技术领域
[0001] 本
发明涉及
水产养殖技术领域，具体涉及一种鲤鱼快速高效选育方法。
背景技术
[0002] 鲤鱼是我国广为推广的
淡水鱼类品种，是一种杂食性鱼类，它具有生长快，抗逆性强，耐低
氧等优点，然而其肉质不够鲜美限制了它的进一步推广。自然界绝大部分鱼类是由二倍体形式存在的，并以两性融合的方式繁殖后代，在二倍体鱼类的性成熟阶段，其性腺发育消耗大量
能量，且由于性腺发育阶段和产卵季节鱼肉
质量下降并延长
上市时间，同时，性腺发育阶段个体生长停滞和死亡率增加，并且个体体型受到很大限制。自然二倍体鱼类需要人工诱导才能产生三倍体。人工诱导三倍体鱼的方法主要有冷休克、热休克、静水压等物理方法，采用化学物质(如6-二甲基
氨基嘌呤(6-DMAP)、秋水仙素等)处理的化学方法。目前用
温度休克、静水压、药物处理等办法抑制受精卵第二极体外排，使
染色体组三倍化来生产三倍体鱼在国内外也有不少报道，但大多数仍然处于探索与试验阶段，离实践应用仍有一定的距离，许多结果仍没有完全摸索出最佳的诱导参数，受精卵
坏死率高、出苗率低、幼鱼畸形率高及三倍化比率偏低等现象，影响了三倍体产业化的
进程。
[0003] 鱼类在养殖中病害问题日益显著，并逐步成为养殖业中持续、稳定发展的
瓶颈，选育和使用抗病品种是防治病害最经济有效地措施。柱形病又叫细菌性烂鳍病，是世界各国
水产养殖业中广泛流行的一种细菌病，无论冷水性鱼、温水性鱼，还是淡水鱼或咸淡水鱼都有发生。该病在鳍条、体表
皮肤、鳃等与
水体接触的部位，均可形成病灶，让鱼患病。当鱼患上这种病的时候，幼鱼和成鱼是有所不同的，患有这种病的幼鱼、小鱼的背鳍受伤变白，逐渐朝鳍基部及其周围组织蔓延溃烂，呈白色病变区，尾鳍亦可能溃烂，严重的时候可能使尾柄
腐蚀。成鱼背鳍往往不会有病变，而鱼背鳍附近的皮肤，先出现鱗片脱落、肿胀充出血的圆形病变区，渐而扩大表皮剥离，呈现难看的溃蚀病变。与其他的病不同的是患病的鱼食欲与精神等尚正常，死亡率也不是很高，体弱的鱼只可能零星死亡，高
密度放养时，发病率约10-30％。
[0004] 东平湖鲤俗称红鱼，是东平湖特有的大型经济鱼类，其肉嫩鲜美、营养丰富，由于近年来市场需求量的急剧增加，过度捕捞使得东平湖鲤野生资源锐减，建年来湖区人工增值放流和民间放生活动的开展，导致东平湖鲤这一长久以来形成的独特地理群体遭受到不同程度的遗渐渗，造成基因污染，而一旦污染，这一种质资源的原种便再难找到和恢复，因此有必要对东平湖鲤的种质资源进行发掘，以培养生长速度快、抗病抗逆能
力强等优良性质的经济品系。文章《四种鲤鱼对柱形病抗病能力的差异》(杨玲等)对东平湖鲤、建鲤、俄罗斯鲤以及德国镜鲤对柱形病的抗病力进行了试验研究，结果表明东平湖鲤在其中的抗病性能最佳。
[0005] 水文环境是影响鱼类产卵繁殖的重要因素，许多鱼类的繁殖必须在一定温度
阈值之上或至之下，产卵活动才能发生。但黑龙江流域有许多鱼类为适应繁殖期多变的水温环境，产卵温度阈值已经不是限制性的环境因子。黑龙江野鲤是上第三纪保存下来的鱼类，在长期的进化过程中对黑龙江水域多变的水温环境已经适应，它具有较强的耐寒性，繁殖行为和该流域水温的变化规律相适应。目前未发现将东平湖鲤和黑龙江野鲤杂交选育，得出具有抗柱形病性好、耐寒性佳的三倍体鲤鱼的相关技术。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于克服
现有技术存在的
缺陷，提供一种鲤鱼快速高效选育方法，得到抗柱形病性好、耐寒性佳的三倍体鲤。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0008] 本发明的鲤鱼快速高效选育方法，包括如下步骤：
[0009] (1)以东平湖鲤为
