기관지 천식의 예방과 치료를 위한 조성물

기관지 천식의 예방과 치료를 위한 조성물{A pharmaceutical for treating or preventing asthma}

본 발명은 숙지황(熟地黃, Rehmannia glutinosa ), 반하(半夏, Pinellia ternata ), 진피(陳皮, Citrus reticulata ), 감초(甘草, Glycyrrhiza glabra ) , 길경(桔梗, Platycodon grandiflorum ), 오미자(五味子, Schizandra chinensis ) 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 기관지 천식의 예방과 치료를 위한 조성물에 및 건강기능식품에 관한 것이다.

본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없고 NO 생성을 억제하며, 기관지 조직의 치료, 기도저항의 억제, 염증성 물질의 억제, 항염증성 물질의 증가, T 세포 활성화 억제, 폐조직 단백질 STAT4 및 STAT6의 억제 및 간독성이 없는 효과를 보유하고 있다.

일반적으로, 천식은 심장 천식과 기관지 천식으로 분류되는데, 전자는 심장질환이나 고혈압 등에서 볼 수 있는 발작적 호흡곤란으로서, 폐울혈이나 조직울혈로 인한 호흡 중추의 과민상태로 볼 수 있다.

기관지 천식은 기관지(bronchus)가 좁아지고 염증이 생겨, 숨쉬기가 곤란해지고, 숨쉴 때 쌕쌕거리는 소리(천명음, wheezing)가 들리는 만성 폐질환이다.

천식발작 동안에는 기관지를 둘러싸고 있는 근육이 수축을 하여 기도가 매우 좁아지므로 기도의 일부가 막히게 되는데, 만일 기관지의 염증으로 점액질의 가래가 만들어져서 그 좁아진 기도를 채우게 되면, 기도가 완전히 막히게 될 수도 있다.

천식을 유발시킬 수 있는 물질은 알레르기 항원(알레르겐, allergen)으로서, 면역 체계의 과민반응을 일으킬 수 있다.

여기에서, 체내 염증 과정을 살펴보면 유도성 NOS(inducible NO synthase, iNOS, NOS-II) 및 COX2(cyclooxygenase2)에 의해 과량의 NO(nitric oxide) 및 PGE ₂ (prostaglandin E ₂ ) 등의 염증인자가 형성된다.

여기에서, NOS-II는 LPS(lipopolysaccharide) 및 다양한 염증 유도 사이토카인(cytokines)에 노출되는 경우에 발현되는데, NOS의 종류 중에서 NOS-II에 의한 NO 생성이 절대적으로 많으며 병리학적으로 중요한 작용을 한다고 알려져 있다.

또한 기관지 천식은 기도 내에 호산구, 비반세포, T 임파구 등 활성화된 염증 세포가 침착되어 있게 된다. 특히 호산구는 골수에서 만들어지고 기도 내로 이동하여 활성화되는데 이러한 과정에서 T helper(Th)세포에서 분비하는 사이토카인이 중요한 역할을 한다.

특히 Th1 세포에서는 IFN-γ를 분비하고, Th2 세포에서는 IL-4, IL-5, IL-10, IL-3 를 분비하게 되는데, 천식환자의 기관지 폐포 세척액이나 폐조직에는 Th2 사이토카인의 발현이 증가되어 있음이 밝혀졌다.

한편 종래에는 기관지 천식의 대한 치료제로서 기관지 확장제 및 항염증제가 주로 이용되어 왔으며, 응급상황이나 중증 천식환자들은 경구용 스테로이드제제나 오말리주맙(Omalizumab, 상품명:졸레어(Xolair)) 등을 사용하여 왔다.

그러나 이들은 치료반응은 신속하나 사용을 중지시 증상이 악화되기도 하고 쇼크의 위험성이 있는 등 부작용이 있는바, 이를 대체할 수 있는 보완제품의 필요성이 절실한 실정이다.

한편 본 발명자들은 천연물을 이용하여 기관지 천식의 예방과 치료를 위한 조성물을 개발하고자, 숙지황, 반하, 진피, 감초, 길경, 오미자를 이용하였는바, 이에 대해 간략히 살펴본다.

