一种青花菜‘台绿6号’杂交种种子纯度EST-SSR分子标记体
系、鉴定方法及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 青花菜(Brassica oleracea var.italica)，又名绿花菜、西兰花等，是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种。其食用部分是带有花蕾群的肥嫩花茎，营养丰富，
风味独特，而且具有抗癌和抗
氧化功效，深受广大消费者的喜爱。近年来我国青花菜栽培面积逐年增加，对优势青花菜品种的需求也不断加大，利用
杂种优势生产青花菜F1杂交种已经成为一种趋势。但是，在杂交种制种过程中，人们操作过程的相互传粉，
鸟类、
蜜蜂等造成的串粉都会形成假杂种，再加上青花菜杂交种种粒小且品种之间差异小，在
收获、脱粒、加工、贮藏、
包装、销售的过程中也容易造成混杂。目前育种者主要依靠常规大田种植的方式对青花菜杂交种纯度进行鉴定，但其周期长且费工、占地，易受季节限制，对当年生产的杂交种纯度难以确定，对因环境条件影响所引起的变异与本品种遗传所产生的变异区分较困难，不适应当前生产的需要。
植物品种之间的差异归根结底是基因的差异，利用现代分子生物学手段从遗传
基础上检测杂交种的纯度更加符合市场需求。
[0003] 利用分子标记进行DNA指纹鉴定直接检测品种间DNA
水平上的差异，不受环境影响和季节限制，测试周期短、准确率高，已经被广泛应用于种子的纯度鉴定。EST-SSR是基于表达序列标签开发微卫星的一种新型分子标记，利用公共
数据库中的EST序列开发SSR等标记，免去了传统的从基因组中开发标记时需要的克隆、测序等步骤，对开发标记而言具有省时、省
力、
费用低等特点，所开发出的的引物来自于功能基因区，该区域在近缘种中相对保守，因而具有良好的可转移性的优点。目前，EST-SSR被广泛应用于植物基因组学研究如遗传图谱构建、比较作图、遗传多样性评价、种质鉴定、系统发育与进化研究等方面。但对青花菜杂交种的纯度鉴定应用较少。
发明内容
[0004] 针对
现有技术存在的问题，本发明提供了一种青花菜‘台绿6号’杂交种种子纯度EST-SSR分子标记体系、鉴定方法及其应用。
[0005] 本发明是这样实现的，一种青花菜‘台绿6号’杂交种种子纯度EST-SSR分子标记体系，所述分子标记体系包括三对核苷酸序列如下所示的EST-SSR分子标记特异引物：
[0006] 编号BnGNS0636：上游引物5'-ACCTCTGCTCCTCATTCAC-3'，见SEQ ID NO.1；下游引物5'-GTGTAGCCCATCTCATCTTT-3'，见SEQ ID NO.2；
[0007] 编号BoE002：上游引物5'-CGTCACGGTGGCGCTTTATTTT-3'，见SEQ ID NO.3；下游引物5'-TAGCGGCAGCGACGTGGAGAAC-3'，见SEQ ID NO.4；
[0008] 编号CB10005：上游引物5'-TATGTTAGAAAATGCTTACG-3'，见SEQ ID NO.5；下游引物5'-ATGGAGAGAAGGTTAGGTG-3'，见SEQ ID NO.6。
[0009] 一种利用
权利要求1所述的EST-SSR分子标记体系对青花菜‘台绿6号’杂交种种子纯度进行鉴定的方法，包括以下步骤：
[0010] 步骤1：提取待测样品基因组DNA；
[0011] 步骤2：利用权利要求1中所述的分子标记特异引物进行PCR扩增；
[0012] 步骤3：根据扩增产物的
电泳结果判断杂交种种子纯度，只有同时具有3对引物各自父母本特异性标记条带的单株才是真正的‘台绿6号’杂交种单株。
[0013] 进一步，步骤2中进行PCR扩增的扩增体系为基因组DNA 8ng，10μM上下游引物分别0.2μL，10mM dNTP 0.2μL，5U·μL-1Taq DNA聚合酶0.15μL，10×buffer(含Mg2+)1μL，无菌重蒸水补齐至7.45μL。
[0014] 进一步，步骤2中进行PCR扩增的扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性0.5min，55℃
