유자, 유근피 및 함초 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물

유자, 유근피 및 함초 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물{Skin external composition containing Citron Extract, Ulmus Davidiana root Extract, and Salicornia herbacea Extract}

본 발명은 유자 추출물, 유근피 추출물 및 함초 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 인체 세포에 존재하는 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase2, HAS2)의 유전자 발현을 증가시켜 인체의 히알루론산 생성 작용을 활성화시키고, 버시칸(versican)의 합성을 촉진하며, 버시칸 분해를 담당하는 MMP-12의 생성을 억제함으로써 세포외 기질의 구조를 견고히 하여 피부 탄력 증가 및 피부 보습 효과가 우수한 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

느릅나무 뿌리의 껍질인 유근피(ULMUS DAVIDIANA)와 관련하여 종래의 연구들은 면역억제제나 식용 음료 등에 대한 사항이었으며, 대한민국 등록특허 제10-0439939호에서는 유근피 추출물을 함유하는 주름개선효과, 콜라겐 합성 촉진효과 그리고 보습효과가 우수한 화장료 조성물을 제시하고 있으나 유근피 추출물을 단독 사용하는 경우에는 그 효과가 미비하며, 저분자 및 고분자 히알루론산과 유근피로부터 분리된 다당체 추출물을 함유하는 노화방지용 조성물 역시 본 발명과 대비하여 그 효과가 미비하다.

이에, 본 발명자들은 세포 배양 상태에서의 실시간 DNA 연쇄 중합 반응 어세이, ELISA를 수행하여 유자추출물, 유근피추출물, 함초추출물 및 이들의 복합 추출물이 히알루론산 합성 효소 2 (HAS2) 유전자의 발현을 증가시키고 히알루론산의 합성을 증가시키고, 또한 히알루론산, 콜라젠 다발과 결합하여 세포외기질 구조를 강화하는 버시칸 유전자의 발현을 증가시키며, 버시칸의 분해를 야기하는 MMP-12 유전자의 감소를 유도하는 효과를 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 유자추출물, 유근피추출물, 함초추출물 또는 이들의 복합 추출물을 유효성분으로 함유하여 히알루론산 생성을 촉진하고 세포외기질 성분의 구조를 견고히 하여 노화로 인한 피부 탄력 저하를 억제하는 히알루론산 생성촉진용 외용제 또는 피부 보습 증진 및 노화 방지용 조성물을 제공한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 유자추출물, 유근피추출물, 함초추출물 또는 이들의 복합성분을 유효성분으로 함유하는 피부 보습 및 피부 노화 방지용 피부 외용제 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 유효성분으로 사용되는 유자(citron)는 유자나무( Citrus Junos )의 과실로, 유자나무는 쌍떡잎식물 쥐손이풀목 운향과의 상록관으로 바닷가나 민가부근에서 자란다. 중국 원산이며 남쪽에서 과수로 심는다. 높이 약 4m이다. 가지에 뾰족한 가시가 있다. 잎은 어긋나고 달걀 모양 긴 타원형이며 가장자리에 둔한 톱니가 있고 잎자루에 날개가 있다. 꽃은 양성화이며 5～6월에 흰색으로 피는데, 잎겨드랑이에 1개씩 달린다. 꽃받침조각과 꽃잎은 5개씩이고 수술은 20개가 통처럼 합쳐지거나 5개로 나누어진다. 열매는 장과로서 편구형이며 지름 4～7cm이고 9～10월에 익는다. 빛깔은 밝은 노란색이며 겉이 울퉁불퉁하고 향기가 있다. 번식은 종자나 접붙이기 등으로 한다. 열매인 유자는 부드럽고 즙이 많지만 신맛이 강하고 향기가 있으므로 요리에 다용하고, 익지 않은 것은 한방과 민간에서 건위·건담에 약용한다. 또한 유자를 설탕으로 재워 차로 마시면 추위를 잘 이길수 있는 것으로 알려져 있어 옛날에는 추위를 이기기 위해 동지에 유자를 목욕물에 넣어 목욕을 했다고 한다.

