토란 추출물을 활성성분으로 포함하는 약학조성물

토란 추출물을 활성성분으로 포함하는 약학조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING EXTRACT OF TARO}

본 발명은 토란 추출물을 활성성분으로 포함하는 면역계 활성 증강용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

최근 웰빙이라는 새로운 생활양식이 대두되면서, 소비생활 영역에서도 중요한 사회조류로 유행하고 있으며 이러한 웰빙의 급부상은 국내뿐만 아니라, 전 세계적으로 소비문화의 변화, 새로운 산업과 상품의 거대한 시장형성, 사회구조와 개인의 생활양식마저 바꿀 것이라고 예상되고 있다. 이러한 사회 풍조에서 전 세계의 식품 업계가 가장 큰 관심을 두고 집중하고 있는 것이 건강기능성 식품으로, 특히 천연물 소재를 이용한 식품에 많은 관심과 연구가 집중되고 있다. 그 중, 과거 에너지원으로써의 기능만 부각되어 온 탄수화물, 그 중에서도 천연물 유래의 여러 다당류에는 매우 우수한 면역 자극 활성이 있는 것으로 보고되고 있다. 천연물에서 분리한 다당류에는 보체계 활성화(anti-complementary), 대식세포 증식활성(macrophage activity), 항암활성(anti-tumor activity) 등의 면역증강 활성이 보고되고 있으며, 따라서 이들을 기능성 식품 소재로 활용하고자 하는 시도들이 크게 주목받고 있다.

한편, 토란(Taro, the corms of Colocasia esculenta L. Scotte)은 이용가치가 매우 높은 구황작물로 천남성과(Araceae)에 속하는 다년생 초본으로 전 세계적으로 100속, 1,500품종 이상이 분포하고 있으며, 식물체의 대부분 또는 구경(알뿌리)만을 식용 및 약용으로 이용하는 작물이다. 토란에 대한 연구는 토란에서 관찰되는 점질류로 인해 나타나는 수확 후 수분손실 또는 전단, 박피 등의 가공공정에서 발생하는 조직 손상으로 인한 갈변현상 등으로 인하여 품질의 열화가 발생되어 수요가 감소되고 있는데 따라서 보다 간편하고 경제적인 방향으로 안전성을 확보하고 품질을 높일 수 있는 방법이 모색되고 있다. 즉, 토란의 저장과 저장수명에 관련된 생리적 변화, 병리학적 부패와 생화학적 변화에 관한 연구들이 토란 연구의 대부분을 차지하고 있으며(7,18,42,44,56), 저장 중의 이화학적 성분의 변화, 갈변 저해 등을 제외하고는 연구에 큰 진척이 없는 실정이며 특히 토란의 고부가가치화에 대한 연구, 즉 생리활성 및 활성성분에 관한 연구는 극히 제한된 실정이다.

이에 본 발명자들은 토란 유래 점질물로부터 선천면역계 자극 활성 다당을 분리, 정제하고 이들이 갖는 면역 활성 및 활성 성분의 구조적 특성을 규명함으로써 토란 다당을 기능성 소재로 개발하기 위하여 본 발명에 이르렀다.

본 발명의 목적은 토란으로부터 다당체 분획을 추출하여 이 추출물을 포함하는 면역 활성 증강용 약학 조성물 및 건강기능식품과 상기 추출물을 포함하는 종양 세포에 대한 항전이 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 구체예에서 하기 화학식 1의 고분자 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역계 활성 증강용 약학 조성물을 제공한다.

화학식 1:

다른 구체예에서 상기 화학식 1의 분자량은 5 내지 500 kDa인 것을 특징으로 하는 약학조성물을 제공한다.

일 구체예에서 하기 화학식 1의 고분자 다당체를 유효성분으로 함유하는 면역계 활성 증강용 건강기능식품을 제공한다.

화학식 1:

다른 구체예에서 상기 화학식 1의 분자량은 5 내지 500 kDa인 것을 특징으로 하는 건강기능식품을 제공한다.

일 구체예에서 하기 화학식 1의 고분자 다당체를 유효성분으로 함유하는 종양세포에 대한 항전이 약학 조성물을 제공한다.

화학식 1:

다른 구체예에서, 상기 화학식 1의 분자량은 5 내지 500 kDa인 것을 특징으로 하는 약학조성물을 제공한다.

일 구체예에서 하기 화학식 1의 고분자 다당체를 유효성분으로 함유하는 종양세포에 대한 항전이 건강기능식품을 제공한다.

화학식 1:

다른 구체예에서 상기 화학식 1의 분자량은 5 내지 500 kDa인 것을 특징으로 하는 건강기능식품을 제공한다.

