联合光热治疗和化疗的IR820-PTX两亲性小分子前药及其纳
米粒制备方法和应用
技术领域
[0001] 本
发明涉及医药技术领域，具体涉及一种环境响应性的联合
近红外染料分子光热治疗和紫杉醇化疗作用的两亲性小分子前药纳米粒的制备方法、评价和应用。
背景技术
[0002] 癌症因其发病率高、死亡率高、生存率低而成为世界范围内的重大公共卫生问题，其中
乳腺癌是严重威胁妇女健康的
恶性肿瘤之一。传统的肿瘤治疗手段主要有手术、放疗、化疗、
激素疗法、免疫疗法等，随着科技的进步，光热治疗、光动治疗、
冷冻疗法等新兴治疗手段也不断发展。但是单一疗法治疗肿瘤往往不能达到令人满意的效果，如手术后复发，化疗全身毒性及多药耐药、放疗
定位困难等，因此，临床上开始采用联合疗法，在大量实验和临床应用中，人们发现光
热疗和化疗联合往往起到协同作用，例如，黄丹华将具有良好的光热转换特性Fe3O4纳米粒和热敏脂质体(TST)构建了一种兼具了磁靶向、光热以及热敏释放等特性的多功能药物载体Fe3O4-TSL，然后与阿霉素(DOX)负载构成DOX-Fe3O4-TSL，研究发现其表现出良好的体内
磁共振成像效果和光热效应，体内抗肿瘤结果显示，DOX-Fe3O4-TSL的光热-化疗
抗肿瘤效果明显优于单纯的光热治疗或化疗，且
组织病理学检查表明其在治疗过程中并没有对正常组织造成损伤；祝侠丽等通过纳米载体负载具有光热转换特性的Cu2S
纳米粒子和
化疗药物，实现肿瘤热化疗
联合治疗，克服肿瘤治疗药物的
副作用和效果不佳的问题。可见，热疗和化疗联合作用后抗肿瘤效果有一定的提高，相关研究也逐渐成为热潮。
[0003] 光热治疗，指在肿瘤局部注射或埋植光热剂从而提高其光敏感性，当特定
波长的激光(多为近红外光)辐照该区域后，光热剂快速将光能转化为
热能，达到杀灭肿瘤细胞的目的。该疗法具有无创性、侵袭性强、治疗时间短、操作简单、效率高等优点，因此受到越来越多的关注。一个优秀的光热剂需要较高的光热转换效率，
生物毒性低，同时，在700-900nm处有较强的吸收，因为该波段是近红外的透明
生物组织窗口，即在700-900nm，近红外光更易穿过组织而杀伤肿瘤。在过去的几年中，近红外光热疗法主要以金属
纳米材料如纳米金，
碳类纳米材料如
石墨烯和单壁碳
纳米管，黑磷
量子点，硫化物纳米材料等无机材料为光热剂，但是这些材料具有较高的光热转换效率，但
生物相容性差，体内不易清除甚至致畸致突变等
缺陷对其临床应用产生了一定影响。近红外
荧光染料，如ICG，IR820等具有较好的生物相容性，是一种有前景的用于诊断和治疗肿瘤的
试剂，但仍存在
稳定性差、血液
半衰期短、体内快速排除和肿瘤靶向性不足等缺点。
[0004] 紫杉醇，是一种在临床上广泛应用的广谱抗肿瘤药物，它可以通过促进微管蛋白结合，抑制其解聚，影响细胞分裂增殖，从而起到抗肿瘤作用。紫杉醇亲脂性较强，但
水溶性较低，以往其制剂的开发主要集中在增溶上，如开发了紫杉醇制剂为紫杉醇注射剂商品名为泰素，是将紫杉醇溶解在聚
氧乙烯
蓖麻油和
乙醇的混合
溶剂(50:50，v/v)中，然而，聚氧乙烯蓖麻油具有严重的毒副作用，如超敏反应、肾毒性、神经毒性等；又开发了多聚物胶束载紫杉醇，但不稳定且在体内有
泄漏缺点；开发了脂质体紫杉醇，但容易出现过敏等。在
专利CN103007281A多机制治疗肿瘤光热
控释长循环药物转运系统的制备方法及其应用，提出一种通过形成单
硬脂酸甘油酯包裹靶向热敏剂(
石墨烯及其衍生物、单壁
碳纳米管及其衍生物和纳米金及其衍生物)和化疗药物(西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素等)转运系统，但是正如前面所述的该专利采用的热敏剂生物相容性差，体内不易清除甚至致畸致突变等缺陷。因此，开发一种溶解性好、安全无毒的紫杉醇制剂一直是研究的热点。
