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알부민 변이체
申请号 KR1020147024412 申请日 2013-03-15 公开(公告)号 KR1020140136934A 公开(公告)日 2014-12-01
申请人 알부메딕스 에이/에스; 发明人 델라헤이카렌앤;
摘要 본 발명은 모(parent) 알부민과 비교하여 변경된 혈장 반감기를 갖는 모 알부민의 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물, 벡터 및 숙주 세포; 및 변이체의 사용 방법에 관한 것이다.
权利要求
  • 알부민의 변이체, 그의 단편 또는 상기 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드가 상기 알부민, 단편 또는 융합 폴리펩티드의 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경을 가지며, 상기 알부민, 단편 또는 융합 폴리펩티드의 도메인 III 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경을 갖고, FcRn에 대한 모(parent) 알부민, 참조 알부민, 그의 단편, 또는 상기 모 알부민, 참조 알부민 또는 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 융합체(fusion)의 결합 친화성과 비교하여 변경된 FcRn에 대한 결합 친화성을 갖는 폴리펩티드.
  • 알부민의 변이체, 그의 단편 또는 상기 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드가 상기 알부민, 단편 또는 융합 폴리펩티드의 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경 및/또는 상기 알부민, 단편 또는 융합 폴리펩티드의 도메인 III 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경을 갖고, FcRn에 대한 모 알부민, 참조 알부민, 그의 단편, 또는 상기 모 알부민, 참조 알부민 또는 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 융합체의 결합 친화성과 비교하여 변경된 FcRn에 대한 결합 친화성을 갖고, 상기 도메인 I 내의 변경(들)이 SEQ ID NO: 2의 위치 78 내지 120 중 임의의 위치에 상응하는 위치로부터 선택되고, 상기 도메인 III 내의 변경(들)이 SEQ ID NO: 2의 위치 425, 505, 510, 512, 524, 527, 531, 534, 569, 573, 575 중 임의의 위치에 상응하� �� 위치로부터 선택되는 폴리펩티드.
  • 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경이 SEQ ID NO: 2의 78 내지 88 중 임의의 위치 및/또는 SEQ ID NO: 2의 105 내지 120 중 임의의 위치에 상응하는 위치로부터 선택되는 폴리펩티드.
  • 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 위치 (a) 111 및 573; (b) 82 및 83; (c) 82 및 111; (d) 82 및 112; (e) 82 및 573; (f) 83 및 111; (g) 83 및 112; (h) 83 및 573; (i) 111 및 112; (j) 83, 111, 및 573; (k) 112 및 573; (l) 82, 83, 및 111; (m) 82, 83, 및 112; (n) 82, 83, 및 573; (o) 82, 111, 및 112; (p) 82, 111, 및 573; (q) 82, 112, 및 573; (r) 83, 111, 및 112; (s) 83, 112, 및 573; (t) 111, 112, 및 573; (u) 82, 83, 111, 및 112; (v) 82, 83, 111, 및 573; (w) 82, 83, 112, 및 573; (x) 82, 111, 112, 및 573; (y) 83, 111, 112, 및 573; 또는 (z) 82, 83, 111, 112, 및 573에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하는 폴리펩티드.
  • 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경이 SEQ ID NO: 2의 83 및/또는 111에 상응하는 위치로부터 선택되는 폴리펩티드.
  • 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 III 내의 변경이 SEQ ID NO: 2의 573에 상응하는 위치에서 구성되는 폴리펩티드.
  • 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 I 내의 변경 및/또는 상기 도메인 III 내의 변경이 치환인 폴리펩티드.
  • 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 83에 상응하는 위치에서의 변경이 N, K 또는 S로의 치환인 폴리펩티드.
  • 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 111에 상응하는 위치에서의 변경이 D, G, H, R, Q 또는 E로의 치환인 폴리펩티드.
  • 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 573에 상응하는 위치에서의 변경이 P, Y, W, H, F, T, I 또는 V로의 치환인 폴리펩티드.
  • 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 573에 상응하는 위치에서의 치환이 P, Y 또는 W로의 치환인 폴리펩티드.
  • 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 573에 상응하는 위치에서의 치환이 P로의 치환인 폴리펩티드.
  • 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 참조 알부민이 HSA(SEQ ID No: 2) 또는 그의 단편, 또는 HSA 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO: 2인 폴리펩티드.
  • 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 모 알부민, 참조 알부민, 그의 단편, 또는 상기 모 알부민, 참조 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 융합체보다 더 강한 FcRn에 대한 결합 친화성 및/또는 더 긴 혈장 반감기를 갖는 폴리펩티드.
  • 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 2에 대한 폴리펩티드의 서열 동일성이 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 더욱 바람직하게는 95% 초과, 더욱 바람직하게는 96% 초과, 더욱 바람직하게는 97% 초과, 더욱 바람직하게는 98% 초과, 가장 바람직하게는 99% 초과인 폴리펩티드.
  • 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 및 치료, 예방, 진단, 영상화 또는 기타 유익한 모이어티(moiety)로부터 선택되는 융합 파트너 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드.
  • FcRn에 대한 참조 알부민, 그의 단편 또는 융합체의 결합 친화성과 비교하여 변경된 FcRn에 대한 결합 친화성을 갖는 알부민의 변이체, 그의 단편, 또는 상기 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
    (a) SEQ ID NO: 2에 대하여 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 모 알부민을 암호화하는 핵산을 제공하는 단계;
    (b) i. 모 알부민의 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 위치 및 도메인 III 내의 하나 이상의(몇몇의) 위치에 상응하는 위치에서의 변경, 또는
    ii. SEQ ID NO: 2의 도메인 I의 위치 78 내지 120 중 임의의 하나 이상의 위치에 상응하는 위치, 또는 SEQ ID NO: 2의 도메인 III의 위치 425, 505, 510, 512, 524, 527, 531, 534, 569, 573, 575 중 임의의 하나 이상(몇몇)의 위치에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하는 변이체 알부민, 그의 단편, 또는 상기 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 폴리펩티드를 암호화하도록 단계 (a)의 핵산 서열을 변형시키는 단계;
    (c) 선택적으로, 상기 단계 (b)의 변형된 서열을 적절한 숙주 세포에 도입하는 단계;
    (d) 선택적으로, 상기 세포를 상기 폴리펩티드의 발현을 야기하는 조건 하에서 적절한 성장 배지에서 성장시키는 단계; 및
    (e) 선택적으로, 상기 폴리펩티드를 상기 성장 배지로부터 회수하는 단계를 포함하며;
    (f) 상기 폴리펩티드가 모 알부민, 참조 알부민, 그의 단편, 또는 상기 모 알부민, 참조 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 그의 융합체와 비교하여 변경된 FcRn에 대한 결합 친화성 및/또는 변경된 혈장 반감기를 갖는, 폴리펩티드의 제조 방법.
  • 제17항에 있어서, 상기 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경이 SEQ ID NO: 2의 78 내지 88 중 임의의 위치 및/또는 105 내지 120 중 임의의 위치에 상응하는 위치로부터 선택되는 방법.
  • 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 2의 위치 (a) 111 및 573; (b) 82 및 83; (c) 82 및 111; (d) 82 및 112; (e) 82 및 573; (f) 83 및 111; (g) 83 및 112; (h) 83 및 573; (i) 111 및 112; (j) 83, 111, 및 573; (k) 112, 및 573; (l) 82, 83, 및 111; (m) 82, 83, 및 112; (n) 82, 83, 및 573; (o) 82, 111, 및 112; (p) 82, 111, 및 573; (q) 82, 112, 및 573; (r) 83, 111, 및 112; (s) 83, 112, 및 573; (t) 111, 112, 및 573; (u) 82, 83, 111, 및 112; (v) 82, 83, 111, 및 573; (w) 82, 83, 112, 및 573; (x) 82, 111, 112, 및 573; (y) 83, 111, 112, 및 573; 또는 (z) 82, 83, 111, 112, 및 573에 상응하는 변경을 포함하는 방법.
  • 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경이 SEQ ID NO: 2의 83 및/또는 111에 상응하는 위치로부터 선택되는 방법.
  • 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 III 내의 변경이 SEQ ID NO: 2의 573에 상응하는 위치에서 구성되는 방법.
  • 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 I 내의 변경 및/또는 상기 도메인 III 내의 변경이 치환인 폴리펩티드.
  • 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 83에 상응하는 위치에서의 변경이 N, K 또는 S로의 치환인 폴리펩티드.
  • 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 111에 상응하는 위치에서의 변경이 E, Q, D, G 또는 H로의 치환인 폴리펩티드.
  • 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 573에 상응하는 위치에서의 변경이 P, Y, W, H, F, T, I 또는 V로의 치환인 폴리펩티드.
  • 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 573에 상응하는 위치에서의 치환이 P, Y 또는 W로의 치환인 폴리펩티드.
  • 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위치 573에 상응하는 위치에서의 치환이 P로의 치환인 폴리펩티드.
  • 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 참조 알부민이 HSA(SEQ ID No: 2) 또는 그의 단편, 또는 HSA 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 가장 바람직하게는 SEQ ID NO: 2인 폴리펩티드.
  • 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른, 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드 및 컨쥬게이션 파트너(conjugation partner)를 포함하는 컨쥬게이트(conjugate).
  • 제29항에 있어서, 상기 컨쥬게이션 파트너가 치료, 예방, 진단, 영상화 또는 기타 유익한 모이어티인 컨쥬게이트.
  • 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드, 및 치료, 예방, 진단, 영상화 또는 기타 유익한 모이어티를 포함하는 회합물(associate).
  • 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드, 제29항 또는 제30항에 따른 컨쥬게이트, 또는 제31항에 따른 회합물을 포함하는 나노입자 또는 마이크로입자.
  • 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드, 제29항 또는 제30항에 따른 컨쥬게이트, 제31항에 따른 회합물, 또는 제32항에 따른 나노입자 또는 마이크로입자를 포함하는 조성물로서, FcRn에 대한 상기 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 화합물, 또는 나노입자 또는 마이크로입자의 결합 친화성이, FcRn에 대한 상응하는 모 알부민, 참조 알부민, 그의 단편, 또는 상기 모 알부민, 참조 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 회합물, 또는 나노입자 또는 마이크로입자, 또는 그의 융합체를 포함하는 조성물의 결합 친화성보다 더 큰 조성물.
  • 제33항에 있어서, FcRn에 대한 상기 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 회합물, 또는 나노입자 또는 마이크로입자의 결합 친화성이 FcRn에 대한 HSA의 결합 친화성보다 더 강한 조성물.
  • 제33항 또는 제34항에 있어서, FcRn에 대한 상기 폴리펩티드의 변이체, 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 회합물, 또는 나노입자 또는 마이크로입자의 결합 계수(binding coeffcient)가 FcRn에 대한 HSA의 KD의 0.9배 미만, 더욱 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 0.5배 미만, 더욱 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 0.1배 미만, 더욱 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 0.05배 미만, 더욱 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 0.02배 미만, 가장 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 0.01배 미만인 조성물.
  • 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드, 제29항 또는 제30항에 따른 컨쥬게이트, 제31항에 따른 회합물, 또는 제32항에 따른 나노입자 또는 마이크로입자를 포함하고, 항체 결합 도메인(ABD), 및 치료, 예방, 진단, 영상화 또는 기타 유익한 모이어티를 포함하는 화합물을 더 포함하는 조성물.
  • 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  • 치료, 예방, 진단, 영상화 또는 기타 유익한 모이어티의 FcRn에 대한 결합 친화성 또는 바람직하게는 혈장에서의 반감기를 변경시키기 위한, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드, 제29항 또는 제30항에 따른 컨쥬게이트, 제31항에 따른 회합물, 또는 제32항에 따른 나노입자 또는 마이크로입자, 또는 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  • 제38항에 있어서, 상기 FcRn에 대한 결합 친화성이 FcRn에 대한 HSA(SEQ ID NO: 2) 또는 그의 단편, 융합체, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자 또는 마이크로입자를 포함하거나 그로 구성된 참조물질의 결합 친화성과 비교하여 증가되는 용도.
  • 제39항에 있어서, 상기 FcRn에 대한 결합 친화성이 FcRn에 대한 HSA(SEQ ID NO: 2) 또는 그의 단편, 융합체, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자 또는 마이크로입자를 포함하거나 그로 구성된 참조물질의 결합 친화성과 비교하여 감소되는 용도.
  • (a) 분자가 폴리펩티드인 경우, 상기 분자를 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드, 또는 제29항 또는 제30항에 따른 컨쥬게이트에 융합시키거나 컨쥬게이트시키는 단계, 상기 분자를 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드, 또는 제29항 또는 제30항에 따른 컨쥬게이트에 회합시키는 단계; 상기 분자를 제31항에 따른 회합물, 제32항에 따른 나노입자 또는 마이크로입자, 또는 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물에 혼입시키는 단계;
    (b) 상기 분자가 폴리펩티드가 아닌 경우, 상기 분자를 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드, 또는 제29항 또는 제30항에 따른 컨쥬게이트에 컨쥬게이트시키는 단계; 상기 분자를 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드, 또는 제29항 또는 제30항에 따른 컨쥬게이트에 회합시키는 단계; 상기 분자를 제31항에 따른 회합물, 제32항에 따른 나노입자 또는 마이크로입자, 또는 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물에 혼입시키는 단계를 포함하는 분자의 FcRn에 대한 결합 친화성 또는 바람직하게는 혈장에서의 반감기의 변경 방법.
  • 제41항에 있어서, 상기 분자가 치료, 예방, 진단, 영상화 또는 기타 유익한 모이어티인 방법.
  • 제1항 내지 제16항, 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른, 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자 또는 마이크로입자, 또는 조성물로서, 상기 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자 또는 마이크로입자, 또는 조성물이 본 명세서에 기재된 모이어티로부터 선택되는 하나 이상의(몇몇의) 모이어티를 포함하는, 제1항 내지 제16항, 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른, 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자 또는 마이크로입자, 또는 조성물.
  • 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
  • 제44항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  • 제45항에 따른 핵산 또는 제34항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  • 제46항에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵, 바람직하게는 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지에( Saccharomyces cerevisiae )) 또는 포유류 세포(예를 들어, CHO 또는 HEK) 또는 식물 세포(예를 들어, 벼)인 숙주 세포.
  • 제1항 내지 제16항, 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른, 또는 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 조성물, 회합물, 나노입자 또는 마이크로입자, 또는 폴리뉴클레오티드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 예방, 치료 또는 진단 방법.
    • 说明书全文

    알부민 변이체{ALBUMIN VARIANTS}

    서열 목록에 대한 참조

    본 출원은 본 명세서에 참조로 포함되는 컴퓨터 판독가능한 형태의 서열 목록을 포함한다.

    기술 분야

    본 발명은 알부민, 그의 단편, 또는 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 비하여, FcRn에 대한 결합 친화성의 변화 및/또는 반감기의 변화를 갖는 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 사용자 또는 응용의 요구 및 요망에 대한 알부민의 결합 친화성 및/또는 반감기의 맞춤화를 가능하게 한다.

    알부민은 포유류의 혈장에서 천연적으로 관찰되는 단백질이며, 포유류의 혈장에서, 알부민은 가장 풍부한 단백질이다. 이는 요망되는 혈액 삼투압의 유지 및 또한 혈류 중의 다양한 기질의 수송에 있어서 중요한 역할을 갖는다. 알부민은 인간, 돼지, 마우스(mouse), 랫트(rat), 토끼 및 염소를 포함하는 많은 종으로부터 특성화되었으며, 그들은 고도의 서열 및 구조 상동성을 공유한다.

    알부민은 생체 내에서 그의 수용체, 신생아 Fc 수용체(FcRn) "브렘벨(Brambell)"에 결합하며, 이러한 상호작용은 알부민의 혈장 반감기에 중요한 것으로 알려져 있다. FcRn은 많은 세포 및 조직 유형에서 발현되는 막 결합 단백질이다. FcRn은 세포내 분해로부터 알부민을 구하는 것으로 관찰되었다(문헌[Roopenian DC and Akilesh, S. (2007), Nat. Rev. Immunol 7 , 715-725]). FcRn은 포유류, 예를 들어, 인간의 혈청에서 높은 수준의 IgG 및 알부민을 유지하는데 기여하는 이작용성 분자이다.

    FcRn-면역글로불린(IgG) 상호작용은 종래 기술에서 특성화되었지만, FcRn-알부민 상호작용은 덜 특성화되어 있다. 주요 FcRn 결합 부위는 DIII(381-585) 내에 위치한다(문헌[Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43 , 367-372]). 수많은 주요 아미노산, 특히 히스티딘 H464, H510 및 H536, 및 Lys500이 결합에 중요한 것으로 보인다(문헌[Andersen et al (2010), Nat. Commun. 3 :610. DOI:10.1038/ncomms1607]). 데이터에 의해, IgG 및 알부민이 FcRn 상의 별개의 부위에 비-협동적으로 결합하는 것으로 나타났다(문헌[Andersen et al. (2006), Eur. J. Immunol 36 , 3044-3051]; 문헌[Chaudhury et al. (2006), Biochemistry 45 , 4983-4990]).

    마우스 FcRn이 마우스 및 인간 유래의 IgG에 결합하는 반면, 인간 FcRn은 더욱 차별적인 것으로 보이는 것으로 알려져 있다(문헌[Ober et al. (2001) Int. Immunol 13 , 1551-1559]). 문헌[Andersen et al . (2010) Journal of Biological Chemistry 285( 7 ):4826-36]에는 각각의 마우스 및 인간 알부민에 대한 인간 및 마우스 FcRn의 친화성이 기술되어 있다(모든 가능한 조합). 생리적 pH에서, 어느 하나의 종 유래의 알부민의 어느 하나의 수용체로의 결합이 관찰되지 않았다. 산성 pH에서, 결합 친화성의 100배 차이가 관찰되었다. 모든 경우에, 어느 하나의 종 유래의 알부민 및 IgG의 둘 모두의 수용체로의 결합은 상가적이었다.

    인간 혈청 알부민(HSA)은 585개 아미노산의 폴리펩티드로서 널리 특성화되어 있으며, 그의 서열은 문헌[Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical, Applications pp 10 , Academic Press, Inc., Orlando(ISBN0-12-552110-3)]에서 찾을 수 있다. 그것은 그의 수용체 FcRn으로의 특징적인 결합을 가지며, 여기서, 그는 pH 6.0에서는 결합하나 pH 7.4에서는 결합하지 않는다.

    HSA의 혈장 반감기는 대략 19일인 것으로 관찰되었다. 보다 낮은 혈장 반감기를 갖는, D494N 치환을 갖는 천연 변이체가 확인되었다(문헌[Peach, RJ and Brennan, S. 0., (1991) Biochim Biophys Acta . 1097 :49-54]). 이러한 치환에 의해 이러한 변이체에 N-글리코실화 부위가 생성되었으며, 이는 야생형 알부민에는 존재하지 않는 것이다. 글리코실화 또는 아미노산 변화가 혈장 반감기의 변화의 원인인지 여부는 알려져 있지 않다.

    알부민은 긴 혈장 반감기를 가지며, 이러한 특성 때문에, 그것은 약물 전달에서의 사용을 위해 제시되었다. 알부민은 약제학적으로 유익한 화합물에 컨쥬게이트되며(conjugated)(WO2000/69902호), 컨쥬게이트가 알부민의 긴 혈장 반감기를 유지하는 것으로 관찰되었다. 얻어진 컨쥬게이트의 혈장 반감기는 일반적으로 단독의 유익한 치료 화합물의 혈장 반감기보다 상당히 더 길었다.

    또한, 알부민을 치료적으로 유익한 펩티드에 유전학적으로 융합시켰으며(WO 2001/79271A호 및 WO2003/59934호), 전형적인 결과는 융합체가 치료적으로 유익한 펩티드의 활성을 가지며, 단독의 치료적으로 유익한 펩티드의 혈장 반감기보다 상당히 더 긴 혈장 반감기를 갖는 것이었다.

    문헌 [Otagiri et al (2009), Biol. Pharm. Bull. 32 (4), 527-534]에는 70개 초과의 알부민 변이체가 개시되어 있으며, 이들 중 25개는 도메인 III에서 돌연변이된 것으로 관찰되었다. 카르복시 말단에서 마지막 175개 아미노산이 결여된 천연 변이체는 감소된 반감기를 갖는 것으로 관찰되었다(문헌[Andersen et al (2010), Clinical Biochemistry 43 , 367-372]). 이와오(Iwao) 등(2007)은 마우스 모델을 사용하여 천연 발생 인간 알부민 변이체의 반감기를 연구하였으며, K541E 및 K560E가 감소된 반감기를 가지며, E501K 및 E570K가 증가된 반감기를 가지며, K573E가 반감기에 거의 효과를 갖지 않는 것을 관찰하였다(문헌[Iwao, et. al . (2007) BBA Proteins and Proteomics 1774, 1582-1590]). 문헌[Galliano et al (1993) Biochim. Biophys. Acta 1225, 27-32]에는 천연 변이체 E505K가 개시되어 있다. 문헌[Minchiotti et al (1990)]에는 천연 변이체 K536E가 개시되어 있다. 문헌[Minchiotti et al (1987) Biochim. Biophys. Acta 916, 411-418]에는 천연 변이체 K574N이 개시되어 있다. 문헌[Takahashi et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4413-4417]에는 천연 변이체 D550G가 개시되어 있다. 문헌[Carlson et al (1992). Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 8225-8229]에는 천연 변이체 D550A가 개시되어 있다.

    WO2011/051489호 및 WO2012/150319호(PCT/EP2012/058206호)에는 알부민의 FcRn으로의 결합을 조절하는 알부민 내의 수많은 점 돌연변이가 개시되어 있으며, WO2010/092135호에는 알부민에서 컨쥬게이션에 이용가능한 티올의 개수를 증가시키는 알부민 내의 수많은 점 돌연변이가 개시되어 있으며, 개시내용은 알부민의 FcRn으로의 결합에 대한 돌연변이의 효과가 침묵(silent)하는 돌연변이이다. WO2011/103076호에는 각각이 HSA의 도메인 III 내의 치환을 포함하는 알부민 변이체가 개시되어 있다. WO2012/112188호에는 HSA의 도메인 III 내의 치환을 포함하는 알부민 변이체가 개시되어 있다.

    알부민은 수많은 리간드에 결합하는 능력을 가지며, 이들은 알부민과 회합하게 된다(회합한다). 이러한 특성을 사용하여, 알부민에 비공유적으로 결합하는 능력을 갖는 약물의 혈장 반감기를 연장시켰다. 또한, 이는 알부민 결합 특성이 거의 없거나, 이를 갖지 않는 약제학적으로 유익한 화합물을 알부민 결합 특성을 갖는 모이어티(moiety)에 결합시킴으로써 달성될 수 있으며, 문헌[Kratz (2008) Journal of Controlled Release 132 , 171-183] 및 그 안의 종설 논문 및 참고문헌을 참조한다.

    알부민은 약제학적으로 유익한 화합물의 제조에 사용되며, 여기서, 이러한 제제는 예를 들어, 비제한적으로 알부민의 나노입자 또는 마이크로입자일 수 있다. 이들 예에서, 약제학적으로 유익한 화합물 또는 화합물의 혼합물의 전달은 알부민의 그의 수용체에 대한 친화성의 변경에서 이익을 얻을 수 있으며, 여기서, 유익한 화합물은 전달의 수단을 위해 알부민과 회합하는 것으로 보인다. 어떤 것이 형성된 회합물(associate)(예를 들어, 비제한적으로, 레베미르(Levemir)®, 문헌[Kurtzhals P et al . Biochem. J. 1995; 312 : 725-731]), 컨쥬게이트 또는 융합 폴리펩티드의 혈장 반감기를 결정하는 지는 명백하지 않으나, 알부민 및 선택된 약제학적으로 유익한 화합물/폴리펩티드의 조합의 결과인 것으로 보인다. 회합, 컨쥬게이션 또는 융합의 요소에 의해 제공되는 것보다 더 길거나 더 짧은 혈장 반감기가 달성될 수 있도록 주어진 알부민 컨쥬게이트, 회합물 또는 알부민 융합 폴리펩티드의 혈장 반감기를 조절하여, 치료하고자 하는 특정한 징후(indication)에 따라 특정 약물을 설계할 수 있는 것이 바람직할 것이다.

    알부민은 종양에서 축적되고 이화되는 것으로 알려져 있으며; 그는 또한 류마티스 관절염 환자의 염증성 관절에 축적되는 것으로 나타났다. 문헌[Kratz (2008) Journal of Controlled Release 132 , 171-183] 및 그 안의 종설 논문 및 참고문헌을 참조한다. 증가된 FcRn에 대한 친화성을 갖는 HSA 변이체가 약제학적으로 유익한 화합물의 전달에 유익할 것으로 예상된다.

    심지어, 문헌[Kenanova et al (2009) J. Nucl. Med. ; 50 (Supplement 2): 1582)]에 기술된 바와 같이 알부민의 변이체가 FcRn에 거의 결합되지 않거나, 결합되지 않아서, 보다 짧은 반감기 또는 조절된 혈청 약동학을 제공하는 것이 바람직할 수 있다.

    문헌[Kenanova et al (2010, Protein Engineering, Design & Selection 23(10): 789-798; WO2010/118169호)]에는 HSA의 도메인 III의 구조 모델(pH 7 내지 8에서 해석) 및 FcRn의 구조 모델(pH 6.4에서 해석)을 포함하는 도킹 모델(docking model)이 개시되어 있다. 케나노바(Kenanova) 등은 도메인 III 내의 위치 464, 505, 510, 531 및 535가 잠재적으로 FcRn과 상호작용하는 것을 개시하였다. 위치 464, 510 및 535에서의 히스티딘은 상기 문헌[Chaudhury et al ., (2006)]에 의해 특히 흥미로운 것으로 확인되었으며, 이들은 상기 문헌[Kenanova (2010)]에 의해 마우스에서 친화성의 상당한 감소 및 보다 짧은 반감기를 갖는 것으로 나타났다. 그러나, 케나노바 등의 연구는 HSA의 도메인 III에 제한되며, 이에 따라, 천연의 무손상(intact) 구조의 HSA를 고려하지 않는다. 또한, 확인된 위치는 FcRn 수용체에 대한 친화성의 감소를 야기하는 것이다.

    본 발명은 FcRn 수용체로의 조절된(즉, 변경된) 결합 친화성을 갖는 추가의 변이체를 제공한다. 따라서, 알부민 모이어티(들)를 사용하여, 알부민 모이어티를 포함하는 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자 및 조성물의 FcRn에 대한 결합 친화성 및/또는 반감기를 맞춤화시킬 수 있다.