일 구체예에서 토란 추출물을 활성성분으로 포함하는 면역계 활성 증강용 약학 조성물을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 토란 추출물은 갈락토스(galactose) 및 만노스(mannose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 약학 조성물은 항보체 활성화 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 약학 조성물은 대식세포 또는 자연살해 세포의 활성화 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다.

일 구체예에서, 토란 추출물을 활성성분으로 포함하는 면역계 활성 증강용 건강기능식품을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 토란 추출물은 갈락토스(galactose) 및 만노스(mannose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 건강기능식품은 항보체 활성화 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능식품을 제공한다. 상기 건강기능식품은 대식세포 또는 자연살해 세포의 활성화 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능식품을 제공한다.

일 구체예에서, 토란 추출물을 활성성분으로 포함하는 종양 세포에 대한 항전이 약학 조성물을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 토란 추출물은 갈락토스(galactose) 및 만노스(mannose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 약학 조성물은 항보체 활성화 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 약학 조성물은 대식세포 또는 자연살해 세포의 활성화 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다.

일 구체예에서, 토란 추출물을 활성성분으로 포함하는 종양 세포에 대한 항전이 건강기능식품을 제공한다. 다른 구체예에서, 상기 토란 추출물은 갈락토스(galactose) 및 만노스(mannose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 건강기능식품은 항보체 활성화 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능식품을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 상기 건강기능식품은 대식세포 또는 자연살해 세포의 활성화 기능을 갖는 것을 특징으로 하는 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화학식 1의 고분자 다당체 또는 토란추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 상기 화학식 1의 고분자 다당체 또는 토란추출물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화학식 1의 고분자 다당체 또는 토란추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500 mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌실내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 화학식 1의 고분자 다당체 또는 토란추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 화학식 1의 고분자 다당체 또는 토란추출물을 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강 기능 식품을 제공하는데, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 화학식 1의 고분자 다당체 또는 토란추출물을의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 명세서에서 정의되는 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다. 본 발명에 따른 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서, 상기 화학식 1의 고분자 다당체 또는 토란추출물 외에 첨가되는 성분에 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 의한 토란 추출물을 포함하는 약학 조성물 및 건강기능식품은 항보체 활성화 기능, 대식세포 또는 자연살해 세포의 활성화 기능을 가져 면역계를 활성화 시키고, 암세포의 전이를 효과적으로 경감시키는 효과를 가짐으로써 항암제 및 항전이의 치료제로 사용할 수 있다.

도 1은 토란 추출물의 항보체 활성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 토란 추출물의 항보체 활성에 미치는 금속이온의 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 토란 추출물을 기본 반응계와 특정 금속이온이 제거된 반응계에서 각각 반응시킨 후 C ₃ 인자의 분해여부를 관찰한 결과이다.
도 4는 토란 추출물 IL-6, IL-12 및 TNF-α의 생산 촉진능을 나타낸 그래프이다.
도 5는 토란 추출물의 자연 살해 세포 활성화능을 나타낸 그래프이다.
도 6 및 도 7은 토란 추출물을 메틸화한 후 GC로-MS로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 Taro-4-Ⅰ의 예상되는 전체구조이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 토란 추출물의 제조

1-1. 토란 유래 조다당의 분리

전남 곡성에서 수확한 토란을 구입하여 껍질을 제거하고 절편한 후, 토란 5 kg에 10 L의 물을 가하여 상온에서 24시간 냉수추출을 하였다. 토란 냉수추출물은 회전감압 농축장치(rotary vacuum evaporator, EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축하였고, 여기에 4배 부피의 에탄올을 가하고 하루동안 교반하면서 다당을 침전시켰다. 이 때 침전된 다당을 원심분리기(6000 rpm, 30 min, 4℃)를 이용하여 침전물을 회수하고, 이를 소량의 물에 용해시킨 후 투석막(MW cut-off 12,000, Sigma)을 이용하여 3일간 투석을 행하여 저분자 물질을 제거하였다. 이를 회전감압 농축장치를 이용하여 재차 농축한 후, 동결건조(FreeZone 12 Liter, Labconco, MISSOVRI 64132, KANSAS CITY, USA)하여 조다당 획분인 Taro-0를 얻었다.

1-2. 토란 유래 다당의 정제

1-2-1. Anion exhange chromatography ( AEC )

토란에서 분리한 조다당 Taro-0를 소량의 증류수에 녹인 후, 증류수로 평형화된 DEAE-Sepharose FF (Cl ^- form, 5.5×25 ㎝) column에 흡착시킨 후, 증류수를 용출하여 비흡착획분을 분리하였으며 이후 0.05 M ~ 2 M NaCl 용액으로 단계적으로 용출시켜 흡착획분을 각각 분리하였다. Anion exchange chromatography column에서 용출된 획분은 분획 수집기(1200series, EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 분획하고, 각각 중성당, 산성당, 단백질 및 KDO 함량을 측정하여 용출 peak를 작성하였다.

