PM/DM患者miR-146a mRNA表达水平显着降低，而REG3AmRNA表达水平显着升高。与临床数据一致，miR-146a的mRNA表达水平也降低，而REG3A的mRNA和蛋白水平在小鼠模型中显着增加。miR-146a抑制巨噬细胞迁移，抑制REG3A也抑制巨噬细胞迁移。IL-17RA诱导REG3A表达，而miR146a抑制巨噬细胞中REG3A的表达。此外，mir-146a通过抑制REG3A的表达阻断巨噬细胞的迁移侵润。
[0008] 本发明的第一方面，提供了miR-146a及其类似物作为潜在生物标志物在开发多发性肌炎/皮肌炎诊断试剂中的应用。
[0009] 所述的miR-146a的具体序列如下：
[0010] hsa-miR-146a-5pTGAGAACTGAATTCCATGGGTTCCGATGTGTATCCTCAGCTTTGAGAACTGAATTCCATGGGTTGTGTCAGTGTCAGACCTCTGAAATTCAGTTCTTCAGCTGGGATATCTCTGTCATCGT(SEQ ID NO.1)
[0011] hsa-miR-146a-3pCCTCTGAAATTCAGTTCTTCAGCCGATGTGTATCCTCAGCTTTGAGAACTGAATTCCATGGGTTGTGTCAGTGTCAGACCTCTGAAATTCAGTTCTTCAGCTGGGATATCTCTGTCATCGT(SEQ ID NO.2)
[0012] 本发明所述的miR-146a，可以来自被分离细胞，或者可通过人工合成的方式获得。
[0013] 所述的miR-146a类似物，指能够生成类似于miR-146a序列的重组质粒、病毒载体，或者是化学合成的类似miR-145-3p的序列。
[0014] 所述的试剂，为检测miR-146a表达量或有效量的试剂。
[0015] 本发明的另一方面，还提供了作为潜在生物标志物在开发多发性肌炎/皮肌炎防治药物中的应用。
[0016] 本发明首次揭示了miR-146a的表达与多发性肌炎/皮肌炎密切相关，下调mir-146a的表达可提高巨噬细胞的迁移能力，促进PM/DM患者的炎性浸润。REG3A的表达抑制可能是PM/DM潜在的发病机制之一。
[0018] 图1表示PM/DM患者的REG3A水平升高而miR-146a水平降低。
[0019] (A)从患者(n＝25)和健康对照者(n＝20)中分离PBMC，并通过RT-PCR技术测定IFN-γ、IL-17A、REG3A和miRNA-146a的mRNA水平，相对mRNA的表达量采用GAPDH/U6归一化。
[0020] (B)采用ELISA测定疾病组者和健康对照者血清中IFN-γ和IL-17A的表达水平。
[0021] (C)通过免疫组织化学测定来自患者和健康对照的REG3A水平。
[0022] 数据显示为平均值±S.E.M.与健康对照相比，*p<0.05，**p<0.01.PBMC从20名健康对照和25名PM/DM患者中获得。
[0023] 图2为在替代性自身免疫性肌炎(EAM)模式小鼠中REG3A和miR-146a的水平。
[0024] (A)采用RT-PCR测定肌肉组织中IFN-γ，IL-17A，REG3A和miRNA-146a的mRNA表达量。相对mRNA表达量使用GAPDH/U6归一化。(n＝9)
[0025] (B)采用ELISA测定EAM小鼠血清中的IFN-γ和IL-17A水平。(n＝9)[0026] (C)采用蛋白质印迹法(n＝3)测定肌肉组织中REG3A的蛋白水平。GAPDH被用作蛋白质印迹分析的内部对照。使用软件Image J量化条带。
[0027] 数据显示为平均值±S.E.M.与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。
[0028] 图3为miR-146a和REG3A对巨噬细胞迁移的影响。
[0029] (A)用阴性对照(NC)miRNA和miR-146a模拟物，miR-146a抑制剂转染健康捐献者(n＝3)PBMC的衍生巨噬细胞24小时。
[0030] (B)来自PBMC的单核衍生巨噬细胞，用NC siRNA，REG3A siRNA，pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-REG3A质粒转染健康供体(n＝3)24小时。将所有处理过的细胞(2×105)悬浮并添加到transwell的上室中。含有10％人血清的培养基在下腔室中用作化学吸引剂。温育24小时后，将侵入下腔的细胞用结晶紫染色。对迁移的细胞进行计数，并在Olympus倒置显微镜(IX71，Olympus，日本)下拍摄显微照片。
