【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特定の生薬抽出物を有効成分として含んでなる皮膚外用剤に関する。 具体的には、ミカン科（Rutaceae）ミクロメラム属（Microm
elum）植物の抽出物を配合することにより、優れた脱毛防止、ふけ・痒み抑制作用効果を有するとともに、毛乳頭細胞あるいは毛包上皮系細胞を活性化することによって、毛髪伸長の促進をする等の養毛効果を有する皮膚外用剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】高齢化社会、ストレス社会といわれる現代社会では、頭部毛髪が様々な原因により脱毛の危機にさらされる機会がますます多くなってきている。 これに対応して、より優れた「養毛料」を提供すべく様々な試みがなされている。 養毛料が毛髪に与える効果として主なものに、発毛誘導効果（発毛促進効果，成長期誘導効果）、毛髪を太くする効果、毛髪成長期延長効果、５α
−レダクターゼ阻害効果、血行促進効果、殺菌効果、フケ防止効果、保湿効果、抗酸化効果等の効果が挙げられる。

【０００３】しかしながら、前記のように種々の試みがなされているにもかかわらず、従来の養毛料では、その脱毛防止，発毛効果等の養毛作用は必ずしも十分なものではなかった。 これはおそらく脱毛の原因がさまざまであり、また発毛の機構も非常に複雑であるためと考えられている。 従って、毛髪のより具体的構造に着目して養毛料を作出することは極めて有用であり、そのような薬剤の提供が望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者は従来の試験方法として用いられていきた脱毛防止、発毛効果あるいはふけ、痒み抑制作用に加え、毛髪のより具体的構造に着目した毛乳頭細胞あるいは毛包上皮系細胞に直接働きかける成分を有効成分とする養毛料を見出すことを目指した。 すなわち、本発明の目的は、前記多様な脱毛の原因に対処すべく、優れた脱毛防止効果、発毛促進効果等の養毛作用及びフケ、痒み抑制作用ならびに、
乳頭細胞あるいは毛包上皮系細胞を活性化することによって、毛髪伸長の促進をする等の養毛効果を有する皮膚外用剤を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、有用物質の探索対象を脱毛防止効果及び発毛促進効果等の養毛作用を示すことが示唆されていない植物体抽出物に広げ、
上記目的を達成すべく検討してきた。 その結果、ミカン科（Rutaceae）ミクロメラム属（Micromelum）に属する民間薬または生薬として使用されることのある植物の抽出物が、優れた脱毛防止効果、発毛促進効果等の養毛作用及びフケ、痒み抑制作用を示すことを見い出した。 さらに、毛乳頭に直接働きかける成分及び毛髪成長期延長効果を有する成分について、本発明者が見出した育毛薬剤検定方法を用いて鋭意検討したところ、所望する毛乳頭活性化能及び毛髪成長期延長効果が認められることを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち本発明は、ミカン科（Rutaceae）
ミクロメラム属（Micromelum）植物の抽出物を配合することを特徴とする皮膚外用剤である。 本発明の皮膚外用剤は、養毛料であることを好適とする。

【０００７】また本発明は、ミカン科（Rutaceae）ミクロメラム属（Micromelum）植物の抽出物を有効成分とする毛乳頭活性化剤を提供する発明である。

【０００８】前記したように、本発明において「毛乳頭活性化剤」は、主に後述する育毛検定方法によって毛乳頭を刺激することによって、毛周期における成長期を延長させる作用と同休止期から成長期への移行を促進する作用を有する成分を有効成分として配合した、特に「毛乳頭」という作用点に着目した毛髪関連薬剤であり、いわば「個別効能育毛剤」としての特徴を有する。

【０００９】また本発明は、ミカン科（Rutaceae）ミクロメラム属（Micromelum）植物の抽出物を有効成分とする毛髪成長期延長剤を提供する発明である。

【００１０】前記したように、本発明において「毛髪成長期延長剤」は、主に後述する育毛薬剤検定方法によって少なくとも毛包上皮系細胞の分裂増殖活性を維持又は促進することで毛髪の成長期を維持又は延長する効果を有する成分を有効成分として配合した、特に上記の毛髪成長期延長効果に着目した毛髪関連薬剤であり、いわば「個別効能育毛料」としての特徴を有する。

