技术领域
[0001] 本
发明涉及一种弓形虫乳酸脱氢酶基因敲除虫株的构建方法，以及使用该方法构建的乳酸脱氢酶1(LDH1)和乳酸脱氢酶2(LDH2)双基因缺失虫株的用途。
背景技术
[0002] 弓形虫是从属于顶复
门原虫的专性细胞内寄生虫，在全世界范围内广泛分布，是非常重要的
人畜共患病原体，能引起严重的人兽共患弓形虫病。在南美和欧洲一些地区，人群和动物的感染率高达80-90％；在中国，感染率一般在10％左右。免疫
力低下的人群感染弓形虫有非常高的
风险，严重时可以致死。妇女在孕期感染弓形虫将对
胎儿的发育造成不良影响，引起畸形、智障、早产甚至胎儿死亡。鉴于其危害，弓形虫已被列为孕妇常规检查中的一个必检项目。在农业上，弓形虫感染重要农业动物(如羊、猪等)容易引起动物流产、肉/奶产品
质量下降而产生巨大的经济损失，同时能将感染经食物传给人类。近年来，随着
有机农业的兴起，动物的弓形虫感染率有上升的趋势。
[0003] 因此，弓形虫病的防控对于人类健康和畜牧养殖业的发展均有重要意义。然而，到目前为止，弓形虫病的
预防没有良好的
疫苗，因而构建具有良好免疫原性和免疫保护力的弓形虫疫苗具有重要价值。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种弓形虫基因敲除虫株的构建方法，该虫株由于敲除了乳酸脱氢酶1和乳酸脱氢酶2两个基因，具有
毒力小，在动物体内繁殖少等优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有制备抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。
[0005] (1)本发明所述弓形虫基因敲除虫株(△LDH1△LDH2虫株)的构建：构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgLDH2质粒、制备ldh2-5UTR::DHFR::ldh2-3UTR同源模板,共电转至出发虫株ME49，经1uM乙胺嘧啶筛选、PCR鉴定获得弓形虫基因敲除虫株△LDH2；构建pSAG1-Cas9-TgU6-sgLDH1质粒，制备ldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR同源模板,电转至△LDH2,经30uM氯霉素筛选、PCR鉴定获得弓形虫基因敲除虫株△LDH1△LDH2。
[0006] (2)进行了基因敲除虫株△LDH1△LDH2毒力试验：以野生型虫株ME49为对照,
腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，5×102个速殖子/小鼠，每组接10只，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明感染△LDH1△LDH2双敲除株的小鼠30天内没有死亡，存活率100％。
[0007] (3)不同剂量的△LDH1△LDH2虫株对小鼠的毒力试验：腹腔接种7周龄雌性ICR小2 3 3 4 2
鼠，5×10，2×10 ,8×10和3.2×10个敲除株虫子，每组接10只，对照组接5×10个ME49速殖子/小鼠，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明接种不同剂量的敲除株实验组小鼠30天之内没有死亡，说明弓形虫LDH1和LDH2敲除之后对小鼠的毒力下降明显。
[0008] (4)小鼠感染△LDH1△LDH2虫株后的荷虫量试验：对7周龄雌性ICR小鼠腹腔接种15
×10 个双敲除株或野生型虫株速殖子，感染后5天，收取小鼠腹
水，进行定量qPCR，分析腹水荷虫量。结果表明接种△LDH1△LDH2敲除虫株小鼠腹水荷虫量显著低于野生型ME49的对照组小鼠腹水荷虫量，说明弓形虫△LDH1△LDH2在小鼠体内无明显繁殖，可以被宿主有效清除。
[0009] (5)△LDH1△LDH2虫株对小鼠的免疫保护力：以103、104、105个速殖子每只小鼠的感染量接种ICR小鼠，每组5只。30天后对免疫过的小鼠及空白ICR小鼠(10只)接种1×103个野生型虫体ME49，观察、记录小鼠死亡情况，统计小鼠30天内的死亡率。结果表明△LDH1△LDH2虫株对小鼠抵抗野生型虫株感染具有良好的保护力，有成为基因工程疫苗的潜力。
