β-微管蛋白、其所述基因β-tubulin及其基因区段的应用
阅读：1038发布：2020-07-05
专利汇可以提供β-微管蛋白、其所述基因β-tubulin及其基因区段的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供β-微管蛋白基因β-tubulin区段，还提供所述区段在防治 植物 病害和/或增强植物的抗病性、在抑制病原 真菌 发育和致病 力 、以及在提高病原真菌对微管蛋白结合剂的药敏性中的应用。本发明还提供一种体外干扰制剂，所述体外干扰制剂含有上述βtubulin基因βTubdsRNA区段，以及所述体外干扰制剂在转基因植物抗病品种培育中的应用。本发明的微管蛋白β-tubulin基因RNA干扰技术具有增加病原真菌的药敏性、降低抗药性 水 平、干扰致病力、增强植物抗病性；防治多种植物病害；提高对化学药剂多菌灵的药敏性，同时多菌灵可延长dsRNAs药剂的持效期等绿色、安全的突出优点。，下面是β-微管蛋白、其所述基因β-tubulin及其基因区段的应用专利的具体信息内容。
1.β-微管蛋白基因β-tubulin区段，其特征在于所述区段是以βTubdsRNA区段、dsRNA区段的联合或以全长或部分βTubdsRNA进行RNase消化后随机产生15-30nt的siRNA。
2.根据权利要求1所述的β-微管蛋白基因β-tubulin区段，其特征在于所述β-微管蛋白基因来源于亚洲镰刀菌(F.asiaticum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、藤仓镰刀菌(F.fujikuroi)、三线镰刀菌(F.tricinctum)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)或炭疽(Colletotrichum higginsianum)。
3.根据权利要求2所述的β-微管蛋白基因β-tubulin区段，其特征在于所述βTubdsRNA区段是将β-tubulin基因的cDNA分成4个不同区段得到的，分别是cDNA起止位点1nt-482nt的βTub-1、cDNA起止位点460nt-984nt的βTub-2、βTub-3及βTub-4，其中，当β-tubulin基因来源于禾谷镰刀菌或亚洲镰刀菌时，βTub-3的cDNA起止位点为917nt-1405nt，βTub-4的cDNA起止位点为1345nt-1686nt；当β-微管蛋白基因来源于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)时，βTub-3的cDNA起止位点为922nt-1409nt，βTub-4的cDNA起止位点为1345nt-最终碱基；当β-微管蛋白基因来源于灰霉病菌(Botrytis cinerea)时，βTub-3的cDNA起止位点为727nt-1209nt，βTub-4的cDNA起止位点1150nt-最终碱基；当β-微管蛋白基因来源于炭疽(Colletotrichum higginsianum)时，βTub-3的cDNA起止位点755nt-1242nt，βTub-4的cDNA起止位点1150nt-最终碱基。
4.根据权利要求3所述的应用，以cDNA为模板，体外合成相应的dsRNA，其特征在于所述dsRNA区段的联合是以多条根据权利要求3所述的cDNA区段的组合作为合成区段的模板，使用RNAi Kit试剂盒得到的dsRNA。
5.权利要求1-4中任一项权利要求所述的β-微管蛋白基因β-tubulin区段在防治植物病害和/或增强植物抗病性中的应用。
6.权利要求1-4中任一项权利要求所述的β-微管蛋白基因β-tubulin区段在抑制病原真菌发育和致病力中的应用。
7.权利要求1-4中任一项权利要求所述的β-微管蛋白基因β-tubulin区段在提高病原真菌对微管蛋白结合剂的药敏性中的应用。
8.一种体外干扰制剂，所述体外干扰制剂含有根据权利要求5所述的β-微管蛋白基因β-tubulin区段。
9.权利要求8所述的体外干扰制剂在转基因植物抗病品种培育中的应用。
β-微管蛋白、其所述基因β-tubulin及其基因区段的应用
【技术领域】
[0002] 多菌灵，又名苯并咪唑-2-氨基甲酸酯，属于苯并咪唑类杀菌剂，是一种微管蛋白结合药剂，具有高效低毒的特点，有内吸治疗和保护作用。20世纪70年代起成为防治小麦赤霉病、水稻稻瘟病和灰霉病等主要农作物和经济作物重要病害的高效杀菌剂之一。然而应用40多年以来，病原真菌对多菌灵的抗药性频率不断增加，针对这一问题，农业部自2015年开始在全国组织开展“到2020年农药使用量零增长行动”，以减少多菌灵等化学农药使用量。
[0003] 研究表明，多菌灵是β-微管蛋白(β-tubulin)的抑制剂，通过结合真菌微管蛋白破坏纺锤丝等结构的形成，阻止细胞有丝分裂，达到杀菌的目的(Howard&Aist,1980)。在稻瘟病菌和灰葡萄孢中，β-微管蛋白基因是单拷贝的必需基因，而β-微管蛋白基因在赤霉病菌拥有两个拷贝，分别是β1-tubulin，β2-tubulin基因，β2-微管蛋白在病原真菌的生长、发育及致病方面具有不可或缺的生物学功能，在病原菌对苯并咪唑类药敏性中具有负调控作用。多菌灵单一药剂的长时期使用，造成β-微管蛋白的抗性突变频率增加，其中β2-tubulin编码第167、198和200、位氨基酸的密码子突变是引起赤霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性的主要位点，其表达水平与抗药性水平呈正相关；β1-tubulin的表达量及其生物学作用，主要是通过对β2-tubulin基因的调控来实现的。因此，降低β2-tubulin的表达可以降低β-微管蛋白的表达量，增加赤霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂的敏感性和降低抗药性水平；同时由于β-微管蛋白在赤霉病菌生长和发育中具有重要功能，降低β-tubulin基因的表达还可降低赤霉病菌的适合度。
