一种和胃接骨的中药组合物及其制备方法

申请号 CN201610112374.1 申请日 2016-02-29 公开(公告)号 CN105687924A 公开(公告)日 2016-06-22
申请人 杭州市中医院; 发明人 周辉;
摘要 本 发明 公开了一种和胃接骨的中药组合物及其制备方法。该和胃接骨的中药组合物由以下重量份的成份制得:骨碎补130~180份、续断130~180份、土鳖虫80~100份、自然 铜 280~320份、当归130~180份、元胡180~220份、刘寄奴10~20份、木瓜130~180份、僵蚕5~15份、女贞子5~15份、黄芪25~35份、白术100~150份、佛手80~120份、木香50~80份、谷芽130~180份、麦芽130~180份、苯 甲酸 钠1~5份。该中药组合物能够显著促进骨折部位愈合,加快骨折愈合 进程 ;具有较好的健运脾胃、消肿止痛和营续骨作用,且适合早、中、后三期的病人使用,接骨而不伤脾胃。
权利要求

1.一种和胃接骨的中药组合物,其特征在于,由以下重量份的成份制得:
骨碎补130~180份、续断130~180份、土鳖虫80~100份、自然280~320份、当归130~180份、元胡180~220份、刘寄奴10~20份、木瓜130~180份、僵蚕5~15份、女贞子5~15份、黄芪25~35份、白术100~150份、佛手80~120份、木香50~80份、谷芽130~180份、麦芽
130~180份、苯甲酸钠1~5份。
2.如权利要求1所述和胃接骨的中药组合物,其特征在于,由以下重量份的成份制得:
骨碎补150份、续断150份、土鳖虫90份、自然铜300份、当归150份、元胡200份、刘寄奴15份、木瓜150份、僵蚕10份、女贞子10份、黄芪30份、白术120份、佛手100份、木香60份、谷芽
150份、麦芽150份、苯甲酸钠3份。
3.如权利要求1所述和胃接骨的中药组合物,其特征在于,为合剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂或片剂。
4.如权利要求3所述和胃接骨的中药组合物,其特征在于,为合剂或口服液。
5.如权利要求1或2所述和胃接骨的中药组合物的制备方法,其特征在于,包括:将所有成份按预设重量份混合后,加入2000~3000份,煎至滤液为800~1200份,将滤液密封保存,获得和胃接骨中药合剂。
6.如权利要求1或2所述和胃接骨的中药组合物的制备方法,其特征在于,包括:
(1)将所有成份按预设重量份混合后,加水煎煮成浸膏;
(2)向浸膏中加入辅料制成软材,制粒、整粒后获得颗粒剂;
或者,还包括下述步骤(3):
(3)将颗粒剂压片或装胶囊,制成片剂或胶囊剂。
7.如权利要求1或2所述和胃接骨中药的制备方法,其特征在于,包括:
(1)将所有成份按预设重量份混合后,加水煎煮成浓浸膏;
(2)将所述浓浸膏真空干燥后装胶囊,获得和胃接骨中药胶囊剂。

说明书全文

一种和胃接骨的中药组合物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种治疗骨折的中药,具体涉及一种和胃接骨的中药组合物及其制备方法。

背景技术

[0002] 骨折愈合是一个复杂过程,虽然认为有自然愈合倾向,但诸多实验和临床研究均证明其愈合过程确实存在各种影响因素和愈合快慢的问题,因此临床上出现了较多用于加速骨折愈合的中西药物。
[0003] 对于加速骨折愈合的西药,临床上常用的有制剂和局部刺激骨折部位愈合药物。其中钙制剂如盖天、钙尔奇D等等,治疗以补充钙质,提供骨骼钙元素为原理;局部药物有骨折刺激素、金葡液、转化生长因子-β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMP)、TGF-β与BMP复合材料(孙玉鹏,张皖清,福成,等。TGF-B与BMP复合材料的骨修复作用。中华创伤杂志,1998,2:10)等等。近年研究发现,转化生长因子-β(TGF-β)可刺激骨膜间充质细胞增殖、分化,促进成骨细胞和成软骨细胞增生,刺激Ⅰ型胶原合成,诱导膜内成骨和软骨内成骨过程。
[0004] 西药虽能促进骨折愈合,但也存在不少缺陷,如:(1)钙的吸收问题;(2)局部注射骨折刺激素、金葡液经常会引起局部红肿等副作用;(3)BMP等价格太过昂贵,许多病人家庭难以负担。