退火0.5min，72℃延伸0.5min，31个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
[0015] 进一步，步骤3中EST-SSR引物BnGNS0636产生的母本特异性标记条带大小约120bp，产生的父本特异性标记条带大小约100bp。
[0016] 进一步，步骤3中EST-SSR引物BoE002产生的母本特异性标记条带大小约180bp，产生的父本特异性标记条带大小约170bp。
[0017] 进一步，步骤3中EST-SSR引物CB10005产生的母本特异性标记条带大小约165bp，产生的父本特异性标记条带大小约150bp。
[0018] 如上所述的EST-SSR分子标记体系在青花菜‘台绿6号’杂交种种子纯度鉴定中的应用。
[0019] 如上述的利用EST-SSR分子标记体系对青花菜‘台绿6号’杂交种种子纯度进行鉴定的方法在青花菜‘台绿6号’杂交种种子纯度鉴定中的应用。
[0020] 综上所述，本发明的优点及积极效果为：
[0021] (1)本发明设计了200对EST-SSR引物，从中开发出了3个同时鉴定‘台绿6号’杂交种纯度的标记。
[0022] (2)本发明使用的3个标记同时鉴定青花菜‘台绿6号’杂交种纯度的准确性高，与田间鉴定结果相符度达100％，结果可靠；鉴定在10天以内即可完成，避免了田间种植鉴定的繁琐程序，节约了劳动力和土地资源，鉴定成本降低；能在制种当年确定种子遗传纯度，便于种子定级与收购，提高了鉴定效率。
[0023] (3)本发明对DNA提取、凝胶电泳等实验操作都做了相应的简化，更适合对大规模批量样本进行检测。
附图说明
[0024] 图1是青花菜‘台绿6号’种子检测特征引物BnGNS0636的SSR-PCR电泳图谱；
[0025] 图2是青花菜‘台绿6号’种子检测特征引物BoE002的SSR-PCR电泳图谱；
[0026] 图3是青花菜‘台绿6号’种子检测特征引物CB10005的SSR-PCR电泳图谱。
具体实施方式
[0027] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合
实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和
试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0028] 本发明披露了一种青花菜‘台绿6号’杂交种种子纯度EST-SSR分子标记体系、鉴定方法及其应用，具体如下各实施例所示。
[0029] 实施例1针对青花菜‘台绿6号’杂交种开发EST-SSR引物并进行EST-SSR多态性引物的筛选
[0030] 1.从NCBI数据库中下载青花菜EST序列，采用CAP3
软件进行EST拼接并获得Unigene，利用SSRIT软件(http://www.gramene.org/gramene/searches/ssrtool)搜索青花菜数据库中的SSR位点，要求二核苷酸重复单元不少于8个，四核苷酸重复单元不少于5个，五核苷酸重复单元不少于4个，六核苷酸重复单元不少于3个。
[0031] 2.通过Primer5.0软件设计引物，选择含有符合要求的SSR位点，
串联重复长度＞15bp的Unigene及GC含量在40％～60％；引物长度15～25bp，最适为20bp；Tm值的最适
温度为57℃，上游引物下游引物复性温度的差值不能超过2℃；预期扩增产物长度介于100～
500bp，如引物二聚体、发夹结构和错配等现象尽量避免出现。经分析青花菜数据库共设计出200对EST-SSR标记引物。
[0032] 3.EST-SSR多态性引物的筛选
[0033] 采用CTAB简易提取法快速提取青花菜
幼苗基因组DNA：苗期取幼嫩
叶片0.2g，剪成小
块，装入2mL离心管中，同时每只离心管加入1粒不锈
钢钢珠(直径约0.5cm)，盖好离心管盖后放入装有液氮的