[0004] 近十年以来，RNA干扰成为科学研究的热点，该技术在病害防治方面取得了大量的成果，通过寄主诱导的基因沉默(HIGS)或体外喷施干扰(SIGS)的方式，特异性干扰病原菌关键基因，可有效阻止病害发生。寄主诱导的基因沉默(HIGS)通过将病原菌基因构建成颈环结构并转入植物中表达，植物中的RNA干扰机制产生病原菌靶基因的siRNA，当病原菌侵入转基因植物利用植物营养时，植物产生的siRNA经高尔基体包裹形成多泡体，随后经外泌体分泌出植物细胞，多泡体通过真菌的胞吞作用进入病原菌细胞中，随即引起病原菌自身的RNAi机制沉默自身靶基因(Koch&Kogel,2014；Cai et al.,2018)。体外喷施长链RNA诱导的基因沉默已在灰霉病菌和赤霉病菌中得到证实(Wang等，Bidirectional cross-kingdom RNAi and fungal uptake of external RNAs confer plant protection.Nat Plants.2016(2)16151；Koach等，An RNAi-Based Control of Fusarium graminearum Infections Through Spraying of Long dsRNAs Involves a Plant Passage and Is Controlled by the Fungal Silencing Machinery.Plos Pathogens.2016(12)
e1005901.)。
e1005901.)。
[0005] RNA干扰的靶标基因是决定RNA干扰效应大小的关键。β-微管蛋白基因编码的微管蛋白是阻止纺锤体的形成，干扰细胞有丝分裂及物质运输等的结构蛋白，是细胞骨架的重要组成成分，参与细胞分裂繁殖、细胞内物质运输、细胞的分化发育等生物学过程。β-微管蛋白在不同真菌中具有高度保守性，针对亚洲镰刀菌β-微管蛋白β-tubulin基因序列构建RNAi载体，筛选有效的降低病原菌致病性的RNAi区段，以减轻病害的发生；利用转基因技术或者体外喷施βTubdsRNA直接或者间接地诱导亚洲镰刀菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、藤仓镰刀菌、灰霉病菌、稻瘟病菌以及炭疽病菌产生β-微管蛋白的RNA干扰机制，影响病原菌正常的生长、发育以及致病力，为农药的减施及开发植物病害防治的核酸农药提供了关键技术。因此，本发明研发的β-微管蛋白基因RNA干扰技术具有增加病原真菌的药敏性、降低抗药性水平、干扰致病力、增强植物抗病性和防治镰刀菌、灰霉、稻瘟、炭疽等重要植物病害的特异性等绿色、安全的突出优点。【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对β-微管蛋白基因(β-tubulin)，提供一种增强真菌对β-微管蛋白结合剂的药敏性或降低抗药性和提高植物抗病性的病原真菌β-微管蛋白基因β-tubulin的有效RNA干扰区段，使其能在植物抗病和体外干扰中得以应用；另一个目的是开发βTubdsRNA核酸农药用于防治真菌引起的植物病害，以及增强真菌对β-微管蛋白结合剂的药敏性。本发明的β-tubulin基因及其干扰区段可以作为寄主诱导的基因沉默和体外干扰的靶标，通过转基因、植物病毒等基因工程手段导入植物中(包括小麦、水稻、葡萄等)，或者利用体外干扰的方法喷施到寄主植物表面，通过RNAi途径沉默镰刀菌的β-微管蛋白基因表达，从而降低镰刀菌对多菌灵的抗性以及控制病害发生，提供一种新型的病害防治技术。
[0007] 为了实现上述目的，本发明的思路是针对β-微管蛋白基因序列构建RNAi载体，筛选有效RNAi区段降低病原菌致病力，从而减轻病害发生；根据基因干扰的原理，喷施βTubdsRNA或利用转基因技术构建βTubRNAi载体导入植物可直接或(和)间接诱导镰刀菌、灰霉病菌、稻瘟病菌和大豆炭疽产生β-微管蛋白基因的RNA干扰机制，使病原菌生长、发育异常，并提高了对苯并咪唑类药剂的敏感性，为农药减施及开发防治多种植物病害的核药剂提供了关键技术。
[0008] 为此，本发明提供β-微管蛋白基因β-tubulin区段，所述区段是以βTubdsRNA区段、dsRNA区段的联合或以cDNA全长或部分为模板合成的βTubdsRNA进行RNase随机消化后得到的15-30nt siRNA。
[0009] 在本发明中，所述β-微管蛋白基因来源于亚洲镰刀菌(F.asiaticum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、藤仓镰刀菌(F.fujikuroi)、三线镰刀菌(F.tricinctum)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)或炭疽(Colletotrichum higginsianum)。
[0010] 其中，所述的βTubdsRNA区段是β-tubulin基因的cDNA分成4个不同区段，各区段分别命名为βTub-1、βTub-2、βTub-3及βTub-4。当β-tubulin基因来源于亚洲镰刀菌时(如SEQ No.2所示，全长1686nt)或禾谷镰刀菌时(如SEQ No.3所示，全长1686nt)，βTub-1(cDNA起止位点1nt-482nt)、βTub-2(cDNA起止位点460nt-984nt)、βTub-3(cDNA起止位点917nt-1405nt)及βTub-4(cDNA起止位点1345nt-1686nt)。特别优选的，β-tubulin基因cDNA起止位点917nt-1405nt的βTub-3具备异常突出的效果。
[0011] 当β-微管蛋白基因来源于稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)时(如SEQ No.4所示，全长1779nt)，βTub-1(cDNA起止位点1nt-482nt)、βTub-2(cDNA起止位点460nt-984nt)、βTub-3(cDNA起止位点922nt-1409nt)、βTub-4(cDNA起止位点1345nt-最终碱基)。
