技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物技术领域，具体涉及一种深海来源的弯曲芽孢杆菌R29-2，该菌能有 效抑制金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌、蜡样芽胞杆菌等
革兰氏阳性菌，能显著提 高禽类存活率，降低料肉比，同时能有效改善
水产养殖动物的抗病性能。
背景技术
[0002] 近年来，对人和动物误用和滥用抗生素大大
加速了微生物耐药性的形成，随着2020年 养殖行业全面禁抗的时限逐渐逼近，寻找安全高效的替抗产品已迫在眉睫。动物肠道中存在 着大量微生物菌群，使用抗菌药物杀灭动物体内的有害菌时，也会杀死肠道内的正常菌群， 使得动物肠道菌群失衡，免疫
力下降，进而导致动物疫病防治难度加大。使用
益生菌替代养 殖
饲料中抗生素添加剂使用，已经逐渐被人们所接受。选择合适的微生态制剂，其分泌的抗 菌活性物质不仅能专一性的杀灭动物肠道内的致病菌，抑制有害菌繁殖，同时可以促进其他 肠道健康菌群的生长，使肠道更加健康，进而使动物发挥更大的生长潜力，获得更强的免疫 力抵御其他
疾病。
[0003] 目前常用的益生菌大多是来自陆生生物或陆地环境中的菌种，关于海洋来源益生菌在 养殖中的应用报道较少。深海环境特有的高盐、高压、低温、缺
氧、少光等极端条件，赋予 了海洋微生物不同于陆地微生物的代谢系统和防御体系，产生了具有多种生物活性的代谢产 物，在抗菌方面有独特效应。
[0004] 弯曲芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，此前有文献报道其在降解有机氮、邻苯二酚、 促进沼气
发酵以及产β-
淀粉酶等方面具有良好的应用，但未见该菌有抗菌活性的相关报道， 本发明从深海中分离到一株弯曲芽孢杆菌，具有抑制金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球 菌、蜡样芽胞杆菌等革兰氏阳性菌活性，通过溶血实验验证无溶血性，在肉鸡、罗非鱼养殖 中具有良好应用。
发明内容
[0005] 基于当前寻找替抗产品的迫切需求，本发明从西太平洋卡罗琳海山中筛选并提供了一株 具有抑制金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌等部分革兰氏阳性菌活性的弯曲芽孢杆菌， 作为替代抗革兰氏阳性菌促生长抗生素添加剂，将该菌制成微生态制剂，可以有效提高禽类 的成活率，降低料肉比，改善
水产养殖动物的抗病性能。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 本发明提供了一株弯曲芽孢杆菌R29-2，其特征在于：其分类命名为弯曲芽孢杆菌 Bacillus flexus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年10月24日；保藏 编号为CGMCC No.18731。
[0008] 进一步的，所述弯曲芽孢杆菌R29-2在LB平板上呈米黄色不透明，边缘光滑，湿润且 扁平；革兰氏阳性菌，在光学
显微镜下呈短杆状。
[0009] 本发明提供了弯曲芽孢杆菌R29-2在抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无 乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、粪肠球菌(Enterococcus faecium)的制剂中的应用。
[0010] 本发明提供了一种含有弯曲芽孢杆菌R29-2的微生态制剂。
[0011] 进一步的，所述微生态制剂是液体微生态制剂或固体微生态制剂，所述液体微生态制剂 的制备方法为，取弯曲芽孢杆菌R29-2于培养基中培养活化获得培养液，后将培养液以培养 基总体积1％-2％的接种量接种于
发酵罐中，在转速为180-200rpm、通气为10-20L/min条件 下搅拌发酵，适量加入灭菌消泡剂，并在30-37℃下培养24h后获得发酵液，即为液体微生 态制剂。
[0012] 进一步的，所述液体微生态制剂中的菌体
密度大于等于108CFU/ml。
[0013] 所述固体微生态制剂的制备方法为，弯曲芽孢杆菌R29-2在液体培养基中培养后获得种 子液，按照培养基总体积1％-2％的接种量接种于发酵罐中，在转速为180-200rpm、通气为 10-20L/min条件下搅拌发酵，适量加入灭菌消泡剂，并在30-37℃下培养24h后获得发酵液， 加入保护剂后喷干，获得弯曲芽孢杆菌R29-2的菌体及代谢产物。
