脂肪干细胞美容微囊泡的培养制备方法 |
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| 申请号 | CN201611151767.X | 申请日 | 2016-12-14 | 公开(公告)号 | CN106727264A | 公开(公告)日 | 2017-05-31 |
| 申请人 | 溯源生命科技股份有限公司; | 发明人 | 万谦; 高莉; | ||||
| 摘要 | 本 发明 描述了脂肪干细胞美容微囊泡的培养制备方法，它涉及细胞培养技术领域，培养制备方法为：无菌条件下取健康女性腹部和腿部皮下脂肪约5g，用含有双抗的PBS充分漂洗3遍，在超净台上将脂肪剪成组织小碎 块 ，用PBS缓冲液洗净血污；胰蛋白酶消化,采用2倍体积的I型胶原酶消化脂肪组织块；将脂肪消化后的产物接种培养基中，至脂肪干细胞生长铺满瓶底，即可进行传代；传代结束后，取出脂肪干细胞悬液，冻融，进行细胞裂解；加入PBS缓冲液15‑20ml，制备成脂肪干细胞美容微囊泡保存，使用时融化即可。具有取材容易、适宜大规模培养、对 机体 损伤小等优点，它取材来源广泛，体内储备量大，培养过程较为简单，操作容易。 | ||||||
| 权利要求 | 1.脂肪干细胞美容微囊泡的培养制备方法,其特征在于：所述的培养制备方法具体步骤为：步骤一：无菌条件下取健康女性腹部和腿部皮下脂肪约5g，浸没于含0.5-1.5％的青链霉素的PBS溶液中采用无菌塑料瓶密封后送回实验室； |
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| 说明书全文 | 脂肪干细胞美容微囊泡的培养制备方法技术领域： [0001] 本发明涉及脂肪干细胞美容微囊泡的培养制备方法，属于细胞培养技术领域。背景技术： [0002] 多年来，美容、整形都是大家关注的焦点，找到切实有效、安全可靠的美容产品已变得尤为迫切。一直到20世纪的80年代，人们都觉得脂肪只是一个能量储备的组织，多余的脂肪是肥胖的元凶，是各种疾病的源头，于是想尽办法减掉身上的脂肪，不惜通过手术的方式去除脂肪，直到2001年Zuk等人首次将脂肪干细胞从脂肪组织中提取出来，用于在很多医疗应用，并已被广泛承认，自从那时候，脂肪干细胞的密集研究和成功的医疗应用已在全球广泛实施。 [0003] 有研究表明脂肪来源干细胞具有组织修复能力，研究证实，脂肪来源干细胞辅助下的面部年轻化治疗后患者的皮肤毛孔、斑点改善效果均较好。ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。 [0004] 传统的脂肪移植手段由于存在免疫排斥、炎症反应等缺陷难以得到让人满意的疗效。据统计，自体脂肪组织移植到缺损部位后，通常其中40％～60％会被吸收。通过患者自身的脂肪组织内的干细胞，来构建具有完整生物学结构和功能工程脂肪组织无疑将是解决这一难题的最佳方案。 [0005] 现在整形美容手术的最突出特征就是追求最小的侵入性手术操作，沿着最自然的技术方向发展。脂肪组织来源干细胞技术的应用已经在整形美容外科占有重要的地位，并且未来更将如此。但是目前现有的脂肪干细胞培养过程较为复杂,不适合大范围推广。发明内容： [0006] 针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供脂肪干细胞美容微囊泡的培养制备方法。 [0007] 本发明的脂肪干细胞美容微囊泡的培养制备方法具体步骤为：步骤一：无菌条件下取健康女性腹部和腿部皮下脂肪约5g，浸没于含0.5-1.5％的青链霉素的PBS溶液中采用无菌塑料瓶密封后送回实验室； [0008] 步骤二：在超净台上将脂肪剪成1mm3×1mm3组织小碎块，去除小血管，用PBS缓冲液洗净血污； [0009] 步骤三：在37℃下，用0.25％的胰蛋白酶消化3-8min后,采用0.1％的I型胶原酶消化脂肪组织块15-25min； [0010] 步骤四：将脂肪消化后的产物接种于1mm孔径的尼龙网中在含10％FBS的L-DMEM培养基中，放置在37℃下，5％CO2的饱和湿度的培养箱内培养； [0011] 步骤五：24h后半量换液，48h后全量换液，以后每2d换液1次。