    발명의 요약

    본 발명은 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드의 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경 및 도메인 III 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경, 또는 다른 알부민 또는 그의 단편의 동등한 위치의 하나 이상의(몇몇의) 변경을 포함하는 알부민 변이체에 관한 것이다.

    또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드의 도메인 I 내의, 또는 다른 알부민 또는 그의 단편의 동등한 위치 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경을 포함하는 알부민 변이체에 관한 것이다.

    또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드의 도메인 III 내의, 또는 다른 알부민 또는 그의 단편의 동등한 위치 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경을 포함하는 알부민 변이체에 관한 것이다.

    또한, 본 발명은 변이체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드; 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물(construct), 벡터 및 숙주 세포; 및 변이체의 생성 방법에 관한 것이다.

    또한, 본 발명은 본 발명에 따른 변이체 알부민 또는 그의 단편 및 치료적으로 유익한 모이어티를 포함하는 컨쥬게이트 또는 회합물, 또는 본 발명의 변이체 알부민 또는 그의 단편과 융합 파트너 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다.

    게다가, 본 발명은 변이체 알부민, 그의 단편, 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 본 발명에 따른, 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트, 또는 본 발명에 따른, 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 회합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 바람직하게는 약제학적 조성물이다.

    게다가, 본 발명은 변이체 알부민, 그의 단편, 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 회합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

    또한, 본 발명은 변이체, 단편, 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자 및 마이크로입자의 용도에 관한 것이다.

    또한, 본 발명은 변이체 알부민, 그의 단편, 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 회합물의 제조 방법에 관한 것이다.

    도 1: (i) 전장 성숙 HSA(Hu_1_2_3), (ii) HSA의 도메인 I 및 도메인 III을 포함하는 알부민 변이체(Hu_1_3), (iii) HSA의 도메인 II 및 도메인 III을 포함하는 알부민 변이체(Hu_2_3), (iv) 전장 마카카 물라타( Macaca mulatta ) 알부민(Mac_mul), (v) 전장 라투스 노르베지쿠스( Rattus norvegicus ) 알부민(랫트) 및 (vi) 전장 무스 무스쿨루스( Mus musculus ) 알부민(마우스)의 아미노산 서열의 다중 정렬. 위치 500, 550 및 573(전장 HSA에 대한)은 화살표로 표시되어 있음. 도 1에서, 도메인 I, II 및 III은 1, 2 및 3(각각)으로 지칭됨.
    도 2: 인간, 양, 마우스, 토끼 및 염소 유래의 성숙 알부민 및 침팬지("Chimp"), 마카크(macaque), 햄스터, 기니피그, 랫트, 소, 말, 당나귀, 개, 닭 및 돼지 유래의 미성숙 알부민의 아미노산 서열의 다중 정렬. 도메인 1, 2 및 3의 시작 및 종결 아미노산(문헌[Dockal et al (The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274(41): 29303-29310)]에 정의된 바와 같음)은 성숙 인간 알부민에 대하여 표시되어 있음.
    도 3: 아미노산의 특성에 기초한, 보존된 아미노산의 그룹.
    도 4: shFcRn-HSA 도킹 모델의 표현. (AB) 2가지 배향의 복합체가 나타나 있음. 알부민은 공간-채움 디아그램에 의해 나타나 있고, FcRn은 리본 디아그램으로 나타나 있음. HSA의 코어 결합 계면은 분홍색으로 강조되어 있는 한편(회색 스케일(grey-scale)에서는 이는 가장 어두운(거의 검은) 영역으로 관찰됨; DI(CBI)), 계면으로부터 멀리 국소화된 영역은 DII(주황색)로 표시되고, DIII은 하위-도메인 DIIIa(이는 색이 청록색임) 및 DIIIb(이는 색이 청색임)로 나뉨.
    도 5: pH5.5에서 야생형 HSA, HSA K573P 및 HSA N111Q/K573P의 shFcRn 결합. 시료를 pH 5.5에서 고정화된 shFcRn-HIS(약 1500 내지 2500 RU)에 주입함.
    도 6: shFcRn(공간 채움 디아그램)과, 위치 78 내지 88 및 108 내지 112를 포함하는 HSA의 루프를 포함하는 HSA(리본 디아그램) DI, DII 및 DIII 간의 공간 관계를 보여주는 제안된 shFcRn-HSA 도킹 모델.
    정의
    변이체: 용어 "변이체"는 하나 이상의(몇몇의) 위치에서의 하나 이상의(몇몇의) 변경(들), 즉 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 모 알부민으로부터 유도된 폴리펩티드를 의미한다. 치환은 소정의 위치를 차지하는 아미노산이 상이한 아미노산으로 대체된 것을 의미하고; 결실은 소정의 위치를 차지하는 아미노산의 제거를 의미하며; 삽입은 1개 이상의(몇몇의), 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개, 바람직하게는 1 내지 3개의 아미노산을 소정의 위치를 차지하는 아미노산에 바로 인접하게 부가하는 것을 의미한다. 치환과 관련하여, '바로 인접한'은 소정의 위치를 차지하는 아미노산('표기된 아미노산')의 N-측('업스트림') 또는 C-측('다운스트림')에 대한 것일 수 있다. 따라서, 'X'로 표기된/넘버링된 아미노산에 대하여, 삽입은 위치 'X+1'('다운스트림') 또는 위치 'X-1'('업스트림')에서 일어날 수 있다.
    돌연변이체: 용어 "돌연변이체"는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
    야생형 알부민 : 용어 "야생형"(WT) 알부민은 동물 또는 인간에서 천연적으로 관찰되는 것과 동일한 아미노산 서열을 갖는 알부민을 의미한다.
    모 알부민: 용어 "모체" 또는 "모 알부민"은 변경이 인위적으로 구성되어서, 본 발명의 알부민 변이체를 생성하는 알부민을 의미한다. 모체는 천연 발생(야생형) 폴리펩티드 또는 그의 대립형질 또는 심지어 그의 변이체일 수 있다.
    알부민 : 알부민은 단백질이며, 포유류의 혈장에서 가장 풍부한 단백질을 이루고, 생화학적 방법 및/또는 서열 정보에 의해 수많은 포유류 유래의 알부민이 특성화되어 있다. 또한, 몇몇 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA)은 결정학적으로 특성화되었으며, 구조가 결정되었다(HSA: 문헌[He XM, Carter DC (July 1992). "Atomic structure and chemistry of human serum albumin". Nature 358(6383): 209-15]; 말 알부민: 문헌[Ho, JX et al . (2001). X-ray and primary structure of horse serum albumin ( Equus caballus ) at 0.27-nm resolution. Eur J Biochem. 215(1): 205-12]).
    용어 "알부민"은 HSA 또는 HSA 도메인과 동일하고/거나 매우 유사한 3차원(3차) 구조를 가지며, HSA 또는 관련 도메인과 유사한 특성을 갖는 단백질을 의미한다. 유사한 3차원 구조는 예를 들어, 본 명세서에 언급된 종 유래의 알부민의 구조이다. 알부민의 주요 특성 중 일부는 i) 혈장 부피를 조절하는 알부민의 능력(팽창(oncotic) 활성), ii) 약 19일 ± 5일의 긴 혈장 반감기, iii) FcRn으로의 결합, iv) 리간드-결합, 예를 들어, 내인성 분자, 예를 들어, 빌리루빈, 지방산, 헤민 및 티록신을 포함하는 산성, 친유성 화합물의 결합(또한, 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Kragh-Hansen et al , 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695]의 표 1 참조), v) 산성 또는 음전성 특징을 갖는 작은 유기 화합물, 예를 들어, 약물, 예를 들어, 와파린, 디아제팜, 이부프로펜 및 파클리탁셀의 결합(또한, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Kragh-Hansen et al , 2002, Biol. Pharm. Bull. 25, 695]의 표 1 참조). 단백질 또는 단편을 알부민으로 특징짓기 위하여 이들 특성 모두를 충족시킬 필요는 없다. 예를 들어, 단편이 특정 리간드 또는 유기 화합물의 결합을 담당하는 도메인을 포함하지 않는다면, 이러한 단편의 변이체는 이들 특성 중 어느 하나를 갖는 것으로 예상되지 않을 것이다.
    알부민은 일반적으로 대략 20일 이상의 긴 혈장 반감기를 가지며, 예를 들어, HSA는 19일의 혈장 반감기를 갖는다. HSA의 긴 혈장 반감기가 그의 수용체 FcRn과의 상호작용을 통하여 매개되는 것으로 알려져 있지만, HSA의 긴 반감기의 원인이 되는 정확한 메카니즘의 이해 또는 지식은 본 발명에 필수적이지 않다.
    본 발명에 따른 알부민 단백질의 예로서, 인간 혈청 알부민(예를 들어, AAA98797 또는 P02768-1, SEQ ID NO: 2(성숙), SEQ ID NO: 4(미성숙)), 영장류 혈청 알부민, (예를 들어, 침팬지 혈청 알부민(예를 들어, 예측된 서열 XP_517233.2 SEQ ID NO: 5), 고릴라 혈청 알부민 또는 마카크 혈청 알부민(예를 들어, NP_001182578, SEQ ID NO: 6), 설치류 혈청 알부민(예를 들어, 햄스터 혈청 알부민(예를 들어, A6YF56, SEQ ID NO: 7), 기니피그 혈청 알부민(예를 들어, Q6WDN9-1, SEQ ID NO: 8), 마우스 혈청 알부민(예를 들어, AAH49971 또는 P07724-1 버전 3, SEQ ID NO: 9) 및 랫트 혈청 알부민(예를 들어, AAH85359 또는 P02770-1 버전 2, SEQ ID NO: 10))), 소 혈청 알부민(예를 들어, 암소 혈청 알부민 P02769-1, SEQ ID NO: 11), 말과 혈청 알부민, 예를 들어, 말 혈청 알부민(예를 들어, P35747-1, SEQ ID NO: 12) 또는 당나귀 혈청 알부민(예를 들� �, Q5XLE4-1, SEQ ID NO: 13), 토끼 혈청 알부민(예를 들어, P49065-1 버전 2, SEQ ID NO: 14), 염소 혈청 알부민(예를 들어, ACF10391, SEQ ID NO: 15), 양 혈청 알부민(예를 들어, P14639-1, SEQ ID NO: 16), 개 혈청 알부민(예를 들어, P49822-1, SEQ ID NO: 17), 닭 혈청 알부민(예를 들어, P19121-1 버전 2, SEQ ID NO: 18) 및 돼지 혈청 알부민(예를 들어, P08835-1 버전 2, SEQ ID NO: 19) 또는 이러한 알부민에 대하여 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 적어도 99% 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩티드가 언급될 수 있다. 모 알부민 또는 참조 알부민은 인공 변이체, 예를 들어, HSA K573P(SEQ ID NO: 3) 또는 키메라 알부민, 예를 들어, HSA의 N-말단 및 마카카 알부민의 C-말단(SEQ ID NO: 20), HSA의 N-말단 및 마우스 알부민의 C-말단(SEQ ID NO: 21), HSA의 N-말단 및 토끼 알부민의 C-말단(SEQ ID NO: 22), HSA의 N-말단 및 양 알부민의 C-말단(SEQ ID NO: 23)일 수 있다.
    또한, 본 출원의 범주에 포함되는 알부민의 다른 예에는 오브알부민(예를 들어, P01012.pro: 닭 오브알부민; O73860.pro: 칠면조 오브알부민)이 포함된다.
    SEQ ID NO: 2에 개시된 바와 같은 HSA 또는 그의 임의의 천연 발생 대립형질은 본 발명에 따른 바람직한 알부민(모 알부민)이다. HSA는 585개 아미노산 잔기로 구성되는 단백질이며, 67 kDa의 분자량을 갖는다. 알부민은 그의 천연의 형태에서 글리코실화되지 않는다. 해당 분야의 숙련자는 HSA와 본질적으로 동일한 특성을 가지나, SEQ ID NO: 2에 비하여 하나 이상의(몇몇의) 아미노산 변화를 갖는 천연의 대립형질이 존재할 수 있는 것을 인식할 것이며, 본 발명자들은 또한 본 발명에 따른 모 알부민으로서의 이러한 천연의 대립형질의 사용을 고려한다.
    모 알부민, 그의 단편, 또는 본 발명에 따른 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분은 바람직하게는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 HSA의 서열에 대하여 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 86%, 바람직하게는 적어도 87%, 바람직하게는 적어도 88%, 바람직하게는 적어도 89%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 91%, 바람직하게는 적어도 92%, 바람직하게는 적어도 93%, 바람직하게는 적어도 94%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 모 알부민이 알부민, 예를 들어, HSA와 유사한 3차 구조 또는 알부민의 주요 특성 중 적어도 하나를 유지하는 것이 바람직하다. 서열 동일성은 SEQ ID NO: 2의 전장에 대한 것이거나, SEQ ID NO: 2의 하나 이상의(몇몇의) 도메인과 같은 단편으로 구성되거나 이를 포함하는 분자, 예를 들어, 도메인 III으로 구성되거나 이를 포함하는 분자(예를 들어, SEQ ID NO: 27), 도메인 II 및 도메인 III으로 구성되거나 이를 포함하는 분자(예를 들어, SEQ ID NO: 25), 도메인 I 및 도메인 III으로 구성되거나 이를 포함하는 분자(예를 들어, SEQ ID NO: 24), 2 카피의 도메인 III으로 구성되거나 이를 포함하는 분자(예를 들어, SEQ ID NO: 26), 3 카피의 도메인 III으로 구성되거나 이를 포함하는 분자(예를 들어, SEQ ID NO: 28) 또는 도메인 I 및 2 카피의 도메인 III으로 구성되거나 이를 포함하는 분자(예를 들어, SEQ ID NO: 29)에 대한 것일 수 있다.
    모체는 바람직하게는 SEQ ID NO: 4(HSA의 미성숙 서열) 또는 SEQ ID NO: 2( HSA의 성숙 서열)의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
    다른 구현예에서, 모체는 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드의 대립형질 변이체이다.
    모 알부민은 매우 낮은 엄격성(stringency) 조건, 낮은 엄격성 조건, 중간의 엄격성 조건, 중간 내지 높은 엄격성 조건, 높은 엄격성 조건 또는 매우 높은 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, 또는 (ii) (i)의 전장 상보성 가닥과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다(문헌[J. Sambrook, EF Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual , 2d edition, Cold Spring Harbor, New York]).
    SEQ ID NO: 1의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 하위서열, 및 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 사용하여 해당 분야에 널리 공지되어 있는 방법에 따라 상이한 속 또는 종의 균주로부터 모체를 암호화하는 DNA를 확인하고 클로닝하기 위한 핵산 프로브를 설계할 수 있다. 특히, 이러한 프로브를 표준 서던 블롯팅(Southern blotting) 절차 후에, 대상 속 또는 종의 게놈 또는 cDNA와의 혼성화를 위해 사용하여, 거기에서 상응하는 유전자를 확인하고 분리할 수 있다. 이러한 프로브는 전체 서열보다 상당히 더 짧을 수 있지만, 길이가 적어도 14개, 예를 들어, 적어도 25개, 적어도 35개, 또는 적어도 70개 뉴클레오티드일 것이다. 바람직하게는, 핵산 프로브는 길이가 적어도 100개 뉴클레오티드, 예를 들어, 길이가 적어도 200개 뉴클레오티드, 적어도 300개 뉴클레오티드, 적어도 400개 뉴클레오티드, 적어도 500개 뉴클레오티드, 적어도 600개 뉴클레오티드, 적어도 700개 뉴클레오티드, 적어도 800개 뉴클레오티드, 또는 적어도 900개 뉴클레오티드이다. DNA 및 RNA 프로브 둘 모두가 사용될 수 있다. 프로브는 전형적으로 상응하는 유전자의 검출을 위해 표지된다(예를 들어, 32 P, 3 H, 35 S, 비오틴 또는 아비딘 사용). 이러한 프로브는 본 발명에 포함된다.
    이러한 다른 유기체로부터 제조된 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리는 상기 기재된 프로브와 혼성화하고 모체를 암호화하는 DNA에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 다른 유기체 유래의 게놈 또는 기타 DNA는 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 기타 분리 기술에 의해 분리될 수 있다. 라이브러리로부터의 DNA 또는 분리된 DNA는 니트로셀룰로스 또는 기타 적절한 캐리어 물질로 전달되고 그에 고정화될 수 있다. SEQ ID NO: 1 또는 그의 하위서열과 상동성인 클론 또는 DNA를 확인하기 위하여, 캐리어 물질이 서던 블롯에 사용된다.
    본 발명의 목적을 위하여, 혼성화에 의해, 폴리뉴클레오티드가 낮은 엄격성 내지 매우 높은 엄격성 조건 하에서, SEQ ID NO: 1에 나타낸 폴리뉴클레오티드, 그의 상보성 가닥 또는 그의 하위 서열에 상응하는 표지된 뉴클레오티드 프로브에 혼성화하는 것으로 나타났다. 프로브가 혼성화하는 분자는 예를 들어, X-선 필름 또는 해당 분야에 공지되어 있는 임의의 다른 검출 수단을 사용하여 검출될 수 있다.
    핵산 프로브는 SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, 즉, SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 1 내지 1785를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 핵산 프로브는 SEQ ID NO: 2의 폴리펩티드 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
    적어도 100개 뉴클레오티드 길이의 긴 프로브에 대하여, 매우 낮은 엄격성 내지 매우 높은 엄격성 조건은 최적으로 12 내지 24시간 동안의 표준 서던 블롯팅 절차에 따른, 5× SSPE, 0.3% SDS, 200 ㎍/㎖ 변형 및 변성 연어 정자 DNA, 및 매우 낮은 엄격성 및 낮은 엄격성에 대해서는 25% 포름아미드, 중간의 엄격성 및 중간 내지 높은 엄격성에 대해서는 35% 포름아미드, 또는 높은 엄격성 및 매우 높은 엄격성에 대해서는 50% 포름아미드 중 어느 하나 중의 42℃에서의 사전-혼성화 및 혼성화로 정의된다. 캐리어 물질은 45℃(매우 낮은 엄격성), 50℃(낮은 엄격성), 55℃(중간의 엄격성), 60℃(중간 내지 높은 엄격성), 65℃(높은 엄격성) 또는 70℃(매우 높은 엄격성)에서 2× SSC, 0.2% SDS를 사용하여 최종적으로 각각 15분 동안 3회 세척한다.
    약 15개 뉴클레오티드 내지 약 70개 뉴클레오티드 길이인 짧은 프로브에 대하여 엄격성 조건은 최적으로 12 내지 24시간 동안의 표준 서던 블롯팅 절차에 따른, 0.9M NaCl, 0.09M Tris HCl pH7.6, 6mM EDTA, 0.5% NP-40, 1× 덴하르트(Denhardt's) 용액, 1mM 피로인산나트륨, 1mM 제1 인산나트륨, 0.1mM ATP 및 0.2mg/㎖의 효모 RNA 중에서의, 볼튼(Bolton) 및 맥카티(McCarthy)(문헌[1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390])에 따른 계산을 사용하여 계산한 T m 보다 약 5℃ 내지 약 10℃ 낮은 온도에서의 사전-혼성화 및 혼성화로 정의된다. 캐리어 물질은 최종적으로 6× SCC + 0.1% SDS에서 15분 동안 1회, 및 각각, 계산한 T m 보다 약 5℃ 내지 약 10℃ 낮은 온도에서 6× SSC를 사용하여 15분 동안 2회 세척한다.
    모체는 알부민으로 작용할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는, SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대하여 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 일 구현예에서, 모체는 SEQ ID NO: 1을 포함하거나 이로 구성되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
    알부민 모이어티: 본 발명에 따른 알부민 변이체 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자 또는 조성물의 알부민 부분은 '알부민 모이어티' 또는 '알부민 성분'으로 지칭될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 알부민 모이어티를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
    FcRn 및 shFcRn: 용어 "FcRn"은 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 의미한다. shFcRn은 FcRn의 용해성 재조합 형태이다. hFcRn은 SEQ ID NO: 30(주요 조직적합성 복합체 분류 I-유사 Fc 수용체의 절단형 중쇄(FCGRT)) 및 SEQ ID NO: 31(베타-2-마이크로글로불린)의 헤테로다이머이다. SEQ ID NO: 30 및 31은 함께 hFcRn을 형성한다.
    분리된 변이체: 용어 "분리된 변이체"는 변이체가 천연 발생하는 적어도 하나의 성분으로부터 인위적으로 변형되고, 완전히 또는 부분적으로 분리된 변이체를 의미한다. 용어 "분리된 변이체"는 천연에서 발생하지 않는 형태 또는 환경의 변이체를 의미한다. 분리된 물질의 비제한적인 예에는 (1) 임의의 비천연 발생 변이체, (2) 변이체가 자연에서 회합되어 있는 천연 발생 구성요소 중 하나 이상(몇몇) 또는 모두로부터 적어도 부분적으로 제거된 임의의 변이체; (3) 변이체가 유도된 폴리펩티드와 비교하여 인위적으로 변형된 임의의 변이체(예를 들어, 천연에서 관찰되는 것으로서 유도되는 폴리펩티드); 또는 (4) 변이체가 천연에서 회합되어 있는 다른 성분에 비하여 변이체의 양을 증가시킴으로써 변형된 임의의 변이체(예를 들어, 물질을 암호화하는 다수 카피의 유전자; 물질을 암호화하는 유전자와 천연적으로 회합되어 있는 프로모터보다 더 강한 프로모터의 사용)가 포함된다. 분리된 변이체는 발효 브로쓰 시료에 존재할 수 있다. 변이체는 SDS-PAGE 또는 GP-HPLC에 의해 결정시 적어도 1% 순도, 예를 들어, 적어도 5% 순도, 적어도 10% 순도, 적어도 20% 순도, 적어도 40% 순도, 적어도 60% 순도, 적어도 80% 순도, 적어도 90% 순도일 수 있다.
    실질적으로 순수한 변이체: 용어 "실질적으로 순수한 변이체"는 중량 기준으로, 변이체가 천연적으로 또는 재조합에 의해 회합되어 있는 다른 폴리펩티드 물질이 최대 10%, 최대 8%, 최대 6%, 최대 5%, 최대 4%, 최대 3%, 최대 2%, 최대 1%, 및 최대 0.5% 포함된 제제를 의미한다. 바람직하게는, 변이체는 제제에 존재하는 총 폴리펩티드 물질의 중량을 기준으로, 적어도 92% 순도, 예를 들어, 적어도 94% 순도, 적어도 95% 순도, 적어도 96% 순도, 적어도 97% 순도, 적어도 98% 순도, 적어도 99% 순도, 적어도 99.5% 순도 및 100% 순도이다. 순도는 SDS-PAGE 또는 GP-HPLC에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 변이체는 바람직하게는 실질적으로 순수한 형태로 존재한다. 이는 예를 들어, 널리 공지되어 있는 재조합 방법 및 정제 방법에 의해 변이체를 제조함으로써 달성될 수 있다.
    성숙 폴리펩티드: 용어 "성숙 폴리펩티드"는 번역 및 임의의 번역후 변형, 예를 들어, N-말단 가공, C-말단 절단, 글리코실화, 인산화 등 후의 그의 최종 형태의 폴리펩티드를 의미한다. 성숙 폴리펩티드는 예를 들어, 본 발명에 따른 변경 및/또는 임의의 번역후 변형의 함유물을 갖는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 585일 수 있다.
    성숙 폴리펩티드 암호화 서열: 용어 "성숙 폴리펩티드 암호화 서열"은 성숙 알부민 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 성숙 폴리펩티드 암호화 서열은 예를 들어, 본 발명에 따른 변이체를 암호화하는데 필요한 함유물을 갖는 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 1 내지 1758일 수 있다.
    서열 동일성: 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 간의 관계는 파라미터 "서열 동일성"에 의해 기재된다.
    본 발명의 목적을 위하여, 2개의 아미노산 서열 간의 서열 동일성 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 문헌[Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277])의 니들(Needle) 프로그램, 바람직하게는 3.0.0 또는 그 이후의 버전, 더욱 바람직하게는 5.0.0 또는 그 이후의 버전에서 구현되는 바와 같이, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘(문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. MoI. Biol. 48: 443-453])을 사용하여 결정된다. 사용된 선택적 파라미터는 10의 갭 오픈 벌점, 0.5의 갭 연장 벌점 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "최장 동일성"(-nobrief 옵션을 사용하여 얻어짐)으로 표기된 니들만의 출력을 동일성 백분율로서 사용하며, 하기와 같이 계산한다:
    (동일한 잔기×100)/(정렬 길이-정렬 중 총 갭의 수).
    본 발명의 목적을 위하여, 2개의 데옥시리보뉴클레오티드 서열 간의 서열 동일성의 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 상기 문헌[Rice et al., 2000]), 바람직하게는 3.0.0 또는 그 이후의 버전, 더욱 바람직하게는 5.0.0 또는 그 이후의 버전의 니들 프로그램에서 구현되는 바와 같이, 니들만-분쉬 알고리즘(상기 문헌[Needleman and Wunsch, 1970])을 사용하여 결정된다. 사용된 선택적 파라미터는 10의 갭 오픈 벌점, 0.5의 갭 연장 벌점 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. "최장 동일성"(-nobrief 옵션을 사용하여 얻어짐)으로 표기된 니들만의 출력을 동일성 백분율로서 사용하며, 하기와 같이 계산한다:
    (동일한 데옥시리보뉴클레오티드×100)/(정렬 길이-정렬 중 총 갭의 수).
    단편: 용어 "단편"은 알부민의 아미노 및/또는 카르복실 말단으로부터 하나 이상의(몇몇의) 아미노산이 결실되고/거나 FcRn에 결합하는 능력을 유지하는 알부민의 내부 영역을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 HSA로부터 유도된 하나의 연속된(uninterrupted) 서열로 구성되거나, 단편은 HSA로부터 유도된 2개 이상의(몇몇의) 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 단편은 대략 20개 초과의 아미노산 잔기, 바람직하게는 30개 초과의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 40개 초과의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 50개 초과의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 75개 초과의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 100개 초과의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 200개 초과의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 300개 초과의 아미노산 잔기, 더더욱 바람직하게는 400개 초과의 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 500개 초과의 아미노산 잔기의 크기를 갖는다. 단편은 알부민의 하나 이상의 도메인, 예를 들어, DI + DII, DI + DIII, DII + DIII, DIII + DIII, DI + DIII + DIII, DIII + DIII + DIII, 또는 이러한 도메인의 단편 또는 도메인의 조합을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
    도메인 I, II 및 III은 HSA(SEQ ID NO: 2)를 참조로 정의될 수 있다. 예를 들어, HSA 도메인 I은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 1 내지 194(± 1 내지 15개 아미노산)로 구성되거나 이를 포함할 수 있으며, HSA 도메인 II는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 192(± 1 내지 15개 아미노산) 내지 387(± 1 내지 15개 아미노산)로 구성되거나 이를 포함할 수 있으며, 도메인 III은 SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 381(± 1 내지 15개 아미노산) 내지 585(± 1 내지 15개 아미노산)로 구성되거나 이를 포함할 수 있다. "± 1 내지 15개 아미노산"은 잔기 번호가 언급된 아미노산 위치의 C-말단 및/또는 N-말단에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 만큼 벗어날 수 있음을 의미한다. 도메인 I, II 및 III의 예는 도칼(Dockal) 등(문헌[The Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274 (41): 29303-29310]) 및 켈드센(Kjeldsen) 등(문헌[Protein Expression and Purification, 1998, Vol 13: 163-169])에 의해 기술되었으며, 하기에 표로 작성되어 있다.