【００１１】この「毛髪成長期延長剤」は、例えば毛根近傍における毛包上皮系細胞の増殖が緩徐であること等により成長期が短くなって、相対的に成長期毛よりも休止期毛の割合が多くなってしまうことに起因する脱毛症に特に有効な薬剤である。

【００１２】本発明のミカン科（Rutaceae）ミクロメラム属（Micromelum）植物の抽出物を有効成分とする養毛料は、上記の２つの作用点を合わせ持った養毛料である。 すなわち、この「養毛料」は、漫然とした育毛効果をうたう一般的な養毛料用途とは一線を画する用途を有するものである。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態について説明する。 はじめに、本発明の「養毛」とは、発毛促進、脱毛防止、さらにふけ、痒み抑制作用等ならびに、
乳頭細胞あるいは毛包上皮系細胞の活性化作用を包含する概念で使用する。

【００１４】本発明の皮膚外用剤は、ミカン科（Rutace
ae）ミクロメラム属（Micromelum）植物の抽出物を有効成分とする毛髪関連薬剤である。

【００１５】本発明に用いられるミカン科（Rutaceae）
ミクロメラム属（Micromelum）植物の抽出物としては、
ハッサクーン（Ha-Sa-Khun、学名：Micromelum minutu
m）が好適である。 これは、東南アジアを中心に広く分布植物であり、タイ国ではハサクーン（Ha-Sa-Khun）と呼ばれている。

【００１６】ミカン科（Rutaceae）ミクロメラム属（Mi
cromelum）植物の抽出物に関する報告はこれまでにないばかりか、養毛料への応用は全くない。

【００１７】本発明に用いられる抽出物は、上記植物の葉、地下茎を含む茎、根、果実等、植物全草を抽出溶媒と共に浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮して得られる。 本発明に用いられる抽出溶媒は、通常抽出に用いられる溶媒であれば何でもよく、特に熱水やメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等の低級アルコールあるいはプロピレングリコール、１，
３−ブチレングリコール等の多価アルコール、あるいはこれらの含水アルコール類、アセトン、酢酸エチルエステル等の有機溶媒を単独あるいは組み合わせて用いることができる。 低級アルコールを使用する場合、得られる抽出液をそのまま用いることもできるが、抽出溶媒を留去し、必要により乾燥した後、本発明の皮膚外用剤に含ませてもよい。

【００１８】本発明におけるミカン科（Rutaceae）ミクロメラム属（Micromelum）植物の抽出物の配合量は、組成物の形態または施用方法に応じて変動しうるので特定されるものでない。 しかし、後述の実施例に記載の方法に従って得られる抽出物を使用する場合、外用剤全重量中、一般に抽出物（乾燥物基準）が0.0005〜20.0重量％、好ましくは 0.001〜10.0重量％である。 0.0005重量％未満であると、本発明でいう効果が十分に発揮されず、20.0重量％を超えると製剤化が困難であるので好ましくない。 また、10.0重量％以上配合してもさほど大きな効果の向上は得られない。

【００１９】本発明の皮膚外用剤には、上記必須成分以外に、通常化粧品、医薬部外品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、油性成分、保湿剤、増粘剤、金属封鎖剤、その他の活性成分、酸化防止剤、紫外線吸収剤、界面活性剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。

【００２０】具体的には、油分として、例えば高級脂肪酸、固形パラフィン、流動パラフィン、シリコーン油、
スクワラン等；保湿剤として、例えばヒアルロン酸、プロピレングリコール、マルチトール、アテロコラーゲン、乳酸ナトリウム等；増粘剤、マルメロ粘質物、カルボキシビニ−ルポリマー、キサンタンガム等；金属封鎖剤として、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸；その他の活性成分として、例えばカフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸およびその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、火棘の果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸およびその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の他の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類などが挙げられる。

【００２１】また、養毛料の補助成分として、これらの製剤を調製する上で上記油性成分、保湿剤、増粘剤に加えて、その他の活性成分として、例えばモノオレイン酸グリセリル等の油分、ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、ビタミンE アセテート、センブリ抽出物、塩化カルプロニウム、センブリエキス、アセチルコリン誘導体等の血管拡張剤、セリン、メチオニン等のアミノ酸類、ビタミンB6、ビタミンE 及びその誘導体、ビオチン等のビタミン類、パントテン酸及びその誘導体グリチルレチン酸及びその誘導体、ニコチン酸、ニコチン酸メチル、ニコチン酸トコフェロールなどのニコチン酸エステル類、セファランチン等の皮膚機能亢進剤、エストラジオ−ル等の女性ホルモン剤等を同時に配合してもよい。
さらに、通常、養毛料に用いられる添加剤、例えばヒノキチオ−ル、ヘキサクロロフェン、ベンザルコニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド、ウンデシレン酸、トリクロロカルバニリドおよびビチオノール等の抗菌剤、メントール等の清涼剤、サリチル酸、亜鉛およびその誘導体、乳酸およびそのアルキルエステルなどの薬剤、クエン酸等の有機酸類、アルギニン等のアミノ酸類等が本発明の効果を損なわない範囲で適宜配合することができる。