基础选育群体，选育获得抗病性好、遗传性状稳定的雄鱼和雌鱼；
[0010] (2)以步骤(1)的雌鱼和雄鱼为母本和父本，自交繁殖得到遗传性状稳定的同源四倍体鱼苗，选取四倍体雄鱼作为三倍体父本；
[0011] (3)以黑龙江野鲤为基础选育群体，选育获得耐寒性好、遗传性状稳定的二倍体雌鱼，作为三倍体母本；
[0012] (4)将步骤(2)的三倍体父本和步骤(3)的三倍体母本进行倍间杂交，获得三倍体鲤。
[0013] 优选地，所述步骤(1)的选育方法包括如下步骤：
[0014] (1a)分别取50-100尾1.5龄及1.5龄以上的雄性东平湖鲤和1龄及1龄以上的雌性东平湖鲤，进行一雄配一雌的
配对繁殖，建立50-100个第一代选育家系；
[0015] (1b)将第一代选育家系的子孙为3-5组，取一组做空白对照，其余组别柱形病感染试验，用病原体感染；
[0016] (1c)选取步骤(1b)中存活的鱼，重复(1a)和(1b)至少2次，选取抗柱形病性能最佳、性状遗传最好的雌鱼和雄鱼30-50对。
[0017] 优选地，所述步骤(2)的四倍体雄鱼的选育方法包括如下步骤：
[0018] (2a)在繁殖季节，取步骤(1)的1.5龄及1.5龄以上的雄鱼和1龄及1龄以上的雌鱼进行人工催产和人工授精，授精后的受精卵在恒温、通气、流水的环境下孵化，对饲养后的鱼苗进行检测筛选，得到染色体数目为200的雌、雄同源四倍体鲤；
[0019] (2b)取步骤(2a)的雌、雄同源四倍体鲤自交，通过至少3代自交传代培养，得到遗传性状稳定的四倍体雄鱼作为三倍体父本。
[0020] 优选地，所述步骤(3)的三倍体母本的选育方法包括如下步骤：
[0021] (3a)选取体质强壮、体表无伤的黑龙江野鲤至少100尾，雌雄各半，按一雄配一雌分别单独放入产卵池中，控制水温为16-18℃，对黑龙江野鲤雄鱼进行人工催产，当其有明显发情行为时，进行人工授精；
[0022] (3b)将步骤(3a)的受精卵粘到已准备好的鱼巢上，进行孵化，孵化水温为18-23℃，选取耐寒性佳、遗传性状稳定的鱼苗重复步骤(3a)至少3次，选取耐寒性最佳、体质强壮、遗传性状最稳定的雌鱼作为三倍体母本。
[0023] 优选地，所述步骤(4)的倍间杂交包括如下步骤：
[0024] (4a)在繁殖季节，水温维持在18-21℃，挑选1.5龄及1.5龄以上的三倍体母本，1龄及1龄以上的三倍体父本，对三倍体父本进行人工催产，当其有明显发情行为时，将三倍体父本和三倍体母本按2-3:1的数量比放入同一产卵池中待产；
[0025] (4b)待三倍体父本开始产精，三倍体母本开始产卵后，进行人工授精，授精后的受精卵在16-19℃、通气、流水的环境下孵化，将孵化后的鱼苗进行专池饲养，到鱼苗长到10-12cm长度后，通过流式细胞仪测定挑选出血细胞DNA含量为150的鱼苗，即得三倍体鲤。
[0026] 优选地，所述步骤(2)和步骤(3)不分先后。
[0027] 本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：
[0028] 1、本发明通过多代培育建立了一个遗传稳定、具有高抗柱形病的四倍体东平湖鲤，获得的同源四倍体鲤具有生长速度快、抗逆性强、繁殖力强、抗逆性强、肉质细嫩和营养价值高等优点。本发明克服了人工制备的同源四倍体物种在遗传和生殖方面不稳定的瓶颈，孵化率及苗种存活率都较高，两性可育且遗传稳定。不但为制备新型优良三倍体鱼奠定了关键的亲本资源，也提供了遗传背景清晰的四倍体动物品系，是系统研究
多倍体动物
生物学特性的好材料，在鱼类遗传育种和鱼类物种演化研究方面具有重要的意义。利用该同源四倍体东平湖鲤与其它二倍体鱼倍间杂交，则有望制备具有生长速度快、抗逆性强、不育的三倍体鱼。可见，同源四倍体东平湖鲤品系的建立具有明显的经济效益和社会效益。