[0005] 中国传统医学治疗骨折有着悠久的历史,并且积累了丰富的经验,总结了许多有效的方药。目前早、中期临床上常用的中药虽有活血化瘀,消 肿止痛,接骨续筋等促进骨折愈合的作用,但这些药大多存在胃肠道反应较重的缺点。经过较长时间的临床观察,发现所有骨折病人在早、中、后三期都有不同程度的脾胃虚弱证表现,因此开发在促进骨折愈合的同时对病人消化系统无刺激或胃肠道反应较轻的中药具有重大意义。

发明内容

[0006] 本发明提供了一种和胃接骨的中药组合物,解决了现有技术的接骨中药胃肠道反应重的问题。
[0007] 一种和胃接骨的中药组合物,由以下重量份的成份制得:
[0008] 骨碎补130~180份、续断130~180份、土鳖虫80~100份、自然280~320份、当归130~180份、元胡180~220份、刘寄奴10~20份、木瓜130~180份、僵蚕5~15份、女贞子5~
15份、黄芪25~35份、白术100~150份、佛手80~120份、木香50~80份、谷芽130~180份、麦芽130~180份、苯甲酸钠1~5份。
[0009] 本发明的和胃接骨中药组合物中含有白术、佛手、木香、谷芽和麦芽这几种成份,这几种成份主要起和胃作用,试验发现,该和胃接骨中药组合物能促进小鼠肠推进功能,不会影响大鼠胃残留,不会损伤大鼠胃黏膜,并且能显著改善大鼠乙醇性胃溃疡模型的溃疡发生情况。这表明该和胃接骨中药组合物不会引起或基本不引起胃肠道反应,具有较好的消肿止痛、活血化瘀、和营续骨、健运脾胃、滋补肝肾的作用,因此早、中、后三期的骨折病人均可使用。
[0010] 同时,该和胃接骨中药组合物中含有的黄芪,不仅具有补气血、促进骨骼生长的作用,而且还有健运脾胃的作用。除此之外,本发明和胃接骨中药组合物中其他成份则主要起到接骨的作用,这些成份能够促进TGF-β在骨折愈合的各个阶段表达,显著促进成骨细胞和软骨细胞增生,促进细 胞外基质合成。
[0011] 此外,本发明的和胃接骨中药组合物可以明显促进成骨细胞合成及分泌BMP-2,并使BMP-2表达高峰期提前,加速间充质细胞向成软骨细胞及成骨细胞转化,从而促进骨折愈合。这可能是因为其中含有的土鳖虫能加速成骨细胞内DNA合成,促进成骨细胞的增殖并活跃其功能;其中含有的自然铜、土鳖虫和海螵蛸中均含有锌、锰等无机元素,这些元素是胶原超化物歧化酶的重要辅酶,对成骨细胞的活跃程度起着积极的调节作用;土鳖虫和当归中富含大量基酸,为成骨细胞合成BMP-2提供了必需原料;同时骨碎补也有推迟成骨细胞退行性变的作用。
[0012] 并且,主要起接骨作用的成份与主要起和胃作用的成份相辅相成,互为补充,使得本发明的和胃接骨中药组合物接骨而不伤脾胃。
[0013] 作为优选,所述和胃接骨的中药组合物由以下重量份的成份制得:
[0014] 骨碎补150份、续断150份、土鳖虫90份、自然铜300份、当归150份、元胡200份、刘寄奴15份、木瓜150份、僵蚕10份、女贞子10份、黄芪30份、白术120份、佛手100份、木香60份、谷芽150份、麦芽150份、苯甲酸钠3份。
[0015] 根据不同的需要,本发明的和胃接骨中药组合物可以做成各种不同本领域熟知的剂型,如汤剂、合剂、口服液、颗粒剂、胶囊剂或片剂。
[0016] 本发明还提供了所述和胃接骨的中药组合物的制备方法,包括:
[0017] 将所有成份按预设重量份混合后,加入2000~3000份,煎至滤液为800~1200份,将滤液密封保存,获得和胃接骨中药合剂。
[0018] 若要制成和胃接骨中药口服液,则在上述煎制过程中将滤液的浓缩度提升至较合剂大,具体的浓缩度可以根据具体需要具体设置。
[0019] 或者包括:
[0020] (1)将所有成份按预设重量份混合后,加水煎煮成浸膏;
[0021] (2)向浸膏中加入辅料制成软材,制粒、整粒后获得颗粒剂;
[0022] 还包括下述步骤(3):
[0023] (3)将颗粒剂压片或装胶囊,制成片剂或胶剂。
[0024] 所述辅料是本领域常用的用于制作颗粒剂、片剂或胶囊剂的辅料。
[0025] 制备胶囊剂的方法也可以是:
[0026] (1)将所有成份按预设重量份混合后,加水煎煮成浓浸膏;
[0027] (2)将所述浓浸膏真空干燥后装胶囊,获得和胃接骨中药胶囊剂。
[0028] 本发明的和胃接骨中药组合物由于组分较多,制成胶囊剂或片剂时病人服药量较大,会增加病人的不适感,因此较为优选地制成合剂、口服液等制剂。
[0029] 与现有技术相比,本发明的有益效果为:
[0030] (1)本发明的和胃接骨中药组合物能够促进TGF-β在骨折愈合的各个阶段表达,显著促进成骨细胞和软骨细胞增生,促进细胞外基质合成,提高骨密度,促进骨折部位愈合,加快骨折愈合进程,用药后骨折部位的抗折力也显著提高;
[0031] (2)本发明的和胃接骨的中药组合物能促进小鼠肠推进功能,不会影响大鼠胃残留,不会损伤大鼠胃黏膜,并且能显著改善大鼠乙醇性胃溃疡模型的溃疡发生情况,表明本发明的和胃接骨的中药组合物不会引起或基本不引起胃肠道反应,具有较好的健运脾胃、消肿止痛和营续骨作用,且适合早、中、后三期的病人使用,接骨而不伤脾胃。附图说明
[0032] 图1a为实验用药组(A组)家兔在术后第一周时骨折断端的X线片;
[0033] 图1b为阳性对照组家兔在术后第一周时骨折断端的X线片;
[0034] 图1c为空白对照组家兔在术后第一周时骨折断端的X线片;
[0035] 图1d为实验用药组(A组)家兔在术后第二周时骨折断端的X线片;
[0036] 图1e为阳性对照组家兔在术后第二周时骨折断端的X线片;
[0037] 图1f为空白对照组家兔在术后第二周时骨折断端的X线片;
[0038] 图1g为实验用药组(A组)家兔在术后第四周时骨折断端的X线片;
[0039] 图1h为阳性对照组家兔在术后第四周时骨折断端的X线片;
[0040] 图1i为空白对照组家兔在术后第四周时骨折断端的X线片;
[0041] 其中,a1表示“实验用药组第一周”,b1表示“阳性对照组第一周”,c1表示“空白对照组第一周”,以此类推;
[0042] 图2a为在术后第一周时实验用药组(A组)的家兔标本的组织学观察结果(光镜×4);
[0043] 图2b为在术后第一周时阳性对照组的家兔标本的组织学观察结果(光镜×4);
[0044] 图2c为在术后第一周时空白对照组的家兔标本的组织学观察结果(光镜×4);
[0045] 图2d为在术后第二周时实验用药组(A组)的家兔标本的组织学观察结果(光镜×10);
[0046] 图2e为在术后第二周时阳性对照组的家兔标本的组织学观察结果(光镜×10);
[0047] 图2f为在术后第二周时空白对照组的家兔标本的组织学观察结果(光镜×20);
[0048] 图2g为在术后第三周时实验用药组(A组)的家兔标本的组织学观察结果(光镜×10);
[0049] 图2h为在术后第三周时阳性对照组的家兔标本的组织学观察结果(光镜×10);
[0050] 图2i为在术后第三周时空白对照组的家兔标本的组织学观察结果(光 镜×4);
[0051] 图2j为在术后第四周时实验用药组(A组)的家兔标本的组织学观察结果(光镜×20);
[0052] 图2k为在术后第四周时阳性对照组的家兔标本的组织学观察结果(光镜×4);
[0053] 图2l为在术后第四周时空白对照组的家兔标本的组织学观察结果(光镜×40);
[0054] 图3a为在术后第一周时实验用药组(A组)的家兔标本的免疫组化TGF-β1染色结果(光镜×20);
[0055] 图3b为在术后第一周时阳性对照组的家兔标本的免疫组化TGF-β1染色结果果(光镜×20);
[0056] 图3c为在术后第一周时空白对照组的家兔标本的免疫组化TGF-β1染色结果(光镜×20);
[0057] 图3d为在术后第二周时实验用药组(A组)的家兔标本的免疫组化TGF-β1染色结果(光镜×20);
[0058] 图3e为在术后第二周时阳性对照组的家兔标本的免疫组化TGF-β1染色结果果(光镜×20);
[0059] 图3f为在术后第二周时空白对照组的家兔标本的免疫组化TGF-β1染色结果(光镜×20);
[0060] 图3g为在术后第四周时实验用药组(A组)的家兔标本的免疫组化TGF-β1染色结果(光镜×20);
[0061] 图3h为在术后第四周时阳性对照组的家兔标本的免疫组化TGF-β1染色结果果(光镜×20);
[0062] 图3i为在术后第四周时空白对照组的家兔标本的免疫组化TGF-β1染色结果(光镜×20);
[0063] 图4a为在术后第一周时实验用药组(A组)的家兔标本的免疫组化BMP-2染色结果(光镜×10);
[0064] 图4b为在术后第一周时阳性对照组的家兔标本的免疫组化BMP-2染色结果果(光镜×20);
[0065] 图4c为在术后第一周时空白对照组的家兔标本的免疫组化BMP-2染色结果(光镜×40);