숙지황(熟地黃, Rehmannia glutinosa )는 지황의 뿌리줄기를 가공한 후 쪄서 햇볕에 말린 것으로, 간신(肝腎)을 자양(滋養)하고 보익(補益)하며 혈(血)을 기르고 허(虛)를 보(補)하며 골수(骨髓)를 메우는 효능을 가진 약재로 알려져 있다.

주요 약리작용으로는, 혈당강하, 순환기 계통의 강심 및 이뇨작용, 간 기능 보호작용 및 항균작용 등을 들 수 있다.

반하(半夏, Pinellia ternata )는 천남성과 여러해살이풀 반하의 덩이뿌리로, 일체의 담(痰)을 치료하는데 유용한 약재로 알려져 있다.

주요 약리작용으로는, 진해 거담작용, 진폐증 예방 및 치료효과, 진토(鎭吐) 작용 및 해독작용 등을 들 수 있다.

진피(陳皮, Citrus reticulata )는 성숙한 과실의 껍질로, 기(氣)를 소통시키고 습(濕)을 말리며 담(痰)을 삭이는 효능을 가진 약재로 알려져 있다.

주요 약리작용으로는, 진해 거담작용, 항궤양 작용 및 항위액 분비 작용, 심혈관계 강심 작용, 항알레르기 작용, 항균작용 등을 들 수 있다.

감초(甘草, Glycyrrhiza glabra ) 는 중초(中焦)를 느리게도 빠르게도 하지 않고 조화롭게 하며, 폐(肺)의 건조한 것을 적시며 해독하며 모든 약을 조화시키는 효능이 있는 약재로 알려져 있다.

주요 약리작용으로는, 항소화성 궤양 작용, 경련완화 작용, 항염, 항바이러스 및 해독 작용, 간보호작용 및 진해 거담작용 등을 들 수 있다.

길경(桔梗, Platycodon grandiflorum )은 담(痰)을 없애고 목구멍을 편안하게 하고 폐(肺)를 펴주며 표증(表證)을 풀고 습사(濕邪)를 없애고 기혈(氣血)을 보익(補益)하고 속을 따뜻하게 하며 음식을 잘 소화되게 하고 단단한 것을 깨뜨리고 고름을 배출시키며 구규(九竅)를 통(通)하게 하는 효능을 가진 약재로 알려져 있다.

주요 약리작용으로는, 진해 거담작용, 비만억제작용, 혈당 강하 작용 및 위궤양 치료 효과 등을 들 수 있다.

오미자(五味子, Schizandra chinensis )는 열매를 사용하며 간기(肝氣)를 수렴하고 신(腎)을 자양하며 진액(津液)을 생성하고 땀을 수렴하며 정(精)을 수렴하는 효능을 가진 약재로 알려져 있다.

주요 약리작용으로는, 호흡중추 자극 작용, 심혈관계 생리 조절, 혈액 순환장애 개선 작용 등을 들 수 있다.

한편 천연물을 이용한 천식 치료용 조성물에 대한 선행특허에 대하여 검토해 보면, 대한민국 공개특허공보 10-2004-0023199호에 감초, 소자, 전호, 오미자, 천문동, 상백피 및 소엽을 주성분으로 함유하는 천식 치료용 약학적 조성물이 기재되어 있다.

본 발명의 목적은 기관지 천식의 예방과 치료를 위하여, 천연물을 이용한 조성물 및 건강기능식품을 제공함에 있다.

본 발명은 숙지황(熟地黃, Rehmannia glutinosa ), 반하(半夏, Pinellia ternata ), 진피(陳皮, Citrus reticulata ), 감초(甘草, Glycyrrhiza glabra ) , 길경(桔梗, Platycodon grandiflorum ), 오미자(五味子, Schizandra chinensis ) 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 기관지 천식의 예방과 치료를 위한 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

또한 상기 숙지황, 반하, 진피, 감초, 길경 및 오미자의 중량 비율은 동일한 것을 특징으로 하는 기관지 천식의 예방과 치료를 위한 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

또한 상기 혼합 추출을 위한 용매는 70% 메탄올인 것을 특징으로 하는 기관지 천식의 예방과 치료를 위한 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명의 추출물 자체는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드, 록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전부, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose)또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 1일 0.0001g/kg 내지 10g/kg으로 투여하는 것이 바람직하다.

