一种曼氏无针乌贼神经肽及其用途
阅读：1049发布：2020-06-24
专利汇可以提供一种曼氏无针乌贼神经肽及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种曼氏无针乌贼神经肽及其用途，曼氏无针乌贼神经肽GnRH的基因cDNA全序列长432bp，开放阅读框273bp，编码90个 氨 基酸，5′‑UTR 86bp，3′‑UTR 73bp，前体蛋白MW为10.1kDa，等电点pI为7.73。有益效果为：运用分子 生物 学手段分析了曼氏无针乌贼神经肽的基因序列、基因的组织表达特异性，并对其mRNA在乌贼脑组织中的特异表达位点进行了细胞 定位 ，为曼氏无针乌贼的种质资源保护和人工繁育提供一定的理论 基础 ，同时可用于在 鱼类养殖 过程中利用神经肽及其拮抗剂进行生殖调控的用途。，下面是一种曼氏无针乌贼神经肽及其用途专利的具体信息内容。
1.一种曼氏无针乌贼神经肽，其特征在于：所述的曼氏无针乌贼神经肽GnRH的基因cDNA全序列长432bp，开放阅读框（ORF）273bp，编码90个氨基酸，5′-UTR 86bp，3′-UTR
73bp；ORF包括一段长31个氨基酸的信号肽和44个氨基酸的辅助序列，以及12个氨基酸的成熟肽：pQNYHFSNGWHPG；前体蛋白MW为10.1kDa，等电点pI为7.73。
2.根据权利要求1所述的一种曼氏无针乌贼神经肽，其特征在于：所述曼氏无针乌贼神经肽GnRH可参与调控曼氏无针乌贼生殖活动，该调控作用的分子生物学分析步骤包括：神经肽基因克隆和序列分析、神经肽组织特异性表达分析、神经肽脑组织表达定位分析。
3.根据权利要求2所述的一种曼氏无针乌贼神经肽，其特征在于：所述神经肽基因克隆和序列分析步骤为：选取成熟健康的曼氏无针乌贼，用Trizol试剂从曼氏无针乌贼的脑组织中提取总RNA，提取的总RNA经测定其吸光度R值介于1.8-2.0之间，则说明总RNA为有效；
取3μL的RNA液将其点样到1%的琼脂糖凝胶上，在200V、150mA的电泳仪下跑胶15-16分钟，取出胶在UVP紫外凝胶成像仪中分析RNA条带情况，能够看到一条清晰的28S、18S且比例为
1.9-2.1:1；使用反转录试剂盒，利用曼氏无针乌贼脑组织提取的总RNA合成cDNA第一条链；
以曼氏无针乌贼脑组织cDNA作为模板，简并引物GnRH-F和GnRH-R进行进行GnRH基因核心片段的PCR扩增，用1%琼脂糖电泳检测PCR产物，找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化，对纯化后的目标片段进行克隆连接；分别以曼氏无针乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增3′RACE片段、5′RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增3′RACE未知片段，将PCR产物进行切胶回收和克隆连接；使用Lasergene软件对GnRH基因的3′端、5′端和核心片段序列进行拼接，获得曼氏无针乌贼GnRH基因的cDNA全长序列。
4.根据权利要求3所述的一种曼氏无针乌贼神经肽，其特征在于：所述神经肽基因克隆和序列分析步骤过程中，所用到的引物序列为：
GnRH-F CAGACNCAAGCACARAAYTA
GnRH-R TYTCTATCAAAGCYTTTGT
5′-GnRH-outter TTACCACCAGGGTGCCATCC
5′-GnRH-inner TTGCTAAAATGGTAATTCTG
3′-GnRH-outter CACCTGTGCTATTCTTCCCCTCTCTTTC
3′-GnRH-inner TGCATATCCAGGCACAGAATTACCA
M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R CAGGAAACAGCTATGACC
5′RACE Adapter GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG
5′RACE Outer Primer ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA
5′RACE Inner Primer ACUACUACUAGGGGCGTCGA
3′RACE Adapter GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT
3′RACE Outer Primer GCGGATCCGAATTAATACGACT
3′RACE Inner Primer GCGAGCACAGAATTAATACGACT。
5.根据权利要求3所述的一种曼氏无针乌贼神经肽，其特征在于：所述神经肽基因克隆和序列分析步骤过程中，运用Predict Protein和Scratch Protein Predictor在线工具可用来对GnRH基因进行开放阅读框（ORF）预测，以及推测该ORF所编码的氨基酸序列，应用在线分析站点SignalP v3.0对氨基酸序列进行信号肽预测，应用NCBI对氨基酸序列进行Blast分析，应用ClustalW2对GnRH及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析，前体蛋白相对分子质量同等电点pI的估算使用的是Expasy-ProtParam在线分析软件，使用MEGA v5.0软件进行基于NJ法的进化树构建。
6.根据权利要求2所述的一种曼氏无针乌贼神经肽，其特征在于：所述神经肽组织特异性表达分析步骤为：选取处于Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期3个不同发育阶段、体重健康、活力强的曼氏无针乌贼，迅速处死后取出各组织放入RNA保存液中，雄性组织为：脑、视叶、肝、肌肉、精巢、心、鳃，雌性组织为：脑、视叶、肝、肌肉、卵巢、心、鳃、缠卵腺、副缠卵腺，置于-80～-100℃保存备用；用Trizol试剂对曼氏无针乌贼的各组织提取总RNA，使用试剂盒合成不同组织cDNA，将曼氏无针乌贼β-actin基因（JN564496.1）作为内参基因，心脏的基因表达量作为参照标准，使用荧光定量PCR方法测定GnRH基因在不同发育阶段、不同组织中的特异性表达，使用2-△△Ct方法测定不同组织GnRH基因的表达量水平。
7.根据权利要求6所述的一种曼氏无针乌贼神经肽，其特征在于：所述神经肽组织特异性表达分析步骤过程中，所用的引物序列为：
RT-GnRH-F ACTTCCTTTACACTCGTCCCT
RT-GnRH-R AGGGTGCCATCCATTGCTAA
RT-actin-F TGAGAGGGAGATTGTGCGTG
RT-actin-R GAACATAGATTCTGGAGCACGG。
8.根据权利要求2所述的一种曼氏无针乌贼神经肽，其特征在于：所述神经肽脑组织表达定位分析步骤为：以乌贼脑组织cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增反应程序为：94℃
2min；94℃ 20s，64℃ 40s，10个循环；94℃ 20s，62℃退火40s，15个循环；94℃ 20s，60℃
30s，72℃ 30s，10个循环；72℃ 8min；电泳检测产物；将扩增得到的PCR产物进行切胶纯化、酶切、连接、转化和筛选，使用DIG RNA Labeling kit SP6/T7试剂盒制备反义探针与正义探针；对曼氏无针乌贼完整脑组织切片进行原位杂交处理，拍片后封存。
9.能特异性扩增曼氏无针乌贼GnRH基因的引物：
ISH-GnRH-F CCGTCACGTCCATCATCAGGTAAACATC
ISH-GnRH-R CCGGAAGGGAGTGATTTCCTCGTCTAAG。
10.一种曼氏无针乌贼神经肽的应用，其特征在于：所述曼氏无针乌贼神经肽用于在鱼类养殖过程中利用神经肽及其拮抗剂进行生殖调控的用途。
一种曼氏无针乌贼神经肽及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及神经肽技术领域，尤其是涉及一种曼氏无针乌贼神经肽及其用途。技术背景
[0002] 曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)属软体动物(Mollusca)、头足纲(Cephalopoda)、十腕目(Decapoda)、乌贼科(Sepiidae)、无针乌贼属(Sepiella)。曼氏无针乌贼是一年生的中型乌贼，俗名叫墨鱼，生长快，肉质鲜美，是受市场欢迎的海味食品。头足纲，乌贼科。胴部盾形。胴长为胴宽的2倍。胴背具许多近椭圆形的白花斑。肉鳍前狭后宽，位于胴部两侧全缘，仅在末端分离。无柄腕长度一般为4＞3＞1＞2，吸盘4行。雄性左侧第四腕茎化。触腕穗狭柄形，吸盘约20行，小而密。内科椭圆形。记录最大胴长0.19m，最大体重
0.7kg。分布在西北太平洋和北印度洋沿岸海域。主要作业渔场在中国浙江和福建沿岸海域。最高年产量超过8万吨，是世界重要经济种。主要为鲜食作为一种具有较高药用、食用价值的经济头足类，自20世纪80年代以来自然种群数量急剧下降，众多学者对于其资源保护以及生殖发育进行了研究。
0.7kg。分布在西北太平洋和北印度洋沿岸海域。主要作业渔场在中国浙江和福建沿岸海域。最高年产量超过8万吨，是世界重要经济种。主要为鲜食作为一种具有较高药用、食用价值的经济头足类，自20世纪80年代以来自然种群数量急剧下降，众多学者对于其资源保护以及生殖发育进行了研究。