본 발명의 유효성분으로 사용되는 유근피는 느릅나무의 뿌리 껍질을 한방약재로 통칭하는 이름이다. 느릅나무는 쌍떡잎식물 쐐기풀목 느릅나무과의 낙엽활엽 교목으로 춘유(春楡) 또는 가유(家楡)라고도 하는데, 높이는 20m, 지름은 60cm이며, 나무 껍질은 회갈색이고, 작은 가지에 적갈색의 짧은 털이 있다. 목재는 건축재·기구재·선박재·세공재·땔감 등으로 쓰인다. 느릅나무의 뿌리 껍질을 유근피 혹은 유백피라 하여 한방에서 약재로 사용하는데, 그 맛은 달고 성질은 평하다. 붓기, 소변 불리, 변비, 기침, 옹종, 단독, 젖앓이 등에 쓰인다

본 발명에 사용되는 함초는 퉁퉁마디(Salicornia herbacea)의 한방학적 약재이름으로, 퉁퉁마디는 석죽목 명아주과에 속하는 식물로, 높이 10~30cm 정도로 길쭉하게 자라다가 가지가 마주나게 갈라진다. 줄기가 처음에는 짙은 녹색이나 노란빛을 띠다가 가을이 되면 붉은 색으로 변하며 작은 선인장처럼 퉁퉁한 다육질이며 비대하다. 잎은 퇴화하여 거의 보이지 않고 막질의 작은 비늘조각이 있다. 8~9월 가지의 위쪽 마디에서 꽃이 3개씩 핀다. 화피는 다육질로 통통하고 1~2개의 수술과 2개의 암술대가 있다. 열매는 포과로 화피에 싸이며 검은색의 종자가 있다. 바닷물이 드나드는 갯벌 근처나 내륙 염분지에서 무리지어 자라는 1년생 초본이다. 한방학적으로는 몸 안에 쌓인 독소와 숙변을 없애고, 암, 자궁근종, 축농증, 고혈압, 저혈압, 요통, 당뇨병, 기관지천식, 갑상선 기능저하, 갑상선 기능항진, 피부병, 관절염 등 갖가지 난치병에 탁월한 치료효과를 지니고 있다고 알려져 있다.

본 발명에 사용되는 유자추출물, 유근피추출물 및 함초추출물은 상업적으로 구입하거나 통상 사용되는 제조 방법에 의해서 제조될 수 있으며, 그 제조방법이 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있다.

상기 추출물을 제조하는 방법으로는 열수 추출, 초임계 추출, 아임계 추출 등에 의할 수 있으며, 바람직하게는 초고압 추출에 의한다.

본 발명에 사용되는 유자추출물, 유근피추출물 및 함초추출물은 각 한약재를 물 또는 유기용매로 추출물을 수득할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 80% 에탄올을 사용할 수 있다. 또한 유기용매와 물과의 혼합용매를 사용할 수도 있으며, 바람직하게는 1:1 로 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 유자추출물, 유근피추출물 및 함초추출물로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~20 중량% 로 함유하는 것이 바람직하다. 상기 복합추출물의 함량이 0.0001중량% 미만이면 상기 추출물에 의한 히알루론산 생성 증가, 버시칸 생성 촉진, MMP-12 생성 억제 효과 등을 얻을 수 없고, 20 중량%를 초과하면 함량 증가에 비해 효과의 증가가 크지 않기 때문에 비효율적이기 때문이다.