【００２２】本発明の皮膚外用剤の性状は、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等、
従来皮膚外用剤に用いるものであればいずれでもよく、
剤型は特に問わない。 また、本発明の養毛料としては、
例えばトニック、ヘアークリーム、ムース、シャンプー、リンス等の剤型をとることもできる。

【００２３】

【実施例】次に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものでない。 なお、配合量は特記しない限り重量％である。 まず、発毛効果、育毛効果、培養毛乳頭細胞を用いた細胞増殖、ヒト培養毛包上皮系細胞活性化に関する試験方法とその結果について順に説明する。

【００２４】発毛試験 １． 抽出物の調製（調製例１） 市販のハッサクーン（乾燥物）４８４ｇを、５．０リットルのメタノールに室温で５日間浸漬した。 抽出液から溶媒を留去し、次いで乾燥してハッサクーンのメタノールエキス乾燥物１８．４ｇを得た。

【００２５】２． 試料の調製 上記で得られたメタノールエキス乾燥物 0.5％、１％、
２％を、それぞれ75％エタノール溶液に溶解して試料１
〜３を得た。

【００２６】３． 発毛試験方法及びその結果 対照試料として 0.1％クロトン油の75％エタール溶液を用い、本発明の液状の試料１〜３について下記の発毛試験行った。 実験動物として毛周期の休止期にあるＣ３Ｈ
／ＨｅＮＣｒＪマウスを使用し、小川らの方法（ノーマルアンドアブノーマル、エピダーマル、ディファレンシエ−ション［Normal and Abnormal Epidermal Differen
tiation ］、M ． Seiji およびI ． A ． Bernstein 編集、第159 〜170 ページ、1982年、東大出版）により行なった。

【００２７】すなわち、マウスを１群10匹とし、それぞれ被検試料１〜３と対照試料用の４群に分け、バリカンおよびシェ−バーでマウスの背部を剃毛し、それぞれの試料を１日１回、 0.1mlずつ塗布した。 18日、24日後に毛の再生面積を測定した。 結果は再生面積の平均値で表した。 その結果を表１に示す。

【００２８】

【表１】 ───────────────────────────────── 試 料 毛再生面積（％） １８日後 ２４日後 ───────────────────────────────── 試料１（ハッサクーン抽出物 0.5％） ７８ １００ 試料２（ハッサクーン抽出物 １％） ８８ ９７ 試料３（ハッサクーン抽出物 ２％） ８６ １００ 対照試料 ４１ ６３ ─────────────────────────────────

【００２９】表１より、本発明のハッサクーン抽出物は、マウスの発毛試験において優れた発毛効果を示した。

【００３０】育毛試験（トリコグラム試験） １． 抽出物の調製 上記発毛試験例で調製した調製例１の方法で抽出物を調製した。

【００３１】２． 試料の調製 上記方法で得られたメタノールエキス乾燥物 0.5、１および２％を、70％エタノール溶液（90％）、オレイン酸ナトリウム（0.01％）、ドデシルベンゼンスルホン酸（0.49％）、硬化ヒマシ油エチレンオキシド（40モル）
付加物（ 0.5％）及びイオン交換水（８％）と混合撹拌して溶解させた。 さらにイオン交換水（残余）を添加混合して、液状の試料４、５および６を得た。

【００３２】３． 育毛試験方法及びその結果 本発明の皮膚外用剤の脱毛防止、発毛効果等の養毛作用を調べるために、ヒトに対して、以下の方法でトリコグラム試験を実施した。 試料の使用前と使用後の抜去毛髪の毛根を顕徴鏡下で観察し、毛根の形態から休止期毛根数を計数し、その割合の増減によって養毛作用を比較した。 尚、休止期毛根とは成長の止まった毛の毛根であり、脱毛を訴える人は正常な人よりもこの休止期毛根の割合が多いことが認められている。