[0066] 图4d为在术后第二周时实验用药组(A组)的家兔标本的免疫组化BMP-2染色结果(光镜×40);
[0067] 图4e为在术后第二周时阳性对照组的家兔标本的免疫组化BMP-2染色结果果(光镜×40);
[0068] 图4f为在术后第二周时空白对照组的家兔标本的免疫组化BMP-2染色结果(光镜×40);
[0069] 图4g为在术后第三周时实验用药组(A组)的家兔标本的免疫组化BMP-2染色结果(光镜×40);
[0070] 图4h为在术后第三周时阳性对照组的家兔标本的免疫组化BMP-2染色结果果(光镜×40);
[0071] 图4i为在术后第三周时空白对照组的家兔标本的免疫组化BMP-2染色结果(光镜×40);
[0072] 图4j为在术后第四周时实验用药组(A组)的家兔标本的免疫组化BMP-2染色结果(光镜×40);
[0073] 图4k为在术后第四周时阳性对照组的家兔标本的免疫组化BMP-2染色结果果(光镜×40);
[0074] 图4l为在术后第四周时空白对照组的家兔标本的免疫组化BMP-2染色结果(光镜×40)。

具体实施方式

[0075] 下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的详细说明。
[0076] 实施例1
[0077] 本实施例一种和胃接骨的中药组合物,由以下重量份的成份制得:
[0078] 骨碎补150g,续断150g,土鳖虫90g,自然铜300g,当归150g,元胡200g,刘寄奴15g,木瓜150g,僵蚕10g,女贞子10g,黄芪30g,白术120g,佛手100g,木香60g,谷芽150g,麦芽150g,苯甲酸钠3g。
[0079] 该和胃接骨的中药组合物的制备方法包括:
[0080] 和胃接骨饮(即和胃接骨中药合剂):将所有成份按上述重量份混合后,加入2500mL水,煎至1000mL,密封保存,备用。
[0081] 和胃接骨胶囊:先将所有成份按预设重量份混合后,加水煎煮至少两次后合并煎液,过滤浓缩得浓浸膏;每次煎煮45分钟,过滤浓缩得浓浸膏(相对密度约1.20,20℃下测),将浓浸膏真空干燥后填装胶囊,获得和胃接骨胶囊。每粒和胃接骨胶囊含药用成份9g。
[0082] 实施例2
[0083] 本实施例一种和胃接骨的中药组合物,由以下重量份的成份制得:
[0084] 骨碎补130g,续断180g,土鳖虫80g,自然铜320g,当归180g,元胡180g,刘寄奴10g,木瓜180g,僵蚕15g,女贞子5g,黄芪35g,白术100g,佛手80g,木香80g,谷芽130g,麦芽130g,苯甲酸钠5g。
[0085] 按照与实施例1相同的制备方法制备和胃接骨饮与和胃接骨胶囊。
[0086] 实施例3
[0087] 本实施例一种和胃接骨的中药组合物,由以下重量份的成份制得:
[0088] 骨碎补180g,续断130g,土鳖虫100g,自然铜280g,当归130g,元胡220g,刘寄奴20g,木瓜130g,僵蚕5g,女贞子15g,黄芪25g,白术150g,佛手120g,木香50g,谷芽180g,麦芽
180g,苯甲酸钠1g。
[0089] 按照与实施例1相同的制备方法制备和胃接骨饮与和胃接骨胶囊。
[0090] 对比例1
[0091] 本实施例一种和胃接骨的中药组合物,由以下重量份的成份制得:
[0092] 骨碎补150g,续断150g,土鳖虫90g,自然铜300g,当归150g,元胡200g,刘寄奴15g,木瓜150g,僵蚕10g,女贞子10g,黄芪30g,苯甲酸钠3g。
[0093] 按照与实施例1相同的制备方法制备和胃接骨饮与和胃接骨胶囊。
[0094] 对比例2
[0095] 本实施例一种和胃接骨的中药组合物,由以下重量份的成份制得:
[0096] 骨碎补150g,续断150g,土鳖虫90g,自然铜300g,海螵蛸150g,当归150g,元胡200g,刘寄奴15g,木瓜150g,白术120g,佛手100g,木香60g,谷芽150g,麦芽150g,苯甲酸钠
3g。
[0097] 按照与实施例1相同的制备方法制备和胃接骨饮与和胃接骨胶囊。
[0098] 检测例1和胃接骨的中药组合物加速骨折愈合的研究
[0099] 1、制备动物模型
[0100] 在无菌条件下将家兔左侧桡骨中、上段手术造成骨折模型,骨缺损2~3mm,术后任兔自由行走,无外固定。术后肌注青霉素G钠(购自江西东药业股份有限公司,赣卫药准字(1996)第030008号,批号:020621-3)20万u每天一次,共3天。