본 이온교환 수지를 통해 조다당 획분 Taro-0에서부터 1개의 비흡착획분(Taro-1)과 7개의 흡착획분(Taro-2~8)을 얻을 수 있었다. 또한, 각 획분들은 농축, 투석 및 동결건조를 행하여 이후의 실험에 사용하였다.

1-2-2. Gel permeation chromatography ( GPC )

이온교환수지를 이용한 정제과정에서 수율과 면역활성이 양호했던 Taro-4 획분(0.2 M 용출 획분) 0.5 g을 소량의 물에 용해한 후 50 mM ammonium formate buffer (pH 5.5)로 평형화된 Sephadex G-100 column (4×120 cm)을 이용, 겔 침투 크로마토그래피(gel permeation chromatography, GPC)를 행하였다. 용출액은 7 mL씩 100개의 획분으로 분획하였으며, 각 획분은 중성당함량 분석실험을 거쳐 분자량이 상이한 2개의 획분 Taro-4-Ⅰ과 Taro-4-Ⅱ를 얻을 수 있었다. 그 중 고분자 다당인 Taro-4-Ⅰ이 정제도와 수율 및 면역활성에 우수하였으므로 토란 유래 다당의 최종 획분으로 하고 이후의 실험에 사용하였다.

실시예 2. 토란 추출물의 면역계 자극 활성능 측정

2-1. 토란 추출물의 보체계 활성화

2-1-1. 항보체 활성능

건강한 성인의 혈액을 채취하여 실온에서 약 15분간 방치하여 응고시킨 후, 응고된 혈액을 절단하고 약 5분간 상온에서 방치시켰다. 이 혈액을 다시 4℃에서 약 20분간 방치한 다음 원심분리(2,200 rpm, 15 min, 4℃)하여 혈청을 분리한 뒤 미량 원심분리용 튜브에 1 mL씩 분주하여 -70℃에서 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다.

항보체 활성은 Meyer법을 이용하여 시료에 의한 보체 소비(complement consumption) 후 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈 정도에 근거를 둔 complement fixation test 방법으로 측정하였다. 여러 농도로 증류수에 용해시킨 시료를 GVB ⁺⁺ (gelatin veronal buffer, pH 7.4, 0.1% gelatin, 0.15 mM Ca ⁺⁺ , 0.5 mM Mg ⁺⁺ 함유) 및 정상인의 혈청과 각각 50 μL씩 혼합하여 37℃에서 30분간 1차 반응시켰다. 동 반응액에 GVB ⁺⁺ 350 μL를 가하고, 이를 10~160배까지 연속 희석시킨 후, 750 μL의 GVB ⁺⁺ 와 양의 감작적혈구(IgM-sensitizated sheep erythrocyte, EA cell, 1×10 ⁸ cells/mL)를 250 μL를 가하여 37℃에서 60분간 2차 반응시키고, PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4) 2.5 mL를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액은 2,000 rpm에서 10분 간 원심분리하였으며, 얻어진 상등액을 412 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 용혈활성을 측정하였다. 항보체 활성은 정상인의 혈청과 GVB ⁺⁺ , 증류수만을 반응시킨 음성대조군의 총보체용혈(50% total complement hemolysis, TCH ₅₀ , %)에 대한 저지율(inhibition of 50% total complement hemolysis, ITCH ₅₀ , %)로써 나타내었다. 양성대조군으로는 운지버섯 유래 면역증강제인 PSK (polysaccharide-K)를 사용하여 비교하였다.

음성대조군에서의 활성화 정도를 ITCH ₅₀ 0%로 하여 각 시료의 활성화능을 확인한 결과, Taro-4-Ⅰ의 1,000 μg/mL의 농도에서 동일 농도를 가한 양성대조군에 준하는 우수한 항보체 활성을 보였다(도 1). 양성대조군인 PSK는 현재 항암제로 시판되는 면역활성 다당이며, 일반적으로 1,000 μg/mL의 농도에서 50% 이상의 항보체 활성을 나타내는 다당체는 그 약리성이 통상적으로 인정된다고 알려져 있기 때문에, Taro-4-Ⅰ의 보체계 활성화능이 우수함을 확인할 수 있었다. 또한 시료의 농도에 차이를 두어 실험한 결과 Taro-4-Ⅰ의 활성이 농도 의존적임을 알 수 있었다.