[0003] 神经肽是一类在生物体内主要分布在神经组织对机体有神经激素样作用或者神经元信息传递作用的生物活性多肽，它在串通整个神经系统和身体其他系统的功能方面起到重要作用，诸如生长发育，呼吸调控，体温调节等方面。
发明内容
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种曼氏无针乌贼神经肽，运用分子生物学手段分析了曼氏无针乌贼神经肽的基因序列、基因的组织表达特异性，并对其mRNA在乌贼脑组织中的特异表达位点进行了细胞定位，以及对整个乌贼生殖调控机理，为曼氏无针乌贼的种质资源保护和人工繁育提供一定的理论基础。
[0005] 本发明的目的之二在于提供一种曼氏无针乌贼神经肽的用途，用于在鱼类养殖过程中利用神经肽及其拮抗剂进行生殖调控的用途。
[0006] 本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种曼氏无针乌贼神经肽，曼氏无针乌贼神经肽的基因cDNA全序列长432bp，开放阅读框(ORF)273bp，编码90个氨基酸，5′-UTR 86bp，3′-UTR 73bp；ORF包括一段长31个氨基酸的信号肽和44个氨基酸的辅助序列，以及12个氨基酸的成熟肽：pQNYHFSNGWHPG；前体蛋白MW为10.1kDa，等电点pI为7.73；曼氏无针乌贼神经痛GnRH可参与调控曼氏无针乌贼生殖活动。
[0007] 曼 氏 无 针 乌 贼 神 经 肽 的 基 因 c D N A 全 序 列 为 ：ACTTCCTTTACACTCGTCCCTCGCCTAAGACAAAAGAACACTTCAAATCTCCATCATCAGCTAAACATCTACCAGACAGTGACATCATGTCAACCTCCACAGCCTCGTCCAGCCTGAGAAGAATCCAATTTTTCACCTGTGCTATTCTTCCCCTCTCTTTCTGCATGCATATCCAGGCACAGAATTACCATTTTAGCAATGGATGGCACCCCGGTGGTAAACGAAGTGGACTTCCAGACATGCAGTGTCATTTCAGACCACAAACAAAAGCTACAATCGAGAAACTCTTAGACGAGGAAATCACACGTATAATTACTACATGTACCAATACAGTCAATGACATCGCAGACTTGCAGTAATTTTTCACAGGTCAAGCAAATTCACTGGATATACAACTACCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
[0008] 曼氏无针乌贼神经肽GnRH可参与调控曼氏无针乌贼生殖活动的分子生物学分析步骤包括：神经肽基因克隆和序列分析、神经肽组织特异性表达分析、神经肽脑组织表达定位分析，具体包括以下步骤：神经肽基因克隆和序列分析操作为：
选取成熟健康的曼氏无针乌贼，用Trizol试剂从曼氏无针乌贼的脑组织中提取总RNA，提取的总RNA经测定其吸光度R值介于1.8-2.0之间，则说明总RNA为有效；取3μL的RNA液将其点样到1％的琼脂糖凝胶上，在200V、150mA的电泳仪下跑胶15-16分钟，取出胶在UVP紫外凝胶成像仪中分析RNA条带情况，能够看到一条清晰的28S、18S且比例为1.9-2.1:1；使用反转录试剂盒，利用曼氏无针乌贼脑组织提取的总RNA合成cDNA第一条链；以曼氏无针乌贼脑组织cDNA作为模板，简并引物GnRH-F和GnRH-R进行进行GnRH基因核心片段的PCR扩增，用
1％琼脂糖电泳检测PCR产物，找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化，对纯化后的目标片段进行克隆连接；分别以曼氏无针乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增3′RACE片段、5′RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增3′RACE未知片段，将PCR产物进行切胶回收和克隆连接；使用Lasergene软件对GnRH基因的3′端、5′端和核心片段序列进行拼接，获得曼氏无针乌贼GnRH基因的cDNA全长序列；运用Predict Protein和Scratch Protein Predictor在线工具可用来对GnRH基因进行开放阅读框(ORF)预测，以及推测该ORF所编码的氨基酸序列，应用在线分析站点SignalP v3.0对氨基酸序列进行信号肽预测，应用NCBI对氨基酸序列进行Blast分析，应用ClustalW2对GnRH及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析，前体蛋白相对分子质量同等电点pI的估算使用的是Expasy-ProtParam在线分析软件，使用MEGAv5.0软件进行基于NJ法的进化树构建，重复1000次循环；神经肽基因克隆和序列分析过程中所用到的引物序列如表1所示。
选取成熟健康的曼氏无针乌贼，用Trizol试剂从曼氏无针乌贼的脑组织中提取总RNA，提取的总RNA经测定其吸光度R值介于1.8-2.0之间，则说明总RNA为有效；取3μL的RNA液将其点样到1％的琼脂糖凝胶上，在200V、150mA的电泳仪下跑胶15-16分钟，取出胶在UVP紫外凝胶成像仪中分析RNA条带情况，能够看到一条清晰的28S、18S且比例为1.9-2.1:1；使用反转录试剂盒，利用曼氏无针乌贼脑组织提取的总RNA合成cDNA第一条链；以曼氏无针乌贼脑组织cDNA作为模板，简并引物GnRH-F和GnRH-R进行进行GnRH基因核心片段的PCR扩增，用
1％琼脂糖电泳检测PCR产物，找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化，对纯化后的目标片段进行克隆连接；分别以曼氏无针乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增3′RACE片段、5′RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增3′RACE未知片段，将PCR产物进行切胶回收和克隆连接；使用Lasergene软件对GnRH基因的3′端、5′端和核心片段序列进行拼接，获得曼氏无针乌贼GnRH基因的cDNA全长序列；运用Predict Protein和Scratch Protein Predictor在线工具可用来对GnRH基因进行开放阅读框(ORF)预测，以及推测该ORF所编码的氨基酸序列，应用在线分析站点SignalP v3.0对氨基酸序列进行信号肽预测，应用NCBI对氨基酸序列进行Blast分析，应用ClustalW2对GnRH及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析，前体蛋白相对分子质量同等电点pI的估算使用的是Expasy-ProtParam在线分析软件，使用MEGAv5.0软件进行基于NJ法的进化树构建，重复1000次循环；神经肽基因克隆和序列分析过程中所用到的引物序列如表1所示。
[0009] 表1GnRH基因克隆与序列分析所需引物Primer Name Primer sequence(5′-3′)
GnRH-F CAGACNCAAGCACARAAYTA
GnRH-R TYTCTATCAAAGCYTTTGT
5′-GnRH-outter TTACCACCAGGGTGCCATCC
5′-GnRH-inner TTGCTAAAATGGTAATTCTG
3′-GnRH-outter CACCTGTGCTATTCTTCCCCTCTCTTTC
3′-GnRH-inner TGCATATCCAGGCACAGAATTACCA
M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R CAGGAAACAGCTATGACC
5′RACE Adapter GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG
5′RACE Outer Primer ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA
5′RACE Inner Primer ACUACUACUAGGGGCGTCGA
3′RACE Adapter GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT
3′RACE Outer Primer GCGGATCCGAATTAATACGACT
3′RACE Inner Primer GCGAGCACAGAATTAATACGACT
曼氏无针乌贼神经肽GnRH的基因cDNA全序列长432bp，ORF273bp，编码90个氨基酸，5′-UTR 86bp，3′-UTR 73bp；ORF包括一段长31个氨基酸的信号肽和44个氨基酸的辅助序列，以及12个氨基酸的成熟肽：pQNYHFSNGWHPG；前体蛋白MW为10.1kDa，pI为7.73；通过对前体蛋白氨基酸序列进行信号肽预测分析发现，GnRH前体蛋白的N端含有一段长31个氨基酸的信号肽，GnRH成熟肽序列C端含有一个剪切位点以及一段长44个氨基酸的辅助序列，能结合到成熟肽上，起到稳定作用。GnRH氨基酸序列比对结果显示仅成熟多肽部分比较保守，在进化树分析中与无脊椎动物GnRH聚类为一支。
GnRH-F CAGACNCAAGCACARAAYTA
GnRH-R TYTCTATCAAAGCYTTTGT