[0014] 进一步的，所述固体微生态制剂中的菌体及代谢产物，菌体密度大于等于1010CFU/g。
[0015] 本发明提供了微生态制剂在在提高禽类成活率、提高禽类平均出栏体重、降低料肉比上 的应用。
[0016] 进一步的，所述的微生态制剂在提高禽类成活率、提高禽类平均出栏体重、降低料肉比 上的应用中，所述微生态制剂在禽类养殖饮水线中的添加量占
质量比0.2％-0.5％。
[0017] 本发明提供了微生态制剂在在改善水产养殖动物抗病性能中的应用。
[0018] 进一步的，所述的微生态制剂在改善水产养殖动物抗病性能的应用中，所述微生态制剂 在每克
基础饲料中的添加量占质量比达到0.1％-0.3％。
[0019] 本发明的优点在于：
[0020] 本发明首次提供了一种具有抗革兰氏阳性菌活性的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)R29-2 菌株。弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)R29-2分离自西太平洋卡罗琳海山，在此之前未有关 于该种属细菌抗菌活性的相关报道。该菌对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、无乳链球菌、蜡样 芽胞杆菌等多种革兰氏阳性细菌具有抑菌活性，本发明所述的弯曲芽孢杆菌R29-2微生态制 剂，通过添加饮水的方式作为替抗产品使用，能有效提高禽类的成活率，降低料肉比，通过 添加到每日基础饲料中的方式，可以改善水产养殖动物的抗病性能。
附图说明
[0021] 图1为弯曲芽孢杆菌R29-2显微照片(×1000)；
[0022] 图2为发酵不同时间段发酵上清的抗菌活性；
[0023] 图3为弯曲芽孢杆菌R29-2固体微生态制剂对罗非鱼抗病性的影响。
具体实施方式
[0024] 下面结合
实施例对本发明做进一步说明，所述实施例用于说明本发明，但不用来限制本 发明的范围。下述实施例中所用的材料、
试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。
[0025] 实施例1、菌株R29-2的鉴定
[0026] (1)形态学鉴定
[0027] 菌落在LB平板上呈米黄色不透明，边缘光滑，湿润且扁平；革兰氏
染色后，在光学显 微镜下观察菌体为紫色短杆状(见图1)。
[0028] (2)溶血性
[0029] 挑取弯曲芽孢杆菌R29-2菌落，点在血琼脂平板上，37℃培养48h后观察，无溶血性。
[0030] (3)菌株鉴定
[0031] 16S rRNA基因扩增及测序：将R29-2接种到LB肉汤中37℃过夜培养，以菌液作为 模板，利用细菌通用引物27F和1492R对细菌的16S rRNA基因序列进行扩增。PCR扩增 体系为50μL，1μL菌液作为模板，上下游引物各1μL，2×Mix 25μL，ddH2O 22μL。PCR 反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s；55℃
退火30s和72℃延伸90s，34次 循环后，72℃后延伸10min。将PCR未纯化的产物交给生工
生物工程(上海)股份有限公 司测序，序列如SEQ ID No：1所示，并对该序列在NCBI
数据库进行比对，最终菌株R29-2 被鉴定为Bacillus flexus。
[0032]
[0033]
[0034] 通过对该菌株进行全基因组测序，基于看家基因的样本进化分析得到相同结果，该菌株 为弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus。
[0035] 实施例2、弯曲芽孢杆菌R29-2的抗菌活性测定
[0036] 对弯曲芽孢杆菌R29-2抑菌活性的测定，革兰氏阴性指示菌选取大肠杆菌Escherichia coli K88、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila T2W-1、
肺炎杆菌Klebsiella pneumoniae THM1； 革兰氏阳性指示菌选取金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus JP、无乳链球菌Steptococcus agalactiae Y405、粪肠球菌Enterococcus faecium 2#XB、蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus 3③。