附图说明
[0010] 图1是敲除弓形虫LDH2基因的策略示意图。
[0011] 图2是△LDH2的单克隆虫株PCR鉴定结果。
[0012] 图3是在△LDH2虫株中敲除LDH1基因构建△LDH1△LDH2的策略示意图。
[0013] 图4是△LDH1△LDH2的单克隆虫株PCR鉴定结果。
[0014] 图5是△LDH1△LDH2虫株对小鼠的毒力试验结果。
[0015] 图6是不同剂量△LDH1△LDH2虫株对小鼠的毒力试验结果。
[0016] 图7是小鼠感染△LDH1△LDH2虫株后腹水中的荷虫量。
[0017] 图8是△LDH1△LDH2虫株对小鼠的免疫保护力试验结果。
具体实施方式
[0018] 下面结合
实施例对本发明进行详细说明。
[0019] 实施例1：弓形虫△LDH1△LDH2虫株的构建
[0020] (1)出发虫株ME49
[0021] ME49是具有乳酸脱氢酶1和乳酸脱氢酶2两个基因的球虫目弓形虫科弓形科属的II型虫株，所述乳酸脱氢酶1和2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。
[0022] (2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgLDH2质粒的构建
[0023] ①用gRNA在线设计
网站(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)对目标基因打靶位点进行设计，根据所设计的靶点序列设计gRNA引物：
[0024] 上游引物gRNA-LDH2-Fw:
[0025] 5’–AACCAGTATGAGAAGATCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’
[0026] 下游引物(gRNA-R)为：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’
[0027] ②在灭菌PCR管中配制如下反应体系，其中模板DNA：pSAG1-Cas9-TgU6-sgUPRT质粒(购自http://www.addgene.org)：
[0028]
[0029] ③PCR反应条件如下：
[0030]
[0031] ④PCR结束以后，在PCR反应体系里直接加1μl DpnI，PCR仪里37℃进行消化30min。
[0032] ⑤取新的灭菌PCR管，配制如下反应体系：
[0033]
[0034] 在PCR仪中，25℃反应15min；
[0035] ⑥取全部反应产物转化入DH5α(100μl)感受态细胞中，涂LB/Amp平板，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落置于5ml LB/Amp液体培养基中，37℃/180rpm振荡培养10-12h至菌液浑浊；取500μl菌液进行测序分析，测序引物为M13反向引物，若测序结果显示靶点序列已完全被替换，即质粒构建成功，利用Omega公司的去内毒素质粒提取
试剂盒(Endo-free Plasmid Mini Kit II)对pSAG1-Cas9-TgU6-sgLDH2质粒进行提取，并测定浓度、备用。
[0036] (3)ldh2-5UTR::DHFR::ldh2-3UTR同源模板的制备
[0037] ①根据拟敲除基因的Gene ID在ToxoDB上确定该基因所在的locus，通过其所在的基因组序列确定5’同源臂(ldh2-5UTR)和3’同源臂(ldh2-3UTR)；
[0038] ②根据多
片段无缝连接试剂盒
说明书中所介绍的方法进行5’同源臂，3’同源臂，DHFR，pUC19载体无缝连接扩增引物的设计；
[0039] ③利用设计的引物(表1)用高保真酶(KD plus)分别从弓形虫ME49基因组DNA中扩增获得5’同源臂和3’同源臂片段，从带DHFR的质粒(购自http://www.addgene.org)中扩增获得DHFR片段，利用所设计的特异性引物线性化pUC19载体(购自http://www.addgene.org)，分别对上述目的片段进行回收，并利用NanoDrop2000测定回收产物浓度；