5′-GnRH-outter TTACCACCAGGGTGCCATCC
5′-GnRH-inner TTGCTAAAATGGTAATTCTG
3′-GnRH-outter CACCTGTGCTATTCTTCCCCTCTCTTTC
3′-GnRH-inner TGCATATCCAGGCACAGAATTACCA
M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R CAGGAAACAGCTATGACC
5′RACE Adapter GGCCAGGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG
5′RACE Outer Primer ACUACUACUAGGGGCGTCGACGTA
5′RACE Inner Primer ACUACUACUAGGGGCGTCGA
3′RACE Adapter GCGAGCACAGAATTAATATTTTTTTTTTTT
3′RACE Outer Primer GCGGATCCGAATTAATACGACT
3′RACE Inner Primer GCGAGCACAGAATTAATACGACT
曼氏无针乌贼神经肽GnRH的基因cDNA全序列长432bp，ORF273bp，编码90个氨基酸，5′-UTR 86bp，3′-UTR 73bp；ORF包括一段长31个氨基酸的信号肽和44个氨基酸的辅助序列，以及12个氨基酸的成熟肽：pQNYHFSNGWHPG；前体蛋白MW为10.1kDa，pI为7.73；通过对前体蛋白氨基酸序列进行信号肽预测分析发现，GnRH前体蛋白的N端含有一段长31个氨基酸的信号肽，GnRH成熟肽序列C端含有一个剪切位点以及一段长44个氨基酸的辅助序列，能结合到成熟肽上，起到稳定作用。GnRH氨基酸序列比对结果显示仅成熟多肽部分比较保守，在进化树分析中与无脊椎动物GnRH聚类为一支。
[0010] 从NCBI数据库中获取其他物种的GnRH基因序列，通过ClustalW2在线分析工具对曼氏无针乌贼GnRH氨基酸序列同其他物种的同源序列进行比对。对选取的同源序列通过MEGA5.0软件进行进化树的构建。同源比对结果显示，曼氏无针乌贼GnRH与虎斑乌贼相似度为90％，与剑尖枪乌贼和真蛸GnRH相似度分别为86％和71％，和太平洋牡蛎、虾夷扇贝、海蜗牛相似度分别为47％、41％、31％，序列中成熟肽部分非常保守。
[0011] 神经肽组织特异性表达分析操作为：选取处于Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期3个不同发育阶段、体重健康、活力强的曼氏无针乌贼，迅速处死后取出各组织放入RNA保存液中，雄性组织为：脑、视叶、肝、肌肉、精巢、心、鳃，雌性组织为：脑、视叶、肝、肌肉、卵巢、心、鳃、缠卵腺、副缠卵腺，置于-80～-100℃保存备用；用Trizol试剂对曼氏无针乌贼的各组织提取总RNA，使用试剂盒合成不同组织cDNA，将曼氏无针乌贼β-actin基因(JN564496.1)作为内参基因，心脏的基因表达量作为参照标准，使用荧光定量PCR方法测定GnRH基因在不同发育阶段、不同组织中的特异性表达，使用2-△△Ct方法测定不同组织GnRH基因的表达量水平，所用引物如表2所示。
[0012] 表2GnRH基因荧光定量PCR所用引物引物名称 序列
RT-GnRH-F ACTTCCTTTACACTCGTCCCT
RT-GnRH-R AGGGTGCCATCCATTGCTAA
RT-actin-F TGAGAGGGAGATTGTGCGTG
RT-actin-R GAACATAGATTCTGGAGCACGG
荧光定量PCR检测曼氏无针乌贼GnRH基因的mRNA表达水平结果显示，GnRH基因在三个阶段的乌贼脑组织中均有显著表达。不同是的，在Ⅲ期，GnRH在视叶中微量表达，在Ⅴ期，GnRH在雌性乌贼卵巢、缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。然而在成体剑尖枪乌贼中，半定量PCR被用来检测不同组织的GnRH表达水平，但结果显示仅在脑组织中扩增出PCR产物，雌性乌贼的卵巢与其他组织一样，均没有GnRH的表达。成体曼氏无针乌贼和真蛸也仅在雌性乌贼的脑和卵巢中有表达。
RT-GnRH-F ACTTCCTTTACACTCGTCCCT
RT-GnRH-R AGGGTGCCATCCATTGCTAA
RT-actin-F TGAGAGGGAGATTGTGCGTG
RT-actin-R GAACATAGATTCTGGAGCACGG
荧光定量PCR检测曼氏无针乌贼GnRH基因的mRNA表达水平结果显示，GnRH基因在三个阶段的乌贼脑组织中均有显著表达。不同是的，在Ⅲ期，GnRH在视叶中微量表达，在Ⅴ期，GnRH在雌性乌贼卵巢、缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。然而在成体剑尖枪乌贼中，半定量PCR被用来检测不同组织的GnRH表达水平，但结果显示仅在脑组织中扩增出PCR产物，雌性乌贼的卵巢与其他组织一样，均没有GnRH的表达。成体曼氏无针乌贼和真蛸也仅在雌性乌贼的脑和卵巢中有表达。
[0013] 神经肽脑组织表达定位分析操作为：以乌贼脑组织cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增反应程序为：94℃2min；94℃20s，64℃
40s，10个循环；94℃20s，62℃退火40s，15个循环；94℃20s，60℃30s，72℃30s，10个循环；72℃8min；电泳检测产物；将扩增得到的PCR产物进行切胶纯化、酶切、连接、转化和筛选，使用DIG RNALabeling kit SP6/T7试剂盒制备反义探针与正义探针；对曼氏无针乌贼完整脑组织切片进行原位杂交处理，拍片后封存。能特异性扩增曼氏无针乌贼GnRH基因的引物：ISH-GnRH-F：CCGTCACGTCCATCATCAGGTAAACATC、ISH-GnRH-R：CCGGAAGGGAGTGATTTCCTCGTCTAAG。
40s，10个循环；94℃20s，62℃退火40s，15个循环；94℃20s，60℃30s，72℃30s，10个循环；72℃8min；电泳检测产物；将扩增得到的PCR产物进行切胶纯化、酶切、连接、转化和筛选，使用DIG RNALabeling kit SP6/T7试剂盒制备反义探针与正义探针；对曼氏无针乌贼完整脑组织切片进行原位杂交处理，拍片后封存。能特异性扩增曼氏无针乌贼GnRH基因的引物：ISH-GnRH-F：CCGTCACGTCCATCATCAGGTAAACATC、ISH-GnRH-R：CCGGAAGGGAGTGATTTCCTCGTCTAAG。
[0014] 作为优选，曼氏无针乌贼完整脑组织石蜡切片的制备步骤为：1)固定：将乌贼脑组织浸泡在4％多聚甲醛中，4℃固定16h；PBS中漂洗5min；
2)脱水：将脑组织分别在盛有70％、80％、90％、100％乙醇梯度的染色缸中脱水各1h，期间可更换一次试剂；
3)透明：将脑组织转移至二甲苯：乙醇＝1:1中浸泡处理30min，然后浸入有机溶剂二甲苯中30min，使组织透明；
4)浸蜡：先将脑组织转移至石蜡：二甲苯＝1:1中1h，后转移至石蜡中1h；
5)包埋：事先预热金属盒，将已充分浸蜡的脑组织放入金属盒进行石蜡包埋；
6)修块：将包埋好的蜡块进行修块；
7)切片：将修好的蜡块置于石蜡切片机上切片，纵切，切片厚度为7μm；
8)展片和烘片：42℃展片机上展片5min；50℃烘片机上烘片30min；可以将烘干的的石蜡切片置于-20℃冰箱保存备用；
9)脱蜡：将切好的脑组织切片置于二甲苯脱蜡30min，期间更换一次试剂；
10)复水：将脑组织分别在盛有100％、90％、80％、70％乙醇梯度的染色缸中复水各
10min；PBS中漂洗10min，期间更换一次试剂；
作为优选，原位杂交步骤为：
1)前处理：将脑组织石蜡切片浸入4％多聚甲醛固定10min；PBS漂洗10min；0.1MPBS/甘氨酸中5min；0.3％Triton X-100/PBS中15min；PBS漂洗，10min；
2)通透处理：37℃，蛋白酶K溶液中处理20min；0.1M氨基酸/PBS冲洗1min；PBS漂洗
10min；0.1M三乙醇胺(含0.25％醋酸铵)中10min；最后用盐溶液2×SSC漂洗10min；
3)预杂交和杂交：45℃预杂交液孵育1h；46℃杂交液孵育6h；
4)后处理：杂交液孵育后，4×SSC漂洗1min；37℃，2×SSC漂洗30min；1×SSC漂洗
30min；
5)抗体杂交：Blocking缓冲液室温封闭1h；AP标记抗DIG抗体(1:500)，37℃条件下，孵育1h；之后用PBS冲洗1min；
6)显色：加入显色底物NBT/BCIP，暗处显色30min-24h；DEPC水冲洗3min，最后用甘油封片，两天后拍照，保存。
2)脱水：将脑组织分别在盛有70％、80％、90％、100％乙醇梯度的染色缸中脱水各1h，期间可更换一次试剂；
3)透明：将脑组织转移至二甲苯：乙醇＝1:1中浸泡处理30min，然后浸入有机溶剂二甲苯中30min，使组织透明；
4)浸蜡：先将脑组织转移至石蜡：二甲苯＝1:1中1h，后转移至石蜡中1h；
5)包埋：事先预热金属盒，将已充分浸蜡的脑组织放入金属盒进行石蜡包埋；
6)修块：将包埋好的蜡块进行修块；
7)切片：将修好的蜡块置于石蜡切片机上切片，纵切，切片厚度为7μm；
8)展片和烘片：42℃展片机上展片5min；50℃烘片机上烘片30min；可以将烘干的的石蜡切片置于-20℃冰箱保存备用；