본 발명에 의한 조성물은 상기 추출물을 단독으로 사용할 때보다 2 종 이상을 혼합하여 사용할 때 그 효과가 더 우수하다. 바람직하게는 유자추출물과 유근피추출물 1:1의 중량비로 혼합한 유자추출물과 유근피추출물의 복합추추출물을 0.0001~20 중량% 로 사용할 수 있으나, 특별하게 한정하지 않고 제형 내에서 적절한 비율로 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 유자추출물과 유근피추출물의 혼합추출물에 함초추출물을 혼합하여 사용할 때 그 효과가 더 우수하며, 바람직하게는 유자추출물과 유근피추출물, 함초추출물을 1:1:1의 중량비로 혼합하여 사용할 수 있으나, 특별하게 한정하지 않고 제형 내에서 적절한 비율로 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤 또는 피부 점착타입의 화장료 제형을 가질 수 있으며, 또한 로션, 연고, 젤, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피투여형의 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물은 HAS2 유전자의 발현을 증가시켜 히알루론산의 합성을 증가시킨다. 또한, 버시칸 유전자의 발현을 증가시켜 버시칸의 합성을 촉진시킬 뿐만 아니라 MMP-12 유전자의 발현을 감소시켜 버시칸의 분해를 담당하는 MMP-12의 생성을 억제한다. 따라서, 본 발명은 히알루론산의 생성을 촉진하고 세포외기질 성분의 구조를 견고히 하여 노화로 인한 피부 탄력 저하를 억제시키고 피부 보습을 증진시키는 효과를 가진다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 단일 성분이 아닌 유자추출물과 유근피 추출물을 복합 함유하여 인체 세포에 존재하는 히알루론산 합성효소의 유전자 발현을 현저히 증가시킴으로써 인체의 히알루론산 생성 작용을 활성화시키는 히알루론산 생성촉진제로서의 효과를 가지고 동시에 세포외기질 구조를 견고히 하는 버시칸의 생성을 촉진하며, 버시칸의 분해를 담당하는 MMP-12의 생성을 억제하는 효과를 가지므로 피부 건조증 및 피부 노화 방지를 위해 이용될 수 있다.

도 1은 유자추출물, 유근피 추출물, 함초 추출물을 HaCaT 세포에 처리한 후 mRNA수준에서의 히알루론산 합성효소의 발현을 나타낸 그래프이다.
도 2는 유자추출물, 유근피 추출물, 함초 추출물을 HaCaT 세포에 처리한 후 mRNA수준에서의 버시칸 유전자의 발현을 나타낸 그래프이다.
도 3은 유자추출물, 유근피 추출물, 함초 추출물을 HaCaT 세포에 처리한 후 mRNA수준에서의 UV에 의한 MMP-12 유전자의 발현을 나타낸 그래프이다.
도 4는 유자추출물, 유근피 추출물, 함초 추출물을 HaCaT 세포에 처리한 후 히알루론산의 양을 ELISA 방법으로 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 좀 더 상세히 설명하며, 본 발명이 이들 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

[제조예 1] 유자 추출물의 제조

유자 10g 을 정제수 90 L를 용매로 하여 초고압장치로 1500기압에서 30℃이하의 저온을 유지하면서 3시간 추출하였다. 그 다음 원심분리(9000rpm, 15℃, 30min)로 이물질을 제거 후, 정제수, 부틸렌글라이콜, 페녹시에탄올 등의 희석용매를 사용하여 10배로 희석하여 유자 추출물을 제조하였다.

[제조예 2] 유근피 추출물의 제조

유근피 100g 을 정제수 1000L 를 용매로 하여 초고압장치로 1500기압에서 30℃이하의 저온을 유지하면서 3시간 추출하였다. 그 다음 원심분리(9000rpm, 15℃, 30min)로 이물질을 제거 후 여과포로 여과하고, 정제수, 부틸렌글라이콜, 페녹시에탄올 등의 희석용매를 사용하여 10배로 희석하여 유근피 추출물을 제조하였다.

[제조예 3] 함초 추출물의 제조

함초 100g 을 정제수 1000L 를 용매로 하여 초고압장치로 1500기압에서 30℃이하의 저온을 유지하면서 3시간 추출하였다. 그 다음 원심분리(9000rpm, 15℃, 30min)로 이물질을 제거 후 여과포로 여과하고, 정제수, 부틸렌글라이콜, 페녹시에탄올 등의 희석용매를 사용하여 10배로 희석하여 유근피 추출물을 제조하였다.

[시험예 1] 세포주 및 세포배양

인체 각질형성 세포주 (human keratinocyte)인 HaCaT 세포(상품명: Human keratinocyte cell line, 판매처: cell lines service)를 10% 우혈청 (fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 37℃, 5% CO ₂ 배양기로 18 시간 동안 배양하였다.

[시험예 2] 유자, 유근피, 함초 추출물 처리에 의한 HaCaT 세포에서의 HAS2, 버시칸의 발현 증가

본 발명의 조성물에 의한 히알루론산 및 버시칸의 합성촉진 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 추출물을 처리하여 세포에서의 히알루론산 합성효소인 HAS2 유전자 및 버시칸 유전자의 발현 양상을 mRNA 양에 의해 측정하였다.

