技术领域
[0001] 本
发明属于检测分析领域，涉及一种兽药残留的检测分析方法，尤其涉及一 种运用超高效液相色谱-四级杆/静
电场轨道阱高分辨质谱同时测定畜禽肉中152 种兽药及其他化合物残留的筛查方法。
背景技术
[0002]
食品安全问题是关系国计民生的重大问题，近几年随着“瘦肉精猪肉”、“红 心蛋”和“速生鸡”等典型事件见诸于网络与报端，畜禽产品
质量安全作为食品 质量安全的重要组成部分，正日益成为大众关注的焦点。无独有偶，在欧美也发 生了“疯
牛病”、“二恶英鸡肉”、“氯霉素丑闻”等重大质量安全事件，这也足以 说明畜禽产品质量安全正成为一个全球
畜牧业生产亟需解决的问题。现代畜牧业 中大规模集约化的生产养殖模式对动物疫病的防控和
治疗提出了很高的要求，兽 药的使用及其所带来的残留问题就成为了全球必然要面对的难题。
[0003] 近几年来随着分析技术的发展，违禁物质的检测方法已从原先的单一目标化 合物检测向多目标化合物检测发展，针对常见化学污染物建立了相应的多残留检 测标准，检测手段也日趋多样化。目前国际上比较成熟的多残留检测方法主要有 酶联
免疫吸附分析(ELISA)法、高效液相色谱(HPLC)法、气质联用(GC/MS) 法和液质联用(LC/MS和LC/MS/MS)法，并越来越趋向于用先进的气相色谱或液 相色谱串接高分辨质谱进行不同种类物质的多残留筛查和确证检测。
[0004] 而目前国内利用液质联用或气质联用技术针对单一种类多种违禁药物的检 测已制定了一系列标准，这些检测方法标准的制订有助于各级检测单位对动物组 织与
排泄物中各种化学污染物开展检测，但也存在着较大的局限性，其主要体现 在如下几点：一、针对单一种类化合物建立的检测方法无法检测不在目标化合物 列表中的新型同系物，难以跟上市场趋势；二、针对分子量与目标化合物接近的 物质无法进行有效区分，可能出现
假阳性结果，影响检测结果的可靠性；三、针 对每一类目标化合物需要进行不同的方法进行检测，需要大量人
力物力，难以满 足日益增长的检测样品量。
[0005] 而近些年高分辨质谱技术发展迅猛，从原先的磁质谱(Sector MS)，傅里叶 变换-
离子回旋共振质谱(FT ICR MS)发展到如今的飞行时间质谱(TOF MS)和 静电场轨道阱质谱(Orbitrap MS)，其在质量
精度和
分辨率上不断有所提高， 在检测灵敏度和线性范围方面更是有了质的飞跃。相比于原先的低分辨质谱技 术，高分辨质谱具有如下优势：一、无需标准物质，可直接根据精确质量数进行 筛查；二、分辨率和精确度高，可区分质量数接近的内源物质干扰，避免假阳性 检测结果；三、全扫描采集样品组分，获得更全面更丰富的原始数据，可供非目 标化合物以及回顾性分析使用；四、方便研究药物及其代谢途径，寻找合适的代 谢产物作为残留标示物；五、无需开发设计繁琐的富集
净化过程，只需开发简便 普适的前处理方法，适合多残留检测筛查分析。
[0006] 高分辨质谱技术的运用使检测从原先低分辨率质谱时代的前靶向分析向后 靶向和无靶向分析迈进。欧盟发布的96/23/EC和2002/657/EC中都有关于高分 辨质谱技术在确证化合物领域的运用
细则，并采取识别分(identification points，IPs)制度，其中规定A类(违禁物质)需满足4IPs，B类(限用物质) 需满足3IPs方能确证阳性。因此，应加快高分辨质谱在畜禽肉中多残留检测领 域的运用，提升我国兽药残留检测技术标准的
水平，尽快与国际先进检测技术标 准接轨，这有助于维护我国畜产品在国际上的形象
和声誉。
发明内容
[0007] 针对
现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种同步检测畜禽肉中152 种化学污染物的高分辨质谱方法，所述的这种同步检测畜禽肉中152种化学污染 物的高分辨质谱方法要解决现有技术中的检测畜禽肉中化学污染物残留的方法 分辨率低，检测方法复杂的技术问题。
[0008] 本发明提供了一种同步检测畜禽肉中152种化学污染物的高分辨质谱方法， 1)建立化学污染物标准品质谱谱库：所述的化学污染物为17α-
醋酸羟基孕
酮、 甲基睾酮、2-
氨基氟苯咪唑、3-甲基喹噁啉-2-羟酸、4-差向