9)脱蜡：将切好的脑组织切片置于二甲苯脱蜡30min，期间更换一次试剂；
10)复水：将脑组织分别在盛有100％、90％、80％、70％乙醇梯度的染色缸中复水各
10min；PBS中漂洗10min，期间更换一次试剂；
作为优选，原位杂交步骤为：
1)前处理：将脑组织石蜡切片浸入4％多聚甲醛固定10min；PBS漂洗10min；0.1MPBS/甘氨酸中5min；0.3％Triton X-100/PBS中15min；PBS漂洗，10min；
2)通透处理：37℃，蛋白酶K溶液中处理20min；0.1M氨基酸/PBS冲洗1min；PBS漂洗
10min；0.1M三乙醇胺(含0.25％醋酸铵)中10min；最后用盐溶液2×SSC漂洗10min；
3)预杂交和杂交：45℃预杂交液孵育1h；46℃杂交液孵育6h；
4)后处理：杂交液孵育后，4×SSC漂洗1min；37℃，2×SSC漂洗30min；1×SSC漂洗
30min；
5)抗体杂交：Blocking缓冲液室温封闭1h；AP标记抗DIG抗体(1:500)，37℃条件下，孵育1h；之后用PBS冲洗1min；
6)显色：加入显色底物NBT/BCIP，暗处显色30min-24h；DEPC水冲洗3min，最后用甘油封片，两天后拍照，保存。
[0015] 通过原位杂交方法进行曼氏无针乌贼GnRH基因mRNA在脑组织中的表达位点的细胞定位，如图6所示，在乌贼脑组织的多个区域均能观察到清晰的GnRH基因mRNA阳性杂交信号，而用正义探针进行杂交的图6A中不能观察到信号。在食道上神经团，脑亚脚叶和亚垂直叶(6B)处的阳性杂交信号最为强烈，整个亚垂直叶边缘的髓质区域也均能观察到明显的杂交信号。在亚垂直叶上方的垂直叶(6B)也能观察到阳性信号，但信号较弱。清晰的阳性信号在前基叶(6C)和后基叶(6D)同样能够观察到。在下额叶(6C)中也能观察到经反义探针杂交染色而成的杂交信号，但上额叶(6C)则没有观察到。食道下神经团的各个功能小叶：巨细胞叶、外套内脏叶、前色素细胞、足叶和腕叶(6E)中杂交信号着色很深、信号非常强烈。在视叶(6F)髓质区中亦能观察到清晰的杂交阳性信号，而皮质区则没有观测到阳性信号。
[0016] 通过对曼氏无针乌贼脑组织进行GnRH基因mRNA的原位杂交，发现在乌贼脑组织3个主要组成部中，GnRH基因均有表达。在食道上神经团的脑亚脚叶、垂直叶、亚垂直叶、前基叶、后基叶和下额叶中能够观察到不同强度的阳性杂交信号。食道下神经团的巨细胞叶、外套内脏叶、前色素细胞叶、足叶和腕神经叶，以及视叶中也均能观察到有效的阳性杂交信号。
[0017] 一种曼氏无针乌贼神经肽的用途，在水产养殖过程中，GnRH类似物LHRH-A或sGnRH-A和多巴胺拮抗物DOM能够作为催产剂诱导鱼类进行人工繁育，在曼氏无针乌贼人工繁育过程中，利用神经肽及其拮抗剂可以较为有效地进行生殖调控。
[0018] 与现有技术相比，本发明的优点在于：1)运用分子生物学手段分析了曼氏无针乌贼神经肽的基因序列、基因的组织表达特异性，并对其mRNA在乌贼脑组织中的特异表达位点进行了细胞定位，研究数据可为以后深入研究头足类生殖调控机制提供一定的理论依据；
2)GnRH氨基酸序列比对结果显示仅成熟多肽部分比较保守，在进化树分析中与无脊椎动物GnRH聚类为一支，通过荧光定量PCR方法检测出神经肽GnRH基因在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期的乌贼脑组织中均有显著表达，原位杂交结果显示GnRH基因在乌贼脑的食道上神经团中的SVL、SPL、ABL、PBL和下额叶(IFL)，食道下神经团的MAG、PVL、ACL、足叶(PL)和腕神经叶BL，以及视叶中有表达，根据以上数据推测GnRH可能参与调控曼氏无针乌贼生殖活动。
附图说明
2)GnRH氨基酸序列比对结果显示仅成熟多肽部分比较保守，在进化树分析中与无脊椎动物GnRH聚类为一支，通过荧光定量PCR方法检测出神经肽GnRH基因在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期的乌贼脑组织中均有显著表达，原位杂交结果显示GnRH基因在乌贼脑的食道上神经团中的SVL、SPL、ABL、PBL和下额叶(IFL)，食道下神经团的MAG、PVL、ACL、足叶(PL)和腕神经叶BL，以及视叶中有表达，根据以上数据推测GnRH可能参与调控曼氏无针乌贼生殖活动。
附图说明
[0019] 图1是本发明中GnRH基因PCR电泳结果示意图；图2是本发明中5′RACE扩增电泳条带示意图；
图3是本发明中3′RACE扩增电泳条带示意图；
图4是本发明中GnRH基因cDNA全长示意图；
图5是本发明中GnRH不同组织表达特异性示意图；
图6是本发明中GnRH基因mRNA的脑组织原位杂交示意图。
图3是本发明中3′RACE扩增电泳条带示意图；
图4是本发明中GnRH基因cDNA全长示意图；
图5是本发明中GnRH不同组织表达特异性示意图；
图6是本发明中GnRH基因mRNA的脑组织原位杂交示意图。
[0020] 附图标记：图4中，预测的氨基酸序列显示在碱基序列下方，推测的信号肽序列用黑色下划线标出，预测的GnRH成熟肽用黑色双下划线标出，基本剪切位点用黑色双虚线标出，C-端酰胺化的甘氨酸用圆圈标示，辅助序列用黑色虚线划出，预测的起始密码子为ATG、终止密码子为TAA；图6中A：正义探针对照；B：亚垂直叶；C：下额叶；D：后基叶；E：食道下神经团；F：视叶；ABL：前基叶；ASEM：前食道下神经团；MSEM：中食道下神经团；PBL：后基叶；PSEM：后食道下神经团；SVL：亚垂直叶；黑色尖头指示阳性区域，黑色标尺表示长度1000μm。
具体实施方式
[0021] 下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：
一种曼氏无针乌贼神经肽，曼氏无针乌贼神经肽GnRH的基因cDNA全序列长432bp，ORF
273bp，编码90个氨基酸，5′-UTR 86bp，3′-UTR 73bp。ORF包括一段长31个氨基酸的信号肽和44个氨基酸的辅助序列，以及12个氨基酸的成熟肽：pQNYHFSNGWHPG；前体蛋白MW为
10.1kDa，等电点pI为7.73；GnRH氨基酸序列比对结果显示仅成熟多肽部分比较保守，在进化树分析中与无脊椎动物GnRH聚类为一支。通过荧光定量PCR方法检测出神经肽GnRH基因在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期的乌贼脑组织中均有显著表达。不同是的，Ⅲ期时，GnRH在视叶中微量表达，Ⅴ期时，GnRH在雌性乌贼卵巢、缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。原位杂交结果显示GnRH基因在乌贼脑的食道上神经团中的SVL、SPL、ABL、PBL和下额叶(IFL)，食道下神经团的MAG、PVL、ACL、足叶(PL)和腕神经叶BL，以及视叶中有表达。根据以上数据说明GnRH可参与调控曼氏无针乌贼生殖活动。
一种曼氏无针乌贼神经肽，曼氏无针乌贼神经肽GnRH的基因cDNA全序列长432bp，ORF
273bp，编码90个氨基酸，5′-UTR 86bp，3′-UTR 73bp。ORF包括一段长31个氨基酸的信号肽和44个氨基酸的辅助序列，以及12个氨基酸的成熟肽：pQNYHFSNGWHPG；前体蛋白MW为
10.1kDa，等电点pI为7.73；GnRH氨基酸序列比对结果显示仅成熟多肽部分比较保守，在进化树分析中与无脊椎动物GnRH聚类为一支。通过荧光定量PCR方法检测出神经肽GnRH基因在Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期的乌贼脑组织中均有显著表达。不同是的，Ⅲ期时，GnRH在视叶中微量表达，Ⅴ期时，GnRH在雌性乌贼卵巢、缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。原位杂交结果显示GnRH基因在乌贼脑的食道上神经团中的SVL、SPL、ABL、PBL和下额叶(IFL)，食道下神经团的MAG、PVL、ACL、足叶(PL)和腕神经叶BL，以及视叶中有表达。根据以上数据说明GnRH可参与调控曼氏无针乌贼生殖活动。
[0022] 曼氏无针乌贼神经肽GnRH参与调控曼氏无针乌贼生殖活动机理的分析方法包括：A.准备材料：
(1)DEPC水：向蓝口试剂瓶中加入500mL双蒸水和500μLDEPC，37℃摇床过夜后备用；
(2)DEPC处理水：DEPC水121℃高压灭菌锅中处理30min，冷却后4℃保存备用。75％乙醇：75mL100％乙醇中加入25mLDEPC处理水，-20℃保存备用；
(3)LB液体培养基：将浓度为0.5％的酵母提取物加入去离子水中，再加入1％的NaCl以及1％的蛋白胨，pH调至中性，进行高温高压灭菌，时间为30min，完成后保存于4℃冰箱备用；
(4)LB固体培养基：去离子水中加入终浓度为0.5％的酵母提取物，1％的NaCl，1％的蛋白胨，2％的琼脂粉，pH调至中性，进行高温高压灭菌，时间为30min，取出后摇匀倒入灭过菌的培养皿，完成后保存于4℃冰箱备用。
(1)DEPC水：向蓝口试剂瓶中加入500mL双蒸水和500μLDEPC，37℃摇床过夜后备用；
(2)DEPC处理水：DEPC水121℃高压灭菌锅中处理30min，冷却后4℃保存备用。75％乙醇：75mL100％乙醇中加入25mLDEPC处理水，-20℃保存备用；
(3)LB液体培养基：将浓度为0.5％的酵母提取物加入去离子水中，再加入1％的NaCl以及1％的蛋白胨，pH调至中性，进行高温高压灭菌，时间为30min，完成后保存于4℃冰箱备用；