[0012] 当β-微管蛋白基因来源于灰霉病菌(Botrytis cinerea)时(如SEQ No.5所示，全长1281nt)，βTub-1(cDNA起止位点1nt-482nt)、βTub-2(cDNA起止位点460nt-984nt)、βTub-3(cDNA起止位点727nt-1209nt)、βTub-4(cDNA起止位点1150nt-最终碱基)。
[0013] 当β-微管蛋白基因来源于炭疽(Colletotrichum higginsianum)时(如SEQ No.6所示，全长1344nt)，βTub-1(cDNA起止位点1nt-482nt)、βTub-2(cDNA起止位点460nt-984nt)、βTub-3(cDNA起止位点755nt-1242nt)、βTub-4(cDNA起止位点1150nt-最终碱基)。
[0014] 根据一种优选的实施方式，所述的dsRNA区段是以βTubcDNA全长为模板合成的β-tubulin基因dsRNA区段，所述dsRNA区段到的序列与其相应模板U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列。
[0015] 以来源于镰刀菌的β-tubulin基因为例，所述dsRNA区段βTubdsRNA的构建方法是：
[0016] (1)将β-tubulin基因的cDNA分成4个不同区段，各区段分别命名为βTub-1(cDNA起止位点1nt-482nt)、βTub-2(cDNA起止位点460nt-984nt)、βTub-3(cDNA起止位点917nt-1405nt)及βTub-4(cDNA起止位点1345nt-1686nt)，设计特异PCR引物扩增每个区段的正向序列，引物序列如下：
[0017] 2Tub-1F:
[0018] GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCTCCTTCATTTTACTTTTAGGC
[0019] 2Tub-1R:
[0020] GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGCTCGGCACCCTCGGTGTAAT
[0021] 2Tub-2F:
[0022] GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAACTGGGCCAAGGGTCATTACAC
[0023] 2Tub-2R:
[0024] GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGACCAGTCAGAGGGGCAAATCC
[0025] 2Tub-3F:
[0026] GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGCTCGCTGTTAACATGATTCCG
[0027] 2Tub-3R:
[0028] GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGCAAGTTGGACTGGGCCTCGG
[0029] 2Tub-4F:
[0030] GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGCTTTCTTGCATTGGTACACAAG
[0031] 2Tub-4R:
[0032] GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGAAATCGTGCTTAAAAACAC
[0033] PCR反应总体系50μL：β-微管蛋白基因的cDNA第一链模板1μL，10×LA PCR buffer 5μL，10mM dNTP 4μL，正反向引物各1μL，LATaq酶0.5μL，加水到50μL(PCR反应所用试剂购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃20s，56℃30s，72℃
30s，35个循环；72℃延伸10min。
30s，35个循环；72℃延伸10min。
[0034] PCR产物经凝胶回收后与商业化的pDONR201供体载体分别混合，形成含有attL1/attL2新位点的入门载体，再将其分别与目的载体pDestination混合发生特异性重组，将反应产物转化大肠杆菌感受态，形成pβTubRNAi系列的干扰表达载体：pβTubRNAi-1，pβTubRNAi-2，pβTubRNAi-3和pβTubRNAi-4。所述干扰载体分别含有cDNA区段βTub-1、βTub-2、βTub-3、βTub-4，而dsRNA区段的序列与上述cDNA区段U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同。
[0035] 作为一种优选的实施方式，所述dsRNA区段的联合是以多条前述的dsRNA区段的组合作为合成区段的模板，使用RNAi Kit试剂盒得到的基因区段。
[0036] 本发明还提供β-微管蛋白基因β-tubulin区段防治植物病害和/或增强植物的抗病性中的应用。
[0037] 以及，β-微管蛋白基因β-tubulin区段在抑制病原真菌发育和致病力中的应用。
[0038] 以及，β-微管蛋白基因β-tubulin区段在提高病原真菌对微管蛋白结合剂的药敏性中的应用。
[0039] 进一步地，本发明还提供一种体外干扰制剂，所述体外干扰制剂含有上述βtubulin基因βTubdsRNA区段。作为一种可选的
[0040] 实施方式，所述制剂的制备方法如下：
[0041] (1)βTubdsRNA制剂配制
[0042] 1)以β-tubulincDNA全长为模板，合成2种大小为850bp的β-tubulin基因dsRNAβTub-5(1nt-850nt)、βTub-6(836nt-1686nt)，dsRNA合成使用Invitrogen公司的RNAi Kit AM1626试剂盒，2种βTubdsRNA的序列与相应模板U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同；