    해당 분야의 숙련자는 예를 들어, EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 문헌[Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277])의 니들 프로그램, 바람직하게는 3.0.0 또는 그 이후의 버전, 더욱 바람직하게는 5.0.0 또는 그 이후의 버전에서 구현되는 바와 같이, 니들만-분쉬 알고리즘(문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. MoI. Biol. 48: 443-453])을 사용하여, HSA와의 아미노산 서열 정렬에 의해 비인간 알부민에서 도메인 I, II 및 III을 확인할 수 있다. 사용된 선택적 파라미터는 10의 갭 오픈 벌점, 0.5의 갭 연장 벌점 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. 다른 적절한 소프트웨어에는 사용자 가이드(User Guide)(버전 3.6, 2005년 9월)에 기술된 바와 같은 디폴트 셋팅과 함께 사용될 수 있는 MUSCLE(로그-예측에 의한 다중 서열 비교, 문헌[Robert C. Edgar, Version 3.6], http://www.drive5.com/muscle; 문헌[Edgar (2004) Nucleic Acids Research 32(5), 1792-97] 및 문헌[Edgar (2004) BMC Bioinformatics, 5(1):113])이 포함된다. 3.6 이후의 MUSCLE의 버전도 또한 본 발명의 임의의 양태를 위해 사용될 수 있다. 적절한 정렬의 예는 도 1 및 도 2에 제공된다.


    도메인이 HSA(SEQ ID NO: 2)의 도메인 I, II 또는 III에 대하여 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5% 동일성 또는 100% 동일성을 갖는 것이 바람직하다.


    대립형질 변이체 : 용어 "대립형질 변이체"는 동일한 염색체 유전자좌를 차지하는 유전자의 임의의 둘 이상의(몇몇의) 대안적 형태를 의미한다. 대립형질 변이는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하며, 모집단 내 다형성을 초래할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵형(암호화된 폴리펩티드에서 변화 없음)일 수 있거나 또는 변경된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 폴리펩티드의 대립형질 변이체는 유전자의 대립형질 변이체에 의해 암호화되는 폴리펩티드이다.


    암호화 서열 : 용어 "암호화 서열"은 그의 번역된 단백질 생성물의 아미노산 서열을 직접 명시하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 암호화 서열의 경계는 일반적으로 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에 의해 결정되며, 이는 보통 ATG 출발 코돈 또는 대안적인 출발 코돈, 예를 들어, GTG 및 TTG로 시작하여 종결 코돈, 예를 들어, TAA, TAG, 및 TGA로 종결된다. 암호화 서열은 DNA, cDNA, 합성, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드일 수 있다.


    cDNA : 용어 "cDNA"는 진핵 세포로부터 수득한 성숙, 스플라이스된, mRNA 분자로부터 역전사에 의해 제조될 수 있는 DNA 분자를 의미한다. cDNA는 상응하는 게놈의 DNA에 존재할 수 있는 인트론 서열이 결여되어 있다. 초기의, 일차 RNA 전사물은 스플라이스된 성숙 mRNA가 나타나기 전에 스플라이싱을 포함하는 일련의 단계를 통해 가공되는 mRNA에 대한 전구체이다.


    핵산 작제물 : 용어 "핵산 작제물"은 천연 발생 유전자로부터 분리되거나, 또는 그 밖에 천연에서 존재하지 않는 방식으로 핵산의 세그먼트를 함유하도록 변형되거나, 또는 합성인 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자를 의미한다. 용어 핵산 작제물은 핵산 작제물이 본 발명의 암호화 서열의 발현을 위해 필요한 조절 서열을 함유하는 경우에 용어 "발현 카세트"와 동의어이다.


    조절 서열 : 용어 "조절 서열"은 본 발명의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 모든 성분(예를 들어, 핵산 서열)을 의미한다. 각 조절 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 고유(native, 즉, 동일한 유전자로부터) 또는 외래(즉, 상이한 유전자로부터)일 수 있거나 또는 서로 고유 또는 외래일 수 있다. 이러한 조절 서열은, 제한되는 것은 아니지만, 리더(leader), 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열 및 전사 터미네이터를 포함한다. 최소한으로, 조절 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함한다. 조절 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 암호화 영역 내의 조절 서열의 라이게이션을 용이하게 하는 특정 제한 위치를 도입하는 목적을 위한 링커와 함께 제공될 수 있다.


    작동가능하게 연결된 : 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열이 폴리뉴클레오티드 서열의 암호화 서열에 대해 적절한 위치에 위치하여 조절 서열이 암호화 서열의 발현을 지시하는 구성을 의미한다.


    발현 : 용어 "발현"은 제한되는 것은 아니지만, 전사, 전사-후 변형, 번역, 번역-후 변형 및 분비를 포함하는 변이체의 생성에 수반되는 임의의 단계를 포함한다.


    발현 벡터 : 용어 "발현 벡터"는 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 그의 발현을 가능하게 하는 추가의 뉴클레오티드(예를 들어, 조절 서열)에 작동가능하게 연결되는 선형 또는 원형 DNA 분자를 의미한다.


    숙주 세포 : 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물 또는 발현 벡터로 형질전환, 트랜스펙션(transfection), 형질도입되기 쉬운 등등의 임의의 세포 유형을 의미한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안 발생하는 돌연변이 때문에 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포함한다.


    혈장 반감기 : 혈장 반감기는 이상적으로는 적절한 개체에서 생체내에서 결정된다. 그러나, 그것은 시간이 소모되고, 비용이 많이 들고, 불가피하게, 동물 또는 인간에서 실험을 행하는 것과 관련된 윤리 문제가 존재하기 때문에, 혈장 반감기가 연장되거나 감소되는지를 결정하기 위하여 시험관 내 분석을 사용하는 것이 바람직하다. 알부민의 그의 수용체 FcRn으로의 결합이 혈장 반감기에 중요하며, 수용체 결합과 혈장 반감기의 상관관계는 알부민의 그의 수용체로의 보다 큰 친화성이 보다 긴 혈장 반감기를 야기하는 것임이 알려져 있다. 따라서, 본 발명에 있어서, 알부민의 FcRn에 대한 보다 큰 친화성은 증가된 혈장 반감기를 나타내는 것으로 여겨지며, 알부민의 그의 수용체에 대한 보다 낮은 친화성은 감소된 혈장 반감기를 나타내는 것으로 여겨진다.


    본 출원 및 특허청구범위에서, 알부민의 그의 수용체 FcRn으로의 결합은 친화성이라는 용어 및 "보다 강한" 또는 "보다 약한"이라는 표현으로 기재된다. 따라서, FcRn에 대한 친화성이 HSA보다 더 높은 분자는 HSA보다 더 강하게 FcRn에 결합하며, FcRn에 대한 친화성이 HSA보다 더 낮은 분자는 HSA보다 더 약하게 FcRn에 결합하는 것으로 고려되는 것이 이해되어야 한다.


    용어 "보다 긴 혈장 반감기" 또는 "보다 짧은 혈장 반감기" 및 유사한 표현은 상응하는 모체 또는 참조물질 또는 상응하는 알부민 분자와 관계가 있는 것이 이해된다. 따라서, 본 발명의 변이체 알부민에 대하여, 보다 긴 혈장 반감기는 변이체가 예를 들어, (예를 들어, SEQ ID NO: 2에서) 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 위치 및 도메인 III 내의 하나 이상의(몇몇의) 위치에서의 본 명세서에 기재된 변경(들)을 제외하고 동일한 서열을 갖는 상응하는 알부민보다 더 긴 혈장 반감기를 갖는 것을 의미한다.


    참조물질: 참조물질은 알부민 변이체, 융합체, 컨쥬게이트, 조성물, 회합물 또는 나노입자가 비교되는 알부민, 융합체, 컨쥬게이트, 조성물, 회합물 또는 나노입자이다. 참조물질은 전장 알부민(예를 들어, HSA 또는 그의 천연 대립형질) 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 또한, 참조물질은 알부민 변이체, 융합체, 컨쥬게이트, 조성물, 회합물 또는 나노입자가 비교되는 "상응하는" 알부민, 융합체, 컨쥬게이트, 조성물, 회합물 또는 나노입자로 지칭될 수 있다. 참조물질은 HSA(SEQ ID NO: 2) 또는 그의 단편, 융합체, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자 또는 마이크로입자를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 참조물질은 알부민 모이어티를 제외하고, 본 발명에 따른("연구 중인") 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 조성물, 회합물, 나노입자 또는 마이크로입자와 동일하다. 바람직하게는, 참조물질의 알부민 모이어티는 알부민(예를 들어, HSA, SEQ ID NO: 2) 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 구성된다. 참조물질의 알부민 모이어티의 아미노산 서열은 본 발명에 따른("연구 중인") 폴리펩티드, 융합 폴리펩티드, 컨쥬게이트, 조성물, 회합물, 나노입자 또는 마이크로입자의 알부민 모이어티의 아미노산 서열보다 더 길거나, 더 짧거나, 바람직하게는 동일한 길이(± 1 내지 15개 아미노산)일 수 있다.


    동등한 아미노산 위치: 본 명세서에서, 아미노산 위치는 전장 성숙 인간 혈청 알부민(즉, 리더 서열 없음, SEQ ID NO: 2)과 비교하여 정의된다. 그러나, 해당 분야의 숙련자는 본 발명이 또한 비-인간 알부민의 변이체, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 것들 및/또는 인간 또는 비-인간 알부민의 단편에 관한 것임을 이해한다. 쌍별(예를 들어, ClustalW) 또는 다중(예를 들어, MUSCLE) 정렬을 사용하여 아미노산 서열을 비교함으로써 인간 혈청 알부민의 단편에서, 동물 알부민에서, 및 그의 단편, 융합체 및 기타 유도체 또는 변이체에서 동등한 위치가 확인될 수 있다. 예를 들어, 도 1은 전장 인간 혈청 알부민에서 500, 550 및 573과 동등한 위치가 인간 혈청 알부민의 단편 및 다른 종의 알부민에서 용이하게 확인될 수 있음을 보여준다. 위치 500, 550 및 573은 화살표로 표시된다. 추가의 상세사항은 하기 표에 제공된다.



    도 1은 ClustalW 1.81 포맷에서의 출력을 포함하는 디폴트 파라미터를 사용하여 MUSCLE에 의해 생성하였다. 미가공 출력 데이터를 출력 포맷: RTF_new; 폰트 크기: 10; 컨센서스 라인(Consensus Line): 컨센서스 라인 없음; 서열의 분율(음영과 일치해야 함): 0.5; 입력 서열 포맷: ALN을 사용하는 BoxShade 3.21(

    http://www.ch.embnet.org/software/BOX form.html )을 사용하여 음영화된다. 따라서, 본 명세서에서, 인간 혈청 알부민에서 정의된 아미노산 위치는 또한 인간 혈청 알부민의 단편, 유도체 또는 변이체 및 융합체, 다른 종 유래의 동물 및 이의 단편 및 융합체에서 동등한 위치에 적용된다. 이러한 동등한 위치는 (i) 그의 고유 단백질과 상이한 잔기 개수 및/또는 (ii) 그의 고유 단백질과 상이한 고유 아미노산을 가질 수 있다.


    마찬가지로, 도 2는 동등한 위치가 SEQ ID NO: 2(HSA)와 관련하여 알부민의 단편(예를 들어, 도메인)에서 확인될 수 있는 것을 보여준다.


    변이체의 표기에 대한 합의


    본 발명의 목적을 위하여, SEQ ID NO: 2에 개시된 성숙 폴리펩티드를 사용하여, 다른 알부민에서 상응하는 아미노산 잔기를 결정한다. 다른 알부민의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 2에 개시된 성숙 폴리펩티드와 정렬시키고, 정렬에 기초하여, SEQ ID NO: 2에 개시된 성숙 폴리펩티드 내의 임의의 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 위치 번호는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 문헌[Rice et al., 2000,

    Trends genet .

    16 : 276-277]), 바람직하게는 3.0.0 또는 그 이후 버전, 더욱 바람직하게는 5.0.0 또는 그 이후 버전의 니들 프로그램에서 구현되는 바와 같이, 니들만-분쉬 알고리즘(문헌[Needleman and Wunsch, 1970,

    J. Mol. Biol.

    48 : 443-453])을 사용하여 결정된다.


    다른 알부민에서의 상응하는 아미노산 잔기의 확인은 그들 각각의 디폴트 파라미터를 사용하여, "ClustalW"(문헌[Larkin et al., 2007, Bioinformatics 23: 2947-2948]), MUSCLE(로그-예측에 의한 다중 서열 비교; 3.5 또는 그 이후 버전; 문헌[Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797]), MAFFT(6.857 또는 그 이후 버전; 문헌[Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066]; 문헌[Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518]; 문헌[Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374]; 문헌[Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64]; 문헌[Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26:_1899-1900]), 및 ClustalW를 사용하는 EMBOSS EMMA(1.83 또는 그 이후; 문헌[Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680])를 포함하나 이들에 한정되지 않는 적절한 컴퓨터 프로그램을 사용한 다중 폴리펩티드 서열의 정렬에 의해 결정되거나 확인될 수 있다.


    종래의 서열 기반의 비교에 의해 다른 폴리펩티드(또는 단백질)와 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드의 관계를 검출하지 못하게, 다른 폴리펩티드(또는 단백질)가 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드로부터 분기하는 경우(문헌[Lindahl and Elofsson, 2000,

    J. Mol. Biol.

    295 : 613-615]), 다른 쌍별 서열 비교 알고리즘이 사용될 수 있다. 서열 기반의 검색에서의 보다 큰 감수성은 폴리펩티드 패밀리의 확률적 표현(프로파일)을 사용하여 데이터베이스를 검색하는 검색 프로그램을 사용하여 유지될 수 있다. 예를 들어, PSI-BLAST 프로그램은 반복적 데이터베이스 검색 프로세스를 통해 프로파일을 생성하며, 원위 상동체를 검출할 수 있다(문헌[Atschul

    et al. , 1997,

    Nucleic Acids Res.

    25 : 3389-3402]). 폴리펩티드에 대한 패밀리 또는 슈퍼패밀리가 단백질 구조 데이터베이스에서 하나 이상의(몇몇의) 표현을 갖는다면, 더더욱 큰 감수성이 달성될 수 있다. 프로그램, 예를 들어, GenTHREADER(문헌[Jones, 1999,

    J. Mol. Biol.

    287 : 797-815]; 문헌[Mc Guffin and Jones, 2003,

    Bioinformatics

    19 : 874-881])은 쿼리 서열에 대한 구조적 폴드(fold)를 예측하는 신경망에 대한 입력으로서 다양한 공급원(PSI BLAST, 2차 구조 예측, 구조 정렬 프로파일 및 용매화 능력)으로부터의 정보를 사용한다. 유사하게, 문헌[Gough

    et al. , 2000,

    J. Mol.

    Biol.

    313 : 903-919]의 방법을 사용하여 미공지된 구조의 서열을 SCOP 데이터베이스에 존재하는 슈퍼패밀리 모델과 정렬할 수 있다. 차례로, 이들 정렬을 사용하여, 폴리펩티드에 대한 상동성 모델을 생성할 수 있으며, 이러한 모델은 그 목적을 위해 개발된 다양한 도구를 사용하여 정확성에 대해 평가될 수 있다.


    공지된 구조의 단백질을 위하여, 몇몇 도구 및 자원이 구조 정렬을 검색하고 생성하는데 이용가능하다. 예를 들어, 단백질의 SCOP 슈퍼패밀리가 구조적으로 정렬되었고, 그들 정렬은 이용가능하며 다운로드가 가능하다. 둘 이상의 단백질 구조를 다양한 알고리즘, 예를 들어, 거리 정렬 매트릭스(문헌[Holm and Sander, 1998,

    Proteins

    33 : 88-96]) 또는 조합 연장(문헌[Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747])을 사용하여 정렬할 수 있으며, 이들 알고리즘의 구현을 추가로 사용하여, 대상 구조를 갖는 구조 데이터베이스를 질의하여, 가능한 구조적 상동체를 발견할 수 있다(예를 들어, 문헌[Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567]).


    본 발명의 알부민 변이체를 기재함에 있어서, 하기에 기재된 명명법은 참조의 용이성을 위하여 조정된다. 용인된 IUPAC 1-문자 또는 3-문자 아미노산 약어가 사용된다. 용어 '점 돌연변이' 및/또는 '변경'은 결실, 삽입 및 치환을 포함한다.


    치환 . 아미노산 치환을 위해, 하기 명명법이 사용된다: 원래 아미노산, 위치, 치환된 아미노산. 따라서 위치 226의 트레오닌의 알라닌으로의 치환은 "Thr226Ala" 또는 "T226A"로서 표기된다. 다수의 돌연변이(또는 변경)가 부가 표시("+")에 의해 분리되며, 예를 들어, "Gly205Arg+Ser411Phe" 또는 "G205R+S411F"는 각각 위치 205 및 411에서 글리신(G)의 아르기닌(R)으로의 치환 및 세린(S)의 페닐알라닌(F)으로의 치환을 나타낸다. 또한, 도면에서는 ("/"), 예를 들어, "E492T/N503D"를 사용하며, 이는 ("+")와 상호교환가능한 것으로 보아야 한다.


    결실 . 아미노산 결실을 위해 하기의 명명법이 사용된다: 원래 아미노산, 위치

    * . 따라서, 위치 195에서 글리신의 결실은 "Gly195

    * " 또는 "G195

    * "로 표기된다. 다수의 결실은 부가 표시("+")에 의해 분리되며, 예를 들어, "Gly195

    * +Ser411

    * " 또는 "G195

    * +S411

    * "이다.


    삽입 . 상기 개시된 바와 같이, 삽입은 소정의 위치를 차지하는 아미노산('표기된(또는 원래) 아미노산', 'X')의 N-측('업스트림', 'X-1') 또는 C-측('다운스트림', 'X+1')에 이루어질 수 있다.


    원래 아미노산('X')의 C-측('다운스트림', 'X+1')으로의 아미노산 삽입을 위하여, 하기의 명명법이 사용된다: 원래 아미노산, 위치, 원래 아미노산, 삽입 아미노산. 따라서, 위치 195에서 글리신 뒤의 라이신의 삽입은 "Gly195GlyLys" 또는 "G195GK"로 표기된다. 다수 아미노산의 삽입은 [원래 아미노산, 위치, 원래 아미노산, 삽입 아미노산 #1, 삽입 아미노산 #2 등]으로 표기된다. 예를 들어, 위치 195에서 글리신 뒤의 라이신 및 알라닌의 삽입은 "Gly195GlyLysAla" 또는 "G195GKA"로 표기된다.


    이러한 경우, 삽입 아미노산 잔기(들)는 삽입 아미노산 잔기(들) 앞의 아미노산 잔기의 위치 번호에 대한 소문자의 부가에 의해 넘버링된다. 이에 따라, 상기 예에서, 서열은 하기와 같을 것이다:



    원래 아미노산(X)의 N-측('업스트림', 'X-1')으로의 아미노산 삽입에 대하여, 하기의 명명법이 사용된다: 원래 아미노산, 위치, 삽입된 아미노산, 원래 아미노산. 이에 따라 위치 195에서 글리신(G) 전의 라이신(K)의 삽입은 "Gly195LysGly" 또는 "G195KG"로 표기된다. 다수의 아미노산의 삽입은 [원래 아미노산, 위치, 삽입된 아미노산 #1, 삽입된 아미노산 #2 등, 원래 아미노산]으로 표기된다. 예를 들어, 위치 195에서의 글리신 전의 라이신(K) 및 알라닌(A)의 삽입은 "Gly195LysAlaGly" 또는 "G195KAG"로 표기된다. 이러한 경우에, 삽입된 아미노산 잔기(들)는 삽입된 아미노산 잔기(들) 다음의 아미노산 잔기의 위치 번호에 대한 프라임이 있는 소문자의 부가에 의해 넘버링된다. 이에 따라, 상기 예에서, 서열은 하기와 같을 것이다:



    다중의 변경 . 다수의 변경을 포함하는 변이체는 부가 표시("+")에 의해 분리되며, 예를 들어, "Arg170Tyr+Gly195Glu" 또는 "R170Y+G195E"는 각각 위치 170 및 195에서 아르기닌 및 글리신의 티로신 및 글루탐산으로의 치환을 나타낸다.


    상이한 변경(예를 들어, 치환) . 상이한 변경(예를 들어, 치환)이 소정의 위치에 도입될 수 있는 경우, 상이한 변경(예를 들어, 치환)은 컴마에 의해 분리되며, 예를 들어, "Arg170Tyr,Glu"는 위치 170에서 아르기닌의 티로신 또는 글루탐산으로의 치환을 나타낸다. 따라서, "Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala"는 하기의 변이체를 표기한다:


    "Tyr167Gly+Arg170Gly", "Tyr167Gly+Arg170Ala", "Tyr167Ala+Arg170Gly" 및 "Tyr167Ala+Arg170Ala".


    발명의 상세한 설명


    본 발명은 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드의 도메인 I 내의 위치에서의 변경 및 도메인 III 내의 위치에서의 변경, 또는 다른 알부민 또는 그의 단편에서의 동등한 위치에서의 변경을 포함하는 알부민 변이체에 관한 것이다.


    변이체


    본 발명의 제1 양태는 변이체 알부민 또는 그의 단편인 폴리펩티드, 또는 알부민, 예를 들어, HSA(SEQ ID NO: 2)의 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경, 및 알부민, 예를 들어, HSA(SEQ ID NO: 2)의 도메인 III 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경을 포함하는 모 알부민의 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다.


    모 알부민 및/또는 변이체 알부민이 다음을 포함하거나 이로 구성되는 것이 바람직하다:


    (a) SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드에 대하여 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;


    (b) 낮은 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, 또는 (ii) (i)의 전장 상보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;


    (c) SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대하여 적어도 60% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및/또는


    (d) SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드의 단편.


    알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드의 도메인 I 내의 위치에서의 하나 이상의(몇몇의) 변경, 예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입, 및 도메인 III 내의 위치에서의 하나 이상의(몇몇의) 변경, 예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입, 또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치에서의 하나 이상의(몇몇의) 변경, 예를 들어, 치환, 결실 또는 삽입을 포함한다. 종결 코돈이 본 명세서에 기재된 변경에 더하여 도입될 수 있으며, 도입된다면, 위치 574 또는 더욱 다운스트림에 도입된다(예를 들어, SEQ ID NO: 2에서, 이는 위치 574 내지 585에 도입된다).


    변이체 알부민, 그의 단편, 또는 본 발명에 따른 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분은 일반적으로, SEQ ID NO: 2에 나타낸 HSA의 서열에 대하여 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 변이체는 SEQ ID NO: 2에 대하여 100% 미만의 동일성을 갖는다.


    본 발명에 따른 변이체 알부민, 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 알부민 부분은 일반적으로, 모 알부민의 서열에 대하여 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 96%, 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는다. 변이체는 모 알부민의 서열에 대하여 100% 미만의 동일성을 갖는다.


    일 양태에서, 본 발명의 변이체에서의 변경의 개수는 SEQ ID NO: 2에 대한 또는 모 알부민의 서열에 대한, 1 내지 20개, 예를 들어, 1 내지 10개 및 1 내지 5개, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 변경이다.


    도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경은 HSA(SEQ ID NO: 2)의 위치 78 내지 88(즉, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88) 및/또는 105 내지 120(즉, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120)에 상응하는 위치로부터 선택될 수 있다. HSA에서, 위치 78 내지 88은 루프를 형성하며, 위치 105 내지 120은 루프를 형성한다. 이에 따라, 다른 알부민의 동등한 루프에서의 위치도 또한 본 발명에 포함된다. 바람직한 잔기는 잔기 81 내지 85, 특히 82 및 83, 및 잔기 110 내지 114, 특히 111 및 112이다.


    SEQ ID NO: 2의 위치 82(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서, 변경이 예를 들어, 고유 아미노산으로부터 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, 더욱 바람직하게는 Q, D 또는 A, 더더욱 바람직하게는 D 또는 A, 가장 바람직하게는 A로의 치환인 것이 바람직하다. SEQ ID NO: 2에서, 위치 82에서의 고유 아미노산은 글루탐산이며, 이에 따라, 글루탐산으로의 치환은 바람직하지 않다.


    SEQ ID NO: 2의 위치 83(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서, 변경이 예를 들어, 고유 아미노산으로부터 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, 더욱 바람직하게는 N, K 또는 S, 더더욱 바람직하게는 N 또는 K, 가장 바람직하게는 N으로의 치환인 것이 바람직하다. SEQ ID NO: 2에서, 위치 82에서의 고유 아미노산은 트레오닌이며, 이에 따라, 트레오닌으로의 치환은 바람직하지 않다.


    SEQ ID NO: 2의 위치 111(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서, 변경이 예를 들어, 고유 아미노산으로부터 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, 더욱 바람직하게는 N, E, Q, D, G 또는 H, 더더욱 바람직하게는 E 또는 Q, 가장 바람직하게는 E로의 치환인 것이 바람직하다. SEQ ID NO: 2에서, 위치 111에서의 고유 아미노산은 아스파라긴이며, 이에 따라, 아스파라긴으로의 치환은 바람직하지 않다.


    SEQ ID NO: 2의 위치 112(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서, 변경이 예를 들어, 고유 아미노산으로부터 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, 더욱 바람직하게는 F, Y 또는 W, 더더욱 바람직하게는 F 또는 Y, 가장 바람직하게는 F로의 치환인 것이 바람직하다. SEQ ID NO: 2에서, 위치 112에서의 고유 아미노산은 류신이며, 이에 따라, 류신으로의 치환은 바람직하지 않다.