(4)LB固体培养基：去离子水中加入终浓度为0.5％的酵母提取物，1％的NaCl，1％的蛋白胨，2％的琼脂粉，pH调至中性，进行高温高压灭菌，时间为30min，取出后摇匀倒入灭过菌的培养皿，完成后保存于4℃冰箱备用。
[0023] B.提取总RNA：(1)选取性成熟、活力较强的曼氏无针乌贼个体置于冰上，低温条件下麻醉致死并取乌贼脑组织，小心剥离神经组织周围的结蹄组织，将乌贼脑组织置于保存液中，并于-80℃超低温冷冻保存；
(2)取干净的1.5mL离心管(RNAase free)，用无RNAase枪头加入500μLTrizol(4℃)，用DEPC处理过的镊子夹取30mg脑组织样品浸入Trizol，使用电动匀浆器匀浆30s，补加500μLTrizol；
(3)轻轻摇晃离心管，使组织充分溶解到Trizol中，室温静置5分钟；
(4)在离心管中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置5分钟；
(5)4℃、12000rpm离心15min；
(6)离心后，离心管内分为3层，取最上层的上清液于新离心管中；
(7)向离心管中加500μL的异丙醇，摇匀，室温静置10分钟；
(8)离心机中4℃、12000rpm离心10分钟；
(9)离心后，除去上清液，保留沉淀；
(10)加入1mL的75％的乙醇，用枪头吹吸沉淀；
(11)离心机中4℃、7500rpm离心5分钟，用枪头吸除液体部分，保留沉淀；
(12)室温静置约20分钟待RNA呈半干的透明状态，用DEPC水溶解后备用。
(2)取干净的1.5mL离心管(RNAase free)，用无RNAase枪头加入500μLTrizol(4℃)，用DEPC处理过的镊子夹取30mg脑组织样品浸入Trizol，使用电动匀浆器匀浆30s，补加500μLTrizol；
(3)轻轻摇晃离心管，使组织充分溶解到Trizol中，室温静置5分钟；
(4)在离心管中加入200μL的氯仿，剧烈震荡15s后，室温静置5分钟；
(5)4℃、12000rpm离心15min；
(6)离心后，离心管内分为3层，取最上层的上清液于新离心管中；
(7)向离心管中加500μL的异丙醇，摇匀，室温静置10分钟；
(8)离心机中4℃、12000rpm离心10分钟；
(9)离心后，除去上清液，保留沉淀；
(10)加入1mL的75％的乙醇，用枪头吹吸沉淀；
(11)离心机中4℃、7500rpm离心5分钟，用枪头吸除液体部分，保留沉淀；
(12)室温静置约20分钟待RNA呈半干的透明状态，用DEPC水溶解后备用。
[0024] 步骤(1)中的保存液中的物质及其含量为：二甲基亚砜2g/L、乙酰胺1.6g/L、1,2-丙二醇1g/L、PEG-800 0.5g/L、色甘酸钠0.15g/L、还原性谷胱甘肽0.02g/L、卵磷脂6.0g/L、苯甲酸盐5g/L、硝酸钠12.5g/L、丙三醇16g/L、青霉素150IU/mL、链霉素110IU/mL、120mg/L的赤藓糖、23mg/L的(S)-乳酸乙酯，以磷酸盐缓冲液调整pH为7.3，余量为双蒸水；以保存液冷冻保存曼氏无针乌贼脑组织，可实现高效的冷冻保存脑组织，有效防止乌贼脑组织液化、脑细胞自溶，其生物学特性能得以高效保存，冷冻保存的脑组织可直接用于组织分析，有助于RNA的高效率、完整性提取；特定配比的赤藓糖与(S)-乳酸乙酯具有协同增益作用，该增益作用可以使(S)-乳酸乙酯与脑细胞细胞膜中的糖类发生交联缔结，而且(S)-乳酸乙酯的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水层”，这样就可以保护(S)-乳酸乙酯与糖类的交联缔结位置不直接暴露在周围环境中，该交联缔结可改变细胞膜表面的微环境，可以降低水分子扩散至细胞外，从而防止脑组织失水，降低脑组织细胞皱缩；同时，赤藓糖可以在蛋白质之间产生位阻，能更好地抑制冻藏时冰晶的形成，控制与缓冲冷冻过程中脑组织pH值的变化，从而保证了脑组织的结构、功能的完整性与冷冻时脑组织的稳定性，延长脑组织活性，保持乌贼神经肽的生殖调控活性，生殖调控饲料添加剂能有效发挥促进细胞生长、分化、增殖等生殖调控作用；在可满足组织分析、DNA提取需求的条件下，添加赤藓糖、(S)-乳酸乙酯的保存液相较于未添加赤藓糖、(S)-乳酸乙酯的保存液，其保存期限可以延长40％以上，说明二者对于乌贼脑组织的保存、保质效果具有重要的作用。
[0025] 提取的总RNA必须要测定其吸光度R值，一般R值在1.8-2.0之间说明提取出的RNA为有效的总RNA，可以继续为后续使用，如果小于1.8则表明提取出的RNA含有较多的杂质，会影响准确性，所以不能使用；如果R值大于2.0则说明提取出来的RNA已经降解，也不能使用；测定完其吸光度值之后吸光度值在1.8-2.0之间，说明提取的该RNA可能有效，继续进行电泳检测，取3μL的RNA液将其点样到1％的琼脂糖凝胶上，在200v，150mA的电泳仪下跑胶约15分钟，取出胶在UVP紫外凝胶成像仪中分析RNA条带情况，如果能够看到一条清晰的28S、
18S且比例约为2:1，则说明提取出的RNA效果很好可以满足进一步操作的需求。
18S且比例约为2:1，则说明提取出的RNA效果很好可以满足进一步操作的需求。
[0026] C.合成cDNA第一链：使用Takara公司生产的M-MLV(Rnase H-)反转录试剂盒，利用曼氏无针乌贼脑组织提取的总RNA进行cDNA第一条链合成，具体操作步骤如下：
(1)0.2mL离心管中加入以下反应体系：
总RNA 5.0μL
Oligo DT 1.0μL
(2)混匀反应体系，离心，将离心管置于PCR仪内，70℃孵育10min后立刻冰上静置2min；
(3)在上述离心管中加入以下反应体系：
(4)混匀反应体系，离心，将离心管置于PCR仪内，42℃孵育1h，70℃孵育15min后，迅速冰上静置15min；
(5)将合成的cDNA置于-20℃冰箱保存备用。
(1)0.2mL离心管中加入以下反应体系：
总RNA 5.0μL
Oligo DT 1.0μL
(2)混匀反应体系，离心，将离心管置于PCR仪内，70℃孵育10min后立刻冰上静置2min；
(3)在上述离心管中加入以下反应体系：
(4)混匀反应体系，离心，将离心管置于PCR仪内，42℃孵育1h，70℃孵育15min后，迅速冰上静置15min；
(5)将合成的cDNA置于-20℃冰箱保存备用。
[0027] D.神经肽基因克隆和序列分析：(1)引物设计：
根据NCBI数据库中获得已报道的软体动物物种GnRH基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，合成了多对用来克隆曼氏无针乌贼GnRH基因核心序列片段的简并引物。5′RACE和
3′RACE引物是通过已获得的核心片段序列，使用primer 5软件搜索设计；克隆所需引物为：
(2)获取核心序列：
1)PCR扩增：以曼氏无针乌贼脑组织cDNA作为模板，简并引物GnRH-F和GnRH-R进行GnRH基因核心片段的PCR扩增，反应体系如下：
加样完成之后，PCR扩增程序如下：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃12min。
根据NCBI数据库中获得已报道的软体动物物种GnRH基因序列，通过分析氨基酸序列的保守区，合成了多对用来克隆曼氏无针乌贼GnRH基因核心序列片段的简并引物。5′RACE和
3′RACE引物是通过已获得的核心片段序列，使用primer 5软件搜索设计；克隆所需引物为：
(2)获取核心序列：
1)PCR扩增：以曼氏无针乌贼脑组织cDNA作为模板，简并引物GnRH-F和GnRH-R进行GnRH基因核心片段的PCR扩增，反应体系如下：
加样完成之后，PCR扩增程序如下：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，35个循环；72℃12min。
[0028] 2)PCR产物的纯化、连接：用1％琼脂糖电泳检测PCR产物，找到符合预期大小的条带，用凝胶回收试剂盒进行割胶回收纯化，具体操作步骤如下：①跑胶，利用凝胶成像系统观察目的条带，找到条带后用干净的刀片将其切下，放入RNAase free的1.5mL离心管中，称其重量，按每克胶加1mLSolutionⅠ的计算量，向装有胶块的离心管中加入SolutionⅠ，56℃水浴10min，每2-3min震荡一次帮助加速溶解；
②将含有琼脂糖胶的SolutionⅠ混合液转移至离心柱中，10000rpm离心2min，若混合液过多，可分多次进行；
③收集②中的溶液，并将其移入吸附柱AC中，相同离心率条件下，离心1min，弃废液，后将离心柱放回收集管中；
④向吸附柱中加入700μL漂洗液，10000rpm离心1min，弃废液，将离心柱放回到收集管中；
⑤为尽可能地去除漂洗液，再次加入500μL漂洗液至吸附柱中，相同离心率条件下，离心1min，倒废液，将离心柱放回管中，离心1min；
⑥换一个干净的收集管，在吸附膜的中间部位加30μLDEPC处理水，12000rpm条件下离心2min，收集溶液；
⑦取4μL回收的DNA检测，5μL用于连接，其余-20℃保存。
②将含有琼脂糖胶的SolutionⅠ混合液转移至离心柱中，10000rpm离心2min，若混合液过多，可分多次进行；
③收集②中的溶液，并将其移入吸附柱AC中，相同离心率条件下，离心1min，弃废液，后将离心柱放回收集管中；
④向吸附柱中加入700μL漂洗液，10000rpm离心1min，弃废液，将离心柱放回到收集管中；
⑤为尽可能地去除漂洗液，再次加入500μL漂洗液至吸附柱中，相同离心率条件下，离心1min，倒废液，将离心柱放回管中，离心1min；