[0040] 表1.构建pldh2-5UTR::DHFR::ldh2-3UTR质粒引物
[0041]
[0042]
[0043] ④根据回收产物的浓度配制如下反应体系：
[0044]
[0045] 充分混匀后，37℃反应30min，
冰上放置5min；
[0046] ⑤将10μl连接产物全部转化入DH5α(100μl)感受态细胞中，涂LB/Amp平板，37℃倒置培养过夜；挑取单菌落置于含5ml LB/Amp液体培养基的无菌PV玻璃瓶中，37℃/180rpm振荡培养10h至菌液浑浊；分别利用M13正向和反向引物进行测序分析，若测序结果正确即可认为pldh2-5UTR::DHFR::ldh2-3UTR质粒构建成功，遂将鉴定正确的菌液进行质粒提取，-20℃保存，该正确质粒含有SEQ ID NO：3所示序列。
[0047] ⑥利用高保真酶对pldh2-5UTR::DHFR::ldh2-3UTR质粒进行PCR扩增，扩增引物为U5LDH2-Fw上游引物和U3LDH2-Rw下游引物，对具有SEQ ID NO：3所示序列的目的片段(ldh2-5UTR::DHFR::ldh2-3UTR)进行切胶回收并测定浓度、备用。
[0048] (4)弓形虫基因敲除虫株△LDH2的获得
[0049] ①收取步骤(1)所述新鲜的弓形虫速殖子ME49，利用无菌的3μm孔径滤
膜过滤除掉宿主细胞碎片，1500rpm离心10min；弃上清，用Cytomix(120mM KCl,0.15mM CaCl2,10mM K2HPO4/KH2PO4,25mM HEPES,2mM EGTA,5mM MgCl2,pH＝7.6)重悬虫体沉淀至虫体量为1×107个速殖子/ml。
[0050] ②取250-300μl左右的虫体悬液到电转杯中，加入步骤(2)pSAG1-Cas9-TgU6-sgLDH2质粒和步骤(3)ldh2-5UTR::DHFR::ldh2-3UTR同源模板，其中质粒和同源模板DNA摩尔比＝5:1，
转染DNA的总量为10μg，总体积350μl。
[0051] ③用移液枪将DNA和ME49虫体混合均匀于4mm电转杯中，并去除气泡；将电转杯置于Bio-Rad电转仪内，设置1600V、25μF、50Ω、4mm条件，电击两次。
[0052] ④在电转杯中立即加入1ml虫体培养液(DMEM+2％FBS+双抗)轻轻冲洗，再将该液体转移至新鲜的宿主细胞上进行培养(T25)，同时设立无DNA的转染对照组，同时进行培养观察。
[0053] ⑤在60-80％转染后的虫体逸出HFF宿主细胞后，将细胞裂解使虫体从宿主细胞中释放出来；取500-2000μl虫体悬液加入到新鲜的宿主细胞中(T25)，在该培养基中加入1uM乙胺嘧啶筛选；
[0054] ⑥在乙胺嘧啶作用3天后，可见宿主细胞内出现虫体增殖现象，在50％虫体从宿主细胞内逸出时将细胞裂解使虫体释放，取500-1000μl虫体传到新鲜的宿主细胞中，再进行药物筛选；
[0055] ⑦在经过三至五代药物筛选后，将虫体置于含有宿主细胞的96孔板中进行单克隆筛选(接4
块96孔板)，每孔接种1-3个(计算量)速殖子；剩余虫子可进行基因组DNA的提取，并利用(表3)引物，图1所示方法检测同源臂整合效率和基因敲除效率，PCR1有条带说LDH2的5’同源臂整合入弓形虫基因组中，PCR2有条带说明LDH2的3’同源臂整合入弓形虫基因组中，PCR3条带检测敲除基因LDH2是否还在基因组中，若对照组ME49有PCR3条带，而转染实验组无PCR3条带，则说明LDH2被成功敲除。
[0056] 表3.△LDH2的单克隆虫株PCR鉴定引物
[0057]
[0058] ⑧在96孔板中培养8-11天后观察是否存在单克隆，利用无菌枪头将含有单克隆的宿主细胞从孔内刮下，加入到含有宿主细胞的24孔板中，继续培养；当24孔板中有70％的宿主细胞被裂解时，即可将孔内的虫子150μl传到新的24孔板中培养，其余的用于DNA提取以鉴定克隆；
[0059] ⑨利用PCR1，PCR2和PCR3对挑选的单克隆虫株进行检测，若PCR1和PCR2有特异性条带而PCR3无目的带说明该单克隆虫株为基因敲除虫株△LDH2；将确定为△LDH2的虫株继续扩大培养至T25培养瓶；对T25培养瓶中的基因敲除虫株再次进行PCR1，PCR2和PCR3检测，PCR反应体系如下，若仍为敲除表型即可在扩大后进行冻存。