[0101] 2、分组及给药
[0102] 将骨折模型家兔随机分为实验用药组(服用实施例1制备的和胃接骨胶囊的家兔为A组,服用实施例2制备的和胃接骨胶囊的家兔为B组,服用实施例3制备的和胃接骨胶囊的家兔为C组,服用对比例1制备的和胃接骨胶囊的家兔为D组,服用对比例1制备的和胃接骨胶囊的家兔为E组)、阳性对照组和空白对照组,每组16只。家兔造模术后1日,实验用药组中每只动物服用相应的和胃接骨胶囊一粒;阳性对照组服用麝香接骨丹(购自吉林东丰制药一厂,批号:990106)一粒;空白对照组服用安慰剂一粒,连续服用14日。
[0103] 3、动物的处死及标本的处理
[0104] 每组每次分别于术后7天、14天、21天、28天以空气栓塞法各处死4只。每组处死动物自两侧上臂下端剪下,放入–20℃箱保存。分别进行X线检查、骨密度检查、生物力学检查后取材做组织病理及免疫组化检查。其中骨密度检查、生物力学检查只做术后28天的标本;X线检查、免疫组化检查只做术后7天、14天、28天的标本。
[0105] 4、观察指标
[0106] (1)一般项目:连续观察三组动物毛发光泽度、食量、活动度、反应度、切口情况。
[0107] (2)摄X线片:观察术后7天、14天、21天、28天家兔左侧桡骨中、上段骨折处缺损情况、骨膜反应、骨痂量、骨小梁。
[0108] (3)骨密度检查:用UBIS3000超声骨密度测定仪(法国DMS公司)测定家兔骨折处的声量减弱值(BUA),以反应骨量、骨质变化。
[0109] (4)抗折力测试:用岛津万能测试仪进行兔桡骨三点弯曲最大负载 力学测定,以骨折处为中心,跨距为2厘米,加载速率为5mm/min,测出每根兔桡骨的弯曲载荷。为了克服个体差异,应采取骨折一侧桡骨三点弯曲载荷值除以健侧三点弯曲载荷值得到的百分比进行统计,以减少因个体差异带来的误差。
[0110] (5)组织学观察:取包括骨折断端及其周围软骨痂约1厘米作为观察标本,将标本置入4%多聚甲中浸泡48h后,用骨刀切成5mm×5mm×5mm的小,置入10%EDTA液(pH 7.2)脱钙,4℃,每周换脱钙液1次。待针可刺入骨皮质时停止脱钙,随后石蜡包埋(60℃),制备4μm厚度切片;切片经脱蜡至水、HE染色后,进行组织学观察。
[0111] (6)免疫组化染色:切片经脱蜡至水后,分别经0.3%双氧水封闭内源酶;按常规ABC法进行免疫组化TGF-β1染色和免疫组化BMP-2染色。
[0112] 其中,免疫组化TGF-β1染色结果观察:细胞染色中出现棕黄色颗粒为阳性反应标志,每次染色均作对照,通过与计算机相连的显微镜,将采集到的免疫组化切片图像存入微机,用PAS-9000病理图像分析系统进行分析。染色切片经显微镜放大,每例随机摄取骨痂组织图像5幅。每批和批间输入的图像入射光强度皆严格控制在同一水平。通过彩色分割方法,分割骨痂图像中TGF-β1阳性产物的染色区域,求出阳性产物的染色面积和阳性产物的染色灰度。
[0113] 细胞内染色:间充质细胞,成骨细胞、单核细胞等胞浆内分布的棕黄色颗粒为TGF-B1染色阳性。细胞外染:在骨膜、基质、血肿中的细胞间质中分布的片状棕黄针颗粒,为TGFB-1染色阳性。
[0114] 免疫组化BMP-2染色结果观察:细胞染色中出现棕色为阳性反应,每次染色均做对照,通过与计算机相连的显微镜将采集到的免疫组化切片图像存入微机,用PAS-9000病理图像分析系统进行分析。染色切片经显微镜放大400倍,每例随机摄取骨痂组织图像5幅。每批和批间输入的图像入射光强度皆严格控制在同一水平。通过彩色分割方法,分割骨痂图像中BMP-2阳性产物区域,求出阳性产物平均光密度(代表BMP-2平均着色程度)和阳性产物平均积分光密度(代表BMP-2含量),用0.01mol/L PBS替代一抗作为阴性对照。
[0115] 各组计量资料用均数±标准差 表示,并用SPSS13.0软件统计包对各组数据进行统计分析,组间资料用单因素方差分析,采用t检验,以P<0.05为有显著性差异。
[0116] 5、观察结果
[0117] (1)一般项目:三组动物术后均无感染,实验用药组术后2日行动及饮食恢复如前,空白对照组及阳性对照组倦卧少动,术后3~4日方恢复;术后3日见实验用药组及阳性对照组肢体肿胀基本消失,而空白对照组局部瘀斑明显,1周后才消失。
[0118] (2)摄X线片:
[0119] 术后一周:实验用药组、阳性对照组和空白对照组的骨折线均清晰可见,但实验用药组(A组,图1a)及阳性对照组(图1b)局部的血肿吸收较好,而空白对照组(图1c)的断端周围可见较多血肿阴影。
[0120] 术后两周:实验用药组(A组,图1d)及阳性对照组(图1e)的骨折断端影响均趋向模糊,并有轻度骨膜反应,个别标本有大量骨痂形成;空白对照组(图1f)的标本也表现为骨折端模糊、轻度骨膜反应,但骨痂形成较少。
[0121] 术后四周:实验用药组(A组,图1g)及阳性对照组(图1h)可见到明显的外骨痂,骨折局部密度增高,骨皮质连续性好,大部分标本断端已重塑接近正常骨质;而空白对照组(图1i)断端也有大量骨痂形成,断 端连续,骨痂膨隆较大,但髓腔未通。
[0122] 实验用药组与阳性对照组在第1、2周X线平片检查结果无明显差别,但第4周时实验用药组骨缺损内骨小梁明显比阳性对照组密实。
[0123] 以上结果表明,实验用药组和阳性对照组的骨折修复快于空白对照组,且实验用药组的骨折修复快于阳性对照组。
[0124] (3)骨密度检查:见下表1:
[0125] 表1四周时各组的骨密度比较(n=4, )
[0126]
[0127] 注:*表示与空白对照组比较具有显著差异(P<0.05),▽表示与阳性对照组相比不具备显著差异(P>0.05)。
[0128] 由表1可见,术后28天时,实验用药组与阳性对照组的骨密度值无显著差异,而实验用药组与空白对照组之间则存在显著差异,均值相差近2倍,表明和胃接骨胶囊能增加骨量,促进骨折愈合。
[0129] 四个试验用药组中,A组的骨密度最大,B组、C组、D组和E组的骨密度虽比A组稍低,但仍高于阳性对照组。表明实施例1的和胃接骨胶囊对骨折愈合的促进作用最佳。由A组和E组的检测数据可知,僵蚕、女贞子和黄芪的组合较海螵蛸更有利于增加骨量,促进骨折愈合。
[0130] (4)抗折力测试:见下表2:
[0131] 表2四周时各组3点弯曲最大破坏弯距均值比较(n=4, )
[0132]
[0133] 注:*表示与空白对照组比较具有显著差异(P<0.05),▽表示与阳性对照组相比不具备显著差异(P>0.05)。
[0134] 由表2可见,术后28天时,实验用药组和阳性对照组均与空白对照组存在显著差异,均值相差近2倍,表明试验用药组的桡骨标本在骨折愈合中的力学性能优于空白对照组。
[0135] (5)组织学观察:
[0136] 术后第7天:实验用药组(A组,图2a)、阳性对照组(图2b)和空白对照组(图2c)均可见间充质细胞增殖活跃,从结构和形态上可以看出,间充质细胞有向软骨骨细胞、软骨细胞分化的趋势;细胞间质内均可见毛细血管增生及炎性细胞浸润,并可见大量胶原细胞形成。但空白对照组间充质细胞分化程度低,纤维细胞较少,基质中的胶原纤维稀少;阳性对照组间充质细胞分化程度较高,成纤维细胞分布稠密,基质中胶原纤维生成较多;实验用药组(A组)成纤维细胞数量及胶原纤维较多,分化较成熟,细胞分布规则稠密。
[0137] 术后第14天:实验用药组(A组,图2d)、阳性对照组(图2e)和 空白对照组(图2f)骨痂中胶原纤维逐渐被骨小梁取代,但空白对照组骨小梁较少,骨痂中可见较多未成熟分化的胶原纤维细胞、成骨细胞,细胞排列稀疏,数量较少;阳性对照组称呼细胞较多,骨细胞较少,骨小梁生成较多;实验用药组(A组)骨小梁数量较多,骨小梁边缘的成骨细胞数量也较多,细胞排列致密整齐,基质内可见钙盐沉着,偶见破骨细胞。
[0138] 术后第21天:实验用药组(A组,图2g)新生骨痂与骨折端正常骨组织连成一片,并有形成连续板层骨的趋势,骨痂中可见大量位于骨陷窝内的成熟骨细胞形成,细胞周围基质中可见大量钙盐沉着,骨细胞周围乐见较多破骨细胞;阳性对照组(图2h)也有板层骨形成,但数量较少,基质中骨细胞、成骨细胞较多;空白对照组(图2i)骨小梁逐渐增多,骨痂内成熟的骨细胞数量较少,骨小梁边缘可见较多成骨细胞。
[0139] 术后第28天:实验用药组(A组,图2j)骨痂组织细胞结构及形态、基质骨化程度已接近成熟骨组织;而阳性对照组(图2k)中可见大量位于骨陷窝内的成熟骨细胞,并已形成连续成熟的板层骨,基质钙化明显;空白对照组(图2l)骨痂内成熟的骨细胞较多,可见连续板层骨形成,板层骨边缘可见排列整齐的成骨细胞。
[0140] 由此可见,与实验用药组及阳性对照组相比,空白对照组的骨折愈合进程明显减慢,并且试验用药组的骨折愈合进程快于阳性对照组。