    SEQ ID NO: 2의 위치 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서, 변경이 예를 들어, 고유 아미노산으로부터 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y, 더욱 바람직하게는 P, Y, W, H, F, T, I 또는 V, 더더욱 바람직하게는 P, Y 또는 W, 가장 바람직하게는 P로의 치환인 것이 바람직하다. SEQ ID NO: 2에서, 위치 573에서의 고유 아미노산은 라이신이며, 이에 따라, 라이신으로의 치환은 바람직하지 않다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82 및 83(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82 및 111(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82 및 112(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 83 및 111(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 83 및 112(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 83 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 111 및 112(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 111 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 112 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82, 83 및 111(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82, 83 및 112(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82, 83 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82, 111 및 112(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82, 111 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82, 112 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 83, 111 및 112(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 83, 111 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 83, 112 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 111, 112 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82, 83, 111 및 112(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82, 83, 111 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82, 83, 112 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82, 111, 112 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 83, 111, 112 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 82, 83, 111, 112 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 425 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 505 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 527 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    알부민 변이체는 알부민, 변이체 또는 그의 단편, 특히 SEQ ID NO: 2의 변경, 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 위치 534 및 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 치환을 포함할 수 있다.


    특히 바람직한 알부민 변이체는 치환 T83N/N111E(예를 들어, SEQ ID NO: 32); T83N/N111E/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 33); T83N/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 34); T83K/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 38); E82A/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 39); L112F/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 40); E82D/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 43); P110G/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 44); N111D/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 60); N111G/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 61); N111H/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 62); E425A/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 64); E505Q/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 65); T527M/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 66); N111E/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 68); K534V/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 73); N111Q/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 74)를 포함하며, 이는 HSA(SEQ ID NO: 2)를 참조로 기재된다. 다른 바람직한 알부민 변이체는 HSA(SEQ ID NO: 2) 이외의 알부민에서의 동등한 치환을 포함한다.


    또한, 본 발명에 따른 알부민 변이체는 HSA(SEQ ID NO: 2)의 78 내지 88(78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91) 및/또는 105 내지 120(105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120) 및/또는 425, 505, 510, 512, 524, 527, 531, 534, 569, 575로부터 선택되는 위치 또는 다른 알부민의 동등한 위치에서의 하나 이상의(몇몇의) 변경을 포함할 수 있다. 바람직한 변경은 본 발명의 제1 양태에서 이들 위치에 대해 기재된 것들과 같은 치환이다. 특히 바람직한 치환은 D108A(SEQ ID NO: 59); D108E(예를 들어, SEQ ID NO: 70); N109K(예를 들어, SEQ ID NO: 69); P110G(예를 들어, SEQ ID NO: 42); N111D(예를 들어, SEQ ID NO: 46); N111E(예를 들어, SEQ ID NO: 67); N111G(예를 들어, SEQ ID NO: 48); N111H(예를 들어, SEQ ID NO: 49); N111K(예를 들어, SEQ ID NO: 54); L112F(예를 들어, SEQ ID NO: 37); E425A(예를 들어, SEQ ID NO: 63); E425K(예를 들어, SEQ ID NO: 55); E505Q(예를 들어, SEQ ID NO: 45); H510D(예를 들어, SEQ ID NO: 57); D512E(예를 들어, SEQ ID NO: 50); K524A(예를 들어, SEQ ID NO: 51); T527A(예를 들어, SEQ ID NO: 52); T527M(예를 들어, SEQ ID NO: 47); E531H(예를 들어, SEQ ID NO: 53); K534V(예를 들어, SEQ ID NO: 56); A569S(예를 들어, SEQ ID NO: 58); L575F(예를 들어, SEQ ID NO: 72); E82A(예를 들어, SEQ ID NO: 36); E82D(예를 들어, SEQ ID NO: 41); T83K(예를 들어, SEQ ID NO: 35); T83N(예를 들어, SEQ ID NO: 71)을 포함하며, 이는 HSA(SEQ ID NO: 2)를 참조로 기재된다. 하나 이상의(몇몇의) 변경을 포함하는 다른 바람직한 알부민 변이체는 HSA(SEQ ID NO: 2) 이외의 알부민에서의 동등한 치환을 포함할 수 있다.


    변이체 알부민, 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드가 상응하는 모체 또는 참조 알부민, 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드와 비교하여, FcRn에 대한 변경된 결합 친화성 및/또는 변경된 혈장 반감기 및/또는 FcRn에 대한 변경된 결합 친화성을 갖는 것이 바람직하다.


    특히 바람직한 구현예에서, 모체 또는 참조 알부민은 HSA(SEQ ID NO: 2)이고, 변이체 알부민, 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 HSA, 상응하는 단편 또는 HSA 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 비하여 FcRn에 대한 변경된 결합 친화성 및/또는 변경된 혈장 반감기, 및/또는 FcRn에 대한 변경된 결합 친화성을 갖는다.


    알부민의 그의 수용체에 대한 결합과, 혈장 반감기 간의 상관관계는 HSA D494N의 천연 발생 대립형질에 기초하여, 본 발명자에 의해 인식되었다. 본 발명자들은 이전에 이러한 대립형질을 분석하였으며, 그것이 그의 수용체 FcRn에 대하여, 야생형 HSA의 FcRn에 대한 친화성보다 더 낮은 친화성을 갖는 것을 발견하였다.


    또한, 천연 마우스 FcRn이 인간 FcRn으로 대체된 트랜스제닉(transgenic) 마우스가 정상 마우스보다 더 높은 혈청 알부민 수준을 갖는 것이 개시되었다(문헌[J Exp Med. (2003)

    197 (3):315-22]). 본 발명자들은 인간 FcRn이 마우스 혈청 알부민에 대하여 갖는 친화성이, 마우스 FcRn이 마우스 혈청 알부민에 대하여 갖는 친화성보다 보다 높은 것을 이전에 발견하였으며, 이에 따라, 트랜스제닉 마우스에서의 혈청 알부민의 증가가 혈청 알부민과 그의 수용체 간의 보다 높은 친화성에 상응한다는 관찰은, FcRn에 대한 알부민 결합과 혈장 반감기 간의 상관관계를 확인시켜준다. 또한, FcRn에 대한 결합이 거의 없거나, 그에 대한 결합이 없는 알부민의 변이체는 마우스 모델에서 감소된 반감기를 갖는 것으로 나타났다(문헌[Kenanova

    et al (2009)

    J. Nucl. Med. ;

    50 (Supplement 2): 1582]).


    FcRn에 대한 변이체 알부민의 친화성이 모체 또는 참조 알부민보다 더 높거나 더 낮은 지를 결정하기 위한 한가지 방법은 후술되는 바와 같은 표면 플라스몬 공명 분석(Surface Plasmon Resonance assay, SPR)을 사용하는 것이다. 해당 분야의 숙련자는 FcRn에 대한 변이체 알부민의 친화성이 FcRn에 대한 모체 또는 참조 알부민의 친화성보다 더 높은지 더 낮은지를 결정하는데 다른 방법, 예를 들어, 결합 상수 KD의 결정 및 비교가 유용할 수 있음을 이해할 것이다. 제1 분자(예를 들어, 리간드)와 제2 분자(예를 들어, 수용체) 간의 결합 친화성(KD)은 KD=k

    d /k

    a 에 따른 회합(온-속도(on-rate), k

    a ) 및 해리(오프-속도(off-rate), k

    d )에 대한 반응속도 상수의 함수이다. 따라서, 본 발명에 따라, 천연 HSA에 대한 KD보다 더 낮은 KD를 갖는 변이체 알부민은 HSA보다 더 높은 혈장 반감기를 갖는 것으로 여겨지며, 천연 HSA에 대한 KD보다 더 높은 KD를 갖는 변이체 알부민은 HSA보다 더 낮은 혈장 반감기를 갖는 것으로 여겨진다.


    본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 모체 또는 참조 알부민 또는 그의 단편, 또는 모체 또는 참조 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 혈장 반감기보다 더 긴 혈장 반감기 및/또는 더 강한 FcRn에 대한 결합 친화성을 갖는다.


    추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 모체 또는 참조 알부민 또는 그의 단편, 또는 모체 또는 참조 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 혈장 반감기보다 더 짧은 혈장 반감기 및/또는 FcRn에 대한 더 약한 결합 친화성을 갖는다.


    도메인 I(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 루프 78 내지 88 내 및/또는 루프 105 내지 120 내) 및 III 내의 위치(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서의 변경에 더하여, 본 발명에 따른 변이체 알부민 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 분자의 다른 위치에서의 추가의 치환, 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 이러한 추가의 치환, 결실 또는 삽입은 분자의 다른 특성, 예를 들어, 비제한적으로, 변경된 글리코실화; 표면의 반응성 기, 예를 들어, 티올기의 도입, 카르바모일화 부위의 제거/생성 등을 변경시키는 데 유용할 수 있다.


    표면 상에 반응성 잔기를 제공하기 위해 변경될 수 있으며, 본 발명에 유리하게 적용될 수 있는 잔기는 WO2010/092135호(본 명세서에 참조로 포함)에 기재되어 있다. 특히 바람직한 잔기는 SEQ ID NO: 2의 위치에 상응하는 위치를 포함한다.


    표면 상에 반응성 티올기를 제공하기 위하여, SEQ ID NO: 2에서, 또는 다른 알부민의 상응하는 위치에서 이루어질 수 있는 변경의 예로서, SEQ ID NO: 2에서의 하기의 변경에 상응하는 변경이 포함된다: L585C, D1C, A2C, D562C, A364C, A504C, E505C, T79C, E86C, D129C, D549C, A581C, D121C, E82C, S270C, A578C, L595LC, D1DC, A2AC, D562DC, A364AC, A504AC, E505EC, T79TC, E86EC, D129DC, D549DC, A581AC, A581AC, D121DC, E82EC, S270SC, S579AC, C360

    * , C316

    * , C75

    * , C168

    * , C558

    * , C361

    * , C91

    * , C124

    * , C169

    * 및 C567

    * . 대안적으로, 시스테인 잔기는 알부민의 N 또는 C 말단에 부가될 수 있다. 용어 '반응성 티올'은 시스테인에 이황화 결합되지 않고/거나 파트너, 예를 들어, 컨쥬게이션 파트너에 대한 결합에 입체적으로 이용가능한 Cys에 의해 제공되는 티올기를 의미하고/거나 포함한다.


    융합 폴리펩티드


    본 발명의 제2 양태는 융합 폴리펩티드에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 알부민의 변이체 또는 그의 단편은 비-알부민 폴리펩티드 융합 파트너와 융합될 수 있다. 융합 파트너는 원칙적으로, 임의의 폴리펩티드일 수 있으나, 일반적으로, 융합 파트너가 치료, 예방(백신 포함), 진단, 영상화 또는 기타 유익한 특성을 갖는 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 이러한 특성은 '약제학적으로 유익한 특성'으로 지칭될 수 있다. 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 해당 분야에 공지되어 있다. 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 이러한 융합 폴리펩티드 및 융합 파트너 폴리펩티드가 단독의 융합되지 않은 융합 파트너 폴리펩티드에 비하여 더 긴 혈장 반감기를 갖는 것이 관찰되었다. 본 발명에 따라, 종래 기술의 상응하는 융합 폴리펩티드에 비하여, 본 발명에 따른 융합 폴리펩티드의 혈장 반감기를 변경시킬 수 있다. '변경'은 혈장 반감기의 증가 및 혈장 반감기의 감소 둘 모두를 포함한다. 혈장 반감기의 증가가 바람직하다. 본 발명은 요망되는 기간으로의 반감기의 맞춤화를 가능하게 한다.


    하나 이상의(몇몇의) 치료, 예방(백신 포함), 진단, 영상화 또는 기타 유익한 것은 알부민의 N-말단, C-말단에 융합되거나, 일부민 구조의 루프 내로 삽입되거나 이들의 임의의 조합일 수 있다. 이는 융합 폴리펩티드의 다양한 성분을 분리하는 링커 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.


    알부민 또는 그의 단편의 융합에 관한 교시는 해당 분야에 공지되어 있으며, 해당 분야의 숙련자는 이러한 교시도 또한 본 발명에 적용될 수 있음을 인식할 것이다. WO 2001/79271A호(특히, 페이지 9 및/또는 표 1), WO 2003/59934호(특히 표 1), WO03/060071호(특히, 표 1) 및 WO01/079480호(특히, 표 1)(각각 그들 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨)는 알부민 또는 그의 단편에 융합될 수 있는 치료, 예방(백신 포함), 진단, 영상화 또는 기타 유리한 폴리펩티드의 예를 포함하며, 이들 예도 또한 본 발명에 적용된다.


    본 발명의 제2 양태에 대한 추가의 선호는 본 발명의 제1 양태의 것들 및 하기, 본 발명의 제12 양태에 제공되는 것들을 포함한다. 해당 분야의 숙련자는 본 발명의 임의의 양태가 본 발명의 다른 양태(들) 및/또는 본 발명 및/또는 본 명세서에서 구성되는 다른 개시내용의 양태에 대한 하나 이상의(몇몇의) 선호와 조합될 수 있음을 이해한다.


    폴리뉴클레오티드


    본 발명의 제3 양태는 본 발명의 변이체 또는 융합 폴리펩티드 중 임의의 것을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 벡터(예를 들어, 플라스미드) 및/또는 숙주 세포에 포함될 수 있다.


    본 발명의 제3 양태에 대한 추가의 선호는 본 발명의 제1 양태의 것들 및 하기, 본 발명의 제12 양태에 제공되는 것들을 포함한다. 해당 분야의 숙련자는 본 발명의 임의의 양태가 본 발명의 다른 양태(들) 및/또는 본 발명 및/또는 본 명세서에서 구성되는 다른 개시내용의 양태에 대한 하나 이상의(몇몇의) 선호와 조합될 수 있음을 이해한다.


    핵산 작제물


    본 발명의 제4 양태는 조절 서열과 양립가능한 조건 하에서 적절한 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의(몇몇의) 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 변이체 또는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 작제물에 관한 것이다.


    폴리뉴클레오티드는 다양한 방식으로 조작되어, 변이체의 발현을 가능하게 할 수 있다. 그를 벡터 내로 삽입하기 전에, 폴리뉴클레오티드를 조작하는 것은 발현 벡터에 따라 바람직하거나 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 기법은 해당 분야에 주지되어 있다.


    조절 서열은 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 변이체의 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 포함한다. 프로모터는 돌연변이형, 절단형 및 하이브리드 프로모터를 포함하는 숙주 세포에서 전사 활성을 보이며, 숙주 세포에 대해 동종이거나 이종인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 수득될 수 있는 임의의 핵산 서열일 수 있다.


    효소 숙주에서, 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비지에(

    Saccharomyces cerevisiae ) 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비지에 프로테아제 A(PRA1), 사카로마이세스 세레비지에 프로테아제 B(PRB1), 사카로마이세스 세레비지에 번역 연장 인자(TEF1), 사카로마이세스 세레비지에 번역 연장 인자(TEF2), 사카로마이세스 세레비지에 갈락토키나제(GAL1), 사카로마이세스 세레비지에 알코올 데하이드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(ADH1, ADH2/GAP), 사카로마이세스 세레비지에 트리오스 포스페이트 아이소머라제(TPI), 사카로마이세스 세레비지에 메탈로티오네닌(CUP1), 및 사카로마이세스 세레비지에 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 유전자로부터 수득된다. 효모 숙주 세포에 유용한 기타 프로모터들은 문헌[Romanos

    et al. , 1992,

    Yeast 8: 423-488]에 설명되어 있다.


    해당 분야의 숙련자는 벼 및 포유류 세포, 예를 들어, CHO 또는 HEK에 사용하기에 유용한 프로모터를 안다. 벼 숙주에서, 유용한 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S RNA 유전자(CaMV35S), 옥수수 알코올 데하이드로게나제(Adh1) 및 알파 Amy3으로부터 수득된다.


    포유류 숙주 세포, 예를 들어, CHO 또는 HEK에서, 유용한 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 및 CAG 하이브리드 프로모터(CMV 조기 인핸서 요소 및 닭 베타-액틴 프로모터의 하이브리드), 원숭이 액포형성 바이러스 40(Simian vacuolating virus 40, SV40)으로부터 수득된다.


    조절 서열은 또한 숙주 세포에 의해 인식되어, 전사를 종결시키는 적절한 전사 터미네이터 서열일 수도 있다. 터미네이터 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포에서 작용성인 임의의 터미네이터가 사용될 수 있다.


    효모 숙주 세포에 바람직한 터미네이터는 사카로마이세스 세레비지에 에놀라제, 사카로마이세스 세레비지에 사이토크롬 C(CYC1), 사카로마이세스 세레비지에 알코올 데하이드로게나제(ADH1) 및 사카로마이세스 세레비지에 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제에 대한 유전자로부터 수득된다. 효모 숙주 세포에 유용한 기타 터미네이터는 상기 문헌[Romanos

    et al. , 1992]에 설명되어 있다. 해당 분야의 숙련자는 벼 및 포유류 세포, 예를 들어, CHO 또는 HEK에서 사용하기에 유용한 터미네이터를 안다. 예를 들어, 벼 숙주에서, 바람직한 터미네이터는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 노팔린 신타제(Nos) 및 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S RNA 유전자(CaMV35S)로부터 수득된다.


    조절 서열은 또한 적절한 리더 서열, 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 미번역 영역일 수 있다. 리더 서열은 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포에서 작용성인 임의의 리더 서열이 사용될 수 있다.


    효모 숙주 세포에 적절한 리더는 사카로마이세스 세레비지에 에놀라제(ENO1), 사카로마이세스 세레비지에 3-포스포글리세레이트 키나제, 사카로마이세스 세레비지에 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비지에 알코올 데하이드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(ADH2/GAP)에 대한 유전자로부터 수득된다.


    조절 서열은 또한 폴리아데닐화 서열, 전사되는 경우, 숙주 세포에 의해 폴리아데노신 잔기를 전사된 mRNA에 부가하기 위한 신호로서 인식되는 변이체-암호화 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된 서열일 수도 있다. 숙주 세포에서 작용성인 임의의 폴리아데닐화 서열이 사용될 수 있다.


    효모 숙주 세포에 유용한 폴리아데닐화 서열은 문헌[Guo and Sherman, 1995,

    Mol.

    Cellular Biol.

    15 : 5983-5990]에 기술되어 있다.


    조절 서열은 또한 변이체의 N-말단에 연결된 신호 펩티드를 암호화하고, 변이체를 세포의 분비 경로로 지향시키는 신호 펩티드 암호화 영역일 수도 있다. 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열의 5' 말단은 번역 리딩 프레임(reading frame)으로, 변이체를 암호화하는 암호화 영역의 세그먼트와 천연적으로 연결된 신호 펩티드 암호화 영역을 내재적으로 함유할 수 있다. 대안적으로, 암호화 서열의 5' 말단은 암호화 서열에 대해 외래인 신호 펩티드 암호화 영역을 함유할 수 있다. 암호화 서열이 천연적으로 신호 펩티드 암호화 영역을 함유하지 않는 경우, 외래의 신호 펩티드 암호화 영역이 필요할 수 있다. 대안적으로, 외래 신호 펩티드 암호화 영역은 간단히 천연 신호 펩티드 암호화 영역을 대체하여, 변이체의 분비를 향상시킬 수 있다. 그러나, 발현된 변이체를 숙주 세포의 분비 경로에 지향시키는 임의의 신호 펩티드 암호화 영역이 사용될 수 있다.


    효모 숙주 세포에 유용한 신호 펩티드는 사카로마이세스 세레비지에 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비지에 인버타제(invertase)에 대한 유전자로부터 수득된다. 다른 유용한 신호 펩티드 암호화 서열은 상기 문헌[Romanos

    et al. , 1992]에 기재되어 있다. 해당 분야의 숙련자는 벼 및 포유류 세포, 예를 들어, CHO 또는 HEK에 사용하기에 유용한 신호 펩티드를 안다.


    신호 펩티드 및 프로펩티드 영역 둘 모두가 변이체의 N-말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 변이체의 N-말단 옆에 위치하며, 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 N-말단 옆에 위치한다.


    본 발명의 제4 양태에 대한 추가의 선호는 본 발명의 제1 양태의 것들 및 하기, 본 발명의 제12 양태에 제공되는 것들을 포함한다. 해당 분야의 숙련자는 본 발명의 임의의 양태가 본 발명의 다른 양태(들) 및/또는 본 발명 및/또는 본 명세서에서 구성되는 다른 개시내용의 양태에 대한 하나 이상의(몇몇의) 선호와 조합될 수 있음을 이해한다.


    변이체의 제조


    본 발명의 제5 양태는 하기의 단계를 포함하는 변이체 알부민 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편의 회합물의 제조 또는 수득 방법에 관한 것이다:


    (a) 모 알부민 또는 그의 단편, 또는 모 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드에 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경 및 도메인 III 내의 하나 이상의(몇몇의) 변경을 도입하는 단계; 및


    (b) 변이체 알부민 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 회수하는 단계.


    바람직한 변경은 본 발명의 제1 양태와 관련하여 기재된 바와 같다. 얻어진 변이체 알부민 또는 그의 단편은 참조물질, 예를 들어, 변경을 포함하지 않는 모 알부민 또는 단편의 FcRn-결합 친화성과 비교하여 변경된 FcRn-결합 친화성을 가질 수 있다. 더욱 바람직하게는, 얻어진 변이체 알부민 또는 그의 단편은 더 강한 FcRn-결합 친화성을 갖는다.


    본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 참조 알부민, 그의 단편 또는 융합체의 FcRn에 대한 결합 친화성과 비교하여 변경된 FcRn에 대한 결합 친화성을 갖는 알부민의 변이체, 그의 단편, 또는 상기 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 폴리펩티드의 제조 방법을 포함한다:


    (a) 모 알부민, 예를 들어, SEQ ID NO: 2에 대하여 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 알부민을 암호화하는 핵산을 제공하는 단계;


    (b) (i) 모 알부민의 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 위치 및 도메인 III(도메인 3) 내의 하나 이상의(몇몇의) 위치에 상응하는 위치에서의 변경, 또는


    (ii) SEQ ID NO: 2의 도메인 I의 위치 78 내지 120 중 임의의 위치의 하나 이상의(몇몇의) 위치에 상응하는 위치 또는 SEQ ID NO: 2의 도메인 III의 위치 425, 505, 510, 512, 524, 527, 531, 534, 569, 573, 575 중 임의의 위치의 하나 이상(몇몇)에 상응하는 위치에서의 변경을 포함하는 변이체 알부민, 그의 단편, 또는 상기 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 폴리펩티드를 암호화하도록 단계 (a)의 서열을 변형시키는 단계;


    (c) 선택적으로, 단계 (b)의 변형된 서열을 적절한 숙주 세포에 도입하는 단계;


    (d) 선택적으로, 세포를 폴리펩티드의 발현을 야기하는 조건 하에서 적절한 성장 배지에서 성장시키는 단계; 및


    (e) 선택적으로, 폴리펩티드를 성장 배지로부터 회수하는 단계로서, 상기 폴리펩티드가 모 알부민, 참조 알부민, 그의 단편, 또는 상기 모 알부민, 참조 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드 또는 융합체와 비교하여, 변경된 FcRn에 대한 결합 친화성 및/또는 변경된 혈장 반감기를 갖는 단계.


    모 알부민 및/또는 변이체 알부민이


    (a) SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드에 대하여 적어도 60% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;


    (b) 낮은 엄격성 조건 하에서 (i) SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열, 또는 (ii) (i)의 전장 상보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;


    (c) SEQ ID NO: 1의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대하여 적어도 60% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및/또는


    (d) SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드의 단편을 포함하거나 이로 구성되는 것이 바람직하다.


    변이체는 해당 분야에 공지되어 있는 임의의 돌연변이유발 절차, 예를 들어, 위치-지정 돌연변이유발, 합성 유전자 작제, 반-합성 유전자 작제, 무작위 돌연변이유발, 셔플링(shuffling) 등을 사용하여 해당 분야의 숙련자에 의해 제조될 수 있다.


    위치-지정 돌연변이유발은 하나 이상의(몇몇의) 돌연변이(변경)가 모체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의(몇몇의) 정의된 위치에서 생성되는 기술이다.


    위치-지정 돌연변이유발은 요망되는 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 사용을 수반하는 PCR에 의해 시험관 내에서 달성될 수 있다. 또한, 위치-지정 돌연변이유발은 모체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 내의 소정의 위치에서의 제한 효소에 의한 절단 및 이후에, 폴리뉴클레오티드 내의 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 라이게이션을 수반하는 카세트 돌연변이유발(cassette mutagenesis)에 의해 시험관 내에서 수행될 수 있다. 통상, 플라스미드 및 올리고뉴클레오티드에서 분해하는 제한 효소가 동일하여, 플라스미드와 삽입물의 서로의 라이게이션을 가능하게 한다. 예를 들어, 문헌[Scherer and Davis, 1979,

    Proc.

    Natl.

    Acad.

    Sci.

    USA

    76 :4949-4955]; 및 문헌[Barton

    et al. , 1990,

    Nucleic Acids Res.

    18 :7349-4966]을 참조한다.


    또한, 위치-지정 돌연변이유발은 해당 분야에 공지되어 있는 방법에 의해 생체 내에서도 달성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0171154호; 문헌[Storici

    et al. , 2001,

    Nature Biotechnol.

    19 : 773-776]; 문헌[Kren

    et al. , 1998,

    Nat.

    Med.

    4 : 285-290]; 및 문헌[Calissano and Macino, 1996,

    Fungal Genet.

    Newslett.

    43 : 15-16]을 참조한다.


    임의의 위치-지정 돌연변이유발 절차가 본 발명에 사용될 수 있다. 변이체를 제조하는데 사용될 수 있는 이용가능한 많은 상용의 키트가 존재한다.


    합성 유전자 작제는 관심 폴리펩티드를 암호화하도록 설계된 폴리뉴클레오티드 분자의 시험관 내 합성을 수반한다. 유전자 합성은 다수의 기술, 예를 들어, 문헌[Tian

    et al. (2004,

    Nature

    432 : 1050-1054)]에 의해 기재된 멀티플렉스 마이크로칩-기반의 기술 및 올리고뉴클레오티드가 광-프로그램화가능한 미세유체 칩에서 합성되고 조립되는 유사 기술을 사용하여 수행될 수 있다.


    단일 또는 다중 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 공지되어 있는 돌연변이유발, 재조합 및/또는 셔플링 방법 이후에, 관련 스크리닝 절차, 예를 들어, 문헌[Reidhaar-Olson and Sauer, 1988,

    Science

    241 : 53-57]; 문헌[Bowie and Sauer, 1989,

    Proc.

    Natl.

    Acad.

    Sci.