단계 1. 세포주에 추출물 처리

상기 시험예 1에서 배양된 세포주에 트립신 처리하여 단일세포 현탁액을 만들고, T75 플라스크에 세포 1x10 ⁶ 개의 밀도로 분주하여, 37℃, 5% CO ₂ 배양기로 24시간 동안 배양하였다.

상기 분주하여 배양된 세포를 디메틸설폭시드(Dimethylsulfoxide;DMSO)를 처리한 배지(비교예 1), 상기 제조예 1~3의 추출물들을 디메틸설폭시드에 녹인 상태로 유자추출물(비교예 2), 유근피추출물(비교예 3), 함초추출물(비교예 4)을 각각 10ppm씩 처리한 배지, 상기 제조예 1,2의 추출물들을 디메틸설폭시드에 녹인 상태로 유자추출물 및 유근피추출물 1:1 을 혼합하여 총 5ppm 의 복합추출물을 처리한 배지(실시예 1), 유자추출물, 유근피추출물 및 함초추출물 1:1:1 을 혼합하여 5 ppm 의 복합추출물을 처리한 배지(실시예 2)에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

단계 2. 정량적인 역전사 PCR 을 통한 HAS2 , 버시칸 유전자의 mRNA 합성 증가 확인

상기 세포를 회수하여 냉각된 4℃인산완충용액(PBS)으로 세척하고, TRIzol™ 시약 (Life Technologies, Inc.) 1 ml을 첨가하여 총 RNA를 추출하여 정량적인 실시간 DNA 연쇄중합반응을 수행하였다. 실시간 DNA 연쇄중합반응 수행을 위한 HAS2, 버시칸, MMP-12의 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

상기 프라이머는 SCI급 논문들을 토대로 제작하였다.

상기 추출된 총 RNA 1μg을 50mM 트리스-HCl(Tris-HCl, pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl ₂ , 0.1M DTT, 10mM dNTP 및 40 유닛/μl RNase 저해제가 함유된 역전사 반응 완충액 25μl에 넣고, 0.5μg/μl 올리고(dT) ₁₆ 의 프라이머와 200 유닛 수퍼스크립트 II[SuperScript II, GiboBRL]의 역전사 중합효소를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시킨 후, 역전사 반응 용액 2.5μl를 엠플리택(AmpliTaq) DNA 중합효소[0.04U; Perkin Elmer, Shelton, CT], 50mM 트리스(pH 8.3), 0.25mg/ml 우혈청알부민, 3mM MgCl ₂ , 0.25mM dNTPs, SYBR 그린 I의 1/50,000 희석액[Molecular Probes, Eugene, OR]이 함유된 PCR 반응 완충액 50 리터에 섞고, 10μM의 프라이머를 첨가하여 94℃에서 30초간 변성, 53℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 확장하는 사이클을 30회 수행하였다. 상대적인 mRNA 레벨은 아이사이클러(ICycler) 소프트웨어를 이용하여 SYBR 그린 I 형광 변화를 측정함으로써 분석하였다. 내부 표준물질로 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 사용하여 유전자의 정량적 발현 수준을 보정하였다. HAS2 유전자의 mRNA 발현량은 도 1에 나타내었고, 버시칸 유전자의 mRNA 발현량을 도 2에 나타내었다.

도 1~2에서 보여지는 바와 같이, 유자, 유근피, 함초 추출물을 단독 처리한 경우(비교예 2~4), 상기 추출물을 처리하지 않은 비교예 1에 비하여 HAS2 유전자 및 버시칸 유전자의 발현량이 어느 정도 증가하였으나, 유자추출물과 유근피 추출물의 복합 처방을 사용한 실험군(실시예 1)의 경우에는 단독 처리군보다 소량을 사용했음에도 불구하고 HAS2 유전자 및 버시칸 유전자의 발현량이 유의하게 증가하였으며, 유자 유근피 및 함초 추출물의 복합 처방을 사용한 실험군(실시예 2)의 경우 역시 단독 처리군보다 소량을 사용했음에 도 불구하고 HAS2 유전자 및 버시칸 유전자의 발현량이 현저하게 증가하였고, 2종 복합추출물에 비하여도 현저한 효과를 보임을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라 유자추출물과 유근피 추출물을 복합 사용하면 히알루론산의 합성을 효과적으로 증가시킬 수 있으며, 상기 복합 추출물에 함초추출물을 더 함유하는 경우에는 히알루론산 합성을 보다 현저하게 증가시킬 수 있고, 이로써 세포외기질 구조를 강화시킬 수 있음을 알 수 있다.