투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한 본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 추출물을 유효성분으로 함유하는 기관지 천식의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 기관지 천식의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물은 기관지 천식의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며 건강 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율의 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리통 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 일긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 채소 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없고 NO 생성을 억제하며, 기관지 조직의 치료, 기도저항의 억제, 염증성 물질의 억제, 항염증성 물질의 증가, T 세포 활성화 억제, 폐조직 단백질 STAT4 및 STAT6의 억제 및 간독성이 없는 현저한 효과를 보유하고 있다.

도 1a는 열수 추출물의 세포 독성 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 1b는 70% 메탄올 추출물의 세포 독성 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 2a는 열수 추출물의 항염증 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 2b는 농도별 메탄올 추출물의 항염증 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 2c는 70% 메탄올 추출물의 항염증 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 기관지 천식 모델에 실시예 1의 추출물 시료를 처리한 실험과정을 도시한 도면이다.
도 4는 실시예 1의 추출물의 기관지 조직 치료실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 70% MeOH 추출물의 기도저항 억제 효과실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 70% MeOH 추출물의 염증성 및 항염증성 물질에 미치는 효과 실험결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 70% MeOH 추출물의 T 세포 활성화 억제 효과 실험결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 70% MeOH 추출물의 폐조직 단백질 STAT4 및 STAT6 억제 효과 실험결과를 나타낸 도면이다.
도 9a 및 도 9b는 70% MeOH 추출물의 간독성 실험결과를 나타낸 도면이다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참고예, 실험예, 제제예와 도면에 도시된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1. 기관지 천식 예방 및 치료용 조성물의 제조

1-1. 열수 추출물의 제조

먼저 분쇄기를 사용하여 숙지황, 반하, 길경, 진피, 감초, 오미자 분말을 수득한 후에 각각 100 g 씩 총 600 g을 준비하였다.

분말시료 600g을 약탕기에 넣고 물 6L를 첨가하여 100 ℃에서 3시간 열수 추출하였고, 다음으로 열수 추출물을 0.45 um 여과지로 걸러낸 후에 동결건조하여 200g의 담갈색 분말시료를 얻었다.

분말시료는 -80℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

1-2. 70% MeOH 추출물의 제조

먼저 분쇄기를 사용하여 숙지황, 반하, 길경, 진피, 감초, 오미자 분말을 수득한 후에 각각 100 g 씩 총 600 g을 준비하였다.

분말시료 600g에 70% MeOH 6 L를 넣고 상온에서 24시간 용매 추출하였고, 다음으로 추출물을 0.45 um 여과지로 걸러낸 후에 건조하여 600 mL의 흑갈색 용액으로 농축하였다.

농축용액 시료는 -80℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

참고예 1. 시험관내 ( in vitro ) 활성 실험 준비

1-1. 실험동물 및 시약 준비

C57BL/6 6주령 마우스(mouse)의 암컷을 (주)오리엔트바이오(S. Korea 성남 경기도)에서 구입하여 사용하였다

세포 배양용 시약들(Fetal bovine serum (FBS), RPMI-1640, penicillin-streptomycin 등)은 Gibco BRL (Grand Island, USA)사에서, 배양조는 Corning (Rochester, USA)사에서 구입하여 사용하였다.

실험에 사용된 시약 중 chloroform, HEPES, sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS (Serotype: 055: B5), Tris-HCl 등은 SIGMA (St. Louis, USA)사에서 구입하여 사용하였다.

1-2. 염증성 대식세포의 배양

염증성 대식세포를 얻기 위하여 2.5 ml의 Thioglucollate를 C57BL/6 마우스의 복강 내에 주사하고, 3일 후에 cervical dislocation으로 희생시킨 후 10% FBS가 함유된 RPMI 1640 7 ml를 복강 내에 주사하여 잘 흔든 다음, 다시 주사기로 유출하였다..