[0029] 2、本发明选育出了一种能够适应北方较低水温并且生长性能良好的黑龙江野鲤品种，将其作为母本，四倍体东平湖鲤作为父本，倍间杂交得到的三倍体鲤含有母本和父本的性状，使得黑龙江野鲤的耐寒性和东平湖鲤的抗柱形病的特性得到良好结合，同时具有三倍体鱼类潜在不育、生长快、肉质好的特点，利用本方法培育的三倍体鲤，孵化率高，不存在二倍体鱼类的性成熟阶段性腺发育消耗大量能量、由于性腺发育阶段和产卵季节鱼肉质量下降并延长上市时间、性腺发育阶段个体生长停滞和死亡率增加等问题，在鲤科鱼类三倍体诱导和规模化养殖中具有重要应用价值。
[0030] 3、经过试验，本发明的三倍体鲤对柱形病的抗病率为96.78％，高于四倍体东平湖鲤(92.16％)、东平湖鲤(90.59％)，建鲤(82.14％)、俄罗斯鲤(80.33％)以及德国镜鲤(69.48％)，具有良好的抗病性，为增加水产养殖经济效益提供了良好的助益。在孵化率、成活率、体质量增长率方面均有优异的表现，显著提高水产养殖经济效益。此外，对比黑龙江野鲤，本发明的三倍体鲤可在16℃的水温下产卵繁殖，并且保持较高的孵化率和成活率，对于北方水温较低的地区有养殖优势。
具体实施方式
[0031] 为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选
实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，
说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
[0032] 实施例1
[0033] 本发明的鲤鱼快速高效选育方法，包括如下步骤：
[0034] (1)以东平湖鲤为基础选育群体，选育获得抗病性好、遗传性状稳定的雄鱼和雌鱼，具体步骤如下：
[0035] (1a)分别取100尾1.5龄及1.5龄以上的雄性东平湖鲤和1龄及1龄以上的雌性东平湖鲤，放入网箱中进行一雄配一雌的配对繁殖，水温21℃，建立100个第一代选育家系，雌鱼和雄鱼配对1天后，鱼巢上即可附有受精卵，从网箱中取出附有受精卵的鱼巢，将鱼巢转入孵化网箱中进行孵化3天后，得到第2代鱼苗；
[0036] (1b)将第一代选育家系的第二代鱼苗1000尾，均分为5组，取1组做空白对照，其余4组为试验组，取柱状黄杆菌进行半数致死浓度试验，用浓度为1×104cfu/mL的柱状黄杆菌菌液浸泡攻毒，空白组作为对照；
[0037] (1c)选取步骤(1b)的试验组中经过存活的鱼，重复(1a)和(1b)2次，选取抗柱形病性能最佳、性状遗传最好的雌鱼和雄鱼50对；
[0038] (2)以步骤(1)的雌鱼和雄鱼为母本和父本，自交繁殖得到遗传性状稳定的同源四倍体鱼苗，选取四倍体雄鱼作为三倍体父本，具体步骤如下：
[0039] (2a)在繁殖季节，取步骤(1)的1.5龄及1.5龄以上、体重1kg及以上的雄鱼和1龄及1龄以上的雌鱼，放入
温室内进行升温培育，保持水温在20℃，加快性腺发育，待雌、雄鱼的生殖孔微红后，采用促黄
体素释放
激素类似物2号(LRH-A2)进行一次注射，剂量为3ug/kg，催产后的雌、雄鱼分开放入不同
水泥池内，进行流
水刺激促进性腺快速成熟；人工催产注射
14h后开始观察，轻压雌鱼鱼腹时有卵粒从生殖孔流出的成熟雌鱼取出催产池，擦干鱼体身上的水，将鱼卵挤入准备好的干燥的盆中；将有追鱼动作、轻压有白色精液流出的雄鱼捞取，将精液挤入准备好的干燥的碗中，将大约与精液等量的质量浓度8％生理盐水加入精子碗中，将精液与鱼卵充分混合，再取受精卵粘在21℃、通气、流水的环境下孵化，对饲养后的鱼苗进行检测筛选，得到染色体数目为200的雌、雄同源四倍体鲤；