[0031] 三个独立实验的数据显示为平均值±S.E.与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01.与pcDNA3.1-NC组相比，#p＜0.05。
[0032] 图4为IL-17A诱导巨噬细胞中的REG3A表达。
[0033] (A)用不同浓度的IL-17A处理来自健康供体(n＝3)PBMC的单核细胞衍生巨噬细胞24小时。通过RT-PCR测定REG3A的mRNA表达量。GAPDH为内参。
[0034] (B)用不同浓度的IL-17A处理来自健康供体(n＝3)PBMC的单核细胞衍生巨噬细胞24小时。通过RT-PCR测定miR-146a的mRNA表达量。U6为内参。
[0035] (C)用不同浓度的IL-17A处理来自健康供体(n＝3)PBMC的单核细胞衍生巨噬细胞24小时。REG3A的蛋白质水平通过蛋白质印迹法测定。GAPDH为内参。
[0036] (D)在不存在或存在IL-17A的情况下，用NC siRNA和IL-17RA siRNA转染单核细胞衍生巨噬细胞24小时。REG3A的蛋白质水平通过蛋白质印迹法测定。GAPDH用作内部对照。使用ImageJ定量Western印迹条带，并相对于GAPDH进行标准化。
[0037] 三个独立实验的数据显示为平均值±S.E.M.与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。与IL-17A+NC siRNA组相比，#p<0.05。
[0038] 图5为miR-146a调节巨噬细胞中的REG3A表达。
[0039] (A-B)用NC miRNA，miR-146a模拟物或miR-146a抑制剂转染健康供体(n＝3)PBMC的单核细胞衍生巨噬细胞24小时。REG3A的mRNA和蛋白水平通过RT-PCR和Western印迹法测定。GAPDH用作内部对照。
[0040] (C)将细胞用NC siRNA，REG3A siRNA，pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-REG3A质粒转染24小时。通过实时PCR测定miR-146a的mRNA水平。U6用作内部对照。
[0041] (D-E)在不存在或存在IL-17A的情况下，用NC miRNA或miR-146a模拟物转染细胞24小时。REG3A的mRNA和蛋白水平通过实时PCR和Western印迹法测定。GAPDH用作内部对照。
[0042] 三个独立实验的数据显示为平均值±S.E.M.与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01。与IL-17A治疗组相比，#p<0.05，##p<0.01。
[0043] 图6为miR-146a通过抑制REG3A表达来抑制巨噬细胞迁移。
[0044] (A)加入及不加入miR-146a抑制剂的情况下，将NC siRNA或REG3A siRNA转染来自健康供体(n＝3)PBMC的单核细胞衍生巨噬细胞24小时。
[0045] (B)在不存在或存在miR-146a模拟物的情况下，用pcDNA3.1-NC或pcDNA3.1-REG3A质粒转染单核细胞衍生巨噬细胞24小时。将所有处理过的细胞(2×105)悬浮并添加到transwell的上室中。含有10％人血清的培养基在下腔室中用作化学吸引剂。温育24小时后，将侵入下腔的细胞用结晶紫染色。对迁移的细胞进行计数，并在Olympus倒置显微镜(IX71，Olympus，日本)下拍摄显微照片。
[0046] 三个独立实验的数据显示为平均值±S.E.M.与NC+NC siRNA或NC+pcDNA3.1组相比，*p<0.05，**p<0.01。与抑制剂+NC siRNA或NC+pcDNA3.1-REG3A组相比，#p<0.05，##p<0.01。
具体实施方式
[0047] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
[0048] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0049] 实施例1
[0050] 1、材料
[0051] 本研究的实验对象(PM/DM患者和健康对照人群)招募自2016年至2017年南京医科大学附属无锡市第二人民医院(中国江苏省无锡市)就诊的病例。外周血标本取自20名健康人群和25名PM/DM患者(6名PM患者，19名DM患者；8名男性患者，17名女性患者；平均年龄为37±13岁)。PM/DM患者的年龄和性别与健康对照相匹配。根据其他地方描述的欧洲神经肌肉中心病理诊断标准，通过测定血清样本和肌肉活检结果来诊断PM/DM患者。该实验方案经南京医科大学附属无锡市第二人民医院伦理委员会批准。所有患者在研究之前提供了使用其组织和数据的书面知情同意书。