2-1-2. 보체계 활성화 경로의 검토

보체계의 활성 경로를 확인하기 위해 GVB ⁺⁺ buffer, Ca ⁺⁺ 이온이 선택적으로 제거된 Mg ^++- EGTA-GVB ^-- buffer 및 Ca ⁺⁺ 과 Mg ⁺⁺ 이온이 모두 제거된 EDTA-GVB ^- buffer를 제조하여 시료 및 NHS와 각각 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 각 반응액은 37℃에서 60분간 재차 보체를 활성화시키고, PBS 2.5 mL를 가한 후 2,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 412 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 용혈활성을 측정함으로써 보체계 활성화능을 비교하였다.

도 2에서 보는 바와 같이 Ca ⁺⁺ 가 선택적으로 제거된 반응계에서는 Ca ⁺⁺ 과 Mg ⁺⁺ 이 모두 존재하는 기본 반응계에 비해 1,000 μg/mL에서는 약 60%의 활성을 보였으며, 500 mg/mL이하에서는 급격히 활성이 감소하는 특징을 보였지만 농도 의존적인 경향은 유지되었다. 한편, Ca ⁺⁺ 및 Mg ⁺⁺ 모두가 제거된 반응계에서는 활성이 거의 소실됨을 확인하였다. 이는 Taro-4-Ⅰ의 보체계 활성화가 고전경로와 부경로 모두를 경유하여 나타남을 말해주는 결과였다.

2차원 면역 전기영동을 이용해 C ₃ 의 활성화 여부를 확인함으로써 Meyer법에 의해 확인된 시료의 항보체 활성이 보체계 활성화에 기인한 것인지, 혹은 보체 저해인자에 의한 결과인지를 확인할 수 있다. GVB ⁺⁺ buffer, Mg ⁺⁺ -EGTA-GVB ^-- buffer와 EDTA-GVB ^-- buffer에 각각 정상인의 혈청과 정제 다당 시료를 동량(50 μL 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 냉각하였다. 반응액을 barbital buffer(pH 8.6)에 용해시켜 만든 1% agarose gel plate (5×5 ㎝)의 well에 5 μL씩 loading하고, 4℃에서 약 3시간 동안 1차 전기영동(75 mA/plate)을 실시하였다. 이 후 1% anti-human C ₃ 가 함유된 agarose gel plate 상에서 4℃, 약 15시간 동안 2차 전기영동(25 mA/plate)을 실시하였다. 전개된 gel은 bromophenol blue로 약 10분간 염색 후 탈색하여 침강선(precipitation line)을 확인함으로써 C ₃ 의 활성화 여부를 관찰하였다.

Taro-4-Ⅰ을 기본 반응계와 특정 금속이온이 제거된 반응계에서 각각 반응시킨 후 C ₃ 인자의 분해여부를 관찰한 결과는 도 3과 같았다. Ca ⁺⁺ 과 Mg ⁺⁺ 이 모두 존재하는 정상 반응계에서는 well로부터의 첫 번째 침강선과 두 번째 침강선이 비슷한 비율로 나타남을 확인할 수 있었다. Well로부터 첫 번째 침강선은 C ₃ , 두 번째 침강선은 분해산물인 C ₃ a와 C ₃ b에 의해 기인함을 고려해 볼 때 이는 Taro-4-Ⅰ의 항보체 활성이 보체 저해인자에 의한 것이 아님을 증명할 수 있었다. 반면 금속이온이 모두 제거된 반응계에서는 첫 번째 침강선만이 뚜렷하게 나타나고 두 번째 침강선은 관찰되지 않았다. 한편 Ca ⁺⁺ 만이 선택적으로 제거된 반응계에서는 정상 반응계에서 보다 두 번째 침강선의 높이가 상대적으로 낮아진 것을 확인할 수 있었다. 이는 고전경로가 저해된 상태에서 부경로만으로도 C ₃ 의 활성화가 일어났음을 의미하며, 따라서 Taro-4-Ⅰ에 의한 보체계 활성화는 고전경로 및 부경로 모두를 경유하여 나타남을 재차 확인시켜주는 결과였다.

2-2. 대식세포( macrophage ) 활성능

PBS를 이용하여 0.5 μg/mL 농도로 조제한 다당 시료 용액에 RPMI 1640를 가하여 500 μg/mL에서 0.2 μg/mL의 농도가 되도록 3배수로 연속 희석하고 flat bottomed 96- well microplate에 100 μL씩 분주하였다. 여기에 BALB/c (♀, 6 weeks) mouse의 복강에 5% thioglycollate medium 1 mL를 주입하여 72시간 동안 유도된 macrophage를 복강으로부터 회수하여 세척 후, 세포 수 (2.25×10 ⁵ cells/mL of RPMI 1640)를 조정하여 대식세포 현탁액을 조제하고 이를 100 μL를 가한 후 37℃, 5% CO ₂ 배양기에서 24시간 배양하였다(22,23). 배양 종료 후 1,500 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하여 세포배양액 150 μL를 회수하고 상등액 중에 유도된 cytokine의 함량을 측정하였다.