四环素、5-羟基甲 苯咪唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑、氨苄青霉素或氨苄西林、巴氯 芬、班布特罗、丁酚胺、倍他米松、勃地酮或勃地龙、溴布特罗、康苯咪唑、卡 巴
氧、卡布特罗、头孢噻呋、氯霉素、醋酸氯地孕酮、金霉素、环丙苯唑、西
马 特罗、西布特罗、西诺沙星、环丙沙星、克伦特罗、克仑塞罗、异克仑潘特、甲 基克伦特罗或克伦潘特、克仑普罗、克林霉素、可乐定、氯丙那林、氯唑西林、 可的松、赛庚啶、达诺沙星或甲磺酸达氟沙星、地塞米松、双氟沙星或
盐酸二氟 沙星、二甲硝咪唑/地美硝唑、羟基地美硝唑、多巴酚丁胺、多西环素/强力霉素、 依诺沙星、恩诺沙星、表睾酮、非班太尔、硫苯咪唑、非诺特罗、氟罗沙星、氟 苯尼考、氟苯咪唑、羟基氟苯达唑、氟甲喹、氟甲睾酮、福莫特罗、羟甲基克伦 特罗、羟基异丙硝唑、异丙(去甲)肾上腺素、盐酸苯氧丙酚胺、
吉他霉素、左 旋咪唑、左炔诺孕酮、林可霉素、拉苯咪唑、洛美沙星、鲁苯哒唑、马布特罗、 马喷特罗、麻保沙星、
甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、 醋酸美仑孕酮、乙酰甲喹、甲氢睾酮、去氢甲睾酮、美他环素、甲基强的松龙、 甲硝唑、羟基甲硝唑、
萘夫西林、萘啶酸、诺龙、丙酸诺龙、乙诺酮、炔诺酮、 氟哌酸/诺氟沙星、炔诺孕酮、氧氟沙星、奥西那林、苯唑西林、硫氧苯唑、噁 喹酸、土霉素、丁苯咪唑、培氟沙星、喷布特罗、苯
乙醇胺、吡布特罗、泼尼松 龙、孕酮、喹烯酮、莱克多巴胺、利托君、洛硝哒唑、罗红霉素、沙丁胺醇、沙 美特罗、沙拉沙星、康力龙、磺胺苯甲酰、磺胺氯哒、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧 嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、氨苯磺胺、磺胺甲氧吡嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲 氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲噁唑(磺胺甲基异恶唑)、磺 胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲唑或磺胺二甲恶唑或磺胺噁唑、磺胺苯 吡唑、磺胺吡啶、磺胺喹噁啉、磺胺噻唑、磺胺二甲基异嘧啶或磺胺异嘧啶、磺 胺异噁唑或磺胺二甲异恶唑、特布他林、睾酮、丙酸睾酮、四环素、茶
碱、噻苯 咪唑、5-羟基噻苯咪唑、甲砜霉素、泰妙菌素、替米考星、群勃龙、三氯苯唑、 甲氧苄啶、妥布特罗、泰乐菌素、齐帕特罗；
[0009] 将上述化学污染物对照品配制成1mg/mL的标准储备液，再取适量标准储备 液用质量百分比浓度为10％的乙腈分别稀释为100ng/mL的标准工作液，采用超 高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪器在正负离子切换模式下检 测；
[0010] 液相色谱条件：
[0011] a)色谱柱：100mm×3.0mm，粒径1.8μm的ZORBAX SB-C18；
[0012] b)柱温：30℃；
[0013] c)进样量：10μL；
[0014] d)流速：0.3mL/min；
[0015] e)流动相：A：质量百分比浓度为0.1％的
甲酸水溶液；B:质量百分比浓度 为的0.1％的甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱如下描述：
[0016]时间(min) A：0.1％甲酸水溶液％ B：0.1％甲酸-乙腈溶液％
0 95 5
15 5 95
18 5 95
20 95 5
23 95 5
[0017] 质谱条件：
[0018] a)电离模式：电喷雾离子源；
[0019] b)扫描方式：正、负离子切换扫描；
[0020] c)检测方式：全扫描/数据依赖二级扫描；
[0021] d)脱
溶剂气、锥孔气和碰撞气均为纯度在99％以上的氮气；
[0022] e)毛细管
电压：3.2kV(ESI+)3.0kV(ESI-)；
[0024] g)脱溶剂温度：350℃；
[0025] h)鞘气：40arb；
[0026] i)辅助气：10arb；
[0027] j)一级全扫描范围：m/z100～1000；