[0052] 动物模型从江苏申基生物科技有限公司购买了40只成年(6-8周龄)Balb/c雌性小鼠(15-17克)，并在受控条件下(温度22℃，湿度55％，12小时昼/夜)免费获得颗粒食物和水。所有动物均按照实验室操作规范得到了充分的护理，同时实验方案被南京医科大学附属无锡第二人民医院伦理委员会所批准。为诱导替代性自身免疫性肌炎模型小鼠(EAM)，用含有1.5mg肌球蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis，MS)和5mg/mL结核分枝杆菌(BD Biosciences,Franklin Lakes,NY)的100μ50％完全弗氏佐剂(CFA)在左后肢皮下免疫小鼠，并每周两次在尾巴基部和侧腹处加强。在第一次免疫后立即给小鼠腹膜内注射500ng百日咳毒素(PT，Sigma-Aldrich，St.Louis，MS)。对照组接受盐水/CFA和PT两次，同时在最后一次免疫后10天收集血清和肌肉组织用于进一步测定。
[0053] 2、PBMC分离和体外巨噬细胞分化
[0054] 收集人外周血标本，并根据制造商说明书用人淋巴细胞分离培养基(solarbio life sciences，China)通过密度离心(400×g，30分钟)分离PBMC。用磷酸盐缓冲液(PBS)在400×g和4℃下洗涤单核细胞5分钟。对于巨噬细胞分化，将PBMC与RPMI培养基一起培养并补充谷氨酸，20ng/mL M-CSF和10％FBS 7天，以分化成巨噬细胞(Gibco Thermo Fischer，Waltham，MA)。
[0055] 3、细胞转染
[0056] 将单核细胞衍生的巨噬细胞接种到6孔板中，并根据制造商说明书使用Lipofectamine 3000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)在37℃下用miRNA(50nM)，siRNA(50pmol)或质粒(5μg)转染。24小时后，细胞进行进一步的实验。MiR-146a模拟物，miR-146a抑制剂和阴性对照miRNA获自GenePharma(中国上海)。NC siRNA，REG3A siRNA，IL-17RA siRNA，pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-hREG3A由Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)合成。
[0057] 4、巨噬细胞迁移试验
[0058] 将细胞(2×105)悬浮在游离血清培养基中，然后加入到Transwell 96孔的上室中。含有10％人血清的培养基用作下室中的化学吸引剂。在温育24小时后，进入下室的入侵细胞用结晶紫染色。计数迁移的细胞，并在Olympus倒置显微镜(IX71，Olympus，Japan)下拍摄迁移细胞。
[0059] 5、实时定量PCR
[0060] 依旧检测试剂盒说明书使用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)提取来自肌肉组织和细胞的总RNA。使用SuperScript TM II逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)合成cDNA。用SYBR Green master Mix(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)和ABI 7500序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)进行荧光实时定量PCR。采用2-△△Ct方法分析数据。miR-146a(Qiagen，MS00001638)和RNU6-2(Qiagen，MS00033740)的引物购自Qiagen。每个样品一式三份测量，并使用GAPDH/U6标准化相对mRNA表达。qPCR热循环条件如下：94℃孵育5分钟，94℃30秒，60℃30秒，40个循环。用于PCR扩增的引物序列列于表1中。
[0061] 表1用于PCR扩增的引物序列
[0062]
[0064] 将来自小鼠的全血以8,000×g离心15分钟并收集血清。通过ELISA商业试剂盒(R&D system，Minneapolis，MN)定量IFN-γ和IL-17A的水平。
[0065] 7、蛋白质印迹法(免疫印迹试验)