约7-15天左右能在显微镜下观察到贴壁脂肪干细胞，半量换液后继续培养，去除油脂，三天后换液，脂肪干细胞已经能稳定生长，每三天换液一次，至脂肪干细胞生长铺满瓶底，即可进行传代； [0012] 步骤六：传代时去除培养基，用PBS缓冲液洗涤贴壁脂肪干细胞一次，加入1.5-3.5ml的胰酶-EDTA，在37℃条件下作用3-8min左右，加入等体积含血清的培养基中止消化，吸管轻吹贴壁脂肪干细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液，将脂肪干细胞悬液转移到50ml离心管中，在1000rpm下离心3-8min，弃上清，用适量L-DMEM培养基重悬脂肪干细胞，传代比例为1:2，接种量为5ml/瓶，置于37℃、5％CO2孵箱中培养； [0013] 步骤七：收集脂肪干细胞，加入含有Lipofectamine 2000(Invitrogen美国)0.15-0.25mL的PBS缓冲液18-22ml，在37℃，5％CO2的饱和湿度的培养箱内培养1.5-2.5小时； [0014] 步骤八：取出脂肪干细胞悬液，离心5000rpm，7-12min，去除上清，加入1-3ml的PBS，-20℃和37℃反复冻融，进行细胞裂解； [0015] 步骤九：加入PBS缓冲液15-20ml，制备成脂肪干细胞美容微囊泡，在10℃-20℃下长期保存，使用时融化即可。 [0016] 本发明的有益效果：它能克服现有技术的弊端。具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞、适宜大规模培养、对机体损伤小等优点，并且它取材来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，它的培养过程较为简单，操作容易，适合在美容业和医疗业中大范围推广。具体实施方式： [0017] 本具体实施方式采用以下实施例来具体说明：步骤一：无菌条件下取健康女性腹部和腿部皮下脂肪约5g，浸没于含0.5-1.5％的青链霉素的PBS溶液中采用无菌塑料瓶密封后送回实验室； [0018] 步骤二：在超净台上将脂肪剪成1mm3×1mm3组织小碎块，去除小血管，用PBS缓冲液洗净血污； [0019] 步骤三：在37℃下，用0.25％的胰蛋白酶消化3-8min后,采用0.1％的I型胶原酶消化脂肪组织块15-25min； [0020] 步骤四：将脂肪消化后的产物接种于1mm孔径的尼龙网中在含10％FBS的L-DMEM培养基中，放置在37℃下，5％CO2的饱和湿度的培养箱内培养； [0021] 步骤五：24h后半量换液，48h后全量换液，以后每2d换液1次。约7-15天左右能在显微镜下观察到贴壁脂肪干细胞，半量换液后继续培养，去除油脂，三天后换液，脂肪干细胞已经能稳定生长，每三天换液一次，至脂肪干细胞生长铺满瓶底，即可进行传代； [0022] 步骤六：传代时去除培养基，用PBS缓冲液洗涤贴壁脂肪干细胞一次，加入1.5-3.5ml的胰酶-EDTA，在37℃条件下作用3-8min左右，加入等体积含血清的培养基中止消化，吸管轻吹贴壁脂肪干细胞，使其从瓶壁上脱落下来形成细胞悬液，将脂肪干细胞悬液转移到50ml离心管中，在1000rpm下离心3-8min，弃上清，用适量L-DMEM培养基重悬脂肪干细胞，传代比例为1:2，接种量为5ml/瓶，置于37℃、5％CO2孵箱中培养； [0023] 步骤七：收集脂肪干细胞，加入含有Lipofectamine 2000(Invitrogen美国)0.15-0.25mL的PBS缓冲液18-22ml，在37℃，5％CO2的饱和湿度的培养箱内培养1.5-2.5小时； [0024] 步骤八：取出脂肪干细胞悬液，离心5000rpm，7-12min，去除上清，加入1-3ml的PBS，-20℃和37℃反复冻融，进行细胞裂解； [0025] 步骤九：加入PBS缓冲液15-20ml，制备成脂肪干细胞美容微囊泡，在10℃-20℃下长期保存，使用时融化即可。 |
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