【００３３】被験試料及び対照試料の各試料をそれぞれ男性被験者10名の頭皮に１日２回、１回２mlずつ６ケ月間連続して塗布し、塗布直前および６ケ月間塗布終了直後に被験者１名につき 100本ずつ毛髪を抜去し、それぞれの毛根を調ベ、実使用テストを行った。 結果を表２に示す。

【００３４】

【表２】 ──────────────────────────────────── 試 料 休止期毛根の割合 養毛効果 ─────────────────── の評価 20％以上減少 ±20％ 20％以上増加 ──────────────────────────────────── 試料４(0.5％） ６０ ３０ １０ 有効 試料５( １％） ７０ ３０ ０ 著効 試料６( ２％） ８０ ２０ ０ 著効 対照試料 １０ ３０ ６０ 無効 ────────────────────────────────────

【００３５】表２より明らかなように、本発明のハッサクーン抽出物は、ヒトのトリコグラム試験において有意な育毛効果を示した。

【００３６】培養毛乳頭細胞を用いた細胞増殖試験 ３． 抽出物の調製 上記抽出物の調製は、上記発毛試験例で調製した調製例１の方法で抽出物を調製した。 さらに、メタノールエキス乾燥物をＤＭＳＯで０．２重量％の溶液に調製して、
これを無血清培地（ＭＥＭ）に希釈してハッサクーン抽出物をそれぞれ１．０×１０ ^-9 〜１．０×１０ ^-6 ％を含む溶液を調製した（調製例２〜５）。

【００３７】２． 毛乳頭細胞の採取 整形外科手術によって摘出された３２歳男性の後頭部皮膚（５mm×１．５cm）から、脂肪組織を分離して、そこから毛包を摘出し、毛球部より毛乳頭細胞を単離した。
単離した毛乳頭細胞を２０％ＦＢＳを含むＭＥＭで２週間培養した〔３７℃，５％ＣＯ ₂ 〕。 毛乳頭細胞から細胞のアウトグロースが確認された時点で、培地を１０％
ＦＢＳを含むＭＥＭ（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に交換して同様の条件で培養した。 以降、１週間に２回の割合で培養液（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を交換して細胞を維持した。 培養開始より４週間後に継代培養を行い、以後細胞が十分増殖した時点で再度継代して、この継代を繰り返した。

【００３８】３． 試験方法 継代数３代目の毛乳頭細胞を用い、ＭＥＭ＋１０％ＦＢ
Ｓ培地で，１００００及び細胞／mlの細胞密度の細胞懸濁液を調製した。 この細胞懸濁液を２００μlずつ、９
６ウエルのマイクロプレートに分注し（つまり，２００
０細胞／ウエル）、３７℃，５％ＣＯ ₂で３日間インキュベートを行い細胞を付着させた。 培養開始７２時間後、対照は培養液を無血清のＭＥＭに交換した。 被検体系は対象物質であるハッサクーン抽出物を含む無血清培地（ＭＥＭ）（調製例２〜５）に交換した（各試料７〜
１０）。 対照および被検体系をいずれもさらに４日間培養した。

【００３９】培養終了後、それぞれの系にアラマーブルー（alamar blue)(BIOSOURSE社製)を２０μl 添加後、
さらに８時間培養し、マイクロプレートリーダー（Micr
o plate reader:Bio RAD社製) で５７０nmと５９５nmの吸光度を測定した。 添付の使用説明書に従って、吸光度の測定結果によりアラマーブルーの還元率を算出した。
この還元率は細胞数と相関することから対照および被検体系での細胞増殖率を比較した。

【００４０】４． 結果：測定したハッサクーン抽出物（試料７〜１０）における、上記細胞増殖促進指標を下記第３表に示す。

【００４１】

【表３】 ──────────────────────────────────── 試 料 増殖促進率（％） 効果 ──────────────────────────────────── 試料７ （１．０×１０ ^-9 ） ４．５±３．８ ^*あり 試料８ （１．０×１０ ^-8 ） １８．５±６．２ ^**あり 試料９ （１．０×１０ ^-7 ） １３．８±５．３ ^**あり 試料１０（１．０×１０ ^-6 ） ６．４±３．４ なし 対照試料 ２．６±３．６ なし ──────────────────────────────────── ＊；有意差ｐ＜０．０５ ＊＊；有意差ｐ＜０．０１