[0005] 此外，还有不同研究者尝试了多种方法将染料分子和化疗药物结合在一起，利用纳米胶束或纳米囊等体系共负载染料和化疗药，或者将二者分别共价接合在大分子材料上，但一方面，药物与材料之间非共价结合，作用
力较弱，容易出现药物突释的情况，且载药量较低；另一方面，过度使用惰性材料会造成较大毒性。相比之下，两亲性小分子前药纳米粒具有显著的优势。例如：(1)内在的两亲性可使前药分子在水中自组装成纳米聚集结构，实现药物的自递送；(2)具有合适粒径及表面特征的纳米粒可以被动靶向到肿瘤部位，提高药物的利用率；(3)药物分子本身参与载体形成，极大提高载药量的同时还可减少惰性材料的使用而产生的毒副作用；(4)化学键连接可以设计成环境响应性，可使药物在血液中感受
温度，在肿瘤部位快速释放发挥疗效。目前，环境响应性的联合近红外染料分子和化疗药物的两亲性小分子前药在医学中的应用还未见有报道。
发明内容
[0006] 针对上述问题，本发明选择近红外染料分子IR820和化疗药物紫杉醇，通过两亲性小分子前药的模型实现了光热治疗和化疗的联合应用，最终形成了本发明。
[0007] 本发明的目的之一在于合成一种新型的两亲性小分子前药(IR820-PTX)，在联合光热治疗和化疗同时，克服已有研究中的不足，如载药量低，载体毒性大，生物相容性差等，实现安全，毒性低，载药量高具有靶向抗肿瘤的良好效果。
[0008] 为实现该目的，具体的，本发明涉及以下技术方案：
[0009] 首先，本发明公开了一种新型两亲性小分子前药(IR820-PTX)，其结构式如下所示：
[0010]
[0011] 其次，本发明公开了上述两亲性小分子前药(IR820-PTX)的制备方法，其制备方法为：
[0012] 紫杉醇与修饰所得的IR820-COOH催化反应，紫杉醇与IR820-COOH以酯键结合，实现对紫杉醇2’位羟基的化学修饰。
[0013] 所述催化反应可以为酶促催化或化学催化。
[0014] 优选的，所述催化反应为化学催化。
[0015] 优选的，紫杉醇与IR820-COOH催化反应过程为：紫杉醇，在二环己基碳二亚胺(DCC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，4-二甲
氨基吡啶(DMAP)的催化下，与IR820与6-氨基己酸接枝所得的IR820-COOH反应，生成上述两亲性小分子前药(IR820-PTX)。
[0016] 具体的反应步骤包括：
[0017] (1)IR820与6-氨基己酸溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入三乙胺和氯
甲酸乙酯，惰性气体保护、85℃油浴条件下反应4h后，收集产物纯化的IR820-COOH；
[0018] (2)步骤(1)纯化所得的IR820-COOH溶于无水DMF，加入DCC，NHS，惰性气体保护、
冰浴条件下反应2h后室温反应24h，过滤得滤液。一定量的PTX溶于无水DMF中，与滤液混合，加入DMAP，惰性气体保护、室温反应48h后制备获得上述两亲性小分子前药(IR820-PTX)。
[0019] 优选的，IR820-COOH：PTX：DCC：NHS：DMAP摩尔比为1:3:2:2:2。
[0020] 优选的实施方案中，在步骤(2)之后还包括两亲性小分子前药纯化的步骤(3)。
[0021] 具体的，纯化的步骤(3)为：减压旋蒸除去反应溶剂无水DMF，
真空干燥，得到粗产物；将粗产物溶于乙酸乙酯中，
硅胶柱色谱提纯，乙酸乙酯和甲醇梯度洗脱(300:1-3:1)，得到IR820-PTX纯品为蓝色固体。
[0022] 本发明的目的之二在于提供一种两亲性小分子前药IIR820-PTX纳米粒制剂及其制备方法。该纳米粒可通过简单快速的方法制备获得，并且稳定性良好，易于保存，同时具备更优异的体内效果。