유출한 복강세포는 4℃, 1,200 rpm에서 5분간 원심분리한 후 10% FBS가 함유되고 1% penicillin이 보충된 RPMI 1640에 현탁한 다음, cell을 counting해서 1x10 ⁶ cells/ml로 6cm dish나 plate에 분주하여 대식세포가 바닥에 부착되도록 5% CO2, 37 ℃ 배양기에서 3시간 배양하고, 상등액을 버린 후에 dish나 plate에 부착한 세포를 염증성 대식세포로 간주하여 실험하였다.

실험예 1. 실시예 1 추출물의 세포 독성 실험

1-1. 실험시료 준비

실시예 1에 따른 열수 추출물 및 70% MeOH 추출물 각각을 희석하여, 25 ug/ml, 50 ug/ml, 100 ug/ml, 200 ug/ml 의 농도로 실험시료를 준비하였다.

1-2. 세포 독성 실험

대식세포의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자주빛 formazan 생성물로 변하는 MTT 환원을 바탕으로 MTT 분석법으로 측정하였다.

지수성장을 하는 세포들은 RPMI 1640 배지에서 1 x 10 ⁶ cells/ml의 밀도로 현탁하였고, 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml 농도로 AETD로 처리하였다.

4시간 동안 배양한 뒤 1 mg/ml의 농도로 배양하기 위해서 MTT 용액을 첨가하고 다시 2시간 동안 배양하였다.

MTT-formazan 생성물은 동일한 용량의 용해 완충액 (50% n,n-dimethylformamide을 포함하는 20% SDS 용액, pH 4.7)을 첨가하여 용해한 다음, 20~24시간 동안 배양하였다.

formazan의 양은 570 nm에 흡수되는 양을 측정하였다.

1-3. 세포 독성 실험결과

도 1a는 열수 추출물의 세포 독성 실험결과, 도 1b는 70% 메탄올 추출물의 세포 독성 실험결과를 나타낸 도면이다.

먼저, 본 발명의 실시예 1에 따른 추출물을 "OMC-2010"으로 명명하였으며, 각 실험에 대해 기재된 실험시료에 따라 "OMC-2010"은 열수 추출물 및 메탄올 추출물 모두를 포괄하거나 하나만을 지칭하고 있음을 밝혀둔다.

마우스의 대식세포에 실험시료 추출물을 농도별로 전처리하고, 24시간 후에 세포의 세포의 생존율을 측정하였다.

도 1a 및 도 1b를 참조하면, 열수 추출물 및 70% 메탄올 추출물은 200 ug/ml를 제외하고는 세포생존율을 저하시키지 않았음을 알 수 있다.

따라서 본 발명의 실시예 1에 따른 추출물은 대식세포에 대한 독성작용이 없음을 알 수 있다.

실험예 2. 실시예 1 추출물의 항염증 실험

2-1. 실험시료 준비

실시예 1에 따른 열수 추출물을 희석하여 25 ug/ml, 50 ug/ml, 100 ug/ml의 농도로 실험시료를 준비하였다.

또한 30%, 50%, 70%, 100% MeOH 추출물을 동일 농도로 실험시료를 준비하였다.

또한 70% MeOH 추출물을 희석하여, 25 ug/ml, 50 ug/ml, 100 ug/ml 의 농도로 실험시료를 준비하였다.

2-2. 항염증 실험

NOS의 종류 중에서 NOS-II에 의한 NO 생성이 절대적으로 많으며 병리학적으로 중요한 작용을 하며, NOS-II는 LPS(lipopolysaccharide) 및 다양한 염증 유도 사이토카인(cytokines)에 노출되는 경우에 발현된다고 알려져 있다.

따라서 LPS 유도 NO 생성을 억제하는 실험을 통해 항염증 실험을 수행하였다.