[0066] 将细胞和肌肉组织在含有1mmol/L PMSF的RIPA缓冲液(25mM Tris-HCl pH 7.6,150mM氯化钠，1％NP-40,1％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中匀浆处理。离心10分钟后，使用TM
Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)测定上清液中的蛋白质浓度。用10％SDS-PAGE分离蛋白质并转移到PVDF膜上。用Tris缓冲盐水中的1.5％牛血清白蛋白(BSA)封闭后，将膜与指定的一抗和辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗一起温育。根据制造商指示规范，通过蛋白质印迹检测系统，利用ECL试剂(Cell Signaling Technology，MA，USA)检测条带。
Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)测定上清液中的蛋白质浓度。用10％SDS-PAGE分离蛋白质并转移到PVDF膜上。用Tris缓冲盐水中的1.5％牛血清白蛋白(BSA)封闭后，将膜与指定的一抗和辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗一起温育。根据制造商指示规范，通过蛋白质印迹检测系统，利用ECL试剂(Cell Signaling Technology，MA，USA)检测条带。
[0067] 上述试验的结果使用SPSS 17.0(SPSS Inc.，IL，USA)分析数据并表示为平均值±SEM。使用t检验进行两组之间的统计学比较。P<0.05被认为具有统计学意义。
[0068] 结果如下：
[0069] 1、在PM/DM患者中，REG3A mRNA的表达水平上调，mir-146a表达水平下调[0070] PM/DM作为炎性肌病，通常伴随IFN-γ和IL-17A炎性细胞因子水平的升高。采用荧光定量PCR方法检测PM/DM患者外周血单个核细胞和健康对照外周血单个核细胞的mRNA表达水平。如图1A所示，与健康对照组相比，PM/DM患者外周血单个核细胞中IFN-γ和IL-17A的mRNA表达水平显著增高(p＜0.01)。同样，与健康对照组相比，PM/DM患者外周血单个核细胞REG3A mRNA表达水平显著增高(p＜0.01)，mir-146a表达显著下调(p＜0.01)。此外，与健康对照组相比，PM/DM患者血清中IFN-γ和IL-17A水平显著升高(图1B所示)。免疫组织化学结果分析显示，来自PM/DM患者的肌肉组织REG3A表达水平远高于健康对照组(图1C所示)。
[0071] 2、建立的EAM小鼠模型中REG3A mRNA表达水平升高，miR-146a表达水平下降[0072] 为了研究PM/DM患者的REG3A和miR-146a的水平，建立了EAM小鼠模型，用实时定量PCR方法检测了IFN-γ、IL-17A、REG3A和miR-146a的mRNA水平。结果表明，肌肉组织中mir-146a的mRNA表达明显低于正常组织，REG3A、IFN-γ和IL-17A的mRNA表达明显高于正常组织(图2A所示)。Elisa法测定血清中干扰素和IL-17A的含量。如图2B所示，与对照组相比，模型组小鼠血清中IFN-γ和IL-17A蛋白水平显著升高(p＜0.01)，表明模型小鼠已建立成功。与对照组相比，蛋白质印迹分析显示肌肉组织中REG3A蛋白水平相似的增加(图2C所示)。这些结果表明，伴随着REG3A表达的升高，小鼠肌肉组织中的炎症浸润得到促进，同时观察到miR-146a表达下调。
[0073] 3、miR-146a和REG3A可调节巨噬细胞迁移
[0074] 巨噬细胞在炎症反应和PM/DM发生中起关键作用。因此，旨在研究miR-146a和REG3A对巨噬细胞迁移的影响。首先，从健康供者的外周血单核细胞中分离出单核细胞，并体外诱导分化为巨噬细胞。用空白对照(NC)miRNA、miR-146a模拟物和mir-146a抑制剂分别转染健康供体单核源性巨噬细胞24h(图3A所示)，transwell小室实验结果显示mir-146a模拟物组迁移细胞数量较(NC)miRNA组明显减少(p＜0.05)。相反，与NC组相比，mir-146a抑制剂治疗组迁移细胞数量显著增加(p＜0.01)。接着，将NC-siRNA,REG3A-siRNA,pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-REG3A质粒转染巨噬细胞24h。如图3B所示，与NC-siRNA组相比，转染REG3A-siRNA后迁移的细胞数明显减少(p＜0.05)。与pcDNA3.1-NC组相比，巨噬细胞中过表达pcDNA3.1-REG3A质粒的REG3A导致迁移细胞数量明显增加(p＜0.05)。以上发现表明miR-146a和REG3A可调节巨噬细胞移动。