[0141] (6)免疫组化染色:
[0142] ①免疫组化TGF-β1染色
[0143] 术后第7天:各组骨外膜下及周围软组织形成的血肿中有大量的中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、红细胞浸润,这些细胞间质中TGF-β1成片状分布,呈强阳性染色;在单核炎性细胞周围,TGF-β1的染色更为明显;增生的骨膜细胞内有TGF-β1的阳性染色;大量成纤维细胞不规则地 排列在松散的纤维蛋白网架中,亦可见TGF-β1的细胞外染色;其中,实验用药组(A组)基质中阳性细胞较多,染色较深(图3a);阳性对照组基质中阳性细胞也较多,但染色较实验用药组浅(图3b);空白对照组基质中阳性细胞则较少,染色较淡(图3c)。
[0144] 实验用药组及阳性对照组较空白对照组染色强烈,且实验用药组和阳性对照组与空白对照组之间的平均灰度也存在非常显著性差异。
[0145] 术后第14天:实验用药组(A组,图3d)和阳性对照组(图3e)中均可见新生血管壁周围的间充质细胞内和细胞外均为阳性染色,形成一个清晰的TGF-β1环形染色带;并且实验用药组(图3d)中还可见到骨外膜深层间细胞活跃增殖,并有向成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞分化的趋势;阳性对照组(图3e)骨外膜深层间细胞活跃程度也较高,也有向功能细胞分化的趋势。而空白对照组(图3f)的细胞活跃及分化程度均较低。在第二周时,三组细胞的胞浆内均见TGF-β1阳性染色,间质中未见TGF-β1染色定位
[0146] 术后第28天:实验用药组(A组,图3g)和阳性对照组(图3h)的细胞间质中均开始出现TGF-β1的染色定位;在膜内成骨部位,新生骨小梁表面衬附的成骨细胞内可见TGF-β1的染色,同时也有细胞外染色,而埋入骨基质的成骨细胞内外TGF-β1染色均为阴性;软骨细胞内仍有TGF-β1的强阳性染色;在膜内成骨以上的继续分化的间充质细胞内仍然有TGF-β1阳性染色;在软骨内成骨区域,钙化前沿的软骨细胞浆内未见TGF-β1的染色,而周围基质则为强阳性染色;桥梁骨痂骨膜增厚的部位依旧可见间充质细胞分化,并有细胞内染色阳性。而空白对照组(图3i)中新生骨小梁较少,骨小梁表面衬附的成骨细胞内TGF-β1阳性产物染色较浅,骨基质中成骨细胞、成软骨细胞数量较少,TGF-β1阳性表达较弱。
[0147] 通过免疫组化染色可发现,在试验用药组中,TGF-β1在细胞中的表达水平较高,TGF-β1的高表达能够刺激骨膜间充质细胞增殖分化,促进成骨细胞和软骨细胞增生,诱导膜内成骨及软骨内成骨过程,促进细胞外基质合成。表明和胃接骨胶囊提高骨折愈合质量的作用与促进TGF-β1在骨折愈合各个阶段的表达、促进成骨细胞增殖和基质合成有关。
[0148] ②免疫组化BMP-2染色
[0149] 术后第一周:实验用药组(A组,图4a)、阳性对照组(图4b)和空白对照组(图4c)肉芽组织及纤维性骨痂组织中均出现BMP-2阳性染色细胞(BMP-2阳性染色呈棕黄色,主要分布于骨小梁及阳性细胞胞浆内)。其中,空白对照组中BMP-2阳性染色细胞较少,阳性染色较弱;而阳性对照组BMP-2阳性染色细胞较多,阳性染色较强;实验用药组(A组)的镜下视野中可见大量呈棕黄色的阳性染色细胞,阳性染色强。
[0150] 术后第二周:实验用药组(A组,图4d)、阳性对照组(图4e)和空白对照组(图4f)的镜下视野均可见BMP-2阳性染色细胞增多。其中空白对照组的阳性染色强度仍较低;阳性对照组的阳性染色强度增强,并可见排列紊乱的骨小梁生成;而实验用药组(A组)出现大量的软骨岛和新生骨小梁,可见大量呈棕黄色的阳性染色细胞,阳性染色进一步增强。
[0151] 术后第三周:空白对照组(图4i)BMP-2阳性染色细胞增多,阳性染色强度逐渐增强;阳性对照组(图4h)也可见较多的阳性染色细胞,阳性染色强度较强;而实验用药组(A组,图4g)BMP-2阳性染色细胞较第二周时下降,阳性染色强度较第二周时下降减弱。
[0152] 术后第四周:阳性对照组(图4k)和空白对照组(图4l)的BMP-2阳性染色细胞数量均大幅度减少,阳性染色强度均明显较第三周时要弱。而实验用药组(A组,图4j)骨板边缘可见少量BMP-2阳性染色细胞,基质中以骨细胞为主,细胞基质中BMP-2阳性产物表达已基本消失。