⑥换一个干净的收集管，在吸附膜的中间部位加30μLDEPC处理水，12000rpm条件下离心2min，收集溶液；
⑦取4μL回收的DNA检测，5μL用于连接，其余-20℃保存。
[0029] 3)目的片段的克隆：①PCR产物与pUcm-T载体16℃连接过夜，之后与DH5α感受态混匀，冰上静置30min，42℃处理90s，迅速冰浴静置5min；
②加入1mLLB液体培养基，将含有菌液的离心管置于恒温摇床中，37℃200rpm摇床1h；
③将离心管从恒温摇床中取出，并置于离心机中，室温4000rpm离心5min，除去1mL上清液，枪头吹吸重悬菌体；
④涂板，培养箱中37℃培养16h；
⑤蓝白斑筛选，重新接种菌落，载体引物M13-F/M13-R进行克隆的阳性检测。筛选克隆的PCR体系如下：
菌液送至上海生工测序。
②加入1mLLB液体培养基，将含有菌液的离心管置于恒温摇床中，37℃200rpm摇床1h；
③将离心管从恒温摇床中取出，并置于离心机中，室温4000rpm离心5min，除去1mL上清液，枪头吹吸重悬菌体；
④涂板，培养箱中37℃培养16h；
⑤蓝白斑筛选，重新接种菌落，载体引物M13-F/M13-R进行克隆的阳性检测。筛选克隆的PCR体系如下：
菌液送至上海生工测序。
[0030] 由于核心片段长度仅100bp左右，不适合进行切胶纯化，因此将PCR产物直接与pUcm-T载体进行连接，并转化入DH5α感受态细菌中。培养、筛选后测序。
[0031] (3)获取3′端cDNA序列：1)3′端RACE模板cDNA制备：利用目的基因已知序列设计用于GnRH基因3′端RACE扩增的特异性引物3′-GnRH-outter和3′-GnRH-inner(见表1)。以3′-GnRH-outter和Clontech公司TM
生产的SMART RACE cDNAAmplification kit试剂盒中自带的3′RACE Outer Primer和3′-GnRH-inner为引物。
生产的SMART RACE cDNAAmplification kit试剂盒中自带的3′RACE Outer Primer和3′-GnRH-inner为引物。
[0033] ①0.2mL离心管中加入以下反应体系：脑组织总RNA 1μg
3′RACE Adapter 1μL
DEPC处理水 补至5μL
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，70℃孵育2min后，快速移至冰上静置
2min。
3′RACE Adapter 1μL
DEPC处理水 补至5μL
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，70℃孵育2min后，快速移至冰上静置
2min。
[0034] ②向第一步1)中的反应液中加入以下反应体系：5×第一链缓冲液 2.0μL
dNTP(10mM) 1.0μL
DTT 1.0μL
PowerScript Reverse Transcriptase 1.0μL
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，42℃孵育1.5h后，70℃孵育7min，加入100μL灭菌水稀释产物。将稀释后的模板cDNA置于-20℃保存。
dNTP(10mM) 1.0μL
DTT 1.0μL
PowerScript Reverse Transcriptase 1.0μL
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，42℃孵育1.5h后，70℃孵育7min，加入100μL灭菌水稀释产物。将稀释后的模板cDNA置于-20℃保存。
[0035] 2)3′端RACE的PCR扩增利用巢式PCR方法，进行两轮PCR反应扩增出GnRH基因3′端RACE片段序列。反应体系如下：
①巢式PCR第一轮反应。0.2mL离心管中加入以下反应体系：
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为：94℃2min；94℃5s，66℃
10s，72℃3min，20个循环；72℃延伸5min。
①巢式PCR第一轮反应。0.2mL离心管中加入以下反应体系：
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为：94℃2min；94℃5s，66℃
10s，72℃3min，20个循环；72℃延伸5min。
[0036] ②将第一轮1)中扩增产物用作此轮模板。第二轮反应体系如下：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为：94℃2min；94℃5s，65℃
12s，72℃3min，20个循环；72℃6min。电泳检测PCR产物。
12s，72℃3min，20个循环；72℃6min。电泳检测PCR产物。
[0037] ③将PCR产物进行切胶回收和克隆连接，并将阳性克隆送至上海生工测序。
[0038] (4)获取5′端cDNA序列：1)5′端RACE模板cDNA制备：利用目的基因已知序列设计用于GnRH基因5′端RACE扩增的特异性引物5′-GnRH-outter和5′-GnRH-inner(表1)。以5′-GnRH-outter/5′-GnRH-inner和Clontech公司生产的SMARTTM RACE cDNAAmplification kit试剂盒中自带的5′RACE Outer Primer、5′RACE Inner Primer为引物，进行GnRH基因5′端RACE片段扩增。
[0039] 以曼氏无针乌贼脑组织总RNA为模板，获得扩增5′RACE片段所需的模板cDNA后，利用巢式PCR来扩增5′RACE片段。操作根据试剂盒提供说明书进行。
[0040] ①0.2mL离心管中加入以下反应体系：脑组织总RNA 1μg
5′RACE Adapter 1μL
DEPC处理水 补至15.5μL
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，70℃孵育10min后，快速移至冰上静置2min。
5′RACE Adapter 1μL
DEPC处理水 补至15.5μL
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，70℃孵育10min后，快速移至冰上静置2min。
[0041] ②向上一步1)中的反应液中加入以下反应体系：混匀反应液，轻微离心，将离心管置于PCR内，42℃孵育1min；加入1μL的SperScriptTMⅡRT，42℃孵育50min后，70℃孵育15min；加入1μL的RNase mix，37℃孵育30min。
[0042] ③纯化cDNA：加入120μL的SolutionⅠ至cDNA中，将混合液移至离心柱中，在10000rpm离心率条件下，离心30s，将离心柱取中，吸出液体；加入350μL的SolutionⅡ，
12000rpm离心20s，除上清，重复2次；70％乙醇洗涤2次；12000rpm离心60s，除乙醇；更换离心管，向离心柱中加入50μL灭菌水，相同离心率条件下，离心60s，便可获得纯化产物。
12000rpm离心20s，除上清，重复2次；70％乙醇洗涤2次；12000rpm离心60s，除乙醇；更换离心管，向离心柱中加入50μL灭菌水，相同离心率条件下，离心60s，便可获得纯化产物。
[0043] ④加尾反应，反应体系如下：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，94℃孵育3min后，迅速冰上静置
1min；加入1μL的TdT；37℃孵育10min，65℃热激TdT 10min；加入100μL灭菌水稀释产物。将稀释后的模板cDNA置于-20℃保存。
1min；加入1μL的TdT；37℃孵育10min，65℃热激TdT 10min；加入100μL灭菌水稀释产物。将稀释后的模板cDNA置于-20℃保存。
[0044] 2)5′端RACE的PCR扩增①巢式PCR第一轮反应。0.2mL离心管中加入以下反应体系：
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为：94℃2min；94℃30s，62℃35s，72℃45s，32个循环；72℃8min。
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为：94℃2min；94℃30s，62℃35s，72℃45s，32个循环；72℃8min。
[0045] ②将第一轮1)中扩增产物用作此轮模板。第二轮反应体系如下：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸8min。电泳检测PCR产物。
[0046] ③将PCR产物进行切胶回收和克隆连接，并将阳性克隆送至上海生工测序。
[0047] (5)序列信息分析方法：使用Lasergene软件对GnRH的3′端、5′端和核心片段序列进行拼接，获得曼氏无针乌贼GnRH基因的cDNA全长序列。Predict Protein、Scratch ProteinPredictor等在线工具可用来对GnRH基因进行开放阅读框(ORF)预测，以及推测该ORF所编码的氨基酸序列。应用在线分析站点SignalP v3.0对氨基酸序列进行信号肽预测。应用NCBI对氨基酸序列进行Blast(blastx and blastn)分析，应用ClustalW2对GnRH及其同源基因的氨基酸序列进行比对分析。GnRH前体蛋白相对分子质量同等电点的估算使用的是Expasy-ProtParam在线分析软件。使用MEGA v5.0软件进行基于NJ法的进化树构建，重复1000次循环。