측정과정을 살펴보면, NO의 기질인 L-알기닌은 L-시트룰린과 일산화질소로 변하는데, 이는 빠르게 안정된 이산화질소, 아질산염, 질산염으로 변한다. 그리스 시약(Griss reagent:0.5%의 설파닐아미드, 2.5%의 인산 및 0.5%의 나프틸에틸렌아민)은 아질산염과 화학 반응하여 보라색의 아조염을 형성하고 이것은 일산화질소의 농도와 일치하기 때문에, 아조염의 농도로부터 아질산염의 농도를 측정하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

즉 100 ul의 그리스 시약을 대조군과 실험군의 시료 각각에 첨가하고, 그 혼합물을 37 ℃에서 10분간 배양하였다

그 시료의 빛의 흡수는 스펙트로포토메터(MD, USA)로 540nm에서 측정하였으며, 일산화질소의 농도는 아질산염의 표준커브로부터 계산하였다.

2-3. 항염증 실험결과

도 2a는 열수 추출물의 항염증 실험결과를, 도 2b는 농도별 메탄올 추출물의 항염증 실험결과, 도 2c는 70% 메탄올 추출물의 항염증 실험결과를 각각 나타낸 도면이다.

항염증 효과를 알아보기 위하여 마우스의 대식세포에 열수 추출물, 농도별 메탄올 추출물 및 70% 메탄올 추출물 실험시료를 전처리하고, 24시간 후에 NO(nitrite oxide)을 측정하였다.

도 2a에서, 열수 추출물은 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하고 있음을 알 수 있으며, 또한 도 2b에서, 농도별 메탄올 추출물 중에서 70% 메탄올 추출물의 NO 생성 억제 효과가 현저하다는 것을 알 수 있다.

또한 도 2c에서, 70% 메탄올 추출물 시료는 농도 의존적이긴 하나 도 2a의 열수 추출물 보다 효과가 현저하다는 것을 알 수 있다.

실험예 1 및 실험예 2를 총괄하여 정리해 보면, 열수 추출물 및 메탄올 추출물 모두 세포 독성이 없고 NO 생성을 억제하는 효과가 있다.

또한 열수 추출물 보다는 70% 메탄올 추출물이 현저하게 NO 생성을 억제하는 효과가 있다는 것을 알 수 있다.

따라서 70% 메탄올 추출물이 기관지 천식의 억제 효과가 우수할 수 있다는 점을 시사한다 하겠다.

참고예 2. 생체( in vivo ) 활성 실험 준비

2-1. 기관지 천식 모델

도 3은 기관지 천식 모델에 실시예 1의 추출물 시료를 처리한 실험과정을 도시한 도면이다.

BALB/C 8주령 마우스의 암컷을 (주)오리엔트바이오(S. Korea 성남 경기도)에서 구입하여 사용하였으며, Ovalbumin, alum 등은 SIGMA (St. Louis, USA)사에서 구입하여 사용하였다.

6주에서 8주 정도 된 암컷 BALB/c 마우스를 OVA 감작 시키고, OVA 분무로 챌린지(challenge)시켰다.

즉 마우스를 1일과 15일에 aluminum hydroxide (alum)로 흡착된 20 ug/마우스의 난알부민(ovalbumin, OVA, Sigma)를 복강 주사하여 감작시키고, 7일 후에 마우스를 OVA 분무하여 3번 재감작 시켰다.

2-2. 생체( in vivo ) 활성 실험 방법

대조군으로는 생리식염수를 투여하였으며, 다양한 시간대에 diethylether (Wako)로 마취시키고, 혈액은 안와후정맥동(retro-orbital sinus plexus)으로부터 얻어 서로 다른 세포아형 계수를 위해 Diff-Quick 용액(Merk)으로 염색하였다

혈액에서 총 백혈구 수는 RBC lysis buffer을 사용하여 RBC lysis한 후 측정하였다.

Bronchoalveolar lavage (BAL)는 기관지를 통해 HBSS (0.25 ml과 0.20 ml, 각각)을 주입하여 두 차례 세척하여 각각의 마우스로부터 대략 0.4 ml정도의 BAL fluid를 일정하게 회수하였다

총 세포 수는 hemocytometer로 계수하고, 이형 세포 계수를 위해 Cytospin II를 이용하여 준비한 BAL 세포의 도말을 Diff-Quick 용액으로 염색하거나 immunocytochemistry을 위해 PLP 용액으로 고정하였다.