[0153] BMP-2阳性表达的细胞类型主要有间充质细胞、成软骨细胞、成骨细胞等,退变的软骨细胞和成熟的骨细胞中未见明显阳性表达。
[0154] (7)TGF-β1免疫组化染色分析
[0155] ①TGF-β1阳性产物面积分析结果,请见表3。
[0156] 表3 TGF-β1染色面积( um2,n=8)
[0157]
[0158] 注:﹡表示在同一时间与空白对照组相比具有显著差异(P<0.05);Δ表示在同一时间与阳性对照组相比具有显著差异(P<0.05)。
[0159] 由表3可见,在术后第一周、第二周,试验用药组中TGF-β1阳性产物面积均大于阳性对照组和空白对照组,且具有显著差异;在术后第四周,试验用药组中TGF-β1阳性产物面积与空白对照组相比具有显著差异,但与阳性对照组相比无显著差异。
[0160] 表明阳性对照组与试验用药组虽然在较长的愈合期内均能达到相似的愈合效果,但试验用药组的愈合进程比阳性对照组要快。并且,四个试验用药组的TGF-β1阳性产物面积之间不存在显著差异。
[0161] ②TGF-β1阳性产物染色灰度分析结果,参见表4:
[0162] 表4TGF-β1染色灰度( um2,n=8)
[0163]
[0164] 注:﹡表示在同一时间与空白对照组相比具有显著差异(P<0.05);Δ表示在同一时间与阳性对照组相比具有显著差异(P<0.05)。
[0165] 由表4可见,术后第一周,各试验用药组中TGF-β1阳性产物染色灰度均与空白对照组相比具有显著差异;术后第二周,各试验用药组中TGF-β1阳性产物染色灰度均与空白对照组相比具有显著差异,且A组与阳性对照组相比还具有显著差异;术后第四周,A组和B组中TGF-β1阳性产物染色灰度均与空白对照组相比具有显著差异。
[0166] 从上述结果中可以看出,在术后第一周,TGF-β1表达水平较低,染色灰度较高;术后第二周,TGF-β1表达水平升高,染色灰度变低;术后第四周,骨折愈合进程接近尾声,TGF-β1表达水平下调,染色灰度变高。这与图2a~图2i的观察结果相一致。
[0167] (8)BMP-2免疫组化染色分析
[0168] ①BMP-2阳性产物光密度均值分析,分析结果见表5:
[0169] 表5BMP-2阳性产物光密度均值(n=10, )
[0170]
[0171] 注:﹡﹡表示在同一时间与空白对照组相比具有极显著差异(P<0.01);﹡表示在同一时间与空白对照组相比具有显著差异(P<0.05);Δ表示在同一时间与阳性对照组相比具有显著差异(P<0.05);▽表示在同一时间与阳性对照组相比不具有显著差异(P>0.05)。
[0172] 由表5可见,术后第一周和第二周,各试验用药组的BMP-2阳性产物光密度均值与空白对照组相比均具有极显著差异,与阳性对照组相比均具有显著差异。术后第三周、第四周时,各试验用药组的BMP-2阳性产物光密度均值有所降低,这与BMP-2免疫组化染色的结果相一致。
[0173] ②BMP-2平均积分光密度值分析,分析结果见表6:
[0174] 表6 BMP-2阳性产物平均积分光密度值(n=10, )
[0175]
[0176] 注:﹡﹡表示在同一时间与空白对照组相比具有极显著差异(P<0.01);﹡表示在同一时间与空白对照组相比具有显著差异(P<0.05);Δ表示在同一时间与阳性对照组相比具有显著差异(P<0.05);▽表示在同一时间与阳性对照组相比不具有显著差异(P>0.05)。
[0177] 由表6可见,术后第一周和第二周,各试验用药组的BMP-2阳性产物平均积分光密度值与空白对照组相比均具有极显著差异,与阳性对照组相比均具有显著差异。术后第三周、第四周时,各试验用药组的BMP-2阳性产物平均积分光密度值有所降低,这与BMP-2免疫组化染色的结果相一致。
[0178] 以上结果表明,本发明的和胃接骨中药组合物可以明显促进成骨细胞合成及分泌BMP-2,并使BMP-2表达高峰期提前(试验用药组的BMP-2表达高峰期在术后第二周,而阳性对照组和空白对照组则在术后第三周),加速间充质细胞向成软骨细胞及成骨细胞转化,从而促进骨折愈合。
[0179] 检测例2和胃接骨的中药组合物对消化系统的影响
[0180] 选用实施例1制备的和胃接骨饮(每毫升中含生药0.3g),将与检测例1中相同的麝香接骨丹用蒸馏水配置成0.3g/ml,待用。
[0181] 1、和胃接骨饮对小鼠炭末肠推进的影响
[0182] ICR小鼠50只,雌