[시험예 3] 유자, 유근피, 함초 추출물 처리에 의한 HaCaT 세포에서의 MMP-12의 발현 감소

본 발명의 조성물에 의한 버시칸의 분해저하 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 추출물을 처리하여 버시칸 분해를 담당하는 MMP-12 유전자의 발현양상을 mRNA 양에 의해 측정하였다.

단계 1. 세포주에 UV 및 추출물 처리

상기 시험예 1에서 배양된 HaCaT 세포를 1x10 ⁶ 개의 밀도로 100mm 세포 배양 접시에 분주하여 배양하였고, FS40 램프[Westinghouse, Pittsburgh, PA, USA]를 이용하여 자외선 B를 10mJ/cm2로 조사한 후, 상기 분주하여 배양된 세포를 디메틸설폭시드(Dimethylsulfoxide;DMSO)를 처리한 배지(비교예 6), 상기 제조예 1~3의 추출물들을 디메틸설폭시드에 녹인 상태로 유자추출물(비교예 7), 유근피추출물(비교예 8), 함초추출물(비교예 9)을 각각 10ppm씩 처리한 배지, 상기 제조예 1,2의 추출물들을 디메틸설폭시드에 녹인 상태로 유자추출물 및 유근피추출물을 혼합하여 총 5ppm 의 복합추출물을 처리한 배지(실시예 3), 유자추출물, 유근피추출물 및 함초추출물을 혼합하여 총 5ppm 의 복합추출물을 처리한 배지(실시예 4)에서 37℃, 5% CO ₂ 배양기로 24시간 동안 배양하였다. 이 때, 대조군은 UV를 조사하지 않은 샘플을 사용하였다(비교예 5).

단계 2. 정량적인 역전사 PCR 을 통한 MMP -12 유전자의 mRNA 합성 감소 확인

상기 세포를 회수하여 냉각된 4℃인산완충용액(PBS)으로 세척하고, TRIzol™ 시약 (Life Technologies, Inc.) 1 ml을 첨가하여 총 RNA를 추출하여 정량적인 실시간 DNA 연쇄중합반응을 수행하였다.

상기 추출된 총 RNA 1μg을 50mM 트리스-HCl(Tris-HCl, pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl ₂ , 0.1M DTT, 10mM dNTP 및 40 유닛/μl RNase 저해제가 함유된 역전사 반응 완충액 25μl에 넣고, 0.5μg/μl 올리고(dT) ₁₆ 의 프라이머와 200 유닛 수퍼스크립트 II[SuperScript II, GiboBRL]의 역전사 중합효소를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시킨 후, 역전사 반응 용액 2.5μl를 엠플리택(AmpliTaq) DNA 중합효소[0.04U; Perkin Elmer, Shelton, CT], 50mM 트리스(pH 8.3), 0.25mg/ml 우혈청알부민, 3mM MgCl ₂ , 0.25mM dNTPs, SYBR 그린 I의 1/50,000 희석액[Molecular Probes, Eugene, OR]이 함유된 PCR 반응 완충액 50 리터에 섞고, 10μM의 프라이머를 첨가하여 94℃에서 30초간 변성, 53℃에서 30초간 어닐링 및 72℃에서 1분간 확장하는 사이클을 30회 수행하였다. 상대적인 mRNA 레벨은 아이사이클러(ICycler) 소프트웨어를 이용하여 SYBR 그린 I 형광 변화를 측정함으로써 분석하였다. 내부 표준물질로 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 사용하여 유전자의 정량적 발현 수준을 보정하였다. 결과로서 MMP-12 유전자의 mRNA 발현량을 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보여지는 바와 같이, 유자, 유근피, 함초 추출물을 단독 처리한 경우(비교예 7~9), 상기 추출물을 처리하지 않은 비교예 6 에 비하여 MMP-12 유전자의 발현량이 어느 정도 감소하였으나, 유자추출물과 유근피 추출물의 복합 처방을 사용한 실험군(실시예 3)의 경우에는 단독 처리군보다 소량을 사용했음에도 불구하고 MMP-12 유전자의 발현량이 유의하게 감소하였으며, 유자 유근피 및 함초 추출물의 복합 처방을 사용한 실험군(실시예 4)의 경우 역시 단독 처리군보다 소량을 사용했음에도 불구하고 MMP-12 유전자의 발현량이 현저하게 감소하였고, 2종 복합추출물에 비하여도 현저한 효과를 보임을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라 유자추출물과 유근피 추출물을 복합 사용하면 MMP-12 유전자의 발현량을 감소시킴으로써 세포외기질 구조를 강화하는 버시칸의 분해를 억제할 수 있으며, 상기 복합 추출물에 함초추출물을 더 함유하는 경우에는 버시칸의 분해를 보다 현저하게 감소시킬 수 있고, 이로써 세포외기질 구조를 강화시킬 수 있음을 알 수 있다.