    USA

    86 : 2152-2156]; WO 95/17413호; 또는 WO 95/22625호에 의해 개시된 것들을 사용하여 이루어지고 시험될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 오류-유발 PCR, 파지 디스플레이(예를 들어, 문헌[Lowman

    et al. , 1991,

    Biochemistry

    30 : 10832-10837]; 미국 특허 제5,223,409호; WO 92/06204호) 및 영역-지정 돌연변이유발(문헌[Derbyshire

    et al. , 1986,

    Gene

    46 : 145]; 문헌[Ner

    et al. , 1988,

    DNA

    7 : 127])을 포함한다.


    돌연변이유발/셔플링 방법은 숙주 세포에 의해 발현된 클로닝되고, 돌연변이된 폴리펩티드의 활성을 검출하는 고효율의 자동화된 스크리닝 방법과 조합될 수 있다(문헌[Ness

    et al. , 1999,

    Nature Biotechnology

    17 : 893-896]). 활성 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이된 DNA 분자는 숙주 세포로부터 회수되고 해당 분야의 표준 방법을 사용하여 빠르게 시퀀싱될 수 있다. 이들 방법은 폴리펩티드에서 개개의 아미노산 잔기의 중요성의 빠른 결정을 가능하게 한다.


    반-합성 유전자 작제는 합성 유전자 작제, 및/또는 위치-지정 돌연변이유발, 및/또는 무작위 돌연변이유발, 및/또는 셔플링의 양태를 조합함으로써 달성된다. 반-합성 작제는 PCR 기술과 조합하여 합성되는 폴리뉴클레오티드 단편을 이용하는 과정이 특징이다. 따라서 유전자의 정의된 영역은 새로 합성될 수 있는 한편, 다른 영역은 위치-특이적 돌연변이 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있고, 또 다른 영역은 오류-유발 PCR 또는 비-오류 유발 PCR 증폭으로 처리될 수 있다. 그 후 폴리뉴클레오티드 하위서열이 셔플링될 수 있다.


    본 발명의 제5 양태에 대한 추가의 선호는 본 발명의 제1 양태의 것들 및 하기, 본 발명의 제12 양태에 제공되는 것들을 포함한다. 해당 분야의 숙련자는 본 발명의 임의의 양태가 본 발명의 다른 양태(들) 및/또는 본 발명 및/또는 본 명세서에서 구성되는 다른 개시내용의 양태에 대한 하나 이상의(몇몇의) 선호와 조합될 수 있음을 이해한다.


    생성 방법


    본 발명의 제6 양태는 본 발명에 따른 변이체의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 변이체는 숙련자에게 주지되어 있는 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 하나의 통상적인 방식은 모 알부민 또는 그의 단편, 또는 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 클로닝하고, 상기 핵산을 SEQ ID NO: 2의 성숙 폴리펩티드의 도메인 I 및 도메인 III 내의 위치(또는 다른 알부민 또는 그의 단편에서의 동등한 위치)에 요망되는 치환(들)을 도입하도록 변형시키고, 변형된 핵산이 적절한 조절 유전 요소, 예를 들어, 프로모터, 터미네이터, 활성화 위치, 리보솜 결합 위치 등과 작동가능하게 연결되게 배치되는 적절한 유전자 구축물을 제조하고, 유전자 작제물을 적절한 숙주 유기체로 도입하고, 형질전환된 숙주 유기체를 변이체의 발현을 야기하는 조건 하에서 배양하고, 변이체를 회수함으로써 이루어진다. 모든 이들 기술은 해당 분야에 공지되어 있으며, 본 발명에 따른 특정 변이체의 적절한 제조 방법을 설계하는 것은 평균 실무자의 기술 내에 있다.


    본 발명의 변이체 폴리펩티드는 또한 형질전환된 숙주 유기체의 배양 동안 변이체 폴리펩티드가 성장 배지로 분비되도록 신호 서열에 연결될 수도 있다. 일반적으로, 변이체 폴리펩티드를 성장 배지로 분비시켜, 회수 및 정제를 용이하게 하는 것이 유리하다.


    또한, 변이체 폴리펩티드의 제조 기술은 WO 2009019314호(참조로 포함)에 개시되어 있으며, 이들 기술은 또한 본 발명에 적용될 수 있다.


    알부민은 진균(비제한적으로, 아스페르길루스(

    Aspergillus )(WO06066595호), 클루이베로마이세스(

    Kluyveromyces )(문헌[Fleer 1991,

    Bio/technology

    9 , 968-975]), 피키아(

    Pichia )(문헌[Kobayashi 1998

    Therapeutic Apheresis

    2 , 257-262]) 및 사카로마이세스(문헌[Sleep 1990

    ,

    Bio/technology

    8 , 42-46]) 포함), 박테리아(문헌[Pandjaitab 2000,

    J. Allergy Clin. Immunol.

    105 , 279-285]), 동물(문헌[Barash 1993,

    Transgenic Research

    2 , 266-276]) 및 식물(비제한적으로, 감자 및 담배(문헌[Sijmons 1990,

    Bio/technology

    8 , 217] 및 문헌[Farran 2002,

    Transgenic Research

    11 , 337-346]) 및 벼, 예를 들어, 오리자 사티바(

    Oryza sativa ) 포함), 및 포유류 세포, 예를 들어, CHO 및 HEK를 포함하는 다양한 숙주에서 재조합 단백질로서 성공적으로 발현되었다. 본 발명의 변이체 폴리펩티드는 바람직하게는 적절한 숙주 세포에서 재조합에 의해 생성된다. 원칙적으로, 적절한 양의 폴리펩티드를 생성할 수 있는 임의의 숙주 세포가 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 적절한 숙주 세포를 선택하는 것은 평균 실무자의 기술 내에 있다. 바람직한 숙주 유기체는 바람직하게는 사카로마이카케(

    Saccharomycacae ), 더욱 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에 중에서 선택되는 효모이다.


    본 발명의 변이체 폴리펩티드는 공지되어 있는 분리 기술, 예를 들어, 여과, 원심분리, 크로마토그래피 및 친화성 분리 기술 등의 조합을 사용하여, 성장 배지로부터 회수되고 정제될 수 있다. 이러한 공지되어 있는 분리 단계의 특정 조합을 사용하여 본 발명의 변이체를 정제하는 것은 평균 실무자의 기술 내에 있다. 본 발명의 변이체에 적용될 수 있는 정제 기술의 예로서, WO00/44772호의 교시가 언급될 수 있다.


    본 발명의 변이체 폴리펩티드는 치료적으로 유익한 화합물(예방적으로 유익한 화합물, 예를 들어, 백신 포함)을 그를 필요로 하는 동물 또는 인간 개체에게 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 치료적으로 유익한 화합물은 진단, 예를 들어, 다양한 영상화 기술에서 사용하기 위한 표지 및 용이하게 검출가능한 화합물; 약제학적 활성 화합물, 예를 들어, 약물 또는 특이적으로 결합하는 모이어티, 예를 들어, 항체를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 변이체는 심지어 둘 이상의(몇몇의) 상이한 치료적으로 유익한 화합물, 예를 들어, 항체 및 약물에 연결될 수 있으며, 이는 조합된 분자에 요망되는 표적에 특이적으로 결합하는 능력을 제공하며, 이에 의해, 그 특정 표적에 고농도의 연결된 약물을 제공한다.


    본 발명의 제6 양태에 대한 추가의 선호는 본 발명의 제1 양태의 것들 및 하기, 본 발명의 제12 양태에 제공되는 것들을 포함한다. 해당 분야의 숙련자는 본 발명의 임의의 양태가 본 발명의 다른 양태(들) 및/또는 본 발명 및/또는 본 명세서에서 구성되는 다른 개시내용의 양태에 대한 하나 이상의(몇몇의) 선호와 조합될 수 있음을 이해한다.


    컨쥬게이트


    본 발명의 제7 양태는 컨쥬게이트(컨쥬게이션)에 관한 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 알부민의 변이체 또는 그의 단편 또는 융합 폴리펩티드는 해당 분야에 공지되어 있는 기술을 사용하여 제2 분자('컨쥬게이션 파트너')에 컨쥬게이트될 수 있다. 컨쥬게이션 파트너는 치료, 예방(백신 포함), 진단, 영상화 또는 기타 유익한 모이어티일 수 있다. 상기 컨쥬게이션 파트너는 폴리펩티드 또는 비-폴리펩티드 화학물질일 수 있다. 컨쥬게이션 파트너는 폴리펩티드, 화학물질(예를 들어, 화학적 합성 약물) 또는 핵산(예를 들어, DNA, RNA, siRNA)일 수 있다.


    상기 제2 분자는 진단 또는 영상화 모이어티를 포함할 수 있으며, 이러한 구현예에서, 컨쥬게이트는 영상화에서와 같이 진단 도구로서 유용할 수 있거나; 제2 분자는 치료 또는 예방(예를 들어, 백신) 화합물일 수 있으며, 이러한 구현예에서, 컨쥬게이트는 치료 또는 예방(백신접종) 목적을 위해 사용될 수 있으며, 여기서, 컨쥬게이트는 치료 또는 예방 화합물의 치료 또는 예방 특성, 및 컨쥬게이트의 알부민 부분에 의해 제공되는 바람직한 혈장 반감기를 가질 것이다. 알부민 및 치료 분자의 컨쥬게이트는 해당 분야에 공지되어 있으며, 이러한 컨쥬게이트가 비-컨쥬게이트된 유리 치료 분자 그들 자체와 비교하여 긴 혈장 반감기를 갖는 것이 입증되었다. 본 발명에 따르면, 종래 기술의 상응하는 컨쥬게이트와 비교하여, 본 발명에 따른 컨쥬게이트의 FcRn에 대한 결합 친화성 및/또는 혈장 반감기를 변경시킬 수 있다. '변경'은 양자 모두의 혈장 반감기의 증가 및 FcRn에 대한 혈장 반감기 결합 친화성의 감소 및/또는 결합 친화성의 증가 및 FcRn에 대한 결합 친화성의 감소를 포함한다. 혈장 반감기 및/또는 FcRn에 대한 결합 친화성의 증가가 바람직하다. 컨쥬게이트는 널리 공지되어 있는 화학물질을 사용하여 편리하게 HSA의 표면 상에 존재하는 유리 티올기(성숙 HSA의 아미노산 잔기 34)를 통해 연결될 수 있다.


    특히 바람직한 일 양태에서, 변이체 알부민 또는 그의 단편은 유익한 치료 또는 예방(백신 포함) 화합물에 컨쥬게이트되며, 컨쥬게이트는 질환(condition)이 특정 선택된 치료 화합물에 반응성인 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서 질환의 치료를 위해 사용된다. 이러한 치료적으로 유용한 화합물을 변이체 알부민 또는 그의 단편에 컨쥬게이트시키는 기술은 해당 분야에 공지되어 있다. WO 2009/019314호(전문이 본 명세서에 참조로 포함)는 치료 화합물을 폴리펩티드에 컨쥬게이트시키는 데 적절한 기술의 예를 개시하며, 이러한 기술은 또한 본 발명에 적용될 수 있다. 또한, WO 2009/019314호에는 치환된 트랜스페린에 컨쥬게이트될 수 있는 화합물 및 모이어티의 예가 개시되어 있으며, 이들 예도 또한 본 발명에 적용가능하다. WO 2009/019314호의 교시는 본 명세서에 참조로 포함된다.


    HSA는 그의 천연 형태에서, 컨쥬게이션에 편리하게 사용될 수 있는 하나의 유리 티올기(Cys34에서)를 포함한다. 이러한 양태에서 특정 구현예로서, 변이체 알부민 또는 그의 단편은 표면 상에 추가의 유리 티올기를 생성하기 위해 제공되는 추가의 변형을 포함할 수 있다. 이는 1개 초과의 치료(예를 들어, 예방) 화합물의 분자가 변이체 알부민 또는 그의 단편의 각 분자에 컨쥬게이트될 수 있거나, 둘 이상의(몇몇의) 상이한 치료 화합물이 변이체 알부민 또는 그의 단편의 각 분자에 컨쥬게이트될 수 있도록 변이체 알부민 또는 그의 단편의 페이로드(payload)가 증가되는 이익을 가지며, 예를 들어, 표적화 특성을 갖는 화합물, 예를 들어, 종양에 특이적인 항체; 및 변이체 알부민 또는 그의 단편에 컨쥬게이트된 세포독성 약물에 의해, 종양에 대해 매우 특이적인 약물이 생성된다. 표면 상에 추가의 유리 티올기를 제공하도록 변형될 수 있는 특정 잔기의 교시는 참조로 포함되는 공계류 중인 특허 출원 WO2010/092135호에서 찾을 수 있다.


    컨쥬게이션 파트너는 대안적으로 융합 폴리펩티드(본 명세서에 기재)에 컨쥬게이트되어, 분자가 알부민에 융합된 융합 파트너, 및 동일한 알부민 또는 심지어는 융합 파트너에 컨쥬게이트된 컨쥬게이션 파트너를 포함하게 할 수 있다.


    본 발명의 제7 양태에 대한 추가의 선호는 본 발명의 제1 양태의 것들 및 하기, 본 발명의 제12 양태에 제공되는 것들을 포함한다. 해당 분야의 숙련자는 본 발명의 임의의 양태가 본 발명의 다른 양태(들) 및/또는 본 발명 및/또는 본 명세서에서 구성되는 다른 개시내용의 양태에 대한 하나 이상의(몇몇의) 선호와 조합될 수 있음을 이해한다.


    회합물


    본 발명의 제8 양태는 회합물에 관한 것이다. 따라서, 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 융합 폴리펩티드는 추가로 "회합물"의 형태로 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "회합물"은 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 및 비공유 결합에 의해 변이체 알부민 또는 그의 단편에 결합되거나 회합된 다른 화합물을 포함하는 화합물을 의미하는 것으로 의도된다. 이러한 회합물의 예로서, 변이체 알부민 및 소수성 상호작용에 의해 알부민과 회합된 지질로 구성된 회합물이 언급될 수 있다. 이러한 회합물은 해당 분야에 공지되어 있으며, 이들은 널리 공지되어 있는 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 회합물의 일 예로서, 변이체 알부민 및 탁산, 탁솔 또는 탁솔 유도체(예를 들어, 파클리탁셀)를 포함하는 회합물이 언급될 수 있다. 회합물의 추가의 예에는 치료, 예방(백신 포함), 진단, 영상화 또는 기타 유익한 모이어티가 포함된다.


    본 발명에 따른 알부민 회합물의 반감기는 단독의 '다른 화합물'의 반감기보다 더 길거나 더 짧을 수 있다. 본 발명에 따른 알부민 회합물의 반감기는 참조 알부민, 예를 들어, 고유 HSA(본 발명에 따른 알부민 변이체 또는 유도체 대신) 및 '다른 화합물'을 포함하거나 이로 구성된 유사한/동등한 알부민 회합물의 반감기보다 더 길거나 더 짧을 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 따른 알부민 회합물의 FcRn에 대한 결합 친화성은 참조 알부민, 예를 들어, 고유 HSA(본 발명에 따른 알부민 변이체 또는 유도체 대신) 및 '다른 화합물'을 포함하거나 이로 구성된 유사한/동등한 알부민 회합물의 FcRn에 대한 결합 친화성보다 더 강하거나 더 약할 수 있다. 회합물의 제조 방법은 숙련자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, HSA와 리포-화합물의 포뮬레이션(회합에 의함)은 문헌[Hussain, R. and Siligardi, G. (2006) International Journal of Peptide Research and Therapeutics, Vol. 12, NO: 3, pp. 311-315]에 기술되어 있다.


    본 발명의 제8 양태에 대한 추가의 선호는 본 발명의 제1 양태의 것들 및 하기, 본 발명의 제12 양태에 제공되는 것들을 포함한다. 해당 분야의 숙련자는 본 발명의 임의의 양태가 본 발명의 다른 양태(들) 및/또는 본 발명 및/또는 본 명세서에서 구성되는 다른 개시내용의 양태에 대한 하나 이상의(몇몇의) 선호와 조합될 수 있음을 이해한다.


    조성물


    본 발명의 제9 양태는 조성물에 관한 것이다. 이에 따라, 본 발명은 또한 약제학적 조성물의 제조를 위한, 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 알부민의 변이체 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트, 또는 알부민의 변이체 또는 그의 단편을 포함하는 회합물의 용도에 관한 것이며, 여기서, 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 알부민의 변이체 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트, 또는 알부민의 변이체 또는 그의 단편을 포함하는 회합물은 HSA 또는 그의 상응하는 단편, 또는 HSA 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 HSA를 포함하는 컨쥬게이트와 비교하여, 변경된 FcRn에 대한 결합 친화성 및/또는 변경된 혈장 반감기를 갖는다.


    이와 관련하여, HSA의 상응하는 단편은 그것이 비교되는 변이체 알부민의 단편과 정렬되고, 그과 동일한 개수의 아미노산을 갖는 HSA의 단편을 의미하는 것으로 의도된다. 유사하게, HSA를 포함하는 상응하는 융합 폴리펩티드 또는 HSA를 포함하는 컨쥬게이트는 그것이 비교되는 변이체 알부민을 포함하는 컨쥬게이트의 융합 폴리펩티드와 동일한 크기와 아미노산 서열을 갖는 분자를 의미하는 것으로 의도된다.


    조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제, 예를 들어, 물, 폴리소르베이트 80, 또는 인간 알부민에 대해 미국 약전(US Pharmacopoeia)에 명시된 것들을 포함할 수 있다.


    본 발명의 제9 양태에 대한 추가의 선호는 본 발명의 제1 양태의 것들 및 하기, 본 발명의 제12 양태에 제공되는 것들을 포함한다. 해당 분야의 숙련자는 본 발명의 임의의 양태가 본 발명의 다른 양태(들) 및/또는 본 발명 및/또는 본 명세서에서 구성되는 다른 개시내용의 양태에 대한 하나 이상의(몇몇의) 선호와 조합될 수 있음을 이해한다.


    나노입자


    본 발명의 제10 양태는 본 명세서에 개시된 바와 같은 변이체, 융합체, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자, 조성물 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 나노입자에 관한 것이다.


    나노- 또는 마이크로입자로의 분자의 혼입 기술은 해당 분야에 공지되어 있다. 본 발명에 따른 알부민, 그의 변이체, 단편, 융합체, 컨쥬게이트 또는 회합물에 적용될 수 있는 나노- 또는 마이크로입자의 바람직한 제조 방법은 WO 2004/071536호 또는 WO2008/007146호 또는 문헌[Oner & Groves (Pharmaceutical Research, Vol 10(9), 1993, pages 1387 to 1388)]에 개시되어 있으며, 이들은 본 명세서에 참조로 포함된다. 바람직하게는 나노-입자의 평균 직경은 5 내지 1000㎚, 더욱 바람직하게는 5, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 130, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 999 내지 5, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 130, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000㎚이다. 200㎚ 미만의 직경, 더욱 특별히는 130㎚ 미만의 마이크로입자의 이점은 0.2㎛(미크론) 필터를 통한 여과에 의해 멸균되기 쉽다는 점이다. 바람직하게는, 마이크로-입자의 평균 직경은 1000㎚(1㎛(미크론)) 내지 100㎛(미크론), 더욱 바람직하게는 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 내지 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100㎛(미크론)이다.


    본 발명의 제10 양태에 대한 추가의 선호는 본 발명의 제1 양태의 것들 및 하기, 본 발명의 제12 양태에 제공되는 것들을 포함한다. 해당 분야의 숙련자는 본 발명의 임의의 양태가 본 발명의 다른 양태(들) 및/또는 본 발명 및/또는 본 명세서에서 구성되는 다른 개시내용의 양태에 대한 하나 이상의(몇몇의) 선호와 조합될 수 있음을 이해한다.


    용도


    본 발명의 제11 양태는 변이체 알부민, 그의 단편, 융합체 또는 컨쥬게이트, 또는 그의 나노입자 또는 회합물의 용도에 관한 것이다. 용도는 예를 들어, 치료, 예방, 진단 또는 영상화 방법에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 변이체 알부민 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드는 FcRn에 대한 그들의 결합 친화성 및/또는 혈장 반감기가 모체 또는 참조 알부민 또는 그의 단편, 또는 모체 또는 참조 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드와 비교하여 변경된 이점을 갖는다. 이는 본 발명에 따른 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 회합물의 FcRn에 대한 결합 친화성 및/또는 혈장 반감기가 특정 치료 목적에 따라 선택될 수 있는 이점을 갖는다.


    일부 상황에서, 참조 분자 또는 조성물보다 더 긴 혈장 반감기를 갖는 알부민, 그의 변이체, 단편, 융합체, 컨쥬게이트 또는 회합물 또는 조성물을 사용하는 것이 유리할 것인데, 이는 알부민, 그의 변이체, 단편, 융합체, 컨쥬게이트 또는 회합물 또는 조성물의 투여가 참조 분자 또는 조성물이 사용되는 상황에 비하여 덜 빈번하게 또는 감소된 용량(그리고 결과적으로 더 적은 부작용)으로 필요할 것인 이익을 가질 것이기 때문이다. 변이체, 융합체, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자, 조성물 또는 폴리뉴클레오티드의 사용과 관련하여, 알부민 모이어티는 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 변경을 포함할 수 있다.


    다른 상황에서, 참조 분자 또는 조성물보다 더 짧은 혈장 반감기를 갖는 알부민, 그의 변이체, 단편, 융합체, 컨쥬게이트 또는 회합물 또는 조성물을 사용하는 것이 유리할 것인데, 이는 알부민, 그의 변이체, 단편, 융합체, 컨쥬게이트 또는 회합물 또는 조성물의 투여가 참조 분자 또는 조성물이 사용되는 경우보다 더 신속하게, 투여된 화합물이 수여자로부터 제거되는 이익과 함께, 참조 분자 또는 조성물이 사용되는 상황에 비하여 더 큰 용량으로 수행될 수 있는 이익을 가질 것이기 때문이다. 변이체, 융합체, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자, 조성물 또는 폴리뉴클레오티드의 사용에 관하여, 알부민 모이어티는 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 변경을 포함할 수 있다.


    예를 들어, 영상화 모이어티가 매우 짧은 반감기를 가지며, HSA를 포함하는 컨쥬게이트 또는 융합 폴리펩티드가 영상화 목적에 필요한 것보다 훨씬 더 긴 혈장 반감기를 갖는 동물 또는 인간에서의 영상화 목적을 위하여 사용되는 컨쥬게이트, 회합물 또는 융합 폴리펩티드에 대하여, 모 알부민 또는 참조 알부민 또는 그의 단편보다 더 짧은 혈장 반감기를 갖는 본 발명의 변이체 알부민 또는 그의 단편을 사용하여, 영상화 목적에 충분히 길지만, 그것이 적용되는 특정 환자의 신체로부터 제거되기에 충분히 짧은 긴 혈장 반감기를 갖는 융합 폴리펩티드의 컨쥬게이트를 제공하는 것이 유리할 것이다.


    이러한 치료를 필요로 하는 환자에서 특정 증상을 치료하거나 완화시키는데 유효한 치료 화합물을 포함하는 컨쥬게이트, 회합물 또는 융합 폴리펩티드에 대한 다른 예에서, 모 알부민 또는 참조 알부민 또는 그의 단편보다 더 긴 혈장 반감기를 갖는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 사용하여, 본 발명의 회합물 또는 컨쥬게이트 또는 융합 폴리펩티드의 투여가 모 알부민 또는 참조 알부민 또는 그의 회합물 또는 그의 단편이 사용되는 상황에 비하여 더 적은 부작용과 함께 덜 빈번하게 감소된 용량이 필요할 것인 이익을 가질 더 긴 혈장 반감기를 갖는 회합물 또는 컨쥬게이트 또는 융합 폴리펩티드를 제공하는 것이 유리할 것이다. 예를 들어, 본 발명은 유효량의 본 발명에 따른 회합물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서의 증식 질환의 치료 방법을 제공하며, 여기서, 회합물은 탁산, 탁솔 또는 탁솔 유도체(예를 들어, 파클리탁셀)를 포함한다.


    추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 변이체 알부민, 그의 회합물 또는 그의 단편, 변이체 알부민 단편 또는 그의 회합물, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 바람직하게는 약제학적 조성물이다. 조성물은 약제 분야에 인지되어 있는 안내서에 개시된 바와 같은 해당 업계에 공지되어 있는 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 알부민, 그의 변이체, 단편, 융합체, 컨쥬게이트 또는 회합물이 참조 분자의 것에 비해 조절된(즉, 더 강한 또는 약한 및/또는 더 긴 또는 더 짧은) FcRn에 대한 결합 친화성 및/또는 혈장 반감기를 갖기 때문에, 조성물은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 알부민, 그의 변이체, 단편, 융합체, 컨쥬게이트 또는 회합물 대신에 참조 분자를 포함하는 동등한 조성물에 비하여, 조절된(즉, 변경된) FcRn에 대한 결합 친화성 및/또는 혈장 반감기를 갖는다. 조성물은 백신일 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 활성 약제 또는 부형제일 수 있다. 선택적으로, 조성물은 단위 투여형으로 제공된다.


    바람직하게는, 알부민, 그의 변이체, 단편, 융합체, 컨쥬게이트 또는 회합물은 알부민 성분(예를 들어, 알부민, 그의 변이체, 단편, 융합체, 컨쥬게이트 또는 회합물)이 야생형 알부민(예를 들어, HSA) 또는 변이체, 단편, 융합체, 컨쥬게이트 또는 회합물인 것을 제외하고, 참조 분자, 예를 들어, 동일한 조성물의 혈장 반감기보다 더 긴 혈장 반감기를 갖는다.


    특정 실시형태에서, 조성물은 본 발명에 따른 변이체 알부민 또는 그의 단편 및 약제학적으로 유익한 모이어티 및 알부민 결합 도메인(ABD)을 포함하는 화합물을 포함한다. 본 발명에 따르면, ABD는 생체 내에서 순환 알부민에 결합하여, ABD 및 상기 ABD에 결합된 임의의 화합물 또는 모이어티의 순환에서 수송을 부여할 수 있는 부위, 모이어티 또는 도메인을 의미한다. ABD는 해당 분야에 공지되어 있으며, 알부민에 매우 단단하게 결합하여, 알부민에 결합된 ABD를 포함하는 화합물이 특정 정도로 단일 분자로서 거동할 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 약제학적으로 유익한 모이어티 및 ABD를 포함하는 화합물과 함께, 본 발명에 따른 변이체 알부민 또는 그의 변이체를 사용함으로써 상기 화합물이 그를 필요로 하는 환자에서 그대로 주입되거나 천연 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 제형으로 투여되는 상황에 비하여, 약제학적으로 유익한 모이어티 및 ABD를 포함하는 화합물의 FcRndp 대한 결합 친화성 및/또는 혈장 반감기를 변경시킬 수 있는 것을 인식하였다.