[0023] 为实现该目的，具体的，本发明涉及以下技术方案：
[0024] 本发明公开了一种两亲性小分子前药IR820-PTX纳米粒制剂的制备方法，包括：将IR820-PTX前药溶于二甲基亚砜(DMSO)中，全部溶解后，缓慢滴加一定量去离子水，再将此溶液全部转移至
透析袋中(截留分子量1KD)，室温下于蒸馏水中透析24h即得到蓝色IIR820-PTX纳米粒制剂。
[0025] 上述制备方法得到的两亲性小分子前药IR820-PTX纳米粒制剂也是本发明的保护范围。
[0026] 本发明的目的之三在于提供上述两亲性小分子前药IR820-PTX及其纳米粒制剂的用途。具体的，该目的涉及的技术方案包括：
[0027] 上述两亲性小分子前药IR820-PTX及其纳米粒制剂在制备抗癌抗肿瘤药物中的用途，两亲性小分子前药IR820-PTX及其纳米粒制剂可以通过光热治疗和化疗用于治疗或缓解某一组织或器官的癌症，癌症包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、
肺癌、小肠癌等。
[0028] 优选的，所述光热治疗选择660nm的激光进行照射。
[0029] 本发明取得了以下有益效果：
[0030] (1)本发明首次合成两亲性前药分子IR820-PTX，前药分子不仅解决了IR820半衰期短靶向性差的缺点，同时解决了紫杉醇
水溶性差的问题，还可在水中自组装形成结构均一的纳米粒聚集体。
[0031] (2)本发明可以通过简便快速的方法将IR820-PTX制备成纳米粒制剂，不仅经济实用，还可批量生产，该制剂的稳定性为工业生产提供可能。
[0032] (3)IR820-PTX纳米粒制剂毒性低，安全性好，静脉注射后可以靶向到肿瘤部位并实现环境响应性的释放，具有良好的抗肿瘤效果。
附图说明
[0033] 图1IR820-PTX前药的核磁图谱
[0034] 图2IR820-PTX前药的质谱
[0035] 图3IR820-PTX纳米粒形态TEM图
[0036] 图4IR820-PTX纳米粒制剂体内抗肿瘤效果图
具体实施方式
[0037] 结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述
实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 实施例1 IR820-PTX前药分子合成
[0039] 分析天平精密称取一定量的IR820于100mL圆底烧瓶中，加入无水DMF使溶解，精密称取6-氨基己酸于无水DMF超声混匀后加入圆底烧瓶中，向混合溶液中加入三乙胺，在氮气保护下，85℃油浴反应4h，反应完全后，减压抽滤除去滤液中的无水DMF，得粗产物于真空干燥箱中干燥过夜。干燥产物用甲醇复溶，硅胶拌样，蒸干后固体经硅胶柱分离，乙酸乙酯和甲醇梯度洗脱，收集产物干燥的IR820-COOH。分析天平精密称取一定量的IR820-COOH于100mL圆底烧瓶中，加入无水DMF使溶解，精密称取NHS，DCC分别溶于无水DMF，搅拌加入，在氮气保护下，冰浴反应2h，后转至室温反应24h。将溶液经0.8μm滤头过滤除去副产物，转移至100mL圆底烧瓶中，精密称取DMAP溶于无水DMF，搅拌加入使成混合溶液。精密称取PTX溶于无水DMF，缓慢滴入混合溶液，在氮气保护下，室温反应48h，期间不断搅拌。其中，IR820-COOH：PTX：DCC：NHS：DMAP摩尔比为1:3:2:2:2。反应完全后，减压抽滤除去滤液中的无水DMF，得粗产物于真空干燥箱中干燥过夜。干燥产物用甲醇复溶，硅胶拌样，蒸干后固体经硅胶柱分离，乙酸乙酯和甲醇梯度洗脱(300:1-3:1)，收集产物干燥，得到IR820-PTX纯品为蓝色固体，产率约为30％。