[0043] 设计特异PCR引物扩增每个区段的正向序列，引物序列如下：
[0044] 2Tub-5F:TAATACGACTCACTATAGGGAGACTCCTTCATTTTACTTTTAGGC
[0045] 2Tub-5R:TAATACGACTCACTATAGGGAGAAAATCAGGTAGTTGAGATCGGC
[0046] 2Tub-6F:TAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCGTCATGGCCGGTGTGAC
[0047] 2Tub-6R:TAATACGACTCACTATAGGGAGATTTAGAAATCGTGCTTAAAAAC
[0048] PCR反应总体系50μL：β-微管蛋白基因的cDNA第一链模板1μL，10×LA PCR buffer 5μL，10mM dNTP 4μL，正反向引物各1μL，LATaq酶0.5μL，加水到50μL(PCR反应所用试剂购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃20s，56℃30s，72℃
30s，35个循环；72℃延伸10min。
30s，35个循环；72℃延伸10min。
[0049] PCR产物经凝胶回收后,分别以βTub-5(1nt-850nt)和βTub-6(836nt-1686nt)为模板，使用Invitrogen公司的 RNAi Kit AM1626试剂盒合成对应dsRNA(具体操作步骤见试剂盒说明书)，得到βTubdsRNA，各βTubdsRNA的序列与相应模板U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同；
[0050] 2)以βTub-1、βTub-2、βTub-3和βTub-4单独、或以不同区段相互组合的方式作为体外干扰dsRNA的合成区段的模板合成14种βTubdsRNA，dsRNA合成使用Invitrogen公司的RNAi Kit AM1626试剂盒，14种βTubdsRNA的序列与相应模板U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同；
[0051] 3)以β-tubulin cDNA全长为模板，使用Invitrogen公司的 RNAi Kit AM1626试剂盒合成全长βTubdsRNA，用 RNase III(NEB公司，操作步骤见试剂盒说明书)消化后随机产生长度为15-30nt的siRNA。
[0052] 以上16种βTubdsRNA和1种15-30nt的siRNA分别用醋酸铵缓冲液稀释，-20℃保存备用。
[0053] 本发明还提供上述体外干扰制剂在转基因植物抗病品种培育中的应用。
[0054] 针对多种不同类型的真菌病害，如小麦(大麦)赤霉病，藤仓镰刀菌，尖孢镰刀菌，三线镰刀菌，黄瓜(葡萄)灰霉病菌，水稻稻瘟病菌，大豆炭疽病菌等，本发明以这些真菌的β-tubulin或其同源基因作为靶标基因，在小麦、大麦、水稻等作物的抗病性状改良以及赤霉病菌、尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、藤仓镰刀菌、灰霉病菌、稻瘟病菌和大豆炭疽病原菌致病力和抗药性减除中应用。本发明通过实验证实β-微管蛋白β-tubulin基因RNA干扰技术具有增加病原真菌的药敏性、降低抗药性水平、干扰致病力、增强植物抗病性和防治多种植物病害的特异性等绿色、安全的突出优点。【附图说明】
[0055] 图1为将β-tubulin基因分成4个不同区段以及相应的真菌pβRNAi载体构建示意图。
[0056] 图2为多菌灵抗性菌株NJ003及不同βTubRNAi菌株在PDA培养基中培养3d的表型。
[0057] 图3为βTubRNAi菌株的Southern bolt检测。
[0058] 图中：NJ003为阴性对照菌，有一条带的为单拷贝基因整合转化子。
[0059] 图4为βTubRNAi菌株接种豫麦35苗期致病力分析。
[0060] 图中：*代表样本与对照之间存在显著差异(P<0.05)，对照为菌株NJ003。
[0061] 图5为田间喷施50％可湿性粉剂对高抗菌株NJ003及βTubRNAi转化子防效测定。
[0062] 图中：不同字母代表样本间具有显著差异(P<0.05)。
[0063] 图6为βTubdsRNA对镰刀菌防效测定。图中βTubdsRNA与siRNA的浓度为30ngμL-1，多菌灵浓度为1ngμL-1，多菌灵制剂浓度为150ngμL-1。
[0064] 图7为RNA浓度与抑菌效率分析。
[0065] 图8为βTubdsRNA对多种病原菌体外干扰测定。
[0066] 图9为βTubdsRNA对镰刀菌、稻瘟病菌、灰霉病菌、炭疽病菌活体防效测定。
[0067] 图中：不同字母代表样本间具有差异显著(P<0.05)。
[0068] 图10为不同真菌中β-tubulin基因同源分析。
[0069] 图11为拟南芥转化载体示意图。【具体实施方式】
[0070] 以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
[0071] 在本发明中，如无特殊说明，用于表示浓度的“％”均为重量百分比，“份”均为重量份。
[0072] 本发明涉及以下培养基，其组成分别为：
[0074] SNA培养基：0.1％KH2PO4,0.1％KNO3,0.05％MgSO4˙7H2O,0.05％KCl,0.02％葡萄糖和0.02％蔗糖，蒸馏水定容至1000ml。
[0075] 实施例1亚洲镰刀菌β-tubulin基因的克隆
[0076] 镰刀菌β-微管蛋白基因β-tubulin基因的合成方法，其具体步骤是：