    본 발명에 따른 변이체 알부민 또는 그의 단편, 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 회합물은 또한 당업계에 널리 공지되어 있는 기술을 사용하여 나노- 또는 마이크로입자로 혼입될 수 있다. 본 발명에 따른 변이체 알부민 또는 그의 단편에 적용될 수 있는 나노- 또는 마이크로입자의 바람직한 제조 방법은 WO 2004/071536호 또는 WO2008/007146호 또는 문헌[Oner & Groves (Pharmaceutical Research, Vol 10(9), 1993, pages 1387 to 1388)]에 개시되어 있으며, 이들은 본 명세서에 참조로 포함된다.


    본 발명의 제11 양태에 대한 추가의 선호는 본 발명의 제1 양태의 것들 및 하기, 본 발명의 제12 양태에 제공되는 것들을 포함한다. 해당 분야의 숙련자는 본 발명의 임의의 양태가 본 발명의 다른 양태(들) 및/또는 본 발명 및/또는 본 명세서에서 구성되는 다른 개시내용의 양태에 대한 하나 이상의(몇몇의) 선호와 조합될 수 있음을 이해한다.


    분자의 FcRn-결합 친화성 또는 반감기의 변경 방법


    본 발명의 제12 양태는 하기의 단계를 포함하는 분자의 FcRn-결합 친화성 또는 반감기의 변경 방법을 제공한다:


    (a) 분자가 폴리펩티드인 경우, 분자를 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 또는 본 명세서에 개시된 컨쥬게이트에 융합시키거나 컨쥬게이트시키는 단계; 분자를 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 또는 본 명세서에 개시된 컨쥬게이트에 회합시키는 단계; 분자를 본 명세서에 개시된 나노입자 또는 본 명세서에 개시된 조성물에 혼입시키는 단계;


    (b) 분자가 폴리펩티드가 아닌 경우, 분자를 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 또는 본 명세서에 개시된 컨쥬게이트에 컨쥬게이트시키는 단계; 분자를 본 명세서에 개시된 폴리펩티드 또는 본 명세서에 개시된 컨쥬게이트에 회합시키는 단계; 분자를 본 명세서에 개시된 나노입자 또는 본 명세서에 개시된 조성물에 혼입시키는 단계.


    '분자'의 예에는 치료, 예방(활성 약제 성분으로서 또는 부형제로서 백신에 사용되는 것들 포함), 영상화 및 진단에 유용한 것들, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 것들이 포함된다.


    본 발명의 제12 양태에 대한 추가의 선호는 본 발명의 제1 양태의 것들 및 하기, 본 발명의 제12 양태에 제공되는 것들을 포함한다. 해당 분야의 숙련자는 본 발명의 임의의 양태가 본 발명의 다른 양태(들) 및/또는 본 발명 및/또는 본 명세서에서 구성되는 다른 개시내용의 양태에 대한 하나 이상의(몇몇의) 선호와 조합될 수 있음을 이해한다.


    본 발명의 모든 양태에 대한 선호는 하기에 제공된다. 숙련자는 본 발명의 임의의 양태가 본 발명의 다른 양태(들) 및/또는 본 발명 및/또는 본 명세서에서 구성되는 다른 개시내용의 양태에 대한 하나 이상의(몇몇의) 선호와 조합될 수 있음을 이해한다.


    알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 컨쥬게이트, 나노입자, 회합물 또는 조성물은 상응하는 알부민 또는 그의 단편, 또는 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 컨쥬게이트, 나노입자, 회합물 또는 조성물의 혈장 반감기보다 더 길거나 더 짧은, 바람직하게는 더 긴 혈장 반감기, 또는 강하거나 약한, 바람직하게는 약한 FcRn에 대한 결합을 가질 수 있다. 바람직하게는, 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 컨쥬게이트, 나노입자, 회합물 또는 조성물은 HSA 또는 상응하는 알부민 또는 그의 단편, 또는 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 컨쥬게이트, 나노입자, 회합물 또는 조성물의 혈장 반감기보다 더 긴 혈장 반감기를 갖는다.


    대안적으로, 이는 HSA 또는 그의 상응하는 단편, 또는 HSA 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의, FcRn에 대한 상응하는 KD보다 더 낮은 FcRn(예를 들어, shFcRn)에 대한 KD를 갖는 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 컨쥬게이트, 나노입자, 회합물 또는 조성물로서 표현될 수 있다. 바람직하게는, 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 컨쥬게이트, 나노입자, 회합물 또는 조성물에 대한 KD는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 0.9× 미만, 더욱 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 0.5× 미만, 더욱 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 0.1× 미만, 더더욱 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 0.05× 미만, 보다 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 0.02× 미만, 가장 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 0.01× 미만이다(여기서, ×는 '배'를 의미함). 변이체 알부민 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 컨쥬게이트, 나노입자, 회합물 또는 조성물의 KD는 FcRn에 대한 야생형 알부민(예를 들어, SEQ ID No. 2)의 KD 내지 FcRn에 대한 HSA K573P(SEQ ID No. 3)의 KD일 수 있다. 이러한 KD는 HSA와 FcRn 간의 결합 친화성보다 더 높은 결합 친화성을 나타낸다. 더 높은 결합 친화성은 더 긴 반감기, 예를 들어, 혈장 반감기를 나타낸다.


    대안적으로, 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 컨쥬게이트, 나노입자, 회합물 또는 조성물은 HSA 또는 그의 상응하는 단편, 또는 HSA 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드의 혈장 반감기보다 더 짧은 혈장 반감기를 갖는다.


    이는 HSA 또는 상응하는 알부민 또는 그의 단편, 또는 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 컨쥬게이트, 나노입자, 회합물 또는 조성물의 FcRn에 대한 상응하는 KD보다 더 높은 FcRn에 대한 KD를 갖는 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 컨쥬게이트, 나노입자, 회합물 또는 조성물로서 표현될 수 있다. 바람직하게는, 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 알부민의 변이체 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트에 대한 KD는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 2× 초과, 더욱 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 5× 초과, 더욱 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 10× 초과, 더더욱 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 25× 초과, 가장 바람직하게는 FcRn에 대한 HSA의 KD의 50× 초과이다. 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 컨쥬게이트, 나노입자, 회합물 또는 조성물은 FcRn에 대한 결합이 없을 수 있다.


    알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 또는 알부민의 변이체 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트 또는 나노입자 또는 회합물 또는 조성물은 바람직하게는 본 발명에 따른 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편 또는 알부민의 변이체 또는 그의 단편을 포함하는 컨쥬게이트 또는 나노입자 또는 회합물 또는 조성물이다. 더 낮은 결합 친화성은 더 짧은 반감기, 예를 들어, 혈장 반감기를 나타낸다.


    본 발명의 하나의 이점은 알부민, 알부민의 변이체 또는 그의 단편, 또는 변이체 알부민 또는 그의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드, 그의 단편, 컨쥬게이트, 나노입자, 회합물 또는 조성물의 반감기가 맞춤화되어, 사용자의 요구를 만족시키는 결합 친화성 또는 반감기를 달성하게 한다는 점이다.


    KD를 결정하고/거나 비교하는 경우, 하나 이상의(바람직하게는 모든) 하기의 파라미터가 사용될 수 있다:


    기기: 비아코어(Biacore) 3000 기기(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))


    유동 셀: CM5 센서 칩


    FcRn: 인간 FcRn, 바람직하게는 태그, 예를 들어, GST 또는 His, 가장 바람직하게는 His, 예를 들어, 베타-2-마이크로글로불린(SEQ ID NO: 31)의 C-말단에서 6개 히스티딘에 선택적으로 커플링된 용해성 인간 FcRn


    FcRn의 양: 1200-2500 RU


    커플링 화학물질: 아민 커플링 화학물질(예를 들어, 기기의 제조처에 의해 제공된 프로토콜에 기재된 바와 같음)


    커플링 방법: 커플링은 10 mM 아세트산나트륨 pH 5.0(지이 헬쓰케어) 중 20 ㎍/㎖의 단백질을 주입함으로써 수행될 수 있다. 인산염 완충제(67 mM 인산염 완충제, 0.15 M NaCl, 0.005% 트윈(Tween) 20), pH 5.5)는 런닝(running) 완충제 및 희석 완충제로서 사용될 수 있다. 표면의 재생은 HBS-EP 완충제(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20) pH 7.4(Biacore AB)의 주입을 사용하여 행해질 수 있다.


    시험 분자(예를 들어, HSA 또는 변이체)의 주입량: 20 내지 0.032μM


    주입 유속: 불변, 예를 들어, 30 ㎕/㎖


    주입 온도: 25 ℃


    데이터 평가 소프트웨어: 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 4.1 소프트웨어(비아코어 아베(BIAcore AB)).


    KD의 바람직한 결정 방법은 실시예 2에 제공되어 있다.


    본 발명은 SEQ ID NO: 2의 도메인 I 내의 하나 이상의(몇몇의) 위치와 함께 도메인 III 내의 하나 이상의(몇몇의) 위치(및 이에 따른 인간 혈청 알부민 및 비인간 혈청 알부민 유래의 알부민 및 단편에서의 동등한 위치)를 변경시켜, 알부민, 단편, 융합체, 컨쥬게이트, 회합물, 나노입자 또는 조성물의 결합 친화성 및/또는 반감기, 예를 들어, 혈장 반감기를 조절(증가 또는 감소)할 수 있다. 변경은 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다. 치환이 바람직하다.


    치환 또는 삽입은 보존된, 즉, 대상 위치에서의 아미노산과 비교하여 보존된 아미노산의 도입을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 보존된 아미노산의 예는 도 3의 그룹으로 나타내었다: 지방족, 방향족, 소수성, 하전, 극성, 양성, 초소형 및 소형.


    SEQ ID NO: 2의 위치 82(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서, 변경은 치환, 예를 들어, 고유 아미노산으로부터 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y로의, 더욱 바람직하게는 Q, D, A로의, 더더욱 바람직하게는 D, A로의, 가장 바람직하게는 A로의 치환인 것이 바람직하다. SEQ ID NO: 2에서, 위치 82에서의 고유 아미노산은 글루탐산이며, 이에 따라 글루탐산으로의 치환은 바람직하지 않다.


    SEQ ID NO: 2의 위치 83(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서, 변경은 치환, 예를 들어, 고유 아미노산으로부터 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y로의, 더욱 바람직하게는 N, K, S로의, 더더욱 바람직하게는 N, K로의, 가장 바람직하게는 N으로의 치환인 것이 바람직하다. SEQ ID NO: 2에서, 위치 83에서의 고유 아미노산은 트레오닌이며, 이에 따라 트레오닌으로의 치환은 바람직하지 않다.


    SEQ ID NO: 2의 위치 111(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서, 변경은 치환, 예를 들어, 고유 아미노산으로부터 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y로의, 더욱 바람직하게는 N, E, Q, D, G, H로의, 더더욱 바람직하게는 E, Q로의, 가장 바람직하게는 E로의 치환인 것이 바람직하다. SEQ ID NO: 2에서, 위치 111에서의 고유 아미노산은 아스파라긴이며, 이에 따라 아스파라긴으로의 치환은 바람직하지 않다.


    SEQ ID NO: 2의 위치 112(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서, 변경은 치환, 예를 들어, 고유 아미노산으로부터 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y로의, 더욱 바람직하게는 F, Y, W로의, 더더욱 바람직하게는 F, Y로의, 가장 바람직하게는 F로의 치환인 것이 바람직하다. SEQ ID NO: 2에서, 위치 112에서의 고유 아미노산은 류신이며, 이에 따라 류신으로의 치환은 바람직하지 않다.


    SEQ ID NO: 2의 위치 573(또는 다른 알부민 또는 그의 변이체 또는 단편의 동등한 위치)에서, 변경은 치환, 예를 들어, 고유 아미노산으로부터 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y로의, 더욱 바람직하게는 P, Y, W, H, F, T, I 또는 V로의, 더더욱 바람직하게는 P, Y 또는 W로의, 가장 바람직하게는 P로의 치환인 것이 바람직하다. SEQ ID NO: 2에서, 위치 573에서의 고유 아미노산은 라이신이며, 이에 따라 라이신으로의 치환은 바람직하지 않다.


    위치 82에서의 변경은 A와 비교하여 보존되는 것이 바람직하다. 위치 83에서의 변경은 N과 비교하여 보존되는 것이 바람직하다. 위치 111에서의 변경은 E와 비교하여 보존되는 것이 바람직하다. 위치 112에서의 변경은 F와 비교하여 보존되는 것이 바람직하다. 위치 573에서의 변경은 P와 비교하여 보존되는 것이 바람직하다.


    특히 바람직한 알부민 변이체는 치환 T83N/N111E(예를 들어, SEQ ID NO: 32); T83N/N111E/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 33); T83N/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 34); T83K/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 38); E82A/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 39); L112F/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 40); E82D/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 43); P110G/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 44); N111D/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 60); N111G/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 61); N111H/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 62); E425A/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 64); E505Q/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 65); T527M/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 66); N111E/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 68); K534V/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 73); N111Q/K573P(예를 들어, SEQ ID NO: 74)를 포함하며, 이들은 HSA(SEQ ID NO: 2)를 참조로 기재되어 있다. 다른 바람직한 알부민 변이체는 HSA(SEQ ID NO: 2) 이외의 알부민에서 동등한 치환을 포함한다.


    또한, 본 발명에 따른 알부민 변이체는 HSA(SEQ ID NO: 2)의 78 내지 88 및/또는 105 내지 120 및/또는 425, 505, 510, 512, 524, 527, 531, 534, 569, 575로부터 선택되는 위치 또는 다른 알부민의 동등한 위치에서 하나 이상의(몇몇의) 변경을 포함할 수 있다. 바람직한 변경은 본 발명의 제1 양태에서 이들 위치에 대해 기재된 것들과 같은 치환이다. 특히 바람직한 치환은 D108A(SEQ ID NO: 59); D108E(예를 들어, SEQ ID NO: 70); N109K(예를 들어, SEQ ID NO: 69); P110G(예를 들어, SEQ ID NO: 42); N111D(예를 들어, SEQ ID NO: 46); N111E(예를 들어, SEQ ID NO: 67); N111G(예를 들어, SEQ ID NO: 48); N111H(예를 들어, SEQ ID NO: 49); N111K(예를 들어, SEQ ID NO: 54); L112F(예를 들어, SEQ ID NO: 37); E425A(예를 들어, SEQ ID NO: 63); E425K(예를 들어, SEQ ID NO: 55); E505Q(예를 들어, SEQ ID NO: 45); H510D(예를 들어, SEQ ID NO: 57); D512E(예를 들어, SEQ ID NO: 50); K524A(예를 들어, SEQ ID NO: 51); T527A(예를 들어, SEQ ID NO: 52); T527M(예를 들어, SEQ ID NO: 47); E531H(예를 들어, SEQ ID NO: 53); K534V(예를 들어, SEQ ID NO: 56); A569S(예를 들어, SEQ ID NO: 58); L575F(예를 들어, SEQ ID NO: 72); E82A(예를 들어, SEQ ID NO: 36); E82D(예를 들어, SEQ ID NO: 41); T83K(예를 들어, SEQ ID NO: 35); T83N(예를 들어, SEQ ID NO: 71)을 포함하며, 이들은 HSA(SEQ ID NO: 2)를 참조로 기재되어 있다. 하나 이상의(몇몇의) 변경을 포함하는 다른 바람직한 알부민 변이체는 HSA(SEQ ID NO: 2) 이외의 알부민에서 동등한 치환을 포함한다.


    유리하게는, 폴리펩티드는 참조 또는 모 알부민, 예를 들어, HSA와 실질적으로 동일한 3차 구조(또는 단편에 있어서, 구조의 관련 부분)를 유지한다. 숙련자는 3차 구조에서의 어느 정도의 변화를 염두에 둔 용어 '실질적으로 동일한 3차 구조'가 모든 단백질이 어느 정도의 구조적 유연성을 갖는 것으로 예상됨을 이해한다. 이는 특히 모 알부민 또는 참조 알부민(예를 들어, HSA)이 FcRn에 대해 갖는 것보다 높은 FcRn에 대한 결합 친화성을 갖는 폴리펩티드에 적용된다.


    하나 이상의(몇몇의) His 잔기는 모 알부민에 비하여 유지되거나 유지되지 않을 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 2를 참조하여, 하기의 His 잔기 중 하나 이상(몇몇)이 유지될 수 있다: 3, 9, 39, 67, 105, 128, 146, 242, 247, 288, 338, 367, 440, 464, 510 및/또는 535. 도메인 I 내의 His 잔기 중 하나 이상(몇몇), 바람직하게는 모두가 유지된다(즉, 3, 9, 39, 67, 105, 128, 146). 도메인 II 내의 His 잔기 중 하나 이상(몇몇), 바람직하게는 모두가 유지된다(즉, 242, 247, 288, 338, 367). 도메인 III 내의 His 잔기 중 하나 이상(몇몇), 바람직하게는 모두가 유지된다(즉, 440, 464, 510, 535). His 464, 510, 535 중 하나 이상(몇몇) 또는 모두가 유지될 수 있다.


    알부민의 이황화 결합 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개가 폴리펩티드에서 유지되는 것이 바람직하다. 전장 알부민으로부터 유도된 폴리펩티드에 대하여 알부민에 통상 존재하는 모든 이황화 결합이 유지되는 것이 바람직하다. 알부민의 단편으로부터 유도된 폴리펩티드에 대하여, 그 단편에 통상 존재하는 모든 이황화 결합이 유지되는 것이 바람직하다. Cys34(또는 비인간 알부민에서의 등가물)가 유지되는 것이 바람직하다.