[0075] 4、IL-17A诱导巨噬细胞中REG3A的表达
[0076] IL-17介导的炎症反应对自身免疫性疾病至关重要，自身免疫性疾病中通过IL-17受体信号通路可诱导一系列基因表达。巨噬细胞中IL-17A miR-146a和REG3A之间的关系尚不清楚，尤其在PM/DM患者中。用不同浓度的IL-17A处理健康供体单核源性巨噬细胞24h，发现IL-17A处理后REG3A mRNA表达显著增加(p＜0.01)，呈剂量依赖性(图4A所示)。然而，不同浓度IL-17A的相似处理并不影响miR-146a的mRNA表达(图4B所示)。其次，western blot分析证实IL-17A诱导REG3A表达呈剂量依赖性(图4C所示)。最后，研究了IL-17是否通过IL-17RA受体诱导REG3A表达。免疫印迹分析显示IL-17A处理组与阴性对照组比较，差异有统计学意义(p＜0.05)。IL-17a+NC siRNA处理显著诱导REG3A表达，IL-17A+IL-17RA siRNA处理抑制REG3A表达(图4D所示)。结果表明IL-17A可通过IL-17RA信号通路诱导巨噬细胞REG3A的表达。
[0077] 5.miR-146a可调节巨噬细胞中REG3A的表达
[0078] 为研究mir-146a与REG3A的关系及表达调控机制，转染NC miRNA、miR-146a模拟物或miR-146a抑制剂至单核细胞源性巨噬细胞24h，实时定量PCR和Western blot结果显示，与NC组相比，miR-146a抑制剂组REG3A的表达显著增加(p＜0.05)。相反，与NC组相比，miR-146a模拟物的转染可导致REG3A表达的实质性下调(p0.05)(图5A和5B所示)。转染NC siRNA、REG3A siRNA、pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-REG3A质粒24h均不能改变miR-146a水平(图
5C)所示。与IL-17A治疗组相比，在缺乏IL-17A的情况下，采用miR-146a模拟物处理单核巨噬细胞，其REG3A的mRNA和蛋白表达明显下降(图5D和5E所示)。这些发现表明，miR-146a表达增加可能导致REG3A的表达抑制。
5C)所示。与IL-17A治疗组相比，在缺乏IL-17A的情况下，采用miR-146a模拟物处理单核巨噬细胞，其REG3A的mRNA和蛋白表达明显下降(图5D和5E所示)。这些发现表明，miR-146a表达增加可能导致REG3A的表达抑制。
[0079] 6.miR-146a通过抑制REG3A的表达抑制巨噬细胞迁移
[0080] 为了研究miR-146a对REG3A的抑制是否对巨噬细胞迁移有影响，通过转染健康供体的单核细胞源性巨噬细胞24h，在缺乏或存在miR-146a抑制剂的情况下，获得NC siRNA及REG3A siRNA。转染NC+REG3A siRNA组细胞迁移率明显低于NC+NC siRNA组(p<0.01)。相反，抑制剂+NC siRNA处理后迁移细胞数量明显增加(p<0.05)。但与inhibitor+NC siRNA和NC+NC siRNA组相比，inhibitor+REG3A siRNA组的迁移细胞数明显减少(图6A所示)，表明在REG3A被沉默后，下调miR-146a并不能促进巨噬细胞迁移。此外，用pcDNA3.1-NC及pcDNA3.1-REG3A质粒转染单核细胞来源的巨噬细胞，如图6B所示，在缺乏或存在miR-146a模拟物的情况下24小时，与NC+pcDNA3.1模拟物相比，迁移的细胞数明显减少(p<0.01)。与图3B的结果一致，转染NC+pcDNA3.1-REG3A质粒的巨噬细胞与NC+pcDNA3.1组相比，迁移细胞数明显增加(p<0.05)。与NC+pcDNA3.1-REG3A组相比，模拟+pcDNA3.1-REG3A组巨噬细胞移行显著减少，表明miR-146a组可抑制REG3A诱导的巨噬细胞移行。这些数据表明miR-146a可能通过抑制REG3A表达，抑制巨噬细胞迁移。
[0081] 本发明首次证明了mir-146a可以抑制REG3a表达从而抑制巨噬细胞迁移的能力，从而阻止PM/DM患者的肌肉中的炎性细胞浸润。
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