[0077] 选取抗性镰刀菌β-微管蛋白基因β-tubulin基因作为模板，用化学合成方法人工合成β-微管蛋白基因，其特征在于所述序列编码198氨基酸的密码子为苯并咪唑类药剂的抗性位点，序列如SEQ No.1所示，长度2055nt。
[0078] (分离获得β-tubulin基因的DNA序列，NCBI gene数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)公布的登录号FGSG_06611序列相对应。
[0079] 实施例2β-tubulin基因cDNA的克隆
[0080] 镰刀菌β-微管蛋白cDNA的克隆方法，其具体步骤是：
[0081] 根据实施例1中的β-微管蛋白基因序列，去除内含子序列，用化学合成方法人工合成β-微管蛋白基因cDNA，所述序列(DNA序列去除内含子)如SEQ No.2所示，长度1686nt。
[0082] 实施例3针对β-tubulin基因cDNA不同区段的RNAi载体的构建和真菌转化[0083] (1)将实施例2得到的β-tubulin基因的cDNA分成4个不同区段，分别命名为βTub-1(cDNA起止位点1nt-482nt)、βTub-2(cDNA起止位点460nt-984nt)、βTub-3及βTub-4，(Fusarium graminearum和F.Asiaticum相同，βTub-3cDNA起止位点917nt-1405nt，βTub-4cDNA起止位点1345nt-1686nt；Magnaporthe oryzae，βTub-3cDNA起止位点922nt-1409nt，βTub-4cDNA起止位点1345nt-最终碱基；Botrytis cinerea，βTub-3cDNA起止位点727nt-
1209nt，βTub-4cDNA起止位点1150nt-最终碱基；Colletotrichum higginsianum，βTub-
3cDNA起止位点755nt-1242nt，βTub-4cDNA起止位点1150nt-最终碱基)设计特异PCR引物扩增每个区段的正向序列，引物序列如下：
1209nt，βTub-4cDNA起止位点1150nt-最终碱基；Colletotrichum higginsianum，βTub-
3cDNA起止位点755nt-1242nt，βTub-4cDNA起止位点1150nt-最终碱基)设计特异PCR引物扩增每个区段的正向序列，引物序列如下：
[0084] 2Tub-1F:
[0085] GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCTCCTTCATTTTACTTTTAGGC
[0086] 2Tub-1R:
[0087] GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGCTCGGCACCCTCGGTGTAAT
[0088] 2Tub-2F:
[0089] GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAACTGGGCCAAGGGTCATTACAC
[0090] 2Tub-2R:
[0091] GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGACCAGTCAGAGGGGCAAATCC
[0092] 2Tub-3F:
[0093] GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAGCTCGCTGTTAACATGATTCCG
[0094] 2Tub-3R:
[0095] GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGCAAGTTGGACTGGGCCTCGG
[0096] 2Tub-4F:
[0097] GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGCTTTCTTGCATTGGTACACAAG
[0098] 2Tub-4R:
[0099] GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTTAGAAATCGTGCTTAAAAACAC
[0100] PCR反应总体系50μL：人工合成的β-微管蛋白基因cDNA 20ng，10×LA PCR buffer 5μL，10mM dNTP 4μL，正反向引物各1μL，LATaq酶0.5μL，加水到50μL(PCR反应所用试剂购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃20s，56℃30s，72℃
30s，35个循环；72℃延伸10min。
30s，35个循环；72℃延伸10min。
[0101] PCR产物经凝胶回收后与商业化的pDONR201供体载体分别混合，形成含有attL1/attL2新位点的入门载体，再将其分别与目的载体pDestination(购自invitrogen公司)混合发生特异性重组，将反应产物转化大肠杆菌感受态，形成pβTubRNAi系列的干扰表达载体：pβTubRNAi-1，pβTubRNAi-2，pβTubRNAi-3和pβTubRNAi-4(如图1所示)。
[0102] (2)利用真菌原生质体转化法(Maier等，Development of a highly efficient gene targeting system for Fusarium graminearum using the disruption of a polyketide synthase gene as a visible marker.FEMS Yeast Res.2005.(5):653-662)，将步骤(1)得到的4个RNAi干扰载体分别导入镰刀菌苯并咪唑类抗性菌株NJ003和敏感菌株2021的原生质体中，得到8株不同的重组菌。其中，以NJ003为出发菌株的重组菌分别命名为βTubRNAi-1，βTubRNAi-2，βTubRNAi-3和βTubRNAi-4菌株，以2021为出发菌株的重组菌分别命名为βTubRNAi-i，βTubRNAi-ii，βTubRNAi-iii和βTubRNAi-iv菌株。以2021作为出发菌株的重组菌和以NJ003作为出发菌株产生的重组菌转化子表型一致，图2展示以NJ0031作为出发菌株产生的重组菌在PDA培养基上的形态。