PLP 용액의 조성은 37.5 mM PBS에서 2% paraformaldehyde (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan), 75 mM L-lysine monohydrochloride (Wako), 10 mM sodium m-periodate (Sigma)이다.

서로 다른 형태의 세포수 백분율은 광학현미경에서 적어도 300cells 계수에 의해 결정하였다.

BAL fluid의 원심분리 후, 상등액은 사용하기 위해 -20℃ 에서 보관하였고, 기관지 조직은 PLP용액으로 고정시키고 액체질소 OCT compound에 넣어두었다.

5 um 두께의 조직 절편은 Diff-Quick 용액으로 염색 후 조직의 호산구의 계수에 사용하고, immunohistochemical staining후 CD3-positive cells의 계수에 사용하였다.

실험예 3. 실시예 1 추출물의 기관지 조직 치료 실험

3-1. 실험준비

기관지 천식모델에 실시예 1에 따른 열수 추출물 및 70% MeOH 추출물 0.1mg/kg, 1mg/kg을 각각 처리하였다.

3-2. 기관지 조직 검사

조직검사를 위해, BAL을 수행한 후 고정액 (4 % paraformaldehyde in PBS)을 lavage catheter로 주입하고, 폐 조직을 제거하여 4시간 더 추가 고정하였다. 이후 이를 paraffin에 넣은 후, 4 절편 hematoxylin-eosin(H&E)으로 염색하고 검경하였다.

3-3. 기관지 조직 치료 실험결과

도 4는 실시예 1의 추출물의 기관지 조직 치료실험 결과를 나타낸 도면으로서, 기관지 조직상태를 알 수 있다.

알러지성 기관지 천식은 기도의 협착 및 기관지에 염증성 세포의 침윤과 goblet 세포가 형성되어 점액을 분비하며 콜라젠의 침착이 두드러지게 나타난다.

도 4에 도시된 바와 같이, 열수 추출물 및 70% MeOH 추출물을 투여 후에 기관지는 정상 집단과 유사하게 나타났으며, 기도의 협착 및 염증성 세포의 침윤이 현저하게 감소된 양상을 보였다

또한 열수 추출물 보다는 70% 메탄올 추출물의 기관지 조직 치료효과가 현저하였다.

실험예 4. 70% MeOH 추출물의 기도저항 억제 실험

4-1. 실험준비

실시예 1에 따른 70% 메탄올 추출물을 일주일간 2.5, 10, 20, 50 mg/ml 투여한 후에 기도 저항 값을 측정하였다.

4-2. 기도저항 억제 실험결과

도 5는 70% MeOH 추출물의 기도저항 억제 효과실험 결과를 나타낸 도면으로서, 70% 메탄올 추출물이 현저하게 기도저항을 억제하고 있음을 알 수 있다.

따라서 기관지 천식 환자는 기도저항이 현저하게 증가되어서 호흡곤란이 나타나는데 이런 현상을 완화시킬 수 있음을 알 수 있다.

실험예 5. 70% MeOH 추출물의 염증성 및 항염증성 물질에 미치는 효과 실험

5-1. 실험준비

실시예 1에 따른 70% 메탄올 추출물을 0.1, 1 g/kg 처리한 후에 염증성 및 항염증성 물질에 미치는 효과를 측정하였다.

5-2. BAL 및 세포 아형 분석 및 사이토카인 레벨의 측정

마우스를 마취시킨 후 probe는 기관지를 절개하여 catheter를 삽입하고, 0.5 ml 생리식염수로 두 번 세척하여 회수하였다. BAL fluid는 즉시 270 xg 4℃ 에서 7분간 원심분리하고, cell pellet는 1 ml PBS에 섞어주었다. 세포를 hemocytometer로 계수하고, Diff-Quick 용액으로 염색하여 세포 아형을 분석하였다.

BAL fluid내의 분비되는 cytokines의 양은 ELISA kit(PharMingen, USA)를 사용하였다. 우선 IL-4, IL-5, IL-12, INF-γ의 capture antibody를 96 well에 coating하고 4 ℃ 에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 이들을 PBS로 세척하고, 시료 및 표준물을 처리하고 1시간 방치하였다. PBS로 3회 세척하고, biotinylated secondary antibody를 처리하고 1시간 방치 후, PBS로 3회 세척하였다. 기질을 처리하고 암실에서 30분간 방치한 다음, 반응을 정지시킨 후 이를 450 nm에서 plate reader를 이용해서 값을 환산하였다.