[0060] 在灭菌PCR管中配制如下反应体系：
[0061]
[0062] PCR反应条件如下：
[0063]
[0064] ⑩PCR产物鉴定：扩增完成后，取PCR产物10μL，加2ul的6×核酸上样缓冲液混匀，点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，110-120V，
电泳30分钟，凝胶成像系统观察，PCR鉴定结果如图2所示，表示△LDH2的单克隆虫株构建成功。
[0065] (5)pSAG1-Cas9-TgU6-sgLDH1质粒的构建
[0066] ①引物设计同步骤(2)所述，上游引物gRNA-LDH1-Fw:
[0067] 5’–GCCGGTCTGACCAAGGTGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC–3’
[0068] 下游引物(gRNA-R)为：5’–AACTTGACATCCCCATTTAC–3’
[0069] ②在灭菌PCR管中配制如下反应体系：
[0070]
[0071] 后续步骤同(3)中⑤至⑥所述。利用Omega公司的去内毒素质粒提取试剂盒(Endo-free Plasmid Mini Kit II)对pSAG1-Cas9-TgU6-sgLDH1质粒进行提取，并测定浓度、备用；
[0072] (6)ldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR同源模板的制备
[0073] ①根据拟敲除基因的Gene ID在ToxoDB上确定该基因所在的locus，通过其所在的基因组序列确定5’同源臂(ldh1-5UTR)和3’同源臂(ldh1-3UTR)；
[0074] ②根据多片段无缝连接试剂盒说明书中所介绍的方法进行5’同源臂，3’同源臂，CAT，pUC19载体无缝连接扩增引物的设计；
[0075] ③利用设计的引物(表2)用高保真酶(KD plus)分别从弓形虫ME49基因组DNA中扩增获得5’同源臂和3’同源臂片段，从带CAT的质粒(购自http://www.addgene.org)中扩增获得CAT片段，利用所设计的特异性引物线性化pUC19载体，分别对上述目的片段进行回收，并利用NanoDrop2000测定回收产物浓度；
[0076] 表2.构建pldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR质粒引物
[0077]
[0078]
[0079] ④根据回收产物的浓度配制如下反应体系：
[0080]
[0081] 充分混匀后，37℃反应30min，冰上放置5min；
[0082] 后续步骤同(2)中⑥所述，获得pldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR质粒，该质粒含有SEQ ID NO：4所示序列。
[0083] ⑤利用高保真酶对pldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR质粒进行PCR扩增，扩增引物为U5LDH1-Fw上游引物和U3LDH1-Rw下游引物，对具有SEQ ID NO：4所示序列的目的片段(ldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR)进行切胶回收并测定浓度、备用。
[0084] (7)弓形虫基因敲除虫株△LDH1△LDH2的获得
[0085] ①收取步骤(4)中获得的新鲜弓形虫速殖子△LDH2，利用无菌的3μm滤器过滤除掉宿主细胞碎片，1500rpm离心10min；弃上清，用Cytomix重悬虫体沉淀至虫体量为1×107个速殖子/ml。
[0086] ②取250-300μl左右的虫体悬液到电转杯中，加入步骤(5)pSAG1-Cas9-TgU6-sgLDH1质粒和步骤(6)ldh1-5UTR::CAT::ldh1-3UTR同源模板，其中质粒和同源模板DNA摩尔比＝5:1，转染DNA的总量为10μg,总体积350μl。
[0087] ③后续步骤除筛选药物为30uM氯霉素，PCR鉴定引物见表4，鉴定方法如图3所示(PCR1有条带说LDH1的5’同源臂整合入弓形虫基因组中，PCR2有条带说明LDH1的3’同源臂整合入弓形虫基因组中，PCR3条带检测敲除基因LDH1是否还在基因组中，若对照组△LDH2有PCR3条带，而转染实验组无PCR3条带，则说明在△LDH2敲除虫株