[0040] (2b)取步骤(2a)的雌、雄同源四倍体鲤自交，通过3代自交传代培养，得到遗传性状稳定的四倍体雄鱼作为三倍体父本；
[0041] (3)以黑龙江野鲤为基础选育群体，选育获得耐寒性好、遗传性状稳定的二倍体雌鱼，作为三倍体母本，具体步骤如下；
[0042] (3a)雌鱼选择背高体宽、头较小、腹部膨大、肛
门和生殖孔略红肿突出，手摸鱼腹部柔软且富有弹性，无伤体壮，规格在1.5kg以上的黑龙江野鲤雌鱼，雄鱼选择体狭长、头较大、腹部狭小而硬，成熟后能挤出精液，有“追星或珠星”，生殖孔略内凹，质强壮、体表无伤的黑龙江野鲤，体重在1kg及以上的黑龙江野鲤雄鱼，按一雄配一雌分别单独放入产卵池中，控制水温为18℃，对黑龙江野鲤雄鱼进行人工催产，采用胸腔一次注射方法，注射促黄体素释放激素类似物2号(LRH-A2)，剂量为为3ug/kg，雌雄比例1:2，总数为300尾，当其有明显发情行为时，轻压雌鱼鱼腹时有卵粒从生殖孔流出的成熟雌鱼取出催产池，擦干鱼体身上的水，将鱼卵挤入准备好的干燥的盆中；将有追鱼动作、轻压有白色精液流出的雄鱼捞取，将精液挤入准备好的干燥的碗中，将大约与精液等量的质量浓度8％生理盐水加入精子碗中，将精液与鱼卵充分混合，得到受精卵；
[0043] (3b)将步骤(3a)的受精卵粘到已准备好的鱼巢上，进行孵化，孵化水温为18℃，选取耐寒性佳、遗传性状稳定的鱼苗重复步骤(3a)3次，选取耐寒性最佳、体质强壮、遗传性状最稳定的雌鱼作为三倍体母本；
[0044] (4)将步骤(2)的三倍体父本和步骤(3)的三倍体母本进行倍间杂交，获得三倍体鲤，具体步骤如下：
[0045] (4a)在繁殖季节，水温维持在18℃℃，挑选1.5龄及1.5龄以上的三倍体母本，1龄及1龄以上的三倍体父本，对三倍体父本进行人工催产，当其有明显发情行为时，将三倍体父本和三倍体母本按2:1的数量比放入同一产卵池中待产；本步骤采用步骤(3a)的人工催产方式；
[0046] (4b)待三倍体父本开始产精，三倍体母本开始产卵后，进行人工授精，授精后的受精卵在17℃、通气、流水的环境下孵化，将孵化后的鱼苗进行专池饲养，到鱼苗长到10cm长度后，通过流式细胞仪测定挑选出血细胞DNA含量为150的鱼苗，即得三倍体鲤；本步骤采用采用步骤(3a)的人工受精方式。
[0047] 重复实施例1的步骤6次，在实施过程中观察三倍体鲤的孵化率、成活率、生长速度等指标，并取1龄的鱼进行柱形病的抗病能力和耐寒性的试验，试验结果的平均值见表1。
[0048] 项目 孵化率/％ 成活率/％ 体质量增长率/％ 耐寒性/℃ 柱形病抗病能力/％三倍体鲤 86.50 89.02 32.56 16 96.78四倍体东平湖鲤 85.91 80.53 26.68 - 92.16
东平湖鲤 80.46 81.36 23.55 - 90.59
黑龙江野鲤 78.59 79.88 24.79 18 -
建鲤 81.38 81.54 29.12 - 82.14
俄罗斯鲤 83.96 80.39 20.81 - 80.33
德国镜鲤 86.04 83.81 26.53 - 69.48
[0049] 表1
[0050] 如表1所示，本发明的三倍体鲤对柱形病的抗病率为96.78％，高于四倍体东平湖鲤(92.16％)、东平湖鲤(90.59％)，建鲤(82.14％)、俄罗斯鲤(80.33％)以及德国镜鲤(69.48％)，具有良好的抗病性，为增加水产养殖经济效益提供了良好的助益。在孵化率、成活率、体质量增长率方面均有优异的表现，显著提高水产养殖经济效益。此外，对比黑龙江野鲤，本发明的三倍体鲤可在低至16℃的水温下产卵繁殖，并且保持较高的孵化率和成活率，对于北方水温较低的地区有养殖优势。