[0029] 分别得到上述化学污染物标准品溶液的质谱图，以此建立化学污染物标准品 质谱谱库；
[0030] 2)样品检测：称取样品5.00g于50mL离心管中，加入质量百分比浓度为 90％的乙腈提取溶液20mL，超声提取5min，8000g离心5min，取上清液，备用；
[0031] 取备用液2mL直接过反相固相萃取柱，并收集流出液，取流出液1.6mL于 40℃氮气吹干至0.5mL，用质量百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液定容至1mL，涡 旋，14000r/min离心5min，取上清液采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道 阱高分辨质谱仪器在正负离子切换模式下检测；检测条件如步骤1)；
[0032] 3)筛查分析：通过保留时间及精确质量数测定值来进行筛查，如检出的色 谱峰保留时间与化学污染物标准品质谱谱库中的保留时间偏差在±0.2min或± 5％，且母离子精确分子量与理论质量数的偏差小于10ppm，子离子确分子量与 理论质量数的偏差小于20ppm，则认为检材中可能含有上述的某种化学污染物。
[0033] 进一步的，对于筛选阳性检材，当一级母离子精确质量数偏差小于5ppm，检 出其在不同碰撞能下的二级谱图中出现的2个碎片离子与谱库中的碎片离子精确 质量数偏差小于10ppm相同的2个碎片离子，主要碎片离子丰度比与标准对照品一 致，检出色谱峰保留时间与标准对照品的保留时间偏差在±0.2min或±2.5％，即 可判定为样品中存在这种化学污染物。
[0034] 根据上述建立的方法，可同时筛查肌肉组织中12类152种药物，具体包括： β-受体激动剂类(31种)、喹诺酮类(16种)、
激素类(27种)、磺胺类(21种)、 四环素类(6种)、苯并咪唑类(20种)、大环内酯类(7种)、硝基咪唑类(6种)、 β-内酰胺类(5种)、喹恶林类(4种)、氯霉素类(3种)、其他类(6种)。
[0035] 本发明
覆盖磺胺类、喹诺酮类、喹噁啉类、硝基咪唑类、β-内酰胺类、四 环素类、大环内酯类、氯霉素类、苯并咪唑类、烟碱激动剂类、β-受体激动剂 和激素等12类152种目标化合物在畜禽肉中的多残留液相色谱-高分辨
串联质谱 方法。样品经乙腈溶液提取，反相固相萃取小柱净化、浓缩，采用液相色谱高分 辨串联质谱仪检测，以质量色谱峰保留时间和特征离子定性、筛查及确证。
[0036] 本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的方法样品前处理方 法简便，通过一针进样可以筛查确证152种化合物，检测通量大，准确度高，适 用于畜禽肉中多种类兽药残留的同时定性确证检测。
附图说明
[0037] 图1 152种化合物8ng/mL标准对照品TIC图。
具体实施方式
[0039] 本发明提供了一种同步检测畜禽肉中152种化学污染物的高分辨质谱方法， 1)建立化学污染物标准品质谱谱库：所述的化学污染物为17α-醋酸羟基孕酮、 甲基睾酮、2-氨基氟苯咪唑、3-甲基喹噁啉-2-羟酸、4-差向四环素、5-羟基甲 苯咪唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑、氨苄青霉素或氨苄西林、巴氯 芬、班布特罗、丁酚胺、倍他米松、勃地酮或勃地龙、溴布特罗、康苯咪唑、卡 巴氧、卡布特罗、头孢噻呋、氯霉素、醋酸氯地孕酮、金霉素、环丙苯唑、西马 特罗、西布特罗、西诺沙星、环丙沙星、克伦特罗、克仑塞罗、异克仑潘特、甲 基克伦特罗或克伦潘特、克仑普罗、克林霉素、可乐定、氯丙那林、氯唑西林、 可的松、赛庚啶、达诺沙星或甲磺酸达氟沙星、地塞米松、双氟沙星或盐酸二氟 沙星、二甲硝咪唑/地美硝唑、羟基地美硝唑、多巴酚丁胺、多西环素/强力霉素、 依诺沙星、恩诺沙星、表睾酮、非班太尔、硫苯咪唑、非诺特罗、氟罗沙星、氟 苯尼考、氟苯咪唑、羟基氟苯达唑、氟甲喹、氟甲睾酮、福莫特罗、羟甲基克伦 特罗、羟基异丙硝唑、异丙(去甲)肾上腺素、盐酸苯氧丙酚胺、吉他霉素、左 旋咪唑、左炔诺孕酮、林可霉素、拉苯咪唑、洛美沙星、鲁苯哒唑、马布特罗、 马喷特罗、麻保沙星、甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、 