[0103] 实施例4禾谷镰刀菌β-tubulin基因有效RNAi干扰区段的筛选
[0104] (1)表型实验：
[0105] 制备PDA培养基平板，6cm的皿倒7ml相应的培养基，取浓度为5×105个/ml的实施例3得到的各菌株新鲜分生孢子10μL，接种于培养基平板中央，将平板放25℃培养箱，黑暗培养，3d后观察菌落形态，如图2所示。
[0106] 图2的结果显示：βTubRNAi-3和βTubRNAi-4菌株在PDA培养基上均显示出生物量降低，其中βTubRNAi-3菌株在PDA培养基上生物量降低最为明显。这说明针对β-tubulin基因的这两个片段RNAi干扰后可造成菌丝生物量和生长势的降低。
[0107] (2)Southern分析
[0108] 根据实施例3获得的4株βTubRNAi转化子菌株为例，分别提取基因组用NcoI酶切，用探针G418P-F/G418P-R杂交，预期杂交带分别为8514bp,8598bpm,8528bp,8232bp,NJ003基因组杂交后没有条带，转化子均为单拷贝，且杂交带大小与预期符合，表明该载体已正确导入靶基因中，如图3所示。
[0109] (3)药敏性实验：
[0110] 分别以实例3得到的8株β-tubulin基因RNA干扰镰刀菌转化子、苯并咪唑类抗性菌株NJ003和敏感菌株2021作为分析样本，设置多菌灵在PDA培养基中的浓度为0，0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8μg/mL用于抗性菌株测定；设置多菌灵在PDA培养基中的浓度,
0，0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28μg/mL用于敏感菌株的测定，待在0μg/mL浓度下的菌株长至6cm时，利用PDA平板法测定样本的EC50值。
0，0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28μg/mL用于敏感菌株的测定，待在0μg/mL浓度下的菌株长至6cm时，利用PDA平板法测定样本的EC50值。
[0111] 如表1的结果显示：β-tubulin基因RNA不同区段RNA干扰后的镰刀菌转化子均表现出EC50值得显著下降，这表明β-tubulin基因RNA不同区段RNA干扰后均可降低镰刀菌对苯并咪唑类药剂的抗性、增加药敏性(表1)。
[0112] 表1β-tubulin基因RNAi转化子对多菌灵的敏感性分析
[0113]
[0114] (4)苗期接种：
[0115] 取豫麦35种子，用0.1％升汞消毒5min，无菌水洗3遍后浸泡2h；将种子均匀置于铺有双层无菌滤纸的塑料盒中，每盒放置25粒种子，25℃，90％湿度，12h光照，12h黑暗培养3d，使胚芽鞘长到3cm，用灭菌剪刀快速剪去胚芽鞘尖端，向伤口分别接种5μL(5×105个/mL，取自实例3中以NJ003以及以其为出发菌株的4株重组菌)孢子液，相同条件培养，7d后调查病斑长度，结果如表2所示。
[0116] 经致病力分析表明，β-tubulin基因不同区段干扰后均造成镰刀菌致病力下降，表现为病斑长度的显著减小。
[0117] 图4给出了5株豫麦35苗的病斑部分照片，并标示了病斑长度。照片直观显示了β-tubulin基因RNA不同区段RNA干扰后麦苗的病斑显著短于对照麦苗。
[0118] 表2β-tubulinRNAi菌株接种豫麦35苗期致病力
[0119]
[0120] (5)苗期药敏性的测定
[0121] 以豫麦35作为田间供试小麦品种，扬花期喷施50％多菌灵可湿性粉剂，浓度设置300g ha-1、600g ha-1、1200g ha-1，喷雾24h后接种苯并咪唑类药剂高抗菌株NJ003及4种β-tubulin基因RNA干扰重组菌株接种后21d调查发病情况，结果如表3，以病穗率表示：
[0122]
[0123] 利用Student’s tests和方差分析中的多重比较对接种调查结果进行差异性分析。
[0124] 分析表明，田间300g ha-150％多菌灵可湿性粉剂可使受RNA干扰菌株的致病力比亲本高抗菌株NJ003明显降低，RNA干扰菌株对苯并咪唑类的敏感性显著增加。
[0125] 结果如图5所示，喷施300g ha-150％多菌灵可湿性粉剂低浓度时，对抗性菌株的发病情况没有改善，而重组菌株的致病力明显的降低，表现为病穗显著减少；喷施1200g ha-150％多菌灵可湿性粉剂高浓度时，重组菌株的致病力几乎丧失，特别是重组菌βTubRNAi-3只在接种的小花发病而不能向临近的小花蔓延。分析表明，田间喷施300g ha-1、1200g ha-1的50％多菌灵可湿性粉剂可使致病力比高抗菌株NJ003分别降低了26.7％～81.893％、
60％～100％，菌株对施药浓度的多菌灵敏感性显著增加，见表3、图5。
60％～100％，菌株对施药浓度的多菌灵敏感性显著增加，见表3、图5。
[0126] 表3田间喷施50％多菌灵可湿性粉剂对高抗菌株NJ003及βTubRNAi转化子防效测定
[0127]
[0128] 实施例5βTubdsRNA对镰刀菌药效测定
[0129] (1)βTubdsRNA制剂配制
[0130] 1)以β-tubulin cDNA全长为模板，合成2种大小为850bp的β-tubulin基因dsRNAβTub-5(1nt-850nt)、βTub-6(836nt-最终碱基)，dsRNA合成使用Invitrogen公司的RNAi Kit AM1626试剂盒，2种βTubdsRNA的序列与相应模板U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同；