[0048] 在NCBI中找到已发表同源序列比对，利用相对保守区域设计扩增核心序列的简并引物并以曼氏无针乌贼脑组织cDNA为模板，进行PCR扩增，获得片段。
[0049] 用已测得的曼氏无针乌贼FMRF的cDNA核心序列设计特异性引物来扩增5′端和3′端非编码区序列，扩增产物经过琼脂凝胶电泳后在成像系统中的条带如图2和图3，其中5′RACE产物为289bp条带，3′RACE产物为267bp条带。
[0050] 曼氏无针乌贼GnRH基因cDNA序列全长432bp，开放阅读框273bp，编码90个氨基酸，5′非编码区86bp，3′非编码区73bp。前体蛋白预测相对分子质量10.1kDa，等电点pI 7.73。
根据其他3种已知的头足类GnRH序列推测，曼氏无针乌贼成熟肽产物同其他2种已知的头足类一样为十二肽：pQNYHFSNGWHPG(如图4所示)。通过对前体蛋白氨基酸序列进行信号肽预测分析发现，GnRH前体蛋白的N端含有一段长31个氨基酸的信号肽，GnRH成熟肽序列C端含有一个剪切位点以及一段长44个氨基酸的辅助序列，能结合到成熟肽上，起到稳定作用。
根据其他3种已知的头足类GnRH序列推测，曼氏无针乌贼成熟肽产物同其他2种已知的头足类一样为十二肽：pQNYHFSNGWHPG(如图4所示)。通过对前体蛋白氨基酸序列进行信号肽预测分析发现，GnRH前体蛋白的N端含有一段长31个氨基酸的信号肽，GnRH成熟肽序列C端含有一个剪切位点以及一段长44个氨基酸的辅助序列，能结合到成熟肽上，起到稳定作用。
[0051] 从NCBI数据库中获取其他物种的GnRH基因序列，通过ClustalW2在线分析工具对曼氏无针乌贼GnRH氨基酸序列同其他物种的同源序列进行比对。对选取的同源序列通过MEGA5.0软件进行进化树的构建。同源比对结果显示，曼氏无针乌贼GnRH与虎斑乌贼相似度为90％，与剑尖枪乌贼和真蛸GnRH相似度分别为86％和71％，和太平洋牡蛎、虾夷扇贝、海蜗牛相似度分别为47％、41％、31％，序列中成熟肽部分非常保守。
[0052] E.神经肽组织特异性表达分析：按照卵子发生和卵巢发育阶段划分，取处于Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期3个不同发育阶段、体重健康、活力强的曼氏无针乌贼，体重为500-1000g，快速杀死乌贼，立即取出各种组织放入RNA保存液中，-80℃保存备用；组织包括，雄性乌贼：脑、视叶、肝、肌肉、精巢、心、鳃；雌性乌贼：
脑、视叶、肝、肌肉、卵巢、心、鳃、缠卵腺、副缠卵腺。
脑、视叶、肝、肌肉、卵巢、心、鳃、缠卵腺、副缠卵腺。
[0053] (1)引物设计：以曼氏无针乌贼GnRH基因cDNA序列全长为基础，使用Primer 5.0软件及Primer 3.0在线引物搜索工具，设计GnRH基因荧光定量PCR操作所需引物。引物进行梯度PCR筛选并测序，最终确定该引物能特异扩增曼氏无针乌贼GnRH基因。GnRH基因荧光定量PCR操作中使用的引物为：(2)荧光定量PCR：使用相对定量方法分别检测三个不同发育阶段(Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期，按卵子发生和卵巢发育阶段划分)雌、雄性别曼氏无针乌贼GnRH基因不同组织的表达特异性。
将曼氏无针乌贼β-actin基因(JN564496.1)作为内参基因，心脏的基因表达量作为参照标准。荧光定量PCR操作按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行。
将曼氏无针乌贼β-actin基因(JN564496.1)作为内参基因，心脏的基因表达量作为参照标准。荧光定量PCR操作按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行。
[0054] 将八连管置于冰上，并加入以下反应体系：混匀反应体系，轻微离心，将八连管置于ABI 7500Real Time PCR仪内，设定的程序为：
94℃30s；94℃5s，60℃30s，40个循环；55-95℃逐渐升温2min。进行3次重复。
94℃30s；94℃5s，60℃30s，40个循环；55-95℃逐渐升温2min。进行3次重复。
[0055] (3)数据处理：标准曲线，Ct值等由ABI 7500Real Time PCR仪自带的ABI 7500Real time PCR System Detection软件自动完成。使用2-△△Ct方法测定不同组织LFRFamide基因的表达量水平。使用SPSS 18.0统计软件的单因素方差分析(one way ANOVA)功能进行方差分析，Duncan法多重比较检验组间差异的显著性，P＜0.05检查差异显著。使用Excel 2010软件，进行数据的统计和分析，使用软件Sigma Plot 12.5来制作相关柱形图。
[0056] 取雌、雄性曼氏无针乌贼各组织，雄性乌贼：脑、视叶、肝、肌肉、精巢、心、鳃；雌性乌贼：脑、视叶、肝、肌肉、卵巢、心、鳃、缠卵腺、副缠卵腺组织检测GnRH基因表达，如图5所示。荧光定量PCR检测曼氏无针乌贼GnRH基因的mRNA表达水平结果显示，GnRH基因在三个阶段的乌贼脑组织中均有显著表达。不同是的，在Ⅲ期，GnRH在视叶中微量表达，在Ⅴ期，GnRH在雌性乌贼卵巢、缠卵腺和副缠卵腺中微量表达。然而在成体剑尖枪乌贼中，半定量PCR被用来检测不同组织的GnRH表达水平，但结果显示仅在脑组织中扩增出PCR产物，雌性乌贼的卵巢与其他组织一样，均没有GnRH的表达。成体曼氏无针乌贼和真蛸也仅在雌性乌贼的脑和卵巢中有表达。
[0057] F.神经肽脑组织表达定位分析：(1)配制试剂：
1)4％多聚甲醛：4g多聚甲醛加入到100mL去离子水中室温静置2天待多聚甲醛完全溶解后4℃保存，2周内使用；
2)0.2M EDTA：灭菌水中按终浓度为0.2M加入EDTA，调节pH至8.0；
3)PBS缓冲液：灭菌水中加入0.2g氯化钾，0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸二氢钠，8g氯化钠，调节pH至7.4，定容至1000mL；
4)0.1M甘氨酸/PBS溶液的配制：7.5g甘氨酸加入到1LPBS溶液中，摇匀；
5)20×SSC缓冲液的配制：氯化钠175.2g，柠檬酸钠88.2g加入去离子水800mL，pH调至中性，定容至1000mL；
(2)引物设计：
以曼氏无针乌贼GnRH基因cDNA序列全长为基础，使用Primer 5.0软件及Primer 3.0在线引物搜索工具，设计GnRH原位杂交所需引物。设计引物时，在GnRH基因cDNA序列中筛选限制性内切酶剪切位点，将剪切位点碱基添加到前后引物F/R的5′端。引物进行梯度PCR筛选并测序，最终确定能特异扩增曼氏无针乌贼GnRH基因的引物：ISH-GnRH-F：
CCGTCACGTCCATCATCAGGTAAACATC和ISH-GnRH-R：CCGGAAGGGAGTGATTTCCTCGTCTAAG。
1)4％多聚甲醛：4g多聚甲醛加入到100mL去离子水中室温静置2天待多聚甲醛完全溶解后4℃保存，2周内使用；
2)0.2M EDTA：灭菌水中按终浓度为0.2M加入EDTA，调节pH至8.0；
3)PBS缓冲液：灭菌水中加入0.2g氯化钾，0.27g磷酸二氢钾，1.42g磷酸二氢钠，8g氯化钠，调节pH至7.4，定容至1000mL；
4)0.1M甘氨酸/PBS溶液的配制：7.5g甘氨酸加入到1LPBS溶液中，摇匀；
5)20×SSC缓冲液的配制：氯化钠175.2g，柠檬酸钠88.2g加入去离子水800mL，pH调至中性，定容至1000mL；
(2)引物设计：
以曼氏无针乌贼GnRH基因cDNA序列全长为基础，使用Primer 5.0软件及Primer 3.0在线引物搜索工具，设计GnRH原位杂交所需引物。设计引物时，在GnRH基因cDNA序列中筛选限制性内切酶剪切位点，将剪切位点碱基添加到前后引物F/R的5′端。引物进行梯度PCR筛选并测序，最终确定能特异扩增曼氏无针乌贼GnRH基因的引物：ISH-GnRH-F：
CCGTCACGTCCATCATCAGGTAAACATC和ISH-GnRH-R：CCGGAAGGGAGTGATTTCCTCGTCTAAG。
[0058] (3)制备切片：进行曼氏无针乌贼完整脑组织石蜡切片的制备：
1)固定：将乌贼脑组织浸泡在4％多聚甲醛中，4℃固定16h；PBS中漂洗5min；
2)脱水：将脑组织分别在盛有70％、80％、90％、100％乙醇梯度的染色缸中脱水各1h，期间可更换一次试剂；
3)透明：将脑组织转移至二甲苯：乙醇＝1:1中浸泡处理30min，然后浸入有机溶剂二甲苯中30min，使组织透明；
4)浸蜡：先将脑组织转移至石蜡：二甲苯＝1:1中1h，后转移至石蜡中1h；
5)包埋：事先预热金属盒，将已充分浸蜡的脑组织放入金属盒进行石蜡包埋；
6)修块：将包埋好的蜡块进行修块；
7)切片：将修好的蜡块置于石蜡切片机上切片，纵切，切片厚度为7μm；
8)展片和烘片：42℃展片机上展片5min；50℃烘片机上烘片30min；可以将烘干的石蜡切片置于-20℃冰箱保存备用；
9)脱蜡：将切好的脑组织切片置于二甲苯脱蜡30min，期间更换一次试剂；
10)复水：将脑组织分别在盛有100％、90％、80％、70％乙醇梯度的染色缸中复水各
10min；PBS中漂洗10min，期间更换一次试剂。