대식세포에 의해 생산된 cytokine의 함량은 sandwich ELISA (enzyme -linked immunosorbent assay)에 의해 분석하였다. 각 사이토카인의 항체는 coating buffer에 희석하여 flat- bottomed 96- well microplate에 코팅한 후 4℃에서 12시간 방치하였다. 코팅이 완료된 microplate는 워싱 버퍼(PBS with 0.05% tween 20, PBST)를 이용하여 3차례 세척하고, assay diluent (PBS with 10% FBS or 2% skim milk) 200 μL를 가하여 1 시간 동안 방치하여 항체가 붙지 않은 well 표면을 blocking하였다. Blocking 완료 후 각 well은 washing buffer를 이용하여 재차 3회 세척하고, 각 well에 연속 희석한 표준물질(recombinant mouse cytokine)과 면역세포배양액을 각각 50 μL씩 분주하였다. 이를 실온에서 2시간 동안 방치한 다음 washing buffer로 세척하고 detection antibody (in assay diluent) 100 μL를 처리하여 실온에서 1시간 방치한 후 재차 세척하였다. Enzyme reagent (avidin-horseradish peroxidase conjugate) 100 μL를 처리하여 실온에서 30분간 결합시킨 후 substrate solution [tetramethylbenzidine (TMB) and hydrogen peroxide] 100 μL를 가하여 암소에서 30분간 반응시킨 후 50 μL의 stop solution [(1 MH ₃ PO ₄ ) or (2 NH ₂ SO ₄ )]을 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

토란 유래 다당 시료의 직접적인 자극에 의한 대식세포의 사이토카인 생산을 in vitro 에서 측정한 결과, 활성다당 Taro-4-Ⅰ은 IL-6, IL-12 및 TNF-α의 생산을 촉진함을 확인하였다(도 4). IL-6의 경우 1 μg/mL 이상의 낮은 농도에서도 농도 의존적인 높은 생산량의 증가가 관찰되었다. 시료의 각 농도에서 점진적인 농도 의존성을 보였지만 TNF-α의 생산자극활성은 대체로 낮은 것으로 나타났다. 이러한 결과들로 미루어 보아 토란 유래 다당체 Taro-4-Ⅰ은 염증성 면역작용에 있어서 유효한 활성을 가질 것으로 사료되며 이러한 활성을 갖기 위한 최소 시료의 농도는 수 μg/mL일 것이라 추측된다. 한편 IL-12의 경우, Taro-4-Ⅰ의 19μg/mL 시료 농도까지 농도 의존적 증가 추세를 보였으며 그 이상의 농도에서는 양성대조군인 LPS의 약 70%에 해당하는 높은 IL-12 생산능을 보였다. 그러나 500 μg/mL 농도에서는 생산량이 소폭 감소하는 경향을 보였다. 이는 토란 유래 다당체가 NK cell의 활성화 및 Th1 type의 면역 반응 유도를 통한 cytotoxic T lymphocyte (CTL)의 활성화와 같은 세포매개성 면역에 있어 활성을 갖으리라 예상되며, 그 최적 농도 조건이 수십 μg/mL 부근일 것이라 추측되는 결과였다. 특히 IL-12는 암세포 존재 시, 암세포 치사작용을 하는 NK cell 활성화에 직접 관여하므로 항암 활성 유도에 필수적인 사이토카인으로 인정되고 있으므로, Taro-4-Ⅰ는 암세포에도 효율적으로 작용할 가능성이 있는 것으로 기대되었다. 본 실험에서 대식세포를 Taro-4-Ⅰ에 의해 24시간 자극한 결과, 염증부위에 면역세포의 귀소와 직접 관련이 있는 염증성 사이토카인으로 분류되는 TNF-α 및 IL-6의 생산 및 세포성 면역능의 활성화와 직접 관련이 있는 IL-12를 유의하게 생산하는 활성이 있다고 확인되었으므로 토란 유래 다당 Taro-4-Ⅰ은 생체방어에 작용하는 면역기구를 활성화(조절)하는 기능이 있다고 판단되었다.