[0131] 2)以βTub-1、βTub-2、βTub-3和βTub-4单独、或以不同区段相互组合的方式作为体外干扰dsRNA的合成区段的模板合成14种βTubdsRNA，dsRNA合成使用Invitrogen公司的RNAi Kit AM1626试剂盒，14种βTubdsRNA的序列与相应模板U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同；
[0132] 3)以β-tubulin cDNA全长为模板，使用Invitrogen公司的 RNAi Kit AM1626试剂盒合成全长βTubdsRNA，用 RNase III(NEB公司，操作步骤见试剂盒说明书)消化后随机产生长度为15-30nt的siRNA。
[0133] 以上16种βTubdsRNA和1种15-30nt的siRNA分别用醋酸铵缓冲液(成分：0.1M醋酸铵、0.75mM EDTA、4％乙二醇、40mM氯化钙)稀释至2.5-320ng/μl。
[0134] (2)βTubdsRNA离体干扰过程：
[0135] 用SNA培养基(0.1％KH2PO4,0.1％KNO3,0.05％MgSO4˙7H2O,0.05％KCl,0.02％glucose和0.02％sucrose)醋酸铵缓冲液(成分：0.1M醋酸铵、0.75mM EDTA、4％乙二醇、40mM氯化钙)调节亚洲镰刀菌新鲜孢子浓度为2000个/mL。在96孔酶标板中加入50μLGFP-dsRNA(对照)、30ngμL-116种βTubdsRNA与1种15-30nt的siRNA或16种βTubdsRNA与1种15-
30nt的siRNA和1ngμL-1的苯并咪唑类药剂多菌灵的混合药剂，1ngμL-1的苯并咪唑类药剂多菌灵作为对照与50μLNJ003孢子液(2000个/mL)，混匀后25℃培养5d后置于倒置显微镜下观察。
30nt的siRNA和1ngμL-1的苯并咪唑类药剂多菌灵的混合药剂，1ngμL-1的苯并咪唑类药剂多菌灵作为对照与50μLNJ003孢子液(2000个/mL)，混匀后25℃培养5d后置于倒置显微镜下观察。
[0136] 结果如图6所示，βTubdsRNA和1ngμL-1的苯并咪唑类药剂多菌灵混合处理后比单独使用苯并咪唑类药剂后菌丝生长速率慢，菌丝弯曲生长更加明显，分枝增多，膨大结构出-1现；βTubdsRNA和1ngμL 的苯并咪唑类药剂多菌灵混合处理后第四天依然保持明显的干扰效果，βTubdsRNA单独处理的菌丝开始恢复至正常的菌丝形态。这表明苯并咪唑类药剂可延长dsRNA的持效期，dsRNA可以提高对苯并咪唑类药剂的药敏性。
[0137] (3)βTubdsRNA活体药效测定
[0138] 豫麦35种子消毒后无菌水浸泡2h，均匀铺于含有双层滤纸的塑料盒中，25℃、90％湿度12h光照，12h黑暗培养至胚芽鞘长至3cm，用剪刀剪去胚芽鞘尖端，分组取样喷施16种βTubdsRNA和1种15-30nt的siRNA或者16种βTubdsRNA和1种15-30nt的siRNA与苯并咪唑类(1ng/μL多菌灵)混合药剂(对照喷施1ng/μL多菌灵)，自然晾干6h后，伤口接种5μL(5×105个/mL)的镰刀菌孢子液，相同条件培养，4d后调查病斑长度。
[0139] 结果如图6所示，βTubdsRNA可有效抑制镰刀菌在胚芽鞘的发病，表现为胚芽鞘菌丝稀少、弯曲生长；βTubdsRNA与苯并咪唑类药剂混合处理后致病力降低更为明显，并能提高对苯并咪唑类药剂的敏感性。。
[0140] 结果如图6所示，16种βTubdsRNA和1种15-30nt的siRNA均可有效抑制镰刀菌在胚芽鞘的发病；与苯并咪唑类单剂相比，16种βTubdsRNA和1种15-30nt的siRNA与苯并咪唑类药剂的混合物能大幅度降低苯并咪唑类药剂抗性菌株NJ003在小麦胚芽鞘上的病斑长度，说明16种βTubdsRNA和1种15-30nt的siRNA在小麦活体上能够增加镰刀菌对苯并咪唑类药剂的敏感性。在siRNA浓度为2.5-320ng/μl范围内，各组均表现出对镰刀菌良好的抑菌能力，其中以βTub-3、βTub-6、siRNA为例，RNA浓度与抑菌效率关系如图7所示：不同浓度的βTubdsRNA或siRNA(5-320ng/μl)均可抑制镰刀菌发病抑菌效率越高。
[0141] 实施例6βTubdsRNA对不同真菌离体药效测定干扰
[0142] (1)βTubdsRNA的合成：
[0143] β-微管蛋白基因β-tubulin区段是以βTubdsRNA区段、dsRNA区段的联合或以全长或部分βTubdsRNA进行RNase消化后随机产生15-30nt的siRNA。βTubdsRNA合成使用Invitrogen公司的 RNAi Kit AM1626试剂盒(具体操作步骤见试剂盒说明书)，βTubdsRNA序列与相应模板U(尿嘧啶)替代T(胸腺嘧啶)后的序列相同。
[0144] (2)离体干扰过程：
[0145] 用SNA培养基(0.1％KH2PO4,0.1％KNO3,0.05％MgSO4˙7H2O,0.05％KCl,0.02％glucose和0.02％sucrose)和0.1M醋酸铵调节亚洲镰刀菌、禾谷镰刀菌、三线镰刀菌、尖孢镰刀菌、藤仓镰刀菌、灰霉病菌、稻瘟病菌新鲜孢子浓度为2000个/mL，炭疽的孢子用YEPD培养基和0.1M醋酸铵调至浓度为2000个/mL。在96孔酶标板中加入GFP-dsRNA(对照)或50μL的βTubdsRNA与50μLNJ003孢子液(2000个/mL)，混匀后25℃培养1d、4d置于倒置显微镜下观察。
[0146] 培养1d的结果如图8显示，βTubdsRNA可显著抑制多种镰刀菌镰刀菌、藤仓镰刀菌、灰霉病菌、稻瘟病菌以及炭疽病原菌的生长或孢子萌发，造成菌丝发育迟缓，分枝增多，出现部分膨大的结构。
[0147] 实施例7βTubdsRNA对镰刀菌、稻瘟病菌、灰霉病菌和炭疽菌活体药效实验[0148] 用本说明书中实施例5中βTubdsRNA制剂(16种βTubdsRNA和1种15-30nt的siRNA，浓度为40ng/μL)，分别喷施到水稻叶片表面、黄瓜叶片和大豆叶片上以及30ng/μL喷施到小麦胚芽鞘上，对照组喷施0.1M的醋酸铵，12h后分别接种稻瘟病菌孢子液、灰霉病菌孢子液5 6