    본 발명의 모든 양태에 대하여, 융합 파트너 폴리펩티드 및/또는 컨쥬게이트는 하기 중 하나 이상(몇몇)을 포함할 수 있다: 4-1BB 리간드, 5-나선, 인간 CC 케모카인, 인간 L105 케모카인, 인간 L105 케모카인 지정 huL105_3., 감마-인터페론에 의해 유도된 모노카인(MIG), 일부 CXCR4B 단백질, 혈소판 기본 단백질(PBP), α1-항-트립신, ACRP-30 상동체; 보체 구성요소 C1q C, 아데노이드-발현 케모카인(ADEC), aFGF; FGF-1, AGF, AGF 단백질, 알부민, 에토포시드, 안지오스타틴, 탄저병 백신, 콜랩신에 특이적인 항체, 항-스타신, 항-TGF 베타 패밀리 항체, 항-트롬빈 III, APM-1; ACRP-30; 파목신, 아포지질단백질 종, 아릴설파타제 B, b57 단백질, BCMA, 베타-트롬보글로불린 단백질(베타-TG), bFGF; FGF2, 혈액 응고 인자, BMP 처리 효소 푸린(Processing Enzyme Furin), BMP-10, BMP-12, BMP-15, BMP-17, BMP-18, BMP-2B, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-9, 골형성 단백질-2, 칼시토닌, 칼파인-10a, 칼파인-10b, 칼파인-10c, 암 백신, 카르복시펩티다제, CC 케모카인, MCP2, CCR5 변이체, CCR7, CCR7, CD11a MAb, CD137; 4-1BB 수용체 단백질, CD20 Mab, CD27, CD27L, CD30, CD30 리간드, CD33 면역독소, CD40, CD40L, CD52 Mab, 세레부스 단백질, 케모카인 에오탁신., 케모카인 hIL-8, 케모카인 hMCP1, 케모카인 hMCP1a, 케모카인 hMCP1b, 케모카인 hMCP2, 케모카인 hMCP3, 케모카인 hSDF1b, 케모카인 MCP-4, 케모카인 TECK 및 TECK 변이체, 케모카인-유사 단백질 IL-8M1 전장 및 성숙, 케모카인-유사 단백질 IL-8M10 전장 및 성숙, 케모카인-유사 단백질 IL-8M3, 케모카인-유사 단백질 IL-8M8 전장 및 성숙, 케모카인-유사 단백질 IL-8M9 전장 및 성숙, 케모카인-유사 단백질 PF4-414 전장 및 성숙, 케모카인-유사 단백질 PF4-426 전장 및 성숙, 케모카인-유사 단백질 PF4-M2 전장 및 성숙, 콜레라 백신, 콘드로모듈린-유사 단백질, C-키트 리간드; SCF; 비만 세포 성장 인자; MGF; 섬유육종-유래 줄기 세포 인자, CNTF 및 그의 단편(예를 들면, CNTFAx15`(악소카인(Axokine)™)), 예비(pre) 및 활성형 모두의 응고 인자, 콜라겐, 보체 C5 Mab, 결합 조직 활성화 단백질-III, CTAA16.88 Mab, CTAP-III, CTLA4-Ig, CTLA-8, CXC3, CXC3, CXCR3; CXC 케모카인 수용체 3, 시아노비린-N, 다르베포에틴, 지정된 엑소더스, 지정된 huL105_7., DIL-40, DNase, EDAR, EGF 수용체 Mab, ENA-78, 엔도스타틴, 에오탁신, 내피 호중성 백혈구 활성화 단백질-78, EPO 수용체; EPOR, 에리스로포이에틴(EPO) 및 EPO 모방체, 유트로핀, 엑소더스 단백질, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X 및 인자 XIII, FAS 리간드 억제 단백질(DcR3), FasL, FasL, FasL, FGF, FGF-12; 섬유모세포 성장 인자 상동성 인자-1, FGF-15, FGF-16, FGF-18, FGF-3; INT-2, FGF-4; 겔로닌, HST-1; HBGF-4, FGF-5, FGF-6; 헤파린 결합 분비 형질전환 인자-2, FGF-8, FGF-9; 신경교세포 활성화 인자, 피브리노겐, flt-1, flt-3 리간드, 난포 자극 호르몬 알파 서브유닛, 난포 자극 호르몬 베타 서브유닛, 폴리트로핀, 프랙탈킨, 단편. 근원섬유단백질 트로포닌 I, FSH, 갈락토시다제, 갈렉틴-4, G-CSF, GDF-1, 유전자 치료, 신경교종-유래 성장 인자, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드, 글루코세레브로시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코시다제, 글리코델린-A; 프로게스테론 연관 자궁내막 단백질, GM-CSF, 고나도트로핀, 과립구 주화성 단백질-2(GCP-2), 과립구-대식 세포 콜로니 자극 인자, 성장 호르몬, 성장 관련 종양유전자-알파(GRo-알파), 성장 관련 종양 유전자-베타(GRO-베타), 성장 관련 종양유전자-감마(GRo-감마), hAPO-4; TROY, hCG, B형 간염 표면 항원, B형 간염 백신, HER2 수용체 Mab, 히루딘, HIV gp120, HIV gp41, HIV 억제제 펩티드, HIV 억제제 펩티드, HIV 억제제 펩티드, HIV 프로테아제 억제 펩티드, HIV-1 프로테아제 억제제, HPV 백신, 인간 6CKine 단백질, 인간 Act-2 단백질, 인간 지방세포발생 억제 인자, 인간 B 세포 자극 인자-2 수용체, 인간 베타-케모카인 H1305(MCP-2), 인간 CC 케모카인 DGWCC, 인간 CC 케모카인 ELC 단백질, 인간 CC 타입 케모카인 인터루킨 C, 인간 CCC3 단백질, 인간 CCF18 케모카인, 인간 CC-타입 케모카인 단백질 지정 SLC(이차 림프 케모카인), 인간 케모카인 베타-8 짧은 형태, 인간 케모카인 C10, 인간 케모카인 CC-2, 인간 케모카인 CC-3, 인간 케모카인 CCR-2, 인간 케모카인 Ckbeta-7, 인간 케모카인 ENA-78, 인간 케모카인 에오탁신, 인간 케모카인 GRO 알파, 인간 케모카인 GRO알파, 인간 케� ��카인 GRO베타, 인간 케모카인 HCC-1, 인간 케모카인 HCC-1, 인간 케모카인 I-309, 인간 케모카인 IP-10, 인간 케모카인 L105_3, 인간 케모카인 L105_7, 인간 케모카인 MIG, 인간 케모카인 MIG-베타 단백질, 인간 케모카인 MIP-1알파, 인간 케모카인 MIP1베타, 인간 케모카인 MIP-3알파, 인간 케모카인 MIP-3베타, 인간 케모카인 PF4, 인간 케모카인 단백질 331D5, 인간 케모카인 단백질 61164, 인간 케모카인 수용체 CXCR3, 인간 케모카인 SDF1알파, 인간 케모카인 SDF1베타, 인간 케모카인 ZSIG-35, 인간 Chr19Kine 단백질, 인간 CKbeta-9, 인간 CKbeta-9, 인간 CX3C 111 아미노산 케모카인, 인간 DNAX 인터루킨-40, 인간 DVic-1 CC 케모카인, 인간 EDIRF I 단백질 서열, 인간 EDIRF II 단백질 서열, 인간 에오시노사이트 CC 타입 케모카인 에오탁신, 인간 호산구-발현 케모카인(EEC), 인간 속근 골격근 트로포닌 C, 인간 � ��근 골격근 트로포닌 I, 인간 속근 골격근 트로포닌 서브유닛 C, 인간 속근 골격근 트로포닌 서브유닛 I 단백질, 인간 속근 골격근 트로포닌 서브유닛 T, 인간 속근 골격근 트로포닌 T, 인간 태아 비장 발현 케모카인, FSEC, 인간 GM-CSF 수용체, 인간 gro-알파 케모카인, 인간 gro-베타 케모카인, 인간 gro-감마 케모카인, 인간 IL-16 단백질, 인간 IL-1RD10 단백질 서열, 인간 IL-1RD9, 인간 IL-5 수용체 알파 사슬, 인간 IL-6 수용체, 인간 IL-8 수용체 단백질 hIL8RA, 인간 IL-8 수용체 단백질 hIL8RB, 인간 IL-9 수용체 단백질, 인간 IL-9 수용체 단백질 변이체 #3, 인간 IL-9 수용체 단백질 변이체 단편, 인간 IL-9 수용체 단백질 변이체 단편#3, 인간 인터루킨 1 델타, 인간 인터루킨 10, 인간 인터루킨 10, 인간 인터루킨 18, 인간 인터루킨 18 유도체, 인간 인터루킨-1 베타 전구체, 인간 인터루킨 -1 베타 전구체., 인간 인터루킨-1 수용체 보조 단백질, 인간 인터루킨-1 수용체 길항제 베타, 인간 인터루킨-1 타입-3 수용체, 인간 인터루킨-10(전구체), 인간 인터루킨-10(전구체), 인간 인터루킨-11 수용체, 인간 인터루킨-12 40 kD 서브유닛, 인간 인터루킨-12 베타-1 수용체, 인간 인터루킨-12 베타-2 수용체, 인간 인터루킨-12 p35 단백질, 인간 인터루킨-12 p40 단백질, 인간 인터루킨-12 수용체, 인간 인터루킨-13 알파-수용체, 인간 인터루킨-13 베타 수용체, 인간 인터루킨-15, 클론 P1에서 나온 인간 인터루킨-15 수용체, 인간 인터루킨-17 수용체, 인간 인터루킨-18 단백질(IL-18), 인간 인터루킨-3, 인간 인터루킨-3 수용체, 인간 인터루킨-3 변이체, 인간 인터루킨-4 수용체, 인간 인터루킨-5, 인간 인터루킨-6, 인간 인터루킨-7, 인간 인터루킨-7., 인간 인터루킨-8(IL-8), 인간 세� �� 내 IL-1 수용체 길항제, 인간 IP-10 및 HIV-1 gp120 초가변 영역 융합 단백질, 인간 IP-10 및 인간 Muc-1 코어 에피토프(VNT) 융합 단백질, 인간 간 및 활성화 조절 케모카인(LARC), 인간 Lkn-1 전장 및 성숙 단백질, 인간 유방 연관 케모카인(MACK) 단백질 전장 및 성숙, 인간 성숙 케모카인 Ckbeta-7, 인간 성숙 gro-알파, 패혈증을 치료하는데 사용되는 인간 성숙 gro-감마 폴리펩티드, 인간 MCP-3 및 인간 Muc-1 코어 에피토프(VNT) 융합 단백질, 인간 MI10 단백질, 인간 MI1A 단백질, 인간 단핵구 화학유인물질 인자 hMCP-1, 인간 단핵구 화학유인물질 인자 hMCP-3, 인간 단핵구 주화성 프로단백질(MCPP) 서열, 인간 뉴로탁틴 케모카인 유사 도메인, 인간 비-ELR CXC 케모카인 H174, 인간 비-ELR CXC 케모카인 IP10, 인간 비-ELR CXC 케모카인 Mig, 인간 PAI-1 돌연변이, IL-16 활성이 있는 인간 단백질, IL-16 활� ��이 있는 인간 단백질, 인간 이차 림프 케모카인(SLC), 인간 SISD 단백질, 인간 STCP-1, 인간 기질 세포-유래 케모카인, SDF-1, 인간 T 세포 혼합 림프구 반응 발현 케모카인(TMEC), 인간 흉선 및 활성화 조절 사이토카인(TARC), 인간 흉선 발현, 인간 TNF-알파, 인간 TNF-알파, 인간 TNF-베타(LT-알파), 인간 타입 CC 케모카인 에오탁신 3 단백질 서열, 인간 타입 II 인터루킨-1 수용체, 인간 야생형 인터루킨-4(hIL-4) 단백질, 인간 ZCHEMO-8 단백질, 인간화 항-VEGF 항체, 및 그의 단편, 인간화 항-VEGF 항체, 및 그의 단편, 히알루로니다제, ICE 10 kD 서브유닛., ICE 20 kD 서브유닛., ICE 22 kD 서브유닛., 이듀로네이트-2-설파타제, 이두로니다제, IL-1 알파, IL-1 베타, IL-1 억제제(IL-1i)., IL-1 성숙, IL-10 수용체, IL-11, IL-11, IL-12 p40 서브유닛., IL-13, IL-14, IL-15, IL-15 수용체, IL-17, IL-17 수용체, Il-17 수용체, I l-17 수용체, IL-19, IL-1i 단편, IL1-수용체 길항제, IL-21(TIF), IL-3 함유 융합 단백질., IL-3 돌연변이 단백질, IL-3 변이체, IL-3 변이체, IL-4, IL-4 뮤테인, IL-4 뮤테인 Y124G, IL-4 뮤테인 Y124X, IL-4 뮤테인, Il-5 수용체, IL-6, Il-6 수용체, IL-7 수용체 클론, IL-8 수용체, IL-9 성숙 단백질 변이체(Met117 버전), 플라스미노겐, 인플루엔자 백신, 인히빈 알파, 인히빈 베타, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, 인테그린 Mab, 인터-알파 트립신 억제제, 인터-알파 트립신 억제제, 인터페론 감마-유도성 단백질(IP-10), 인터페론(예를 들면, 인터페론 알파 종 및 서브-종, 인터페론 베타 종 및 서브-종, 인터페론 감마 종 및 서브-종), 인터페론(예를 들면, 인터페론 알파 종 및 서브-종, 인터페론 베타 종 및 서브-종, 인터페론 감마 종 및 서브-종), 인터루킨 6, 인터루킨 8(IL-8) 수용체, 인터루킨 8 수용� �� B, 인터루킨-1알파, 인터루킨-2 수용체 연관 단백질 p43, 인터루킨-3, 인터루킨-4 뮤테인, 인터루킨-8(IL-8) 단백질., 인터루킨-9, 인터루킨-9(IL-9) 성숙 단백질(Thr117 버전), 인터루킨(예를 들면, IL10, IL11 및 IL2), 인터루킨(예를 들면, IL10, IL11 및 IL2), 일본 뇌염 백신, 칼리크레인 억제제, 케라티노사이트 성장 인자, 쿠니츠 도메인 단백질(예를 들면, 아프로티닌, 아밀로이드 전구체 단백질 및 알부민 융합이 있거나 없는 WO 03/066824호에 기술된 것들), 쿠니츠 도메인 단백질(예를 들면, 아프로티닌, 아밀로이드 전구체 단백질 및 알부민 융합이 있거나 없는 WO 03/066824호에 기술된 것들), LACI, 락토페린, 말기 TGF-베타 결합 단백질 II, 렙틴, 간 발현 케모카인-1(LVEC-1), 간 발현 케모카인-2(LVEC-2), LT-알파, LT-베타, 루테인화 호르몬, 라임 백신, 림포탁틴, 대식 세포 유래 케모카 인 유사체 MDC(n+1), 대식 세포 유래 케모카인 유사체 MDC-eyfy, 대식 세포 유래 케모카인 유사체 MDC-일, 대식 세포 유래 케모카인, MDC, 대식 세포 유래 케모카인(MDC), 마스핀; 프로테아제 억제제 5, MCP-1 수용체, MCP-1a, MCP-1b, MCP-3, MCP-4 수용체, M-CSF, 흑색종 억제 단백질, 막-결합 단백질, Met117 인간 인터루킨 9, MIP-3 알파, MIP-3 베타, MIP-감마, MIRAP, 변형된 Rantes, 단일클론 항체, MP52, 돌연변이 인터루킨 6 S176R, 근원섬유 수축 단백질 트로포닌 I, 나트륨배설촉진 펩티드, 신경 성장 인자-베타, 신경 성장 인자-베타2, 뉴로필린-1, 뉴로필린-2, 뉴로탁틴, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4, 뉴로트로핀-4a, 뉴로트로핀-4b, 뉴로트로핀-4c, 뉴로트로핀-4d, 중성구 활성화 펩티드-2(NAP-2), NOGO-66 수용체, NOGO-A, NOGO-B, NOGO-C, 신규 베타케모카인 지정 PTEC, N-말단 변형 케모카인 Gro-HEK/hSDF-1알파, N-말단 변형 케모카인 GroHEK/hSDF-1베타., N-말단 변형 케모카인 met-hSDF-1 알파, N-말단 변형 케모카인 met-hSDF-1 베타, OPGL, 골형성 단백질-1; OP-1; BMP-7, 골형성 단백질-2, OX40; ACT-4, OX40L, 옥시토신(뉴로피신 I), 부갑상선 호르몬, 패치드, 패치드-2, PDGF-D, 백일해 톡소이드, 뇌하수체 발현 케모카인(PGEC), 태반 성장 인자, 태반 성장 인자-2, 플라스미노겐 활성제 억제제-1; PAI-1, 플라스미노겐 활성제 억제제-2; PAI-2, 플라스미노겐 활성제 억제제-2; PAI-2, 혈소판 유래 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 Bv-sis, 혈소판 유래 성장 인자 전구체 A, 혈소판 유래 성장 인자 전구체 B, 혈소판 Mab, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF), 혈소판-유래 성장 인자 A 사슬, 혈소판-유래 성장 인자 B 사슬, 패혈증을 치료하는데 사용되는 폴리펩티드, 프레프로아포지질단백질 "밀라노" 변이체, 프레프로아포지질단백질 "파리" 변이체, 프레-트롬빈, 영장류 CC 케모카인 "ILINCK", 영장류 CXC 케모카인 "IBICK", 프로인슐린, 프롤락틴, 프롤락틴2, 프로삽티드, 프로테아제 억제제 펩티드, 단백질 C, 단백질 S, 프로트롬빈, 프로유로키나제, RANTES, RANTES 8-68, RANTES 9-68, RANTES 펩티드, RANTES 수용체, 재조합 인터루킨-16, 레지스틴, 레스트릭토신, 레트로바이러스 프로테아제 억제제, 리신, 로타바이러스 백신, RSV Mab, 사포린, 사르신, 분비 및 막통과 폴리펩티드, 분비 및 막통과 폴리펩티드, 혈청 콜린에스테라제, 혈청 단백질(예를 들면, 혈액 응고 인자), 가용성 BMP 수용체 키나제 단백질-3, 가용성 VEGF 수용체, 줄기 세포 억제 인자, 스트라피로코쿠스 백신, 기질 유래 인자-1 알파, 기질 유래 인자-1 베타, 물질 P(타키키닌), T1249 펩티드, T20 펩티드, T4 엔도뉴클레아제, TACI, 탈크, TGF-베타 1, TGF-베타 2, Thr117 인간 인터루킨 9, 트롬빈, 트롬보포이에틴, 트롬보포이에틴 유도체1, 트롬보포이에틴 유도체2, 트롬보포이에틴 유도체3, 트롬보포이에틴 유도체4, 트롬보포이에틴 유도체5, 트롬보포이에틴 유도체6, 트롬보포이에틴 유도체7, 흉선 발현 케모카인(TECK), 갑상선 자극 호르몬, 틱 항-응고제 펩티드, Tim-1 단백질, TNF-알파 전구체, TNF-R, TNF-RII; TNF p75 수용체; 사망 수용체, tPA, 트랜스페린, 형질전환 성장 인자 베타, 트로포닌 펩티드, 절단된 단핵구 주화성 단백질 2(6-76), 절단된 단핵구 주화성 단백질 2(6-76), 절단된 RANTES 단백질(3-68), 종양 괴사 인자, 요산염 옥시다제, 유로키나제, 바소프레신(뉴로피신 II), VEGF R-3; flt-4, VEGF 수용체; KDR; flk-1, VEGF-110, VEGF-121, VEGF-138, VEGF-145, VEGF-162, VEGF-165, VEGF-182, VEGF-189, VEGF-206, VEGF-D, VEGF-E; VEGF-X, 폰 빌러브란트씨 인자, 야생형 단핵구 주화성 단백질 2, 야생형 단핵구 주화성 단백질 2, ZTGF-베타 9, 대체 항체 스캐폴드, 예를 들어, 안티칼린(들), 아드넥틴(들), 피브리노겐 단편(들), 나노바디, 예를 들어, 카멜리드 나노바디, 인페스틴 및/또는 WO01/79271호(특히 페이지 9 및/또는 표 1), WO2003/59934호(특히 표 1), WO03/060071호(특히 표 1) 또는 WO01/079480호(특히 표 1)(각각은 본 명세서에 그들 전문이 참고로 포함된)에 언급된 분자 중 임의의 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역글로불린 또는 면역글로불린-기반 분자 또는 이들 중 어느 하나의 단편(예컨대 스몰 모듈라 이뮤노파마슈티컬(Small Modular ImmunoPharmaceutical)™("SMIP") 또는 dAb, Fab' 단편, F(ab')2, scAb, scFv 또는 scFv 단편).


    또한, 컨쥬게이트는 다음과 같은 화학치료 약물 중 하나 이상(몇몇)을 포함할 수 있다: 13-cis-레티노산, 2-CdA, 2-클로로데옥시아데노신, 5-아자시티딘, 5-플루오로우라실, 5-FU, 6-머캅토퓨린, 6-MP, 6-TG, 6-티오구아닌, A, 아브락산, 아큐탄(Accutane)

    ® , 악티노마이신-D, 아드리아마이신(Adriamycin)

    ® , 아드루실(Adrucil)

    ® , 아그릴린(Agrylin)

    ® , 알라-코트(Ala-Cort)

    ® , 알데스루킨, 알렘투주맙, ALIMTA, 알리트레티노인, 알카반(Alkaban)-AQ

    ® , 알케란(Alkeran)

    ® , 모든 트랜스레틴산, 알파 인터페론, 알트레타민, 아메토프테린, 아미포스틴, 아미노글루테티마이드, 아나그렐리드, 아난드론(Anandron)

    ® , 아나스트로졸, 아라비노실시토신, Ara-C, 아라네스프(Aranesp)

    ® , 아레디아(Aredia)

    ® , 아리미덱스(Arimidex)

    ® , 아로마신(Aromasin)

    ® , 아라논(Arranon)

    ® , 아세닉 트리옥사이드, 아스파라기� �제, ATRA, 아바스틴(Avastin)

    ® , 아자시티딘, BCG, BCNU, 베바시주맙, 벡사로텐, BEXXAR

    ® , 바이칼루타미드, BiCNU, 블레녹산(Blenoxane)

    ® , 블레오마이신, 보르테조밉, 부설판, 부설펙스(Busulfex)

    ® , C225, 칼슘 루코보린, 캄페스(Campath)

    ® , 캄토사르(Camptosar)

    ® , 캄토테신-11, 카페시타빈, 카라크(carac)™, 카르보플라틴, 카르무스틴, 카르무스틴 와퍼, 카소덱스(Casodex)

    ® , CC-5013, CCNU, CDDP, CeeNU, 세루비딘(Cerubidine)

    ® , 세툭시맙, 클로람부실, 시스플라틴, 시트로보룸 인자, 클라드리빈, 코르티손, 코스메젠(Cosmegen)

    ® , CPT-11, 사이클로포스파미드, 시타드렌(Cytadren)

    ® , 시타라빈, 시타라빈 리포조말, 사이토사르-U(Cytosar-U)

    ® , 사이톡산(Cytoxan)

    ® , 다카바진, 다코젠, 닥티노마이신, 다르베포에틴 알파, 다사티닙, 다우노마이신, 다우노루비신, 다우노루비신 하이드로클라이드, 다� �노루비신 리포조말, 다우녹솜(DaunoXome)

    ® , 데카드론, 데시타빈, 델타-코르테프(Delta-Cortef)

    ® , 텔타손(Deltasone)

    ® , 데니루킨 디프티톡스, 테포시트(DepoCyt)™, 덱사메타손, 덱사메타손 아세테이트, 덱사메타손 나트륨 인산염, 덱사손, 덱스라족산, DHAD, DIC, 디오덱스, 도세탁셀, 독실(Doxil)

    ® , 독소루비신, 독소루비신 리포조말, 드록시아(Droxia)™, DTIC, DTIC-Dome

    ® , 두랄론(Duralone)

    ® , 에푸덱스(Efudex)

    ® , 엘리가드(Eligard)™, 엘렌스(Ellence)™, 엘록사틴(Eloxatin)™, 엘스파르(Elspar)

    ® , 엠시트(Emcyt)

    ® , 에피루비신, 에포에틴 알파, 에르비툭스(Erbitux)™, 에를로티닙, 에르위니아 L-아스파라기나제, 에스트라무스틴, 에티올, 에토포포스(Etopophos)

    ® , 에토포사이드, 에토포사이드 인산염, 유렉신(Eulexin)

    ® , 에비스타(Evista)

    ® , 엑세메스탄, 파레스톤(Fareston)

    ® , 파슬로덱스(F aslodex)

    ® , 페마라(Femara)

    ® , 필그라스팀, 플록스유리딘, 플루다라(Fludara)

    ® , 플루다라빈, 플루오로플렉스(Fluoroplex)

    ® , 플루오로우라실, 플루오로우라실(크림), 플루옥심에스테론, 플루타미드, 폴린산, FUDR

    ® , 풀베스트란트, G-CSF, 게피티닙, 젬시타빈, 젬투주맙-오조가마이신, 겜자르(Gemzar)

    ® , 글리벡(Gleevec)™, 글리아델(Gliadel)

    ® 와퍼, GM-CSF, 고세렐린, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자, 할로테스틴(Halotestin)

    ® , 허셉틴(Herceptin)

    ® , 헥사드롤, 헥살렌(Hexalen)

    ® , 헥사메틸멜라민, HMM, 하이캄틴(Hycamtin)

    ® , 하이드레아(Hydrea)

    ® , 하이드로코트 아세테이트(Hydrocort Acetate)

    ® , 하이드로코르티손, 하이드로코르티손 나트륨 인산염, 하이드로코르티손 나트륨 숙시네이트, 하이드로코톤 인산염, 하이드록시유레아, 이브리투모맙, 이브리� �모맙 튜세탄, 이다마이신(Idamycin)

    ® , 아이다루비신, 아이펙스(Ifex)

    ® , IFN-알파, 아이포스파미드, IL-11, IL-2, 이마티닙 메실레이트, 이미다졸 카르복사미드, 인터페론 알파, 인터페론 알파-2b(PEG 컨쥬게이트), 인터루킨-2, 인터루킨-11, 인트론 A(Intron A)®(인터페론 알파-2b), 이레사(Iressa)

    ® , 이리노테칸, 이소트레티노인, 키드롤라아제(Kidrolase)

    ® , 라나코르트(Lanacort)

    ® , 라파티닙, L-아스파라기나제, LCR, 레날리도마이드, 레트로졸, 루코보린, 루케란, 루킨(Leukine)™, 루프롤라이드, 루로크리스틴, 루스타틴(Leustatin)™, 리포조말 아라-C, 리퀴드 프레드(Liquid Pred)

    ® , 로무스틴, L-PAM, L-사르콜리신, 루프론(Lupron)

    ® , 루프론 데포(Lupron Depot)

    ® , M, 마툴란(Matulane)

    ® , 막시덱스, 메클로르에타민, 메클로르에타민 하이드로클로라이드, 메드랄론(Medralone)

    ® , 메드롤(Medrol)

    �

    � , 메가스(Megace)

    ® , 메게스트롤, 메게스트롤 에스테이트, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메스나, 메스넥스(Mesnex)™, 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 나트륨, 메틸프레드니솔론, 메티코르텐(Meticorten)

    ® , 미토마이신, 미토마이신-C, 미톡산트론, M-프레드니솔(M-Prednisol)

    ® , MTC, MTX, 머스타르겐(Mustargen)

    ® , 머스틴, 무타마이신(Mutamycin)

    ® , 밀레란(Myleran)

    ® , 마일로셀(Mylocel)™, 마일로타르그(Mylotarg)

    ® , 나벨빈(Navelbine)

    ® , 넬라라빈, 네오사르(Neosar)

    ® , 뉼라스타(Neulasta)™, 뉴메가(Neumega)

    ® , 뉴포겐(Neupogen)

    ® , 넥사바르(Nexavar)

    ® , 닐란드론(Nilandron)

    ® , 닐루타미드, 니펜트(Nipent)

    ® , 질소 머스타드, 노발덱스(Novaldex)

    ® , 노반트론(Novantrone)

    ® , 옥트레오티드, 옥트레오티드 아세테이트, 온코스파(Oncospar)

    ® , 온코빈(Oncovin)

    ® , 온탁(Ontak)

    ® , 온잘(Onxal)™, 오프레벨킨, 오라� ��레드(Orapred)

    ® , 오라손(Orasone)

    ® , 옥살리플라틴, 탁솔 또는 탁솔 유도체, 예를 들어, 파클리탁셀, 파클리탁셀 단백질-결합, 파미드로네이트, 파니투무맙, 판레틴(Panretin)

    ® , 파라플라틴(Paraplatin)

    ® , 페디아프레드(Pediapred)

    ® , PEG 인터페론, 페가스파르가제, 페그필그라스팀, PEG-INTRON™, PEG-L-아스파라기나제, PEMETREXED, 펜토스타틴, 페닐알라닌 머스타드, 플라티놀(Platinol)

    ® , 플라티놀-AQ

    ® , 프레드니솔론, 프레드니손, 프렐론(Prelone)

    ® , 프로카르바진, PROCRIT

    ® , 프로루킨(Proleukin)

    ® , 프롤리페프로스판 20 카무스틴 이식정, 퓨린톨(Purinethol)

    ® , R, 랄록시펜, 레블리미드(Revlimid)

    ® , 류마트렉스(Rheumatrex)

    ® , 리툭산(Rituxan)

    ® , 리툭시맙, 로페론-A(Roferon-A)

    ® (인터페론 알파-2a), 루벡스(Rubex)

    ® , 루비도마이신 하이드로클로라이드, 산도스타틴(Sandostatin)

    ® , 산도스 타틴 LAR

    ® , 사그라모스팀, 솔루-코르테프(Solu-Cortef)

    ® , 솔루-메드롤(Solu-Medrol)

    ® , 소라페닙, SPRYCEL™, STI-571, 스트렙토조신, SU11248, 수니티닙, 수텐트(Sutent)

    ® , 타목시펜, 타르세바(Tarceva)

    ® , 타르그레틴(Targretin)

    ® , 탁솔(Taxol)

    ® , 탁소테르(Taxotere)

    ® , 테모다르(Temodar)

    ® , 테모졸로마이드, 테니포사이드, TESPA, 탈리도마이드, 탈로미드(Thalomid)

    ® , 테라시스(TheraCys)

    ® , 티오구아닌, 티오구아닌 타블로이드(Tabloid)

    ® , 티오포스포아미드, 티오플렉스(Thioplex)

    ® , 티오테파, TICE

    ® , 토포사르(Toposar)

    ® , 토포테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레티노인, 트렉살(Trexall)™, 트리세녹스(Trisenox)

    ® , TSPA, TYKERB

    ® , VCR, 벡티빅스(Vectibix)™, 벨반(Velban)

    ® , 벨케이드(Velcade)

    ® , 베페시드(VePesid)

    ® , 베사노이드(Vesanoid)

    ® , 비아듀르(Viadur)™, 비다자(Vidaza)

    ® , 빈블� ��스틴, 빈블라스틴 설페이트, 빈카사르 Pfs(Vincasar Pfs)

    ® , 빈크리스틴, 비노렐빈, 비노렐빈 타르트레이트, VLB, VM-26, 보리노스탯, VP-16, 부몬(Vumon)

    ® , 젤로다(Xeloda)

    ® , 자노사르(Zanosar)

    ® , 제바린(Zevalin)™, 지네카르드(Zinecard)

    ® , 졸라덱스(Zoladex)

    ® , 졸레드론산, 졸린자, 조메타(Zometa)

    ® ; 방사선약물, 예를 들어, 탄소-11, 탄소-14, 크롬-51, 코발트-57, 코발트-58, 에르븀-169, 불소-18, 갈륨-67, 금-198, 인듐-111, 인듐-113m, 요오드-123, 요오드-125, 요오드-131, 철-59, 크립톤-81m, 질소-13, 산소-15, 인-32, 레늄-186, 루비듐-82, 사마륨-153, 셀레늄-75, 스트론튬-89, 테크네튬-99m, 탈륨-201, 3중 수소, 크세논-127, 크세논-133, 이트륨-90; 영상화제, 예를 들어, 가돌리늄, 자철석, 망간, 테크네튬, I125, I131, P32, TI201, 이오파미돌, PET-FDG.