泡沫盒中静置10min，倒出液氮，快速用力摇晃泡沫盒5min。打开离心管盖倒出钢珠，向离心管中加入600μL 2％CTAB裂解液，65℃水浴30min。加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)轻轻摇晃数次，12000rpm离心10min。取上清，加入2/3体积预冷异丙醇，混匀，-20℃
冰箱静置120min，12000rpm离心10min。弃上清，沉淀出的DNA用70％
乙醇洗涤两次，干燥后加入ddH2O-20℃保存备用。
[0034] PCR扩增反应总体系为10μL，体系成分为：基因组DNA 8ng，10μM上下游引物分别0.2μL，10mM dNTP 0.2μL，5U·μL-1Taq DNA聚合酶0.15μL，10×buffer(含Mg2+)1μL，无菌重蒸水补齐至7.45μL。
[0035] 扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，31个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
[0036] 扩增产物的检测。扩增产物中加入2μL的loading Buffer(含1％GelRad核酸染料)混匀，之后取2.5μL混合物在浓度为8％的双垂直板非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，在恒定
电压220V下电泳70min，凝胶经AgNO3
染色和显色液显色后照相。
[0037] 通过200对EST-SSR引物对‘台绿6号’双亲进行多态性筛选，最后筛选出能在双亲中有明显差异的条带的EST-SSR引物3对，编号及序列分别如下：
[0038] 编号BnGNS0636：上游引物5'-ACCTCTGCTCCTCATTCAC-3'，见SEQ ID NO.1；下游引物5'-GTGTAGCCCATCTCATCTTT-3'，见SEQ ID NO.2。青花菜‘台绿6号’种子检测特征引物BnGNS0636的SSR-PCR电泳图谱见图1，其中1为Marker，2为母本，3为父本，47为‘台绿1号’，48为‘台绿3号’，其余的都为‘台绿6号’杂交种。EST-SSR引物BnGNS0636产生的母本特异性标记条带大小约120bp，产生的父本特异性标记条带大小约100bp。
[0039] 编号BoE002：上游引物5'-CGTCACGGTGGCGCTTTATTTT-3'，见SEQ ID NO.3；下游引物5'-TAGCGGCAGCGACGTGGAGAAC-3'，见SEQ ID NO.4。青花菜‘台绿6号’种子检测特征引物BoE002的SSR-PCR电泳图谱见图2，其中2为Marker，1为母本，3为父本，46为‘台绿1号’，47为‘台绿3号’，其余的都为‘台绿6号’杂交种。EST-SSR引物BoE002产生的母本特异性标记条带大小约180bp，产生的父本特异性标记条带大小约170bp。
[0040] 编号CB10005：上游引物5'-TATGTTAGAAAATGCTTACG-3'，见SEQ ID NO.5；下游引物5'-ATGGAGAGAAGGTTAGGTG-3'，见SEQ ID NO.6。青花菜‘台绿6号’种子检测特征引物BoE002的SSR-PCR电泳图谱见图3，其中3为Marker，1为母本，2为父本，47为‘台绿1号’，48为‘台绿3号’，其余的都为‘台绿6号’杂交种。EST-SSR引物CB10005产生的母本特异性标记条带大小约165bp，产生的父本特异性标记条带大小约150bp。
[0041] 只有同时具有3对引物各自父母本特异性标记条带的单株才是真正的‘台绿6号’杂交种单株，缺少其中的任意一条带记为假杂种，并根据电泳结果计算待测种子的遗传纯度。
[0042] 实施例2EST-SSR多态性引物应用
[0043] 以人为混入假杂种的‘台绿6号’样品种子为材料用以证明本发明方法及其专用引物对青花菜‘台绿6号’杂交种子纯度鉴定的可行性。其中青花菜‘台绿6号’父本和母本各一份，‘台绿6号’杂交种子44份，其它随机混杂种子2份，单株编号。
[0044] (1)人为混入假杂种的‘台绿6号’样品幼苗基因组DNA的提取。采用CTAB简易提取法快速提取青花菜幼苗基因组DNA，具体步骤如下：