2-3. 자연 살해 세포( NK cell )에 의한 종양 세포 살해능

토란으로부터 정제한 Taro-4-Ⅰ 다당 시료를 BALB/c (6 weeks, ♀) mouse에 농도 별로 정맥 주사하고 3일 후에 경추탈구법으로 치사시켜 무균적으로 비장(spleen)을 적출하였다. Stainless steel mesh를 이용, PBS 상에서 마쇄(100 mesh) 및 여과(200 mesh)하여 비장세포를 획득하였다. 0.2% NaCl 5 mL을 15~30초 동안 가하여 혼입된 적혈구를 파괴하고 무혈청 배지로 2~3회 세척 후 세포수가 1×10 ⁶ cells/mL가 되도록 조정하고 이를 effector cell로 사용하였다. 자연 살해 세포에 대한 감수성이 높은 종양세포 YAC-1을 target cell로 하여 round-bottomed 96-well microplate에 effector cell과 target cell의 비율(E/T ratio)이 100, 50, 25이 되도록 조정하여 가하였다. 37℃, 5% CO ₂ 배양기에서 6시간 배양 후 effect cell의 살해능에 의해 target cell로부터 유리되는 lactate dehydrogenase (LDH)의 발생양을 Cytotox 96 (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 측정하였다. 자연 살해 세포의 종양세포 살해능은 다음 식에 의해 계산하였다.

NK cell activity (%) = [(실험분비량--자연분비량)/(최대분비량--자연분비량)]×100

토란 유래 다당 Taro-4-Ⅰ의 자연 살해 세포 자극활성의 결과는 도 5와 같았다. Target cell (YAC-1)에 대한 effect cell (splenocytes)의 비율(E/T ratio)을 의존적인 종양세포에 대한 살해능을 나타내었다. 그 결과, E/T=100에서 가장 뚜렷한 활성이 관찰되었으며, 특히 Taro-4-Ⅰ의 경우 500 μg과 50 μg의 투여농도에서 대조군에 비해 높은 활성이 확인되었다. 또한 실험결과를 통해 500 μg의 고농도 보다는 50 μg의 저농도에서 정상세포 대비 약 250%의 높은 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이로써 토란 유래 다당 Taro-4-Ⅰ은 종양세포에 대한 살해능을 가지는 자연 살해 세포의 활성화에 기여함을 확인할 수 있었으며, 또한 이들은 자연 살해 세포 자극활성에 의한 항암활성을 가질 것이라 사료되었다. 이를 통해 토란 유래 다당인 Taro-4-Ⅰ의 항암 효과는 50 μg/mL의 비교적 저농도에서 그 활성이 강력할 것이라 추측할 수 있었다.

실시예 3. 토란 추출물의 종양 세포에 대한 항전이 활성능

시료의 항전이 활성은 폐(lung)에 대한 고전이성 종양세포주인 melanoma B16BL6를 이용한 실험동물 종양전이모델을 이용하였다. 시료에 의한 종양전이 효과를 관찰하기 위해 B16BL6 lung carcinoma (2.7×10 ⁴ )를 BALB/c mouse에 정맥 주사하였고, 시료는 종양 접종 2일전에 각 농도별로 정맥 주사하였다. 종양접종 14일 뒤 mouse를 치사시키고, 종양세포의 표적기관인 폐를 적출하여 Bouin's solution (Sigma)에서 전이된 종양을 고정시킨 후, 전이된 종양의 colony를 계수하였다. 시료에 의한 항종양전이 효과는 종양만을 접종한 대조군과 비교하여 산출하였다.

실험결과 표 1에서 보는 바와 같이 시료를 투여하지 않은 대조군에서는 약 100개의 전이된 암 colony가 확인된 반면, 5 μg과 500 μg의 농도로 Taro-4-Ⅰ을 투여한 실험군에서는 약 22개와 18개의 colony가 발견됨으로써 각각 78.1%, 81.9%의 우수한 항전이 활성 효과가 확인되었다.

한편, 50 μg을 투여한 결과 약 4개의 전이된 colony가 확인됨으로써 96.8%의 가장 높은 항전이 활성을 나타내었다. 이상의 결과는 고농도의 시료투여에서 보다 50 μg/mouse의 낮은 농도의 투여가 종양의 전이를 저해하는데 유효하다는 특이한 결과로 판단되었다. 이는 앞선 자연 살해 세포 자극 활성실험에서 Taro-4-Ⅰ이 가장 강력한 자극활성을 나타내었던 농도와 동일한 결과로써 Taro-4-Ⅰ에 의한 종양전이 억제효과가 주로 자연 살해 세포의 활성화에 기인한 효과임을 예상할 수 있었다. 자연 살해 세포는 주로 IL-12에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있으므로 Taro-4-Ⅰ에 의한 대식세포의 IL-12 생산자극에 의해 자연 살해 세포의 활성화를 유도, 강력한 항전이 효과를 나타낸 것이라 사료되었다.