醋酸美仑孕酮、乙酰甲喹、甲氢睾酮、去氢甲睾酮、美他环素、甲基强的松龙、 甲硝唑、羟基甲硝唑、萘夫西林、萘啶酸、诺龙、丙酸诺龙、乙诺酮、炔诺酮、 氟哌酸/诺氟沙星、炔诺孕酮、氧氟沙星、奥西那林、苯唑西林、硫氧苯唑、噁 喹酸、土霉素、丁苯咪唑、培氟沙星、喷布特罗、苯乙醇胺、吡布特罗、泼尼松 龙、孕酮、喹烯酮、莱克多巴胺、利托君、洛硝哒唑、罗红霉素、沙丁胺醇、沙 美特罗、沙拉沙星、康力龙、磺胺苯甲酰、磺胺氯哒、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧 嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、氨苯磺胺、磺胺甲氧吡嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲 氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲噁唑(磺胺甲基异恶唑)、磺 胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲唑或磺胺二甲恶唑或磺胺噁唑、磺胺苯 吡唑、磺胺吡啶、磺胺喹噁啉、磺胺噻唑、磺胺二甲基异嘧啶或磺胺异嘧啶、磺 胺异噁唑或磺胺二甲异恶唑、特布他林、睾酮、丙酸睾酮、四环素、茶碱、噻苯 咪唑、5-羟基噻苯咪唑、甲砜霉素、泰妙菌素、替米考星、群勃龙、三氯苯唑、 甲氧苄啶、妥布特罗、泰乐菌素、齐帕特罗；
[0040] 将上述化学污染物对照品配制成1mg/mL的标准储备液，再取适量标准储备 液用质量百分比浓度为10％的乙腈分别稀释为100ng/mL的标准工作液，采用超 高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪器在正负离子切换模式下检 测；
[0041] 液相色谱条件：
[0042] a)色谱柱：100mm×3.0mm，粒径1.8μm的ZORBAX SB-C18；
[0043] b)柱温：30℃；
[0044] c)进样量：10μL；
[0045] d)流速：0.3mL/min；
[0046] e)流动相：A：质量百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液；B:质量百分比浓度 为的0.1％的甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱如下描述：
[0047]时间(min) A：0.1％甲酸水溶液％ B：0.1％甲酸-乙腈溶液％
0 95 5
15 5 95
18 5 95
20 95 5
23 95 5
[0048] 质谱条件：
[0049] a)电离模式：电喷雾离子源；
[0050] b)扫描方式：正、负离子切换扫描；
[0051] c)检测方式：全扫描/数据依赖二级扫描；
[0052] d)脱溶剂气、锥孔气和碰撞气均为纯度在99％以上的氮气；
[0053] e)毛细管电压：3.2kV(ESI+)3.0kV(ESI-)；
[0054] f)离子传输管温度：325℃；
[0055] g)脱溶剂温度：350℃；
[0056] h)鞘气：40arb；
[0057] i)辅助气：10arb；
[0058] j)一级全扫描范围：m/z100～1000；
[0059] k)碰撞能量20、40、60eV；
[0060] 分别得到上述化学污染物标准品溶液的质谱图，以此建立化学污染物标准品 质谱谱库，如图1所示；
[0061] 2)样品检测：称取样品5.00g于50mL离心管中，加入质量百分比浓度为 90％的乙腈提取溶液20mL，超声提取5min，8000g离心5min，取上清液，备用；
[0062] 取备用液2mL直接过反相固相萃取柱，并收集流出液，取流出液1.6mL于 40℃氮气吹干至0.5mL，用质量百分比浓度为0.1％的甲酸水溶液定容至1mL，涡 旋，14000r/min离心5min，取上清液采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道 阱高分辨质谱仪器在正负离子切换模式下检测；检测条件如步骤1)；