【００４２】表３より明らかなように、本発明のハッサクーン抽出物は、培養毛乳頭細胞活性化試験において有意な毛乳頭細胞増殖促進効果を示した。

【００４３】ヒト培養毛包上皮系細胞活性化試験 １． ヒト培養毛包上皮系細胞の採取 外科手術の副産物として得られたヒト男性頭皮から毛周期における成長期の毛包を実体顕微鏡下で機械的に採取した。 この成長期の毛包を1000 U/ml dispase・0.2 ％
コラゲナーゼを含むダルベッコの改変ＭＥＭ（ＤＭＥ
Ｍ）で３０分間、３７℃で処理し、注射針の先を用いて
dermal sheath やdermal papilla、毛球部上皮組織を除去して、0.05％トリプシン・0.02％ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液〔ＰＢＳ（−）：（−）とはカルシウムイオンやマグネシウムイオンを含まない意味である〕で５分間，３７℃で処理した。 次にコラーゲン（Type I）コーティングした培養皿に毛包を静置し、外殖片培養を行った。 なおこの際の培地は、無血清培地〔Keratinocyte G
rowth Medium（ＫＧＭ）〕を用いた（Keratinocyte Ser
um Free Mediumを用いることもできる）。

【００４４】この培養の４〜５日後に、毛包の培養皿への接着及び細胞の増殖が確認できた時点で培地を交換し、これ以降２日おきに培地交換を行った。 このようにして増殖させた細胞を、0.05wt％トリプシン-0.02 ％Ｅ
ＤＴＡで３７℃で５分間処理した後、等量の0.1 ％トリプシンインヒビターで反応を停止させ、遠心処理(800×
g,5 分間) を施して細胞を回収した。

【００４５】次に、細胞を上記の無血清培地に浮遊させて、5000 cells/cm2の密度でコラーゲンコーティング（Type I）した培養皿に播種し、細胞がsubconfluentになるまで２日おきに培地交換を行い、再び0.05wt％トリプシン-0.02 ％ＥＤＴＡで３７℃で５分間処理した後、
等量の0.1 ％トリプシンインヒビターで反応を停止させ、遠心処理(800×g,5 分間) を施して、これにより得られたヒト毛包上皮系細胞に細胞凍結液（セルバンカー：ダイヤトロン製）を添加し、１．０×１０ ⁶ cell/m
l の濃度に調整して、各凍結チューブに１．０×１０ ⁶
cellずつ入れ、これを凍結保存した。 なお、これらの細胞数は、血球算定板で算出した。

【００４６】上記工程により得た毛包上皮系細胞の線維芽細胞混入率（ＦＢ混入率）を測定（３０００倍，５視野）し、その結果ＦＢ混入率が３％以上のものは、アッセイの対象から除外した。 そして、この毛包上皮系細胞を培養フラスコ中に播種後、これを０．０５％トリプシンと０．０２％ＥＤＴＡで処理した後、０．１％トリプシンインヒビターで反応を停止後、系を１５００rpm で５分間遠心処理を施し、上清を除去し、残渣にＫＧＭ培地２０mlを添加して、細胞懸濁液を調製した。

【００４７】０．２ml/well の割合で、９６well-plate
（Ｉ型コラーゲンコーティングプレート：ファルコン社製）に播種し（１．０×１０ ⁴ cell/well ）、細胞がウエルの底に沈むまで約２０分間室温下で放置した。 その後、３７℃，５％ＣＯ ₂で１日間培養を行い、所望するヒト毛包上皮系培養細胞を得た。

【００４８】上記操作により得られた毛包に、０．２５
％トリプシン含有ＰＢＳ（−）を５ml添加して、細胞懸濁液を３７℃で５分間インキュベートした。 インキュベート終了後、５mlの等量の牛胎児血清（ＦＢＳ）とＨａ
ｍ' ｓ Ｆ１２培地を添加して、細胞懸濁液をセルストレーナー（100 μm Nalgene 社製）で濾過後、５０ml遠沈管に入れて、この細胞懸濁液に遠心処理を施した（４
℃，１５００rpm ，５分間）。 この系から上清を除去して、残渣として所望する毛包上皮系細胞を得た。