以及大豆炭疽病菌孢子液10μL(1×10个/mL)以及镰刀菌孢子液3μL(1×10个/mL)，每菌株接种40个叶片，5天后统计发病率，发病率＝发病叶片数/接种总叶片数。
以及大豆炭疽病菌孢子液10μL(1×10个/mL)以及镰刀菌孢子液3μL(1×10个/mL)，每菌株接种40个叶片，5天后统计发病率，发病率＝发病叶片数/接种总叶片数。
[0149] 实验表明，16种βTubdsRNA和1种15-30nt的siRNA可显著提高植物对多种病原菌的抗病能力，见表4。
[0150] 如图9所示，将βTubdsRNA喷施于小麦胚芽鞘表明后，显著抑制镰刀菌菌丝的生长，菌丝稀疏；喷施于大麦叶片后稻瘟病菌的附着胞的形成明显受阻；喷施于黄瓜、大豆叶片后灰霉病菌、大豆炭疽病菌的孢子萌发、菌丝生长明显受到了抑制。
[0151] 表4喷施βTubdsRNA对稻瘟病菌、黄瓜灰霉病菌以及大豆炭疽的防治效果[0152]
[0153] 实施例8不同真菌来源β-tubulin基因对镰刀菌药效测定
[0154] (1)同源比对镰刀菌β-tubulin基因在不同真菌中的同源基因，所述真菌包括：亚洲镰刀菌(F.asiaticum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、藤仓镰刀菌(F.fujikuroi)、三线镰刀菌(F.tricinctum)，枯萎病菌(F.oxysporum)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)或炭疽(Colletotrichum higginsianum)。利用NCBI在线比对工具BlastN(https://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSear ch&LINK_LOC＝blasthome)比对分析，分析结果如图10所示，同源性范围为75％-99％。
blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSear ch&LINK_LOC＝blasthome)比对分析，分析结果如图10所示，同源性范围为75％-99％。
[0155] 图10通过不同颜色显示各真菌的同源性，其中炭疽(Colletotrichum higginsianum)为50-80、三线镰刀菌(F.tricinctum)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的80、其余真菌为>＝200。
[0156] (2)分别以稻瘟病菌、灰霉病菌、炭疽的β-tubulin cDNA作为模板按照实施例6中βTubdsRNA制剂配制方法合成dsRNA，并按照βTubdsRNA活体药效测定的方法测定不同来源的dsRNA对镰刀菌的药效，利用Student’s tests对接种调查结果进行差异性分析，结果如表5所示，不同来源的βTubdsRNA均对镰刀菌有较好的抑菌作用，与镰刀菌自身的dsRNA相比无显著差异，说明通过相同方法获得的、不同真菌源的βTubdsRNA在不同真菌间都具有相当药效作用。
[0157] 表5不同真菌源的βTubdsRNA对镰刀菌药效测定
[0158]
[0159] 实施例9βTubRNAi转基因植株的抗病性鉴定及杀菌剂的减量应用
[0160] (1)植物βTubRNAi表达载体的构建
[0161] 以商业化载体pSGRNAi作为骨架，在其35S启动子的下游和35S终止子的上游连入实例二中的βTub-3正反向序列(βTub-3F：AGCTCGCTGTTAACATGATTCCG；βTub-3R：TGCAAGTTGGACTGGGCCTCGG)和intron组成的颈环结构，所得植物表达载体命名为pPlantβTub-RNAi-3，其载体示意图见图11。
[0162] (2)拟南芥遗传转化过程
[0163] 利用农杆菌介导的拟南芥转化(参见：Brian W.Tague and Joanna Mantis,In Planta Agrobacterium-Mediated Transformation by Vacuum Infiltration,2006,323:215-223)将植物表达载体pPlantβTub-RNAi-3转化到拟南芥(哥伦比亚型)中，经过卡那霉素抗性筛选，获得抗性植株。
[0164] (3)转βTubRNAi-3基因拟南芥的抗病性鉴定及杀菌剂的减量应用：
[0165] 为了检测转βTubRNAi-3基因拟南芥形成的siRNA能否抑制入侵的镰刀菌的生长及增加镰刀菌对肌球蛋白抑制剂药物敏感性，通过叶片接种的方法检测了转基因植株的抗赤霉病性状，通过接种表型观察与统计，转基因株系的抗赤霉病能力和非转基因对照相比，达到显著差异(P<0.05)。经镰刀菌抗性菌株NJ003接种5d后，非转基因对照植株病斑面积为0.98cm2，而转基因植株为0.16cm2防治效果达到84％，喷施150ng/μl多菌灵的野生型拟南芥植株发病为0.93cm2，喷施800ng/μl多菌灵的野生型拟南芥植株发病为0.51cm2，而喷施
2
10ng/μl多菌灵的转基因植株发病为0.01cm ，病情降低了75～89％，防治效果达到99％，并显著降低了杀菌剂用量，见表6。
2
10ng/μl多菌灵的转基因植株发病为0.01cm ，病情降低了75～89％，防治效果达到99％，并显著降低了杀菌剂用量，见表6。
[0166] 表6转βTubRNAi-3基因拟南芥的抗赤霉病能力鉴定及杀菌剂减量应用
[0167]
[0168] 综上所述，本发明的微管蛋白β-tubulin基因RNA干扰技术具有增加病原真菌的药敏性、降低抗药性水平、干扰致病力、增强植物抗病性；防治多种植物病害；提高对化学药剂多菌灵的药敏性，同时多菌灵可延长dsRNAs药剂的持效期等绿色、安全的突出优点。
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