基础上LDH1被成功敲除，进而表明获得了△LDH1△LDH2双敲除虫株)，其余步骤同步骤(4)中④至⑩所述。PCR鉴定结果如图4所示，则表示△LDH1△LDH2的单克隆虫株构建成功。
[0088] 表4.△LDH1△LDH2的单克隆虫株PCR鉴定引物
[0089]
[0090] 实施例2弓形虫△LDH1△LDH2虫株的用途
[0091] 2.1基因敲除虫株△LDH1△LDH2稀释注射液
[0092] 1)稀释注射液配方
[0093]
[0094] 2)稀释注射液制作方法
[0095] ①磁力搅拌器混匀5min。
[0096] ②0.22um滤器过滤除菌。
[0097] 2.2△LDH1△LDH2双敲除株对小鼠毒力实验
[0098] 1)使用HFF细胞体外培养弓形虫速殖子，待有30-50％虫体逸出细胞；弃掉原培养瓶中的培养基，用PBS洗去已逸出的虫体和残留的培养基，加入新鲜不含FBS的稀释液。
[0099] 2)用一次性细胞刮将细胞刮下，5ml
注射器反复吹打悬液8-10次，使纳虫泡破裂，虫体逸出，用无菌的3μm孔径滤膜过滤纯化虫体；用细胞计数板对虫体悬液进行计数、稀释。
[0100] 3)按照500个虫体/小鼠，腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，每组接10只，每天记录小鼠的存活情况，30天后对结果进行统计，结果如图5。从实验结果可以看出，接种△LDH1△LDH2双敲除株的小鼠30天内没有死亡，存活率100％，而接种野生型ME49的小鼠30天内有80％死亡。
[0101] 2.3不同剂量△LDH1△LDH2敲除株对小鼠的毒力
[0102] 分别向不同组7周龄雌性ICR小鼠，按照每组每只接种5×102，2×103,8×103和3.2×104个敲除株虫子进行腹腔接种，每组各接10只小鼠，对照组小鼠每只接种5×102个野生型ME49，每天记录小鼠的死亡情况，30天之后统计小鼠死亡情况，结果如图6显示，接种野生型ME49的对照组小鼠死亡率达80％，接种不同剂量敲除株实验组小鼠30天之内没有死亡，说明△LDH1△LDH2敲除之后对小鼠的毒力下降明显。
[0103] 2.4小鼠腹水中△LDH1△LDH2双敲除虫体荷虫量实验
[0104] 分别向不同组7周龄雌性ICR小鼠，按照每组每只接种1×105个双敲除株虫子进行腹腔接种，每组接种3只小鼠，对照组接种等剂量的野生型ME49虫子，感染后5天，对小鼠进行安乐死，腹腔注射2ml生理盐水，混匀，收取小鼠腹水，分别取1/20混匀腹水提取基因组gDNA，基因组提取方法参照基因组DNA提取试剂盒操作说明进行。
[0105] 将2ml生理盐水注入空白ICR小鼠，然后取出，形成阴性对照液，以102、103、104、5 6 7
10、10、10个弓形虫速殖子ME49分别混匀于2ml阴性对照液，分别取100ul混匀液提取基因组gDNA，基因组提取方法参照基因组DNA提取试剂盒操作说明进行。
[0106] 进行荷虫量qPCR，qPCR所用引物见表5。
[0107] 表5.△LDH1△LDH2的荷虫量qPCR引物
[0108]
[0109] 在Hard-shell-PCR-Plates 96孔板中配制如下反应体系：
[0110]
[0111]
[0112] ②PCR反应条件如下：
[0113]
[0114] qPCR结果如图7所示，接种△LDH1△LDH2敲除虫株小鼠腹水荷虫量显著低于野生型ME49的对照组小鼠腹水荷虫量，说明弓形虫△LDH1△LDH2在小鼠体内无明显繁殖，可以被宿主有效清除。
[0115] 2.5△LDH1△LDH2敲除株对小鼠保护力实验
[0116] 以103、104、105个速殖子每只小鼠的感染量接种ICR小鼠，每组5只。30天后对免疫过的小鼠及未经免疫的对照ICR小鼠(10只)接种1×103个野生型虫体。
[0117] 观察、记录小鼠死亡情况，30天后统计小鼠死亡率如图8，对照组小鼠在17天内全部死亡，经△LDH1△LDH2免疫过的小鼠在30天仍没有死亡，说明△LDH1△LDH2虫株对小鼠抵抗野生株毒力具有良好的保护力，有成为基因工程疫苗的潜力。