[시험예 4] 유자 추출물, 유근피 추출물 및 함초 추출물에 의한 HaCaT 세포에서의 히알루론산 생성 증가

상기 시험예 1에서 배양된 세포주에 트립신을 처리하여 단일세포 현탁액을 만들고, T75 플라스크에 세포 1x10 ⁶ 개의 밀도로 분주하여, 37℃, 5% CO ₂ 배양기로 24시간 동안 배양하였다.

상기 분주하여 배양된 세포를 디메틸설폭시드(Dimethylsulfoxide;DMSO)를 처리한 배지(비교예 10), 상기 제조예 1~3의 추출물들을 디메틸설폭시드에 녹인 상태로 유자추출물(비교예 11), 유근피추출물(비교예 12), 함초추출물(비교예 13)을 각각 10ppm씩 처리한 배지, 상기 제조예 1, 2의 추출물들을 디메틸설폭시드에 녹인 상태로 유자추출물 및 유근피추출물을 혼합하여 총 5ppm 의 복합추출물을 처리한 배지(실시예 5), 유자추출물, 유근피추출물 및 함초추출물을 혼합하여 총 5ppm 의 복합추출물을 처리한 배지(실시예 6)에서 37℃, 5% CO ₂ 배양기로 24시간 동안 배양하였다.

24 시간 경과 시점에서 상기 세포 배양액을 회수하여 15,000g에서 5분간 원심분리하여 침강된 세포를 제거하고 상층액을 얻어 에첼론 생명과학 회사 (Echelon Bioscience, Salt Lake, UT)회사의 ELISA 키트를 이용하여 히알루론산 양을 측정하여 그 결과를 도 4에 나타냈다.

도 4에서 보여지는 바와 같이, 유자, 유근피, 함초 추출물을 단독 처리한 경우(비교예 11~13), 상기 추출물을 처리하지 않은 비교예 10 에 비하여 히알루론산의 양이 어느 정도 증가하였으나, 유자추출물과 유근피 추출물의 복합 처방을 사용한 실험군(실시예 5)의 경우에는 단독 처리군보다 소량을 사용했음에도 불구하고 히알루론산의 양이 유의하게 증가하였으며, 유자 유근피 및 함초 추출물의 복합 처방을 사용한 실험군(실시예 6)의 경우 역시 단독 처리군보다 소량을 사용했음에도 히알루론산의 양이 현저하게 증가하였고, 2종 복합추출물에 비하여도 현저한 효과를 보임을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따라 유자추출물과 유근피 추출물을 복합 사용하면 히알루론산의 합성을 효과적으로 증가시킬 수 있으며, 상기 복합 추출물에 함초추출물을 더 함유하는 경우에는 히알루론산 합성을 보다 현저하게 증가시킬 수 있고, 이로써 세포외기질 구조를 강화시킬 수 있으며, 히알루론산 감소로 인한 피부 탄력 저하 및 수분 함유량 감소를 예방할 수 있다.

[제형예 1] 영양화장수

하기 표 2에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양화장수를 제조하였다.

[제형예 2] 영양크림

하기 표 3에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 영양크림을 제조하였다.

[제형예 3] 팩

하기 표 4에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 팩을 제조하였다.

[제형예 4] 연고

하기 표 5에 기재된 조성에 따라 통상적인 방법으로 연고를 제조하였다.