【００４９】２． 毛包上皮系細胞の前培養 系に混入している線維芽細胞を可能な限り系から除去するために、上記工程により得られた毛包上皮系細胞の前培養を行った。 以下、その手順について説明する。 ３７
℃の恒温槽で、上記工程により得た凍結細胞を融解した。 次いでＦＡＤ培地〔Ｈａｍ' ｓ Ｆ１２培地（後述）とＭＥＮ培地を容量比で３対１で混合したものに、
インシュリン(5.0μg/ml），ハイドロコルチゾン（0.45
μg/ml），エピダーマルグロウスファクター(EGF)(10.0
ng/ml)，コレラトキシン（10 ^-9 Ｍ）及びウシ胎児血清(1
0 ％) を含有させた培地、以下同様である〕を１０ml添加し、細胞溶液を希釈して系に遠心処理を施した（１０
℃以下，１５００rpm ，５分間）。 遠心後、上清を除去し、系にＦＡＤ培地を１０ml添加して、細胞塊が認められなくなるまでピペッティングを繰り返した。

【００５０】得られた細胞数を血球算定板で算出し、Ｆ
ＡＤ培地で２．５×１０ ⁵ cell/mlの濃度になるように調製した。 Ｉ型コラーゲンでコーティングした７５cm3
のフラスコに細胞を播種して、これを３７℃，５％ＣＯ
₂で一晩培養した。 培養後、系をＰＢＳ（−）１０mlで２回洗浄し、０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ（−）を２ml添加して、これを３７℃，５％ＣＯ ₂で４分間インキュベートした。 次に、系に牛胎児血清（ＦＢＳ）を２
ml添加して、１回軽くゆすった後で上清を除去して、系に混入している線維芽細胞を除去した。

【００５１】さらに、系にＫＧＭ培地〔表皮角化細胞基礎培地(Keratinocyto growth medium)：Keratinocyto b
asal medium （ＫＢＭ培地（改変ＭＣＤＢ１５３培地（クローネティックス社製）））に，ウシ脳下垂体エキス(BPE)(0.4vol％),インシュリン(0.5μm/ml),ハイドロコルチゾン(0.5μm/ml),h-EGF(0.1 ng/ml)を添加した培地、以下同様である〕を１５ml添加し、３７℃，５％Ｃ
Ｏ ₂で３日間培養した。 上記工程により得た毛包上皮系細胞を播種した培養フラスコの線維芽細胞混入率（ＦＢ
混入率）を測定（３０００倍，５視野）し、その結果Ｆ
Ｂ混入率が３％以上のものは、アッセイの対象から除外した。 系をＰＢＳ（−）１０mlで２回洗浄し、０．２５
％トリプシン含有ＰＢＳ（−）を２ml添加して、これを３７℃で３分間インキュベートした。 次いで上皮系細胞と線維芽細胞とのトリプシンに対する反応性の違いを利用して，系から線維芽細胞を除去するために、トリプシンを除去し、再び０．２５％トリプシン含有ＰＢＳ
（−）を２ml添加して、３７℃，２０rpm で５分間振盪した。

【００５２】次いで、細胞のはがれを顕微鏡下で確認した後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を１０ml添加して、５０ml遠心チューブ中でピペッティングを行い、系を１５００rpm で５分間遠心処理を施した。 上清を除去し、ＫＧＭ培地２０mlを添加して、細胞塊がなくなるまでピペッティングを行った。

【００５３】懸濁液をセルストレーナー（100 μm Nalg
ene 社製）で濾過後、５０ml遠沈管に入れて、懸濁液中の生細胞数を血球算定板で算出し、系にＫＧＭ培地を添加して、系の中の細胞濃度が５．０×１０ ⁴ cell/ml になるように調整した。 次いで、０．２ml/well の割合で、９６well-plate（Ｉ型コラーゲンコーティングプレート：ファルコン社製）に播種し（１．０×１０ ⁴ cell
/well ）、細胞がウエルの底に沈むまで約２０分間室温下で放置した。 その後、３７℃，５％ＣＯ ₂で１日間培養を行い、所望するヒト毛包上皮系培養細胞を得た。

【００５４】３． 試験培地の調製 上記調製例１で得たハッサクーン抽出物のメタノールエキス乾燥物の０．２％ＤＭＳＯ溶液を、１０００倍量の改変ＭＣＤＢ１５３培地（クローネティックス社製）に添加した〔抽出物濃度：２．０×１０ ^-4 ％（ＤＭＳＯ
０．１％）〕。