    본 발명에 따른 나노입자, 회합물 또는 조성물로의 포함을 위한 추가의 융합 파트너, 컨쥬게이션 파트너 및/또는 분자는 다음을 포함한다: 말단 비대증 약물, 예를 들어, 소마툴린, 란레오티드, 옥트레오티드, 산도스타틴; 항혈전제, 예를 들어, 비발리루딘, 안지오맥스, 달테파린, 프라그민, 에녹사파린, 로베녹스, 드로트레코진 알파(예를 들어, 활성형), 자이그리스(Xigris), 헤파린; 보조 생식 치료 화합물, 예를 들어, 융모성성선자극호르몬, 오비드렐(Ovidrel), 난포자극호르몬, 알파/베타; 효소, 예를 들어, 히알루로니다제, 하이레넥스(Hylenex); 당뇨병 약물, 예를 들어, 엑세나티드, 바이에타(Byetta), 글루카곤, 인슐린, 리라글루티드, 알비글루티드(albiglutide), GLP-1 효능제(agonist), 엑센딘 또는 엑센딘 유사체; 진단에 유용한 화합물, 예를 들어, 프로티렐린, 타이렐(Thyrel) TRH 타이피논(Thypinone), 세크레틴(예를 들어, 합성 인간), 키르호스팀(Chirhostim), 티로트로핀(예를 들어, 알파), 타이로겐(Thyrogen)의 적혈구생성 약물, 예를 들어, 다르베포에틴 알파(Darbepoetin alfa), 아라네스프(Aranesp), 에포에틴 알파(Epoetin alfa), 에포젠(Epogen), 에프렉스(Eprex), 유전자 결함 치료용 약물, 예를 들어, 페가데마제, 성장 부전(growth failure)의 치료용 약물, 예를 들어, 아다젠(Adagen), 메카세르민, 린파베이트, 낭성 섬유증의 치료용 약물, 예를 들어, 도르나세 알파(Dornase alfa), 풀모자임(Pulmozyme), 대사 장애의 치료용 약물, 예를 들어, 아갈시다제 베타(Agalsidase beta), 파브라자임(Fabrazyme), 알글루코시다제 알파, 마이오자임(Myozyme), 라로니다제(Laronidase), 알두라자임(Aldurazyme), 병변내 생식기 사마귀(geni tal wart intralesional)의 치료용 약물, 예를 들어, 인터페론 알파-n3, 알페론 N(Alferon N), 육아종병의 치료용 약물, 예를 들어, 인터페론 감마-1b, 악트이뮨(Actimmune); 성장 부전의 치료용 약물, 예를 들어, 페그비소만트(pegvisomant), 소마버트(Somavert), 소마트로핀, 제노트로핀(Genotropin), 누트로핀(Nutropin), 휴마트로프(Humatrope), 세로스팀(Serostim), 프로트로핀( Protropin); 심부전의 치료용 약물, 예를 들어, 네시리티드, 나트레코르(Natrecor); 혈우병의 치료용 약물, 예를 들어, 응고 인자, 예를 들어, 인자 VIII, 헬릭세이트(Helixate) FS, 코게네이트(Kogenate) FS, 인자 IX, 베네픽스(BeneFIX), 인자 VIIa, 노보세벤(Novoseven), 데스모프레신, 스티메이트(Stimate), DDAVP; 조혈 약물, 예를 들어, 필그라스팀(Filgrastim)(G-CSF), 뉴포젠(Neupogen), 오프렐베킨(Oprelvekin), 뉴메가(Neumega), 페그필그라스팀(Pegfilgrastim), 뉴라스타(Neulasta), 사르그라모스팀(Sargramostim), 류킨(Leukine); C형 간염의 치료용 약물, 예를 들어, 인터페론 알파-2a, 로페론 A(Roferon A), 인터페론 알파-2b, 인트론 A(Intron A), 인터페론 알파콘-1, 인페르젠(Infergen), 페긴테르페론 알파-2a(Peginterferon alfa-2a), 페가시스(Pegasys), 페긴테르페론 알파-2b, PEG-인트론; HIV의 치료용 약물, 예를 들어, 엔푸버타이드(enfuvirtide), 푸제온(Fuzeon); Fab, 예를 들어, Fab(항트롬빈), 아브식시맙(Abciximab), 레오프로(ReoPro); 모노클로널 항체, 예를 들어, 다클리주맙(Daclizumab), 제나팍스(Zenapax); 항바이러스 모노클로널 항체, 예를 들어, 팔리비주맙(Palivizumab), 사이나지스(Synagis); 천식의 치료용 모노클로널 항체, 예를 들어, 오말리주맙(Omalizumab), 졸레어(Xolair); 진단 영상화에 사용하기 위한 모노클로널 항체, 예를 들어, 아르시투모맙(Arcitumomab), CEA-Scan, 카프로맙 펜데티드(Capromab Pendetide), 프로스타신트(ProstaScint), 사투모맙 펜데티드(Satumomab Pendetide), 온코신트(OncoScint) CR/OV, 진단 영상화에 사용하기 위한 Fab, 예를 들어, 노페투모맙(Nofetumomab), 베르루마(Verluma); 면역 억제 모노클로널 항체, 예를 들어, 바실릭시맙(Basiliximab), 시물렉트(Simulect), 무로모납(Muromonab)-CD3, 오르토클론(Orthoclone) OKT3; 악성종양의 치료용 모노클로널 항체, 예를 들어, 알렘투주맙(Alemtuzumab), 캄파트(Campath), 이브리투모맙 티욱세탄(Ibritumomab tiuxetan), 제발린(Zevalin), 리툭시맙(Rituximab), 리툭산(Rituxan), 트라스투주맙(Trastuzumab), 헤르셉틴(Herceptin); 류마티스 관절염(RA)의 치료용 모노클로널 항체, 예를 들어, 아달리무맙(Adalimumab), 휴미라(Humira), 인플릭시맙(Infliximab), 레미케이드(Remicade); 방사성-면역치료제로서 사용하기 위한 모노클로널 항체, 예를 들어, 토시투모맙(Tositumomab) 및 요오드 I

    131 , 토시투모맙, 벡사르(Bexxar); 황반변성의 치료용 약물, 예를 들어, 페가프타닙(pegaptanib), 마쿠젠(Macugen); 악성종양의 치료용 약물, 예를 들어, 알데스류킨(Aldesleukin), 프로류킨(Proleukin), 인터류킨-2, 아스파라기나제(Asparaginase), 엘스파르(Elspar), 라스부리카제(Rasburicase), 엘리테크(Elitek), 데니류킨 디프티톡스(Denileukin diftitox), 온타크(Ontak), 페가스파르가제(Pegaspargase), 온카스파르(Oncaspar), 고세렐린(goserelin), 류프롤리드(leuprolide); 다발성 경화증(MS)의 치료용 약물, 예를 들어, 글라티라머 아세테이트(Glatiramer acetate)(예를 들어, 코폴리머-1), 코팍손(Copaxone), 인터페론 베타-1a, 아보넥스(Avonex), 인터페론 베타-1a, 레비프(Rebif), 인터페론 베타-1b, 베타세론(Betaseron); 점막염의 치료용 약물, 예를 들어, 팔리페르민(palifermin), 케피반스(Kepivance); 근육긴장이상의 치료용 약물, 예를 들어, 뉴로톡신, A형 보툴리눔 독소(Botulinum Toxin Type A), 보톡스(BOTOX), 보톡스 코스메틱(BOTOX Cosmetic), B형 보툴리늄 독소, 마이오블록(MYOBLOC); 골다공증의 치료용 약물, 예를 들어, 테리파라티드(teriparatide), 포르테오(Forteo); 건선의 치료용 약물, 예를 들어, 알레파셉트(Alefacept), 아메비브(Amevive); RA의 치료용 약물, 예를 들어, 아바타셉트(abatacept), 오렌시아(Orencia), 아나킨라(Anakinra), 키네레트(Kineret), 에타너셉트(Etanercept), 엔브렐(Enbrel); 혈전용해제, 예를 들어, 알테플라세(Alteplase), 악티바제(Activase), 재조합 조직 플라스미노겐 활성화제(rtPA), 아니스트레플라제(Anistreplase), 에미나제(Eminase), 레테플라제(Reteplase), 레타바제(Retavase), 스트렙토키나제(Streptokinase), 스트렙타제(Streptase), 테네크테플라제(Tenecteplase), TNKase(테네크테플라제), 유로키나제(Urokinase), 아보키나제(Abbokinase), 킨라이틱(Kinlytic); 골다공증의 치료용 약물, 예를 들어, 칼시토닌(예를 들어, 연어), 미아칼신(Miacalcin), 포르티칼(Fortical), 피부 궤양의 치료용 약물, 예를 들어, 베카플레르민(Becaplermin), 레그라넥스(Regranex), 콜라게나제(Collagenase), 산틸(Santyl).


    이러한 폴리펩티드 및 화합물은 진단 모이어티, 치료 모이어티, 예방 모이어티 또는 유익한 모이어티로 지칭될 수 있다.


    바람직하게는 융합 파트너 및/또는 컨쥬게이션 파트너는 알부민, 그의 변이체 또는 단편이 아니다.


    하나 이상의(몇몇의) 치료 또는 예방 폴리펩티드는 알부민의 N-말단, C-말단에 융합되거나, 알부민 구조 내의 루프에 삽입되거나, 또는 그들의 임의의 조합일 수 있다. 융합 폴리펩티드의 각종 성분을 분리하는 링커 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.


    알부민 또는 그의 단편의 융합에 관한 교시는 당업계에 공지되어 있으며, 해당 분야의 숙련자는 이러한 교시가 또한 본 발명에 적용될 수 있음을 인식할 것이다. 또한, WO 2001/79271A호 및 WO 2003/59934호(본 명세서에 참조로 포함)는 알부민 또는 그의 단편에 융합될 수 있는 치료 및 예방 폴리펩티드의 예를 포함하며, 이들 예도 또한 본 발명에 적용된다.


    본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 기재되며, 이는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.


    실시예


    실시예 1: HSA 뮤테인 발현 플라스미드의 제조.


    HSA 변이체를 예를 들어, 문헌[Sambrook, J. and DW Russell, 2001 (Molecular Cloning: a laboratory manual, 3

    rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)]에 기술된 바와 같이 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 발현시켰다.


    K573P 발현 플라스미드의 작제는 WO2011/051489호(본 명세서에 참조로 포함)에 기술되어 있다. 나머지 발현 플라스미드의 작제는 WO2012/150319호(PCT/EP12/058206, 본 명세서에 참조로 포함)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 변이체 HSA T83K, HSA E82A, HSA E82D, HSA P110G, HSA L112F 및 HSA T83N/N111E를 WO2012/150319호(PCT/EP12/058206호, 본 명세서에 참조로 포함)의 실시예 6, 방법 2에 기술된 바와 같이 생성하였다. K573P 치환을 포함하는 조합 돌연변이체를 "Production of combination mutants with K573P"(WO 2012/150319호(PCT/EP12/058206호))에 기술된 바와 같이 생성하였으며, 여기서, 필요한 단편을 적절하게 분해된 pDB4852로 삽입하였다(WO 2012/150319호(PCT/EP12/058206호, 본 명세서에 참조로 포함)에 기술된 바와 같음). T83N/N111E, T83K, E82A, E82D, P110G 및 L112F를 포함하는 단편을 지정된 제한 부위를 통하여 합성 작제물로부터 제거하였다(표 1). T83N 치환을 포함하는 단편을 pDB4874(WO2012/150319호(PCT/EP12/058206호, 본 명세서에 참조로 포함)에 기술됨)로부터 제거하였다. HSA 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 플라스미드 pDB3964/pDB4852의 라이게이션에 의해, 플라스미드를 생성하였으며, 이를 사용하여 요망되는 돌연변이체를 발현시켰다(표 1). 모든 플라스미드를 시퀀싱하여, HSA 서열이 오직 요망되는 위치(들)에서만 돌연변이된 것을 확인하였다.


    HSA T83N, HSA N111E 및 HSA N111E/K573P의 작제는 WO2012/150319호(PCT/EP12/058206호, 본 명세서에 참조로 포함)에 기술된 바와 같이 이루어졌다.


    사카로마이세스 세레비지에의 형질전환을 숙주 균주가 4 카피의 PDI가 게놈 내로 통합된 사카로마이세스 세레비지에 DYB7(문헌[Payne

    et al (2008) Applied and Environmental Microbiology Vol. 74(24): 7759-7766])인 것을 제외하고, WO2011/051489호에 기술된 24시간 스토킹(stocking) 방법을 사용하여, WO2012/150319호(PCT/EP12/058206호, 본 명세서에 참조로 포함)에 기술된 바와 같이 수행하였다.


    [표 1]



    실시예 2: FcRn에 대한 알부민 변이체의 결합 친화성의 SPR 분석


    SPR 분석을 WO 2012/150319호(PCT/EP12/058206호, 본 명세서에 참조로 포함)에 기술된 바와 같이 수행하였다.


    변이체는 각각이 하기로부터 선택되는 하나의 점 돌연변이를 갖는 알부민(SEQ ID NO: 2)이었다: D108A, N111D, N111G, N111H, N111K, K190A, R197A, K276N, R410A, Y411A, P416A, E425A, E425K, K466A, D471A, R472A, N503D, N503K, E505K, E505Q, H510D, H510E, D512A, D512E, K524A, K525A, T527A, T527D, T527M, E531A, E531H, K534V, H535F, E565V, A569L, A569S, A569V 및 V576F.


    먼저, 변이체를 SPR에 의해 분석하여, shFcRn에 대한 그들의 결합 반응(RU)을 결정하였다. 야생형 알부민의 결합 반응보다 20% 더 높거나 낮은 결합 반응을 보이는 변이체만을 분석하여, KD를 확인하였다(하기 표 2). 야생형 HSA 및 돌연변이 K573P가 있는 HSA를 대조군으로서 사용하였다.


    [표 2]



    야생형 HSA보다 더 낮은 KD가 있는 변이체는 shFcRn에 대한 결합 친화성이 더 높다. 역으로, 야생형 HSA보다 더 높은 KD를 갖는 변이체는 shFcRn에 대한 결합 친화성이 더 낮다.


    위치 108 및 111에 대한 데이터는 FcRn과의 상호작용에서의 위치 105 내지 120을 포함하는 루프의 포함을 뒷받침하며, 이에 따라, 이러한 루프 내의 임의의 위치에서의 변경이 FcRn에 대한 알부민의 결합 친화성을 조절할 것이다.


    실시예 3. FcRn에 대한 알부민 변이체의 결합 친화성의 SPR 분석


    각각이 하기로부터 선택되는 하나의 점 돌연변이를 갖는 알부민(SEQ ID NO: 2)인 변이체를 상기 기술된 바와 같이 제조하였다: N111D, N111G, N111H, N111D/K573P, N111G/K573P, N111H/K573P, E505Q, E425A, T527M, E505Q/K573P, E425A/K573P 및 T527M/K573P.


    [표 3]



    야생형 HSA보다 더 낮은 KD를 갖는 변이체는 shFcRn에 대한 결합 친화성이 더 높다. 역으로, 야생형 HSA보다 더 높은 KD를 갖는 변이체는 shFcRn에 대한 결합 친화성이 더 낮다.


    K573P를 포함하는 변이체에 대한 데이터는, 오직 K573P 치환과 일치하는 친화성의 증가를 생성한다.


    실시예 4. FcRn에 대한 알부민 변이체의 결합 친화성의 SPR 분석


    각각이 하기로부터 선택되는 하나의 점 돌연변이를 갖는 알부민(SEQ ID NO: 2)인 변이체를 상기 기술된 바와 같이 제조하였다: N111R, N111Q, N111E, N111R/K573P, N111Q/K573P, N111E/K573P, N109D, N109E, N109Q, N109R, N109K, N109H, N109G, D108E, T83N, L575F 및 K534V/K573P.


    [표 4a]



    [표 4b]



    데이터는 FcRn에 대한 HSA의 결합에서 108 내지 111 루프에 대한 역할을 보여주며, 감소된 결합 친화성이 D108A 및 N111K 변이체에서 관찰된다(표 2). 위치 111에서의 추가의 돌연변이는, 야생형 HSA와 비교하여, N111K 변이체에 대하여 관찰되는 감소된 친화성으로부터, FcRn에 대한 증가된 친화성을 나타내는 N111E 변이체까지 다양한 결합 친화성을 보여주었다(표 4). 변이체 N111Q/K573P(도 5, SEQ ID NO: 74)는 야생형 HSA에 비하여 더 증가된 반응 및 야생형 HSA에 비하여 더 느린 해리를 갖는 결합 곡선을 보여주며, 이는 K573P 치환과 일치한다. FcRn과 HSA의 루프 영역 108 내지 112의 상대적 위치(도 6)는 이러한 영역이 실시예 2에서 예측된 바와 같이 FcRn 결합에 기여하는 능력을 가짐을 시사한다. 도 5 및 6에 관한 추가의 상세사항은 WO 2012/150319호(PCT/EP12/058206호, 본 명세서에 참조로 포함)에 제공되어 있다.


    잔기 78 내지 88을 포함하는 도메인 I(도메인 1)의 인접 루프 영역의 상대 위치(도 6)는 이러한 영역이 FcRn 결합에 기여하는 능력을 가짐을 시사한다. 이는 T83N 변이체가 야생형 HSA에 비하여 더 증가된 FcRn에 대한 친화성을 보이는 관찰에 의해 뒷받침된다(표 4).


    인접 잔기, 특히, E82, P110 및 L112의 돌연변이(도 6)가 FcRn에 대한 HSA의 결합 친화성을 변경시키는 것으로 예측될 것이다.


    실시예 5: FcRn에 대한 알부민 변이체의 결합 친화성의 SPR 분석


    SPR 분석을 비아코어 3000 기기(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))에서 수행하였다. 제조처의 지시에 따라 지이 헬쓰케어 아민 커플링 화학물질을 사용하여 shFcRn이 커플링된 CM5 칩(진아트(GeneArt) 1177525)에서 고정화를 수행하였다. shFcRn-HIS(베타-2-마이크로글로불린의 C-말단에 6-His 테일(tail)이 있는 shFcRn)의 고정 수준은 약 1200RU였으며, 아세트산나트륨 pH4.5 중 20㎍/㎖ shFcRn을 주입함으로서 달성된다. 25℃에서 하룻밤 일정한 유동(5㎕/분)의 런닝 완충제 - 이염기성/일염기성 인산염 완충제 pH5.5로 안정화되게 하였다. 리간드 안정화 후에, 칩 표면을, 30㎕/분으로 45㎕ 이염기성/일염기성 인산염 완충제를 3회 주입하고, 각 주입 사이에 HBS_EP(0.01 M HEPES, 0.15 M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, pH 7.4)(지이 헬스케어) 재생 단계(12초)를 행하여, 칩 표면을 컨디셔닝하였다. 이어서, 30㎕/분으로 45㎕ 양성 대조군을 3회 주입하고, 12초 재생 펄스를 행함으로써 활성에 대하여 표면을 점검하였다.


    pH 5.5 결합 분석: 결합 데이터에 대한 센서그램을 30㎕/분으로 pH 5.5 런닝 완충제 중의 20μM의 피분석물(pH 5.5 완충제 중에 희석) 45㎕를 2벌로 주입함으로써 수득하였다. 주입 후 12초 재생 펄스를 2회 수행하여, 기준선을 복구시켰다(HBS-EP pH 7.4; 50㎕/분으로 10㎕). 이어서, 참조물질을 제하고, 비아이밸류에이션 소프트웨어 4.1을 사용하여 결합 분석 데이터를 수득하였다.


    pH 5.5 반응속도(kinetic) 분석: 반응속도 분석에 대한 센서그램을 주입후 90초 지연(반응속도 모델링에 대하여 순조로운 해리를 가능하게 함)과 함께, 30㎕/분으로, pH 5.5 런닝 완충제 중 5가지 농도, 20μM, 4μM, 0.8μM, 0.16μM 및 0.032μM의 피분석물 45㎕를 주입함으로써 수득하였다. 주입후 2회의 12초 재생 펄스를 수행하여, 기준선을 복구하였다(HBS-EP pH 7.4; 50㎕/분에서 10㎕). 분석을 2개의 개별 경우에서 수행하였다. 이어서, 참조 셀 값을 제하고, 비아이밸류에이션 소프트웨어 4.1을 사용하여 반응속도 데이터를 수득하고, KD 값을 확인하였다.


    SPR을 사용하여, FcRn에 대한 변이체의 결합 반응을 확인하였으며, 결과는 표 5a 및 표 5b에 나타나 있다.


    [표 5a]



    [표 5b]



    KD 분석을 변이체에서 수행하여, HSA-K573-FcRn 결합 친화성에 대한 변이체-FcRn 결합 친화성을 평가하였다. 결과는 표 6에 나타나 있다. 추가의 분석을 수행하여, 결합 친화성을 계산하였다(표 7).


    [표 6]



    [표 7]



    데이터는 HSA T83N/N111E/K573P 및 HSA T83N/K573P가 야생형 HSA에 비하여 높은 FcRn 결합 친화성을 갖는 것을 보여준다. HSA E82A 및 HSA L112F는 둘 모두 FcRn에 대한 야생형 HSA의 것에 비하여 향상된 FcRn에 대한 결합을 보이며, 이는 HSA(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 78 내지 88 및 HSA(SEQ ID NO: 2)의 아미노산 105 내지 120을 포함하는 루프가 FcRn에 대한 HSA의 결합에 수반되는 것을 뒷받침한다.


    위치 L112 또는 T83에서 단일의 돌연변이를 갖는 HSA는 서로 유사한 FcRn 결합 친화성을 보인다. 그러나, L112 및 K573의 이중 돌연변이는 T83 및 K573의 이중 돌연변이보다 더 강한 FcRn에 대한 결합 친화성을 갖는다.


    [표 8]



    표 8의 데이터는 HSA-E82D가 야생형 알부민에 비하여 낮은 FcRn 결합 친화성을 가지며, HSA-K573P가 야생형 알부민에 비하여 높은 FcRn 결합을 갖는 것을 보여준다. 그러나, 이중 돌연변이 HSA-E82D/K573P는 HSA-K573P와 동일한 FcRn 결합 친화성을 보여주며, 다시 말하면, E82D 치환의 포함은 FcRn 결합에 불리하게 영향을 미치지 않는다.


    본 명세서에 기재되고 청구된 본 발명은 본 명세서에 개시된 특정 양태가 본 발명의 몇몇 양태를 예시하고자 하는 것이기 때문에, 이들 양태에 의해 범주가 제한되지 않을 것이다. 임의의 동등한 양태가 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 실제로, 본 명세서에 나타내고 기재된 변형에 더하여, 본 발명의 다양한 변형은 상기 설명으로부터 해당 분야의 숙련자에게 명백해질 것이다. 또한, 이러한 변형은 첨부된 특허청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 개시내용이 좌우할 것이다.

    SEQUENCE LISTING <110> Novozymes Biopharma UK Ltd Novozymes Biopharma DK A/S <120> Albumin variants <130> 12470-WO-PCT <150> EP12187326.9 <151> 2012-10-05 <150> EP12191086.3 <151> 2012-11-02 <150> EP12191854.4 <151> 2012-11-08 <150> EP12160007.6 <151> 2012-03-16 <150> PCT/EP2012/058206 <151> 2012-05-04 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1758 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1758) <223> cDNA encoding HSA <400> 1 gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60 gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120 aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180 aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240 cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300 tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360 gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420 gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tcct tttctt tgctaaaagg 480 tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540 aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600 gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660 cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720 gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780 gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840 aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900 gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960 gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020 tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080 tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140 gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200 tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260 ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaac at 1320 cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380 tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440 ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500 gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560 agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620 aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680 gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740 gctgccttag gcttataa 1758 <210> 2 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp 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Val 485 490 495 Thr Lys Cys Cy s Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser 500 505 510 Ala Leu Thr Pro Asp Glu Thr Tyr Lys Pro Lys Glu Phe Val Glu Gly 515 520 525 Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Leu Cys Thr Leu Pro Glu Asp Glu Lys 530 535 540 Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro 545 550 555 560 His Ala Thr Glu Glu Gln Leu Arg Thr Val Leu Gly Asn Phe Ala Ala 565 570 575 Phe Val Gln Lys Cys Cys Ala Ala Pro Asp His Glu Ala Cys Phe Ala 580 585 590 Val Glu Gly Pro Lys Phe Val Ile Glu Ile Arg Gly Ile Leu Ala 595 600 605 <210> 20 <211> 584 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> N terminal is residues 1 to 572 of HSA. C terminal is residues 573 to 584 of Macaque albumin. <400> 20 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe L ys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser T hr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Phe Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Ala 580 <210> 21 <211> 584 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N terminal is residues 1 to 572 from HSA. C terminal is residues 573 to 584 from mouse albumin. <400> 21 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe L ys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser T hr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Asn Leu Val 565 570 575 Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala 580 <210> 22 <211> 584 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N terminal is residues 1 to 572 of HSA. C terminal is residues 573 to 584 of rabbit albumin. <400> 22 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe L ys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser T hr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val 565 570 575 Glu Ser Ser Lys Ala Thr Leu Gly 580 <210> 23 <211> 584 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal is residues 1 to 572 of HSA. C-terminal is residues 573 to 583 of sheep albumin. <400> 23 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe L ys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val 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3 <400> 24 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu 195 200 205 Phe Glu Gln 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human serum albumin domain 2 and human serum albumin d omain 3 <400> 25 Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu 1 5 10 15 Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp 20 25 30 Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu 35 40 45 Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys 50 55 60 His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys 85 90 95 Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu 100 105 110 Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val 115 120 125 Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe 130 135 140 Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser 145 150 155 160 Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu 165 170 175 Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe 180 185 190 Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln 195 200 205 Asn C ys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala 210 215 220 Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr 225 230 235 240 Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys 245 250 255 Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser 260 265 270 Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser 275 280 285 Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro 290 295 300 Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe 305 310 315 320 Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu 325 330 335 Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys 340 345 350 His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp 355 360 365 Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr 370 375 380 Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala 385 390 395 400 Leu Gly Leu <210> 26 <211> 410 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Ar tificial albumin variant: two consecutive copies of human serum albumin domain 3 <400> 26 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu 1 5 10 15 Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 20 25 30 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 35 40 45 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 50 55 60 Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 65 70 75 80 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 85 90 95 Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 100 105 110 Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 115 120 125 Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys 130 135 140 Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 145 150 155 160 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu 165 170 175 Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 180 185 190 Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val Glu Glu 195 200 205 Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly 210 215 220 Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val 225 230 235 240 Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly 245 250 255 Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro 260 265 270 Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu 275 280 285 His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu 290 295 300 Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu 305 310 315 320 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala 325 330 335 Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr 340 345 350 Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln 355 360 365 Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys 370 375 380 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 385 390 395 400 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 405 410 <210> 27 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial albumin variant: human serum albumin domain 3 <400> 27 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu 1 5 10 15 Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 20 25 30 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 35 40 45 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 50 55 60 Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 65 70 75 80 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 85 90 95 Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 100 105 110 Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 115 120 125 Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys 130 135 140 Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 145 150 155 160 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu 165 170 175 L ys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 180 185 190 Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 195 200 205 <210> 28 <211> 615 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSA Domain III + HSA Domain III + HSA Domain III <400> 28 Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu 1 5 10 15 Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr 20 25 30 Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg 35 40 45 Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys 50 55 60 Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu 65 70 75 80 Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys 85 90 95 Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu 100 105 110 Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr 115 120 125 Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys 130 135 140 Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr 14 5 150 155 160 Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu 165 170 175 Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly 180 185 190 Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val Glu Glu 195 200 205 Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly 210 215 220 Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val 225 230 235 240 Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly 245 250 255 Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro 260 265 270 Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu 275 280 285 His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu 290 295 300 Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu 305 310 315 320 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala 325 330 335 Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr 340 345 350 Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln 35 5 360 365 Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys 370 375 380 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 385 390 395 400 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn 405 410 415 Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys 420 425 430 Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val 435 440 445 Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly 450 455 460 Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu 465 470 475 480 Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys 485 490 495 Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val 500 505 510 Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val 515 520 525 Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys 530 535 540 Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val 545 550 555 560 Glu 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Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His P ro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu 195 200 205 Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg 210 215 220 Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val 225 230 235 240 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu 245 250 255 Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn 260 265 270 Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr 275 280 285 Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala 290 295 300 Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr 305 310 315 320 Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln 325 330 335 Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys 340 345 350 Ala Thr L ys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe 355 360 365 Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu 370 375 380 Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val 385 390 395 400 Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln 405 410 415 Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys 420 425 430 Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn 435 440 445 Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg 450 455 460 Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys 465 470 475 480 Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys 485 490 495 Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val 500 505 510 Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe 515 520 525 His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys 530 535 540 Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys 545 550 555 560 Glu Gln L eu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys 565 570 575 Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys 580 585 590 Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 595 600 <210> 30 <211> 290 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(290) <223> Truncated heavy chain of the major histocompatibility complex class I-like Fc receptor (FCGRT) (together, SEQ ID No. 30 and SEQ ID No. 31 form FcRN) <400> 30 Met Gly Val Pro Arg Pro Gln Pro Trp Ala Leu Gly Leu Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Leu Pro Gly Ser Leu Gly Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr 20 25 30 His Leu Thr Ala Val Ser Ser Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp 35 40 45 Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu 50 55 60 Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val 65 70 75 80 Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys 85 90 95 Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys Ala Leu Gly 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Beta-2-microglobulin (together, SEQ ID No. 30 and SEQ ID No. 31 form FcRN) <400> 31 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg 20 25 30 His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser 35 40 45 Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu 50 55 60 Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp 65 70 75 80 Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp 85 90 95 Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile 100 105 110 Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115 <210> 32 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSA T83N, N111E <400> 32 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn 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Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Pro Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 34 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSA T83N, K573P <400> 34 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro 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Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Ty r Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr 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