[0040] 实施例2
核磁共振氢谱(1H-NMR)鉴定IR820-PTX前药化学结构
[0041] 称取IR820-PTX前药约5mg，氘代二甲亚砜(DMSO-d6)溶解并置于核磁管内，采用400MHz核磁共振氢谱测定其核磁共振氢谱图，以四甲基硅烷为内标物，记录化合物的化学位移值(ppm)。结果如图1所示，核磁结果可以证实，新合成的分子中IR820和PTX的峰均可归属，且出现了典型的PTX反应羟基的化学位移，证明酯键的合成。通过1H-NMR谱图可以证实IR820-PTX前药的成功合成。
[0042] 实施例3 高分辨质谱(HRMS)鉴定IR820-PTX前药化学结构
[0043] 称取IR820-PTX前药约1mg，甲醇溶解，进行高分辨质谱分析。结果如图2所示，质谱结果可见，分子离子峰[M+H]+(1780.7179)及[M-Na+2H]+(1758.7377)的出现，证明IR820-PTX前药合成成功
[0044] 实施例4 IR820-PTX前药聚集体制剂的制备
[0045] 精密称取5mg IR820-PTX，溶于200μL DMSO中，全部溶解后，缓慢滴加2mL去离子水，再将此溶液全部转移至透析袋中(截留分子量1KD)，室温下于蒸馏水中透析24h，即得到蓝色纳米粒制剂。
[0046] 实施例5 IR820-PTX前药聚集体制剂观察
[0047] 取一滴IR820-PTX前药聚集体制剂滴于碳膜
铜网上，
滤纸吸去多余液体，红外灯照射下干燥后置于透射电镜下观察IR820-PTX前药聚集体形态。电镜照片如图3，结果显示IR820-PTX可在水中聚集成大小均匀的纳米粒，分散性良好，粒径均在10-200nm，静脉注射可通过EPR效应被动靶向到肿瘤组织，从而增加肿瘤组织内的药物积累，减少在其他正常器官的蓄积，降低毒副作用。
[0048] 实施例6 IR820-PTX前药纳米粒制剂体内抗肿瘤效果观察
[0049] 取健康雌性balb/c小鼠40只，3-4周龄，随机分为4组，每组10只。在其右前肢腋下接种0.1mL
密度为1×106的4T1细胞悬液，接种细胞后继续饲养。每天检查小鼠右前肢腋下肿瘤的生长情况。当肿瘤体积(V＝1/2×长×宽2)达到100-200mm3后，开始进行实验。各组每3天分别尾静脉注射生理盐水(NS)，PTX，IR820和IR820-PTX前药纳米粒制剂，并对IR820和IR820-PTX组进行近红外照射。每两天测量体重和瘤体积，共进行19天。之后处死小鼠，剖取肿瘤称重并拍照。结果如图4所示。IR820，IR820-PTX和NS组的体重变化基本相同，而PTX组体重有明显的降低，说明了IR820-PTX前药纳米粒制剂的安全性。同时，IR820-PTX组的肿瘤体积最小，剖取的肿瘤也最小。计算PTX，IR820和IR820-PTX三组的抑制率分别为45.2％、63.2％和89.3％。以上结果均表明，IR820-PTX前药纳米粒制剂是最安全有效的抗肿瘤
治疗方案。
[0050] 总结：本发明首次合成了联合光热治疗和化疗的两亲性前药分子IR820-PTX，前药分子不仅解决了IR820半衰期短靶向性差的缺点，同时解决了紫杉醇水溶性差的问题，还可在水中自组装形成结构均一的纳米粒聚集体。通过简便快速的方法将IR820-PTX制备成纳米粒制剂，不仅经济实用，还可批量生产，该制剂的稳定性为工业生产提供可能。IR820-PTX纳米粒制剂毒性低，安全性好，静脉注射后可以靶向到肿瘤部位并实现环境响应性的释放，具有良好的抗肿瘤效果。
[0051] 最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的
基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或
变形仍在本发明的保护范围以内。
