技术领域
[0001] 本
发明属于
微生物农药领域。具体而言，本发明涉及一株厚垣镰刀菌及其应用。
背景技术
[0002]
植物病原
真菌引起的各种植物病害严重威胁我国的
农作物生产，每年造成的经济损失难以估量。例如：
棉花枯萎病菌在我国主要产棉区均有不同程度的发生，
幼苗期即可发病，甚至能够导致整个棉株枯萎病死，严重影响棉花的产量与品质。
[0003] 植物病原
线虫也是普遍发生的植物病害之一，在我国主要危害
烟草、三七、棉花、花生、西洋参等经济作物，已成为危害经济作物产量的重要因素之一。据统计，全球每年因植物病原线虫所造成的作物损失高达数百亿美元。
[0004] 目前对植物病害的防治主要包括
化学农药防治、
轮作法和抗性品种利用等，均存在一定的局限性。尤其是化学农药防治，容易使植物病原真菌与线虫产生抗药性，而且残留期长，所以在应用上受到限制。而微
生物农药能够有效克服化学合成农药的弊端，具有不易产生抗药性、环境兼容性好、易于规模化
发酵生产等优点。其作为一种“环境友好”的无公害绿色农药，
可持续性强，在植物病害防治中的作用日益明显。因此，从微生物中寻找并开发生物农药，已经成为发展植物病害绿色防治的重要方向。
发明内容
[0005] 本发明的目的为提供一株厚垣镰刀菌QJP1及其应用。该菌株易于规模化发酵生产，其发酵产物经提取分离后对西洋参根结线虫具有较好杀线虫活性，对棉花枯萎病菌与柑橘
炭疽病菌等植物病原真菌具有较好的抑制活性，因此具有良好的发展前景。
[0006] 本发明所提供的菌株为厚垣镰刀菌(Fusarium chlamydosporum)QJP1，分离于青岛市胶州湾
碱蓬湿地采集的盐碱地
土壤。该菌株目前已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2016年12月09日，保藏编号为CGMCC No.13198。
[0007] 厚垣镰刀菌菌株QJP1的保存方法：采用PDA培养基保存。PDA培养基：
马铃薯200g，
葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏
水1000mL，pH调至7.0。
[0008] 本发明的另一个目的是提供一种厚垣镰刀菌菌株QJP1的发酵方法，其特征是，[0009] 1)将保存的厚垣镰刀菌菌株QJP1接种于PDA平板表面，26-30℃培养5-10天，作为规模发酵培养的菌种，待用；
[0010] 2)然后取上述菌种加入发酵培养基中26-30℃下摇床或静置发酵培养10-40天，得到发酵液待用。所述发酵培养基(同PDB培养基)为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0。
[0011] 上述发酵产物可以进一步提取，具体包括以下步骤：
[0012] 1)采用
有机溶剂提取，提取液减压蒸馏得浸膏；所述
有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、丙
酮、甲醇、
乙醇或者正丁醇中的一种或几种，优选乙酸乙酯；
[0013] 2)然后浸膏进行柱层析分离，所述柱层析可采用
硅胶柱层析、凝胶柱层析、反相柱层析及大孔
吸附树脂柱层析中的一种或几种，优选硅胶柱层析；
[0014] 3)以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比10:1梯度的洗脱组分I用于制备微生物
杀线虫剂；所述石油醚-乙酸乙酯洗脱梯度为100:1至1:1；
[0015] 4)然后以氯仿-甲醇梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比20:1梯度的洗脱组分Ⅱ用于制备微生物
杀菌剂；所述氯仿-甲醇洗脱梯度为60:1至1:1。
[0016] 本发明所具有的优点：本发明的发酵产物可由厚垣镰刀菌菌株QJP1经发酵培养、提取分离而获得，具有生产工艺相对简单、易于规模发酵生产、在环境中易于降解及对人畜毒性较低等优点。其对棉花枯萎病菌与柑橘炭疽病菌等植物病原真菌具有较好的抑制活性，最小抑制浓度(MIC)分别为4与8μg/mL；此外，所述发酵产物对西洋参根结线虫具有较好杀线虫活性，其50倍与100倍稀释液对西洋参根结线虫的致死率分别为100％与83％，因此在植物病害防治中具有良好的应用前景。
具体实施方式
[0017] 下面结合具体