[0045] ①苗期取幼嫩叶片0.2g，剪成小块，装入2mL离心管中，同时每只离心管加入1粒
不锈钢钢珠(直径约0.5cm)，盖好离心管盖后放入装有液氮的泡沫盒中静置10min，倒出液氮，快速用力摇晃泡沫盒5min。
[0046] ②打开离心管盖倒出钢珠，向离心管中加入600μL 2％CTAB裂解液，65℃水浴30min。
[0047] ③加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)轻轻摇晃数次，12000rpm离心10min。
[0048] ④取上清，加入2/3体积预冷异丙醇，混匀，-20℃冰箱静置120min，12000rpm离心10min。
[0049] ⑤弃上清，沉淀出的DNA用70％乙醇洗涤两次，干燥后加入ddH2O-20℃保存备用。
[0050] (2)PCR扩增的体系、成分及反应程序。PCR扩增反应总体系为10μL，体系成分为：基因组DNA 8ng，10μM上下游引物分别0.2μL，10mM dNTP 0.2μL，5U·μL-1Taq DNA聚合酶0.15μL，10×buffer(含Mg2+)1μL，无菌重蒸水补齐至7.45μL。所用引物分别为实施例1中筛选到的三对引物。
[0051] 扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，31个循环，72℃延伸5min，4℃保存。
[0052] 扩增产物的检测。扩增产物中加入2μL的loading Buffer(含1％GelRad核酸染料)混匀，之后取2.5μL混合物在浓度为8％的双垂直板非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，在恒定电压220V下电泳70min，凝胶经AgNO3染色和显色液显色后照相。
[0053] 对电泳结果进行分析，通过被鉴定样品在凝胶上的条带特征来鉴定杂交种“台绿6号”的纯度。
[0054] EST-SSR引物BnGNS0636产生的母本特异性标记条带大小约120bp，产生的父本特异性标记条带大小约100bp；EST-SSR引物BoE002产生的母本特异性标记条带大小约180bp，产生的父本特异性标记条带大小约170bp；EST-SSR引物CB10005产生的母本特异性标记条带大小约165bp，产生的父本特异性标记条带大小约150bp。只有同时具有3对引物各自父母本特异性标记条带的单株才是真正的‘台绿6号’杂交种单株，缺少其中的任意一条带记为假杂交种。根据电泳结果表明44份为‘台绿6号’杂交种，2份为假杂交种，鉴定结果为100％。
[0055] 实施例3常规田间种植鉴定法与本发明的鉴定方法比较
[0056] 以台州农科院西兰花育种基地2018年大田制种的‘台绿6号’杂交种为待测样品，采用常规田间种植鉴定法和本发明方法鉴定青花菜‘台绿6号’杂交种纯度，比较两种方法的鉴定结果，进一步考察本发明方法的可行性、可靠性与时效性。
[0057] 本实施例中待测样品共192份，对其单株编号，进行常规田间种植鉴定和本发明方法鉴定，具体如下：
[0058] 常规田间种植鉴定：192份材料于2018年8月20日穴盘育苗，9月20日移栽，2018年12月至2019年2月对192份材料进行形态学观察，确定杂株数与待测样品遗传纯度。
[0059] 本发明方法鉴定。操作步骤、分析
鉴别与实施例2相同，不再赘述。
[0060] 结果显示，利用常规田间鉴定方法，192份待测样品中共有24份混杂单株，种子纯度为87.5％。利用本发明192份待测样品中共有24份混杂单株，种子纯度为87.5％，两者结果相符度达100％。采用田间鉴定从
播种到鉴定需要4-5个月时间，而本发明方法从播种到鉴定只需10天；田间种植鉴定成本包括劳动力、
农药、化肥、用地等是本发明方法的所需费用的五倍以上。由此可见，本发明方法在青花菜杂交种鉴定的可行性、可靠性与时效性方面都具有明显优势，适合在‘台绿6号’的制种、繁种、经销企业推广应用。
[0061] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