5-3. 염증성 및 항염증성 물질에 미치는 효과 실험결과

도 6은 70% MeOH 추출물의 염증성 및 항염증성 물질에 미치는 효과 실험결과를 나타내는 도면이다.

70% MeOH 추출물은 기관지 폐포세척액에서 기관지 천식과 밀접하게 연관되어 있는 IL-4, IL-5의 생성을 현저하게 억제하고 있음을 알 수 있다.

또한 항염증성 활성 물질인 IFN-γ 및 IL-12는 천식을 억제하는 중요한 인자로서, 70% MeOH 추출물은 IFN-γ 및 IL-12를 증가시키고 있음을 알 수 있다.

실험예 6. 70% MeOH 추출물의 T 세포 활성화 억제 효과 실험

6-1. 실험준비

실시예 1에 따른 70% 메탄올 추출물을 0.1, 1 g/kg 처리한 후에 T 세포 활성화 억제 효과를 측정하였다.

6-2. T 세포 활성화 억제 효과 분석방법

T세포의 분리는 10 % 우태아 혈청이 함유된 RPMI 배지에 부유한 세포를 37℃, 5 % CO ₂ 하에서 프라스틱 배양접시에 1.5시간 부착하여 부착세포를 제거한 후 biotinylated anti-CD3 항체(PharMingen, San Diego, CA; T세포의 분리를 위함)로 세포를 labelling하고 세척한 다음 streptavidin-conjugated microbeads (Miltenyl Biotec, Germany)와 부착시킨 후 세척하고 column과 magnetic power(MACS)를 이용하여 T세포를 분리한다.

이렇게 순수 분리한 T세포의 순도는 flow cytometer를 이용하여 분석하며, 순도가 95 % 이상의 세포를 실험에 이용한다. Th1 세포가 생산하는 싸이토카인인 IFN-γ와 Th2세포가 생산하는 싸이토카인인 IL-4와 IL-10의 측정과 분석은 flow cytometer를 이용하여 세포내 염색기법으로 실시한다.

간략히 보면, T세포를 brefeldin A(Sigma)와 4시간 배양하고 씻은 후 2 % paraformaldehyde로 고정한다. FITC conjugated 항-CD4 항체로 염색한 후 0.5 % saponin(Sigma)로 permeabilizing 후 PE-conjugated 항-interleukin 항체로 염색하여 싸이토카인 생산을 flow cytometer로 측정 분석한다.

6-3. T 세포 활성화 억제 효과 실험결과

도 7은 70% MeOH 추출물의 T 세포 활성화 억제 효과 실험결과를 나타내는 도면이다.

기관지 천식 모델에서는 CD23이 활성화되지만, 70% 메탄올 추출물에서는 활성이 억제되었음을 알 수 있다.

실험예 7. 70% MeOH 추출물의 폐조직 단백질 STAT4 및 STAT6 억제 효과 실험

7-1. 실험시료

70% MeOH 추출물 1g/kg을 투여한 폐조직의 STAT4 및 STAT6 억제 효과를 실험하였다.

7-2. 폐조직 단백질 STAT4 및 STAT6 측정

Immunoblotting은 iNOS의 발현정도를 측정하기 위해 수행하는 것으로서, Microcon 10(Millipore)에 의해 농축된 BAL fluid와 정제된 iNOS는 비환원 SDS-PAGE로 loading하고, membrane(Immobilon PVDF)에 전사한다. 이후 전사한 membrane은 5 % skim milk로 blocking한 후, blots은 fibronectin-absorbed polyclonal anti-iNOS, NF-kB goat IgG로 24시간 배양한다. 여러 차례 세척 후 다시 blocking, peroxidase로 결합된 rabbit IgG anti-goat IgG conjugated with horseradish peroxidase는 blots으로 적용한다. 여러 차례 세척 후, blots는 chemoluminescence(ECL) 용액에 충분히 적시어, x-ray films에 노출시킨다.