【００５５】これらの対象物質添加培地を０．１％ＤＭ
ＳＯ含有ＫＢＭ培地に添加し、対象物質の濃度を１．０
×１０ ^-8 〜１．０×１０ ^-5 ％（試料１１〜１４）になるように希釈した。 同様に対象物質添加培地を含まない対照試料を調製した。

【００５６】４． 対象物質培地交換 上記Ａ，Ｂにおいてヒト毛包上皮系培養細胞及びラット毛包上皮系培養細胞を調製した９６well-plate中のＫＧ
Ｍ培地を上記Ｃにおいて調製した、対象物質添加培地及びコントロール培地（２００μl/well）と交換して、交換後３７℃，５％ＣＯ ₂で２日間培養した。

【００５７】なお、この培地の交換はウエル内のＫＧＭ
培地を，底面に付着している細胞を傷つけないように留意しつつアスピレーターで抜いて、その後速やかに対象物質添加培地等をウエルの両端から添加することにより行った。

【００５８】５． 細胞増殖の測定：アラマーブルー(ala
mar blue：アラマーバイオサイエンス社製) を培地量（容量）に対して、１／１０量を添加して、３７℃（５
％ＣＯ2 ）で６時間インキュベートした。 インキュベート後、マイクロプレートリーダー（Micro plate reade
r:Bio RAD社製) で５７０nmと５９５nmの吸光度を測定した。 添付の使用説明書に従って、吸光度の測定結果によりアラマーブルーの還元率を算出した。 この還元率は細胞数と相関することから対照および被検体系での細胞増殖率を比較した。

【００５９】６． 結果：測定したハッサクーン抽出物（試料１１〜１４）における、上記細胞増殖促進指標を下記第４表に示す。

【００６０】

【表４】 ──────────────────────────────────── 試 料 増殖促進率（％） 効果 ──────────────────────────────────── 試料１１（１．０×１０ ^-8 ） ５．２±６．２ ^*あり 試料１２（１．０×１０ ^-7 ） １３．８±５．３ ^**あり 試料１３（１．０×１０ ^-6 ） １５．６±３．４ ^**あり 試料１４（１．０×１０ ^-5 ） ２５．３±５．４ ^**あり 対照試料 1 ． ２±２．５ なし ──────────────────────────────────── ＊；有意差ｐ＜０．０５ ＊＊；有意差ｐ＜０．０１

【００６１】表４より明らかなように、本発明のハッサクーン抽出物は、ヒト培養毛包上皮系細胞活性化試験において有意な毛包上皮系細胞増殖促進効果を示した。

【００６２】 実使用試験 本発明試料例１５ ヘアートニック (1) ハッサクーン抽出物（調製例１） 1.0 (2) プロピレングリコール 5.0 (3) ヒアルロン酸ナトリウム 0.01 (4) ７５％エタノール 残余

【００６３】上記処方にて製造したヘアートニックについて実使用でフケ、発毛、脱毛等の症状に対する効果を検討した。 フケ、発毛、脱毛等の症状を呈する１０名の男性（年齢25才〜55才) に１日１〜２回、１〜３mlずつ４ヵ月にわたって投与し、以下に述べる評価基準で、フケ防止効果、発毛促進効果および脱毛防止効果を試験した。 その結果を表３に示す。 の結果を得た。 表-1から明らかなように、このヘアートニックは発毛促進並びにフケ及び脱毛の防止に対して優れた効果を奏する。

【００６４】評価基準 (1)フケ防止効果テスト 無効：治療にもかかわらず、何らの改善もみられないもの。 有効：フケの発生が減少したもの。 著効：フケの発生が止まったもの。

【００６５】(2)発毛効果テスト 無効：治療にもかかわらず、何らの改善もみられないもの。 有効：脱毛部の２／３以上に毛の新生が認められるもの。 著効：脱毛部に毛が生えそろったもの。

【００６６】(3)脱毛効果テスト 無効：治療にもかかわらず、何らの改善もみられないもの。 有効：脱毛の進行が減少したもの。 著効：脱毛が止まったもの。

【００６７】

【表３】 ─────────────────────────────────── 被験者 年齢 フケ 発毛 脱毛 ─────────────────────────────────── １ 42 著効 有効 有効 ２ 30 著効 有効 有効 ３ 47 著効 有効 有効 ４ 39 有効 有効 無効 ５ 44 無効 有効 有効 ６ 29 有効 著効 著効 ７ 25 無効 有効 有効 ８ 55 有効 無効 有効 ９ 34 有効 有効 有効 10 29 無効 有効 著効 ───────────────────────────────────