1)固定：将乌贼脑组织浸泡在4％多聚甲醛中，4℃固定16h；PBS中漂洗5min；
2)脱水：将脑组织分别在盛有70％、80％、90％、100％乙醇梯度的染色缸中脱水各1h，期间可更换一次试剂；
3)透明：将脑组织转移至二甲苯：乙醇＝1:1中浸泡处理30min，然后浸入有机溶剂二甲苯中30min，使组织透明；
4)浸蜡：先将脑组织转移至石蜡：二甲苯＝1:1中1h，后转移至石蜡中1h；
5)包埋：事先预热金属盒，将已充分浸蜡的脑组织放入金属盒进行石蜡包埋；
6)修块：将包埋好的蜡块进行修块；
7)切片：将修好的蜡块置于石蜡切片机上切片，纵切，切片厚度为7μm；
8)展片和烘片：42℃展片机上展片5min；50℃烘片机上烘片30min；可以将烘干的石蜡切片置于-20℃冰箱保存备用；
9)脱蜡：将切好的脑组织切片置于二甲苯脱蜡30min，期间更换一次试剂；
10)复水：将脑组织分别在盛有100％、90％、80％、70％乙醇梯度的染色缸中复水各
10min；PBS中漂洗10min，期间更换一次试剂。
[0059] (4)原位杂交：1)杂交探针模板的制备：根据GnRH的cDNA序列设计引物ISH-GnRH-F、ISH-GnRH-R，以乌贼脑组织cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物用作原位杂交探针模板的制备。在探针的制备过程中使用的是限制性内切酶AccⅠ和HindⅢ。
[0060] 探针模板的PCR扩增，反应体系如下：混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，反应程序为：94℃2min；94℃20s，64℃40s，10个循环；94℃20s，62℃退火40s，15个循环；94℃20s，60℃30s，72℃30s，10个循环；
72℃8min。电泳检测产物。
72℃8min。电泳检测产物。
[0061] 2)目的片段和载体的酶切、连接、转化和筛选：①扩增得到的PCR产物，进行切胶纯化；
②纯化后使用限制性内切酶AccⅠ和HindⅢ在0.2mL离心管中进行双酶切，酶切体系如下：
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，37℃孵育8h；
③pSPT18亦采用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，酶切体系同上；
④PCR产物和pSPT18酶切产物使用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit(50)试剂盒再次进行切胶纯化后，使用Takara公司生产的SolutionⅠ进行连接，连接体系如下：
GnRH序列片段 2.0μL
pSPT18 3.0μL
灭菌水 5.0μL
⑤转化至DH5α感受态后，涂板，单个挑取合适的菌落，菌体扩大培养。使用D6942-01型Plasmid Mini Kit I(100)质粒提取试剂盒抽提质粒。提取的质粒保存于-20℃冰箱，并送至上海生工进行测序，检测插入序列的正确性；
⑥将正确的重组质粒进行EcoRⅠ单酶切。单酶切反应体系如下：
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，37℃孵育5h后，用酚/氯仿重新抽提产物，并用乙醇沉淀，将沉淀重溶于15μL DEPC处理水中，取2μL电泳检测。
②纯化后使用限制性内切酶AccⅠ和HindⅢ在0.2mL离心管中进行双酶切，酶切体系如下：
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，37℃孵育8h；
③pSPT18亦采用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，酶切体系同上；
④PCR产物和pSPT18酶切产物使用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit(50)试剂盒再次进行切胶纯化后，使用Takara公司生产的SolutionⅠ进行连接，连接体系如下：
GnRH序列片段 2.0μL
pSPT18 3.0μL
灭菌水 5.0μL
⑤转化至DH5α感受态后，涂板，单个挑取合适的菌落，菌体扩大培养。使用D6942-01型Plasmid Mini Kit I(100)质粒提取试剂盒抽提质粒。提取的质粒保存于-20℃冰箱，并送至上海生工进行测序，检测插入序列的正确性；
⑥将正确的重组质粒进行EcoRⅠ单酶切。单酶切反应体系如下：
混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，37℃孵育5h后，用酚/氯仿重新抽提产物，并用乙醇沉淀，将沉淀重溶于15μL DEPC处理水中，取2μL电泳检测。
[0062] 3)探针的制备：使用DIG RNA Labeling kit SP6/T7试剂盒制备反义探针：①0.2mL离心管中加入以下反应体系：
②混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，37℃孵育2h，加入2.0μL EDTA终止反应；
③向离心管中加入75μL预冷无水乙醇，混匀反应液，-20℃静置3h；
④4℃，12,000rpm/min离心15min，除去上清液；
⑤加入100μL70％乙醇，枪头吹吸，4℃，7,500rpm/min离心5min，除去上清，加入50μLDEPC处理水，取2μL用于电泳检测后，保存至-20℃冰箱备用；
⑥正义探针制备体系如下：
反义探针的制备步骤同正义探针。
②混匀反应体系，少许离心，将离心管置于PCR仪内，37℃孵育2h，加入2.0μL EDTA终止反应；
③向离心管中加入75μL预冷无水乙醇，混匀反应液，-20℃静置3h；
④4℃，12,000rpm/min离心15min，除去上清液；
⑤加入100μL70％乙醇，枪头吹吸，4℃，7,500rpm/min离心5min，除去上清，加入50μLDEPC处理水，取2μL用于电泳检测后，保存至-20℃冰箱备用；
⑥正义探针制备体系如下：
反义探针的制备步骤同正义探针。
[0063] 4)原位杂交：①前处理：将脑组织石蜡切片浸入4％多聚甲醛固定10min；PBS漂洗10min；0.1M PBS/甘氨酸中5min；0.3％Triton X-100/PBS中15min；PBS漂洗，10min；
②通透处理：37℃，蛋白酶K溶液中处理20min；0.1M氨基酸/PBS冲洗1min；PBS漂洗
10min；0.1M三乙醇胺(含0.25％醋酸铵)中10min；最后用盐溶液2×SSC漂洗10min；
③预杂交和杂交：45℃预杂交液孵育1h；46℃杂交液孵育6h；
④后处理：杂交液孵育后，4×SSC漂洗1min；37℃，2×SSC漂洗30min；1×SSC漂洗
30min；
⑤抗体杂交：Blocking缓冲液室温封闭1h；AP标记抗DIG抗体(1:500)，37℃条件下，孵育1h；之后用PBS冲洗1min；
⑥显色：加入显色底物NBT/BCIP，暗处显色30min-24h；DEPC水冲洗3min，最后用甘油封片，两天后拍照，保存。
②通透处理：37℃，蛋白酶K溶液中处理20min；0.1M氨基酸/PBS冲洗1min；PBS漂洗
10min；0.1M三乙醇胺(含0.25％醋酸铵)中10min；最后用盐溶液2×SSC漂洗10min；
③预杂交和杂交：45℃预杂交液孵育1h；46℃杂交液孵育6h；
④后处理：杂交液孵育后，4×SSC漂洗1min；37℃，2×SSC漂洗30min；1×SSC漂洗
30min；
⑤抗体杂交：Blocking缓冲液室温封闭1h；AP标记抗DIG抗体(1:500)，37℃条件下，孵育1h；之后用PBS冲洗1min；
⑥显色：加入显色底物NBT/BCIP，暗处显色30min-24h；DEPC水冲洗3min，最后用甘油封片，两天后拍照，保存。
[0064] 通过原位杂交方法进行曼氏无针乌贼GnRH基因mRNA在脑组织中的表达位点的细胞定位。如图6显示，在乌贼脑组织的多个区域均能观察到清晰的GnRH基因mRNA阳性杂交信号，而用正义探针进行杂交的图6A中不能观察到信号。在食道上神经团，脑亚脚叶和亚垂直叶(6B)处的阳性杂交信号最为强烈，整个亚垂直叶边缘的髓质区域也均能观察到明显的杂交信号。在亚垂直叶上方的垂直叶(6B)也能观察到阳性信号，但信号较弱。清晰的阳性信号在前基叶(6C)和后基叶(6D)同样能够观察到。在下额叶(6C)中也能观察到经反义探针杂交染色而成的杂交信号，但上额叶(6C)则没有观察到。食道下神经团的各个功能小叶：巨细胞叶、外套内脏叶、前色素细胞、足叶和腕叶(6E)中杂交信号着色很深、信号非常强烈。在视叶(6F)髓质区中亦能观察到清晰的杂交阳性信号，而皮质区则没有观测到阳性信号。
[0065] 通过对曼氏无针乌贼脑组织进行GnRH基因mRNA的原位杂交，发现在乌贼脑组织3个主要组成部中，GnRH基因均有表达。在食道上神经团的脑亚脚叶、垂直叶、亚垂直叶、前基叶、后基叶和下额叶中能够观察到不同强度的阳性杂交信号。食道下神经团的巨细胞叶、外套内脏叶、前色素细胞叶、足叶和腕神经叶，以及视叶中也均能观察到有效的阳性杂交信号。
[0066] 本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
[0067] 以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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