[0063] 3)筛查分析：通过保留时间及精确质量数测定值来进行筛查，如检出的色 谱峰保留时间与化学污染物标准品质谱谱库中的保留时间偏差在±0.2min或± 5％，且母离子精确分子量与理论质量数的偏差小于10ppm，子离子确分子量与 理论质量数的偏差小于20ppm，则认为检材中可能含有上述的某种化学污染物。
[0064] 进一步的，对于筛选阳性检材，如一级母离子精确质量数偏差小于5ppm， 检出其在不同碰撞能下的二级谱图中出现的2个碎片离子与谱库中的碎片离子 精确质量数偏差小于10ppm相同的2个碎片离子，主要碎片离子丰度比与标准 对照品一致，检出色谱峰保留时间与标准对照品的保留时间偏差在±0.2min或± 2.5％，即可判定为样品中存在这种化学污染物。
[0065] 采用本发明的方法可以检测出的各类药品如表1所示。具体检出药品如表2 所示。一级母离子精确分子量和二级碎片离子精确分子量见表3。
[0066] 表1各类标准品及检出信息
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071]
[0072]
[0073] 表2各类标准品及检出信息
[0074] 表3 152种化学污染物高分辨质谱选择离子参数表
[0075]
[0076]
[0077]
[0078]
[0079]
[0080]
[0081] 实施例2
[0082] 1.提取
[0083] 称取试料5.00g(精确至0.01g)于50mL离心管中，加入90％乙腈提取溶液 20mL，超声提取5min，8000g离心5min，取上清液，备用。
[0084] 2.净化
[0085] 取备用液约2mL直接过反相固相萃取柱，并收集流出液，取流出液1.6mL于 40℃氮气吹干至0.5mL，用0.1％甲酸水溶液定容至1mL，涡旋，14000r/min离心 5min，取上清液在正负离子切换模式下检测。
[0086] 3.筛查分析
[0087] 通过保留时间及精确质量数测定值来进行筛查，如检出的色谱峰保留时间与 化学污染物标准品质谱谱库中的保留时间偏差在±0.2min或±5％，且母离子精确 分子量与理论质量数的偏差小于10ppm，子离子确分子量与理论质量数的偏差小 于20ppm，则认为检材中可能含有上述的某种化学污染物。根据上述建立的方法， 可同时筛查肌肉组织中12类152种药物，具体包括：β-受体激动剂类(31种)、 喹诺酮类(16种)、激素类(27种)、磺胺类(21种)、四环素类(6种)、苯并咪 唑类(20种)、大环内酯类(7种)、硝基咪唑类(6种)、β-内酰胺类(5种)、 喹恶林类(4种)、氯霉素类(3种)、其他类(6种)。
[0088] 4.确证分析
[0089] 对于筛选阳性检材，如一级母离子精确质量数偏差小于5ppm，检出其在不同 碰撞能下的二级谱图中出现的2个碎片离子与谱库中的碎片离子精确质量数偏差 小于10ppm相同的2个碎片离子，主要碎片离子丰度比与标准对照品一致，检出色 谱峰保留时间与标准对照品的保留时间偏差在±0.2min或±2.5％，即可判定为样 品中存在这种化学污染物。
[0090] 2.1主要标准技术指标
[0091] 2.1.1检出限的确定
[0092] 利用空白样品添加混合兽药(12类152种药物)浓度为10μg/kg、20μg/kg、 50μg/kg，用上述前处理方法进行样品处理，依照实施例1的色谱条件进行分析， 进样10μL，以能够触发二级质谱扫描的各化合物最小峰面积为评价标准，通过 不同的加标水平确定该方法的检出限(LOD)，结果见表2。
[0093] 2.1.2标准线性范围考察2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL五点 构成的线性浓度，各药物线性良好，见表4
[0094] 表4线性方程及相关系数
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0100] 对空白猪肉、鸡肉、牛肉进行加标回收率试验，添加浓度为10、20、50μg/kg， 考察方法的准确度和重现性。每批次6个平行样，重复3个批次。结果见表5、。
[0101] 表5猪肉、鸡肉和牛肉中检出限的回收率
[0102]
[0103]
[0104]
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112]
[0113]
[0114]
[0115]
[0116]
[0117]