实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行
修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0018] 实施例1：厚垣镰刀菌QJP1菌株分离与鉴定
[0019] (1)菌株分离
[0020] 本发明所述菌株QJP1是从土壤中采用平板稀释涂布与划线等方法分离获得。(1)土壤样品采集：采集地点为青岛市胶州湾碱蓬湿地，采用5点取样法。(2)分离步骤：称取1g盐碱地土样于100mL无菌水中，置于摇床中30℃、150r/min震荡10min，依次稀释至10-2、10-3、10-4浓度；分别吸取100μL上述稀释液，均匀涂布于含3.5％
海盐的LB双抗培养基平板上，每个梯度涂布三个平行；30℃培养2d后，挑取培养基表面不同形态的微生物菌落，并在含3.5％海盐的LB双抗培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况；最后，采用平板划线法，分离纯化真菌菌株，编号保存。
[0021] (2)菌株鉴定
[0022] 将QJP1菌株接种到PDA平板表面，28℃培养5-7天后观察。菌落中央形成凸起，菌落表面呈白色，密生气生菌丝棉絮状，菌落背面淡黄色；
显微镜检可观察到镰刀形大型、有隔分生孢子，菌丝顶端或菌丝中间生长出球形厚垣孢子。
[0023] 所述菌株的rDNA基因序列测定结果(ITS-5.8S-ITS2区)如下：
[0024] TCCGTAGGTGAACCTTGCGGTTAAACTCCCAAACCCCTGTGACATACCTATACGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCCGAGGACCCCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTAAAACAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGGTAACCCGCGTTCCCCAAATCGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAATCATACACCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTAAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGACCGCAAGGTTCACCTACGGA
[0025] 综上所述，菌株鉴定为厚垣镰刀菌(Fusarium chlamydosporum)，该菌株目前已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏日期：2016年12月09日，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.13198。
[0026] 实施例2：厚垣镰刀菌菌株QJP1发酵培养
[0027] (1)发酵培养
[0028] 按照微生物的常规培养方法，挑取少量保存于PDA培养基斜面的厚垣镰刀菌菌株QJP1，接种于PDA平板表面，28℃培养5天，作为规模发酵培养的菌种，待用。
[0029] PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂12g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0。
[0030] (2)切取上述PDA平板表面的菌种(用量为平板的1/4)，接种至已灭菌的、盛有PDB培养基的锥形瓶中，28℃、120rpm摇床培养10天，备用。
[0031] PDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0。
[0032] (3)发酵产物的制备
[0033] 将上述培养产物用乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯提取液，减压蒸馏得浸膏。将其进行硅胶VLC(vacuum liquid chromatography)快速柱层析，按照洗脱液极性递增顺序，分别以石油醚-乙酸乙酯(体积比100:1至1:1)和氯仿-甲醇(体积比60:1至1:1)为梯度洗脱剂进行硅胶柱层析分离。收集石油醚-乙酸乙酯体积比10:1梯度的洗脱组分I，用于制备微生物杀线虫剂；收集氯仿-甲醇体积比20:1梯度的洗脱组分Ⅱ，用于制备微生物杀菌剂。