[0037] 挑取R29-2单菌落于LBH平板上，28℃培养24h，取指示菌菌液100μl于10ml LB或 MRS培养基中(含0.8％琼脂)，混匀后倾倒在培养好的R29-2单菌落平板上，37℃培养12h 后观察抑菌圈直径。
[0038] 其抑菌效果如下表1所示：该菌对多种革兰氏阳性菌，包括金黄色葡萄球菌、无乳链 球菌、粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌均有拮抗作用，对革兰氏阴性菌大肠杆菌、嗜水气单胞菌、 肺炎杆菌等革兰氏阴性菌没有抑制作用。
[0039] 表1菌株R29-2的抑菌活性
[0040]
[0041] 实施例3、弯曲芽孢杆菌R29-2的液体深层通气发酵条件摸索
[0042] (1)
种子液制备：从弯曲芽孢杆菌R29-2的试管斜面LBH琼脂培养基上挑取单菌落， 接种于LBH液体培养基的试管中，32℃、120rpm培养16-20h，得到一级种子液；将一级种 子液以2％浓度接种于LBH液体培养基中，32℃、120rpm培养至对数生长期，制成浓度为 107-108cfu/ml的二级种子液。
[0043] (2)液体深层发酵：准备培养基于50L发酵罐中，接种量为1-2％，另配制
葡萄糖溶液 单独灭菌，发酵过程中补加葡萄糖作为
碳源。通过设置转速和通气量调整发酵罐内溶氧条件， 发酵过程中取样监测发酵液OD600、残糖含量、菌体密度和抑菌活性(样品采用二倍稀释法 进行稀释，至取10μl样品通过overlay或spot-on-lawn法检测仍有抑菌活性的最小梯度，定 义该稀释度下10μl的样品其抑菌活性为1Au)(见表2、图2)，待OD600值趋于稳定，即停 止发酵下罐得到发酵液。
[0044] 最优条件：转速为180-200rpm、通气为10L/min条件下，发酵24h得到的发酵液菌体 密度和抑菌活性最佳。
[0045] 表2不同条件下各指标的检测
[0046]
[0047]
[0048] 实施例4、弯曲芽孢杆菌R29-2发酵制备微生态制剂
[0049] 制备液体微生态制剂，取弯曲芽孢杆菌R29-2于LBH液体培养基中活化，30-37℃， 100-150rpm条件下摇床培养18-24h，以占培养基总体积2％的接种量接种于250ml三
角瓶中 培养18h，作为二级种子液。种子液按以培养基总体积1％的接种量接种于50L发酵罐，转 速为180-200r/min，通气为10L/min，发酵过程中产生大量气泡时，适量加入灭菌消泡剂， 30-
37℃条件下培养24h后获得弯曲芽孢杆菌R29-2菌液，菌体密度大于等于108CFU/ml。
[0050] 制备固体微生态制剂，取弯曲芽孢杆菌R29-2于培养基中培养活化获得培养液，后将 培养液以培养基总体积1％的接种量接种于发酵罐中，转速为180-200r/min，通气为10L/min， 适量加入灭菌消泡剂，并在30-37℃下培养24h后获得发酵液，加入保护剂后喷干，获得弯 曲芽孢杆菌R29-2的菌体及代谢产物。固体微生态制剂中菌体密度大于等于
1010CFU/g。
[0051] 实施例5、弯曲芽孢杆菌R29-2对肉鸡存活率、料肉比的影响
[0052] 以山东某养殖场的白羽肉鸡为实验对象，选取一个鸡舍进行如下实验：设置两个实验组， 每组选取2000只大小、健康状况比较一致的鸡，第一组饮水线中按日饮水量0.2％添加浓度 为3.7×108CFU/ml的R29-2液体微生态制剂，第二组饮水线中按日饮水量0.5％添加浓度为 3.7×108CFU/ml的R29-2液体微生态制剂，第三组为空白对照CK。液体微生态制剂每次连 用3天，间隔4天，以35天作为实验周期。出栏时两个实验组和空白对照组的鸡群平均体 重、存活率、料肉比如表3所示：
[0053] 表3弯曲芽孢杆菌R29-2对肉鸡存活率、料肉比的影响
[0054]
[0055] 实施例6、弯曲芽孢杆菌R29-2对罗非鱼抗病性的影响
[0056] 以罗非鱼为实验对象，选取大小均匀、生长状态良好的罗非鱼每30条为一组，设置两 个实验组，第一组在每日基础饲料中添加0.1％的R29-2固体微生态制剂，第二组在每日基 础饲料中添加0.3％的R29-2固体微生态制剂，另设空白对照组CK，基础饲料中不添加固体 微生态制剂，每组设置三个重复，每日投喂三次，连续投喂7天。然后对实验组和空白对照 组罗非鱼进行攻毒实验，先将鱼进行麻醉，之后向其腹膜内注入0.1毫升浓度为1×107CFU/ml 的无乳链球菌菌液，另设置攻毒对照组：注射等量
磷酸盐缓冲液，在对鱼进行攻毒后的一天 内停止喂食，之后对所有的罗非鱼投喂对照组饲料。连续监视21天，观察罗非鱼的死亡情 况，结果如图3所示，其中注射等量磷酸盐缓冲液的罗非鱼全部存活。