【００６８】表３から明らかなように、このヘアートニックは、発毛促進、フケ防止および脱毛防止に対して優れた効果を奏する。

【００６９】以下に、種々の剤型の本発明による皮膚外用剤の処方例を実施例として説明する。

【００７０】 実施例１ 乳液 （Ａ相） ハッサクーン抽出物（調製例１） ０．１ ポリオキシエチレン（６０モル）付加硬化ヒマシ油 ２．０ グリセリン １０．０ ジプロピレングリコール １０．０ 1,3-ブチレングリコール ５．０ ポリエチレングリコール１５００ ５．０ （Ｂ相） セチルイソオクタネート １０．０ スクワラン ５．０ ワセリン ２．０ プロピルパラベン ２．０ （Ｃ相） カルボキシビニルポリマー１％水溶液 ３０．０ ヘキサメタリン酸ソーダ ０．０３ イオン交換水 ８．３５ （Ｄ相） イオン交換水 ５．４ （Ｅ相） カセイカリ ０．１２ イオン交換水 ５．０ （製造法）Ａ相、Ｂ相をそれぞれ60℃で加熱溶解し、混合してホモミキサー処理しゲルを作る。 これにＤ相を徐々に添加しホモミキサーで分散する。 次にこれに溶解したＣ相を加え、最後に溶解したＥ相を添加しホモミキサーで乳化してＯ／Ｗ乳液を得た。

【００７１】 実施例２ クリーム （Ａ相） 流動パラフィン ５．０ セトステアリルアルコール ５．５ グリセリルモノステアレート ３．０ ＥＯ（２０モル）−２−オクチルドデシルエーテル ８．０ プロピルパラベン ０．３ 香料 ０．１ （Ｂ相） ハッサクーン抽出物（調製例１） ５．０ グリセリン ８．０ ジプロピレングリコール ２０．０ ポリエチレングリコール４０００ ５．０ ドデシル硫酸ナトリウム ０．１ ヘキサメタリン酸ソーダ ０．００５ イオン交換水 ３９．９９５ （製造法）Ａ相、Ｂ相をそれぞれ加熱溶解して混合し、
ホモミキサーで乳化してクリームを得た。

【００７２】 実施例３ ハッサクーン抽出物（調製例１） １．０ ステアリルジメチルアミンオキシド ０．５ 硬化ヒマシ油エチレンオキシド（40モル）付加物 １．０ ９５％エタノール ５４．０ イオン交換水 残部 （製造法）９５％エタノールにイオン交換水を加え、これに硬化ヒマシ油エチレンオキシド（40モル）付加物およびステアリルジメチルアミンオキシドを加えた後エキス乾燥物を加え、撹拌溶解した。

【００７３】 実施例４ ヘアートニック グリセリン ２．０ Ｌ−メントール ０．１ ハッサクーン抽出物（調製例１） ２．０ ９５％エタノール ５４．０ 香料 ０．５ イオン交換水 残部 （製造法）９５％エタノールにグリセリン、Ｌ−メントール、香料及びエキス乾燥物を加え、撹拌溶解した後、
イオン交換水を加えた。

【００７４】 実施例５ Ｎ−ヤシラウリル−β−アミノプロピオン酸ソーダ ０．２ ハッサクーン抽出物（調製例１） ０．００１ ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム ０．５ 硬化ヒマシ油エチレンオキシド（40モル）付加物 １．０ ９５％エタノール ５４．０ イオン交換水 残部 （製造法）９５％エタノールにイオン交換水を加え、これに硬化ヒマシ油エチレンオキシド（40モル）付加物およびステアリルジメチルアミンオキシド及びＮ−ヤシラウリル−β−アミノプロピオン酸ソーダを加えた後エキス乾燥物を加え、撹拌溶解した。

【００７５】

【発明の効果】以上説明したように、本発明の皮膚外用剤は、優れた脱毛防止効果、発毛促進効果等の養毛作用及びフケ、痒み抑制作用を有するとともに、毛乳頭細胞あるいは毛包上皮系細胞を活性化することによって、毛髪伸長の促進をする等の優れた養毛効果を有するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大田 正弘 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内 (72)発明者 田島 正裕 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株 式会社資生堂第一リサーチセンター内