[0034] 实施例3：抑菌活性
[0035] 采用微量稀释法，测定厚垣镰刀菌菌株QJP1发酵产物对棉花枯萎病菌与柑橘炭疽病菌的抑菌活性。
[0036] 1)菌悬液的制备
[0037] 将供试真菌接种于PDA培养基表面于28℃培养72h后，吸取2mL无菌0.85％NaCl溶液(含0.25％吐温-20)洗涤培养物，并用玻璃刮刀将菌落轻轻刮下。吸取适量菌悬液于无菌试管中，调至0.5麦氏比浊(相当于1.5×108CFU/mL)备用；
[0038] 2)样品的配制
[0039] 取一定量待测样品(实施例2中发酵产物的洗脱组分Ⅱ)，溶解于100μL 50％DMSO中，充分混匀后，吸取50μL样品溶液到另一只离心管中，接着加入50μL 50％DMSO，得到浓度减半的样品溶液。按照此方法，得到12组浓度依次减半的样品溶液。
[0040] 3)MIC测定方法
[0041] (1)采用无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的样品溶液分别加到无菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第12孔各加5μL的样品溶液，并以不加样品孔作为空白对照，加5μL DMSO溶液孔为溶剂对照。
[0042] (2)将相当于0.5麦氏比
浊度的指示菌悬液，经沙氏培养基稀释1000倍后，取95μL依次加入到96孔板中，使得第1至第12孔的样品浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μg/mL。以上所有样品均重复三次。轻轻震荡混匀后，将96孔板密封置于28℃生化
培养箱中培养72h。
[0043] (3)在600nm
波长下使用酶标仪测定每孔的吸光值，以在小孔内完全抑制指示菌生长的最低样品浓度为该化合物的MIC。(注意：当阴性对照孔内指示菌明显生长实验才有意义；当实验出现单一的跳孔时，应记录抑制菌株生长的最高药物浓度；如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复实验。)
[0044] 试验结果为厚垣镰刀菌菌株QJP1发酵产物对棉花枯萎病菌与柑橘炭疽病菌的MIC值分别为4与8μg/mL，具有较好抑菌活性。
[0045] 上述实验结果证明本发明所述厚垣镰刀菌菌株QJP1发酵产物具有较好抑菌活性，可用于制备微生物杀菌剂。
[0046] 实施例4：杀线虫活性
[0047] (1)实验方法
[0048] 供试线虫及其培养方法
[0049] 西洋参根结线虫由山东省林业科学研究院提供。称取20g燕麦片加60mL水，灭菌后加入1mL线虫悬液，25℃培养7d。在无菌条件下，挑取适量已培养好的含线虫的燕麦放于
滤纸上，用简易贝曼漏斗法
洗出线虫，将线虫悬于无菌水中备用，浓度约为2000条/mL，4℃保存备用。
[0050] 杀线虫活性测定
[0051] 取一定量待测样品(实施例2中发酵产物的洗脱组分Ⅰ)，以50％DMSO分别稀释50与100倍，吸取1mL至灭菌离心管中，再加入线虫悬液100μL，以50％DMSO处理为对照，25℃静置
12h。混匀后，吸取
混合液点到
载玻片上，置于
光学显微镜下计数死亡线虫数及线虫总数(线虫僵直不动视为死亡)，计算死亡率。每次观察的线虫数不少于30条。
[0052] 判断活性级别的标准为：死亡率＞90％为“+++”级；70％＜死亡率＜90％，为“++”级；50％＜线虫死亡率＜70％，为“+”级；死亡率＜50％，为“－”级。
[0053] (2)实验结果
[0054] 厚垣镰刀菌菌株发酵产物的50倍稀释液对西洋参根结线虫的致死率为100％，活性级别为“+++”级；12h后在显微镜下观察各处理虫体形态，发现死亡线虫失去活动性，虫体僵直，而对照活线虫运动活泼，虫体弯曲呈“S”型。
[0055] 而厚垣镰刀菌菌株发酵产物的100倍稀释液对西洋参根结线虫的致死率为83％，活性级别为“++”级。可见，尽管发酵产物进一步稀释后，线虫的致死率有所下降，但相比空白对照(5％)仍表现出明显的杀线虫活性。因此，所述菌株制备的发酵产物，能够有效防治植物病原线虫，尤其是西洋参根结线虫，可用于制备微生物杀线虫剂。