실시예 4. 토란 추출물의 구조 분석

4-1. 메틸화 분석에 의한 구조 및 결합위치 결정

4-1-1. Methylsulfinyl carbanion 의 조제

Methylsulfinyl carbanion을 조제하기 위해 무수 NaH 1.26 g에 무수 DMSO (dimethylsulfoxide) 20 mL을 첨가한 후 질소로 충진하며 90℃ 오일 배쓰(oil bath) 하에서 약 10~15분간 반응시켰다. 반응액이 엷은 녹색을 띄는 시점을 종말점으로 하여 반응을 종결하고 상온까지 냉각시킨 후 3,000 rpm, 30℃에서 원심분리하였다. Methylsulfinyl carbanion이 함유된 상등액은 공기의 접촉이 없도록 질소로 치환하여 소량씩 분주한 후 냉동보관하며 사용하였다.

4-1-2. 메틸화

다당 시료의 결합위치를 결정하기 위한 메틸화는 Hakomori 방법을 이용하여 실시하였다. 데시케이터에서 1~2일 간 충분히 건조한 각 다당 시료(0.5 mg)에 1 mL의 무수 DMSO를 가하고 교반하여 완전히 용해시킨 후, 500 μL methylsulfinyl carbanion (MSCA)를 가하여 4시간 동안 반응시켰다. 이때 다당이 완전히 polyalkoxide로 전환될 수 있도록 필요한 경우 MSCA를 추가로 첨가하였으며 미반응 MSCA의 잔존 여부는 triphenylmethane으로 확인하였다. Polyalkoxide로 전환된 시료는 과량의 CH ₃ I를 가하여 메틸화 하였으며, 잔존 CH ₃ I는 N ₂ gas flushing을 통해 제거 후 Sep-pak C ₁₈ cartridge를 이용하여 회수하였다.

4-1-3. 메틸화 다당의 가수분해 및 아세틸화

메틸화된 시료는 2 M TFA 1 mL을 가하여 121℃, 1.5시간 반응시켜 가수분해를 행한 후 건조하였다. 가수분해한 시료는 25% NH ₄ OH가 수 방울 첨가된 에탄올에 용해하고 10 mg의 NaBH ₄ 를 가하여 4시간 동안 개환 및 환원하였으며, 아세트산을 적당량 가하여 잔존 NaBH ₄ 를 제거하고, 메탄올을 가하며 반복 건조함으로써 과량으로 가해진 아세트산을 제거하였다. 이 후 1 mL의 아세트산무수물(acetic anhydride)을 가하고, 121℃에서 3시간 동안 반응시켜 partially methylated alditol acetate로 전환하였으며, 이는 2상 용매계(chloroform, H ₂ O)로 분리, 추출하여 아세톤에 용해시켜 GC 및 GC-MS로 분석하였다.

4-2. Partially methylated alditol acetate 의 GC 및 GC - MS 분석

GC 분석은 SP-2380 capillary column (0.25 mm×30 m, 0.2 mm film thickness, Supelco)이 장착된 Young-Lin ACME-6100 GC를 사용하여 최적온도 조건 [60℃ (1 min), 60℃ → 180℃ (30℃/min), 180℃ → 250℃ (1.5℃/min), 250℃ (5 min)]에서 splitless injection mode (1/20)로 분석하였으며, 이때 carrier gas (N ₂ )의 flow rate는 1.5 mL/min로 조정하였다.

한편 GC-MS는 SP-2380 capillary column (0.2 mm film, 0.25 mm id×30 m, Supelco, Bellefonte, PA, USA)을 장착한 Agilent 6890N GC system과 5973N mass spectrophotometer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 GC 분석과 동일한 최적온도 조건에서 splitless injection mode (He flow rate : 1.5 mL/min)로 분석하였다. 메틸화된 시료의 유도체는 GC-MS에 의한 fragment ion 분석과 GC의 relative retention time을 조합하여 동정하였으며 각 피크의 molar%는 peak area 및 molecular response factor로 부터 환산하였다.

4-3. Taro -4-Ⅰ의 메틸화분석에 의한 당쇄 결합양식 분석

도 6 및 도 7에서 보는 바와 같이 Taro-4-Ⅰ의 당쇄결합 양식을 분석하고자 메틸화후, GC로 분석한 total ion chromatogram을 확인하고 각 피크fragment ion을 GC-MS로 분석하였으며, 이들의 결과를 종합하여 표 2에 구성당 결합 양식의 조성을 종합하여 표시하였다.

표 2에서 보는 바와 같이 Taro-4-Ⅰ는 총 10 종의 당쇄가 결합에 참여하고 있었으며 갈락토스 결합 및 만노스 결합이 높은 비율로 확인되었다. 특히, 갈락토스 잔기의 경우 terminal-Gal p 가 높은 비율(48.4%)로 검출되었는데 이러한 사실은 비환원성 말단에 존재하는 갈락토스가 많으며, 따라서 측쇄(side chain)에 갈락토스 및 이들의 oligo당이 고도로 분지된 galactan이 뻗어나간 형태임을 추정할 수 있었다. 3-linked-Gal p 와 2,3-branched-Gal p 및 3,6-branched-Gal p 가 높은 비율로 존재하는 사실로부터 galactan 형태로 존재하는 side chain은 1→3결합으로 연결된 갈락토스 core에 C2 또는 C6위치에서 또 다른 갈락토스가 분지되어 비환원 말단을 구성함을 추정할 수 있었다.