Westernblotting은 MMP,-9, NF-kB의 gelatinolytic 활성을 측정하기 위해 수행하는 것으로서, Microcon 10(Millipore)에 의해 농축된 BAL fluid와 정제된 MMP는 비환원 SDS-PAGE로 loading하고, membrane(Immobilon PVDF)에 전사한다. 이후 전사한 membrane은 2.2 % skim milk로 blocking한 후, blots은 fibronectin-absorbed polyclonal anti-STAT4, 6 rabbit IgG로 24시간 배양한다. 여러 차례 세척 후 다시 blocking, peroxidase로 결합된 rabbit IgG anti-sheep IgG conjugated with horseradish peroxidase는 blots으로 적용한다. 여러 차례 세척 후, blots는 chemoluminescence(ECL) 용액에 충분히 적시어, x-ray films에 노출시킨다.

조직을 RIPA(-) lysis buffer(1% triton, 1% deoxycholate, and 0.1% NaN ₃ in PBS)로 harvest한 다음, BCA solution으로 단백질을 정량하였다.

20 ug 단백질을 얻어 10% 젤에서 전기영동한 후 nitrocellulose paper에 transfer하고, 10% skim milk로 1시간 동안 blocking시켰다.

PBS-T (phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20)로 세정한 후, STAT 4 등에 대한 항체를 처리하고, PBS-T로 1시간 세정한 후, 30분간 2차 항체를 처리하였다.

그런 다음 PBS-T로 충분히 세정한 후, ECL detection용액(Amersham)으로 밴드를 확인하였다.

7-3. 폐조직 단백빌 STAT4 및 STAT6 억제 효과 실험결과

도 8은 70% MeOH 추출물의 폐조직 단백질 STAT4 및 STAT6 억제 효과 실험결과를 나타낸 도면이다.

도 8과 같이, 폐조직에 있는 STAT4, 6가 기관지 천식이 유발되면 인산화 과정을 거쳐서 염증성 물질들을 생산하는데 70% 메탄올 추출물은 인산화 과정을 억제하였음을 알 수 있다.

실험예 8. 70% MeOH 추출물의 간독성 실험

8-1. 실험준비

BALB/C 8주령 mouse의 암컷을 (주)오리엔트바이오(S. Korea 성남 경기도)에서 구입하여 사용하였다.

실시예 1에 따른 70% 메탄올 추출물을 0, 1, 5, 10 mg/kg 투여하였으며, 각 군은 6마리씩 1군으로 구성하였다.

일주일간 농도별로 하루 간격으로 투여하고, 혈청에서 Alanine aminotransferase (ALT)와 aspartate aminotransferase (AST)를 측정하였다.

8-2. 간독성 실험결과

9a 및 도 9b는 70% MeOH 추출물의 간독성 실험결과를 나타낸 도면이다.

관찰기간 동안 사망한 군은 없었으며, 정상군과 비교하였을 때 체중변화는 보이지 않았다.

간독성 면에서, 10, 5 mg/kg에서 약간의 독성을 보였지만, 1 mg/kg 군에서는 독성은 없었다.

실험예 1 내지 실험예 8을 총괄하여 정리해 보면, 70% 메탄올 추출물은 세포 독성이 없고 NO 생성을 억제하는 효과가 열수 추출물보다 현저하다.

또한 70% 메탄올 추출물을 투여 후에 기관지는 정상 집단과 유사하게 나타났으며 그 효과가 열수 추출물보다 현저하다.

또한 70% 메탄올 추출물은 기도저항을 억제하는 효과가 현저하다.

또한 70% 메탄올 추출물은 염증성 물질인 IL-4, IL-5의 생성을 억제하고, 항염증성 물질인 IFN-γ 및 IL-12를 증가시키는 효과가 현저하다.

또한 70% 메탄올 추출물은 T 세포 활성화 억제 효과가 현저하다.

또한 70% 메탄올 추출물은 폐조직 단백질 STAT4 및 STAT6 억제 효과가 현저하다.

또한 70% MeOH 추출물은 간독성을 보이지 않았음을 알 수 있다.