¹⁾ Calculated from the peak area and molecular response factors of each partially methylated alditol acetates in GC and GC-MS.

²⁾ T-Ara f means non-reducing terminal arabinofuranoside.

³⁾ 3-Gal p means 3-linked galactopyranoside.

⁴⁾ 2,4,6-Man p means 2,4,6-branched mannopyranoside.

한편 만노스 잔기의 경우 비환원 말단의 만노스는 거의 검출되지 않은 반면 4-linked Man p 와 4,6-linked Man p , 2,4,6-linked Man p 가 높은 비율로 검출되었다. 이러한 사실은 Taro-4-I의 주쇄(main chain)가 (1→4) 결합의 만난(mannan) 형태로 존재하며, 만노스의 C6위치에서 다시 한가닥의 측쇄가 뻗어져 나가거나 C2 및 C6위치에서 동시에 두가닥의 측쇄로 뻗어져 나감을 추정할 수 있었다. 특히 토란에서 유래한 Taro-4-I 다당에는 2,4,6-linked Man p 잔기가 특히 높은 비율로 검출되는 특이한 양상을 보였는데 이러한 사실은 (1→4) 결합으로 연결된 만노스 주쇄에 두가닥으로 galactan 측쇄가 연결된 형태로, 타 식물체 유래의 다당에서는 발견되지 않는 고도로 분지된 형태임을 확인할 수 있었다. 일반적으로 토란에서 관찰되는 높은 점질류와 생리활성은 이처럼 고도로 분지된 갈락토만난(galactomannan)에 기인하는 것으로 사료된다. 하지만 다당에 의한 생리활성은 같은 종류로 분류되는 다당이라 하여도 미세 구조가 식물마다 상당한 다양성을 보이고 있으며, 이에 따라 활성의 차이를 보인다고 알려져 있으므로 이후, 미세 구조에 대한 연구가 필수적으로 요구된다고 할 수 있다.

4-4. Taro -4-I의 전체구조 추정

토란의 면역활성 다당 Taro-4-I의 메틸화분석에 의한 당쇄 결합양식의 분석과 2차례의 효소처리 과정을 거쳐 얻어진 정보를 바탕으로 추정된 Taro-4-I의 예상되는 전체구조는 하기 도 8에 도식화한 바와 같다. 본 실험에서 획득한 Taro-4-I의 분자량은 약 200 kDa의 다당체로, 전체 약 1,200여개의 당으로 구성되어 있으며 따라서 이들의 전체 미세 구조를 예측하는 데는 한계가 있었으므로 약 1/30로 축소하여 구조를 추정, 작성하였다. 토란의 면역활성 다당Taro-4-I은 ① 만노스가 (1→4) 결합으로 연결된 만난(mannan)이 주쇄(main chain)를 구성하고 있으며, 주쇄의 대부분은 만노스의 C6위치에서 한가닥 또는 C2 및 C6위치에서 동시에 두가닥의 측쇄(side chain)가 측쇄 구조로 연결되어 존재한다. ② 측쇄 구조는 α-(1→3) 결합으로 연결된 짧은 galacto-oligosaccharide로 구성되어 있으며 이들 중 몇몇 잔기는 C2 또는 C6위치에서 갈락토스 또는 아라비노스(arabinose) 잔기가 연결된 구조로 존재함을 최종 추론할 수 있었다. 따라서 토란이 갖는 면역활성은 고도로 분지된 갈락토만난(galactomannan)에 기인함을 알 수 있었다.

실시예 5. 토란 추출물의 생체 내 투여

대한실험공급센터에서 공급받은 6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 하기와 같이 실시하였다. 각 그룹 당 2마리씩의 동물에 상기 실시예 1의 추출물을 1g/㎏의 용량으로 1회 경구 투여 후, 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상 여부를 관찰하였다. 실험결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특이할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 추출물은 랫트에서 각각 1g/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD 50 )은 1g/㎏이상인 안전한 물질로 판단됨을 확인할 수 있었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다. 단, 하기 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제제예 1: 산제의 제조

토란 추출물 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2: 정제의 제조

토란 추출물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3: 캡슐제의 제조

토란 추출물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4: 주사제의 제조

토란 추출물 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5: 액제의 제조

토란 추출물 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6: 건강 식품의 제조

토란 추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7: 건강 음료의 제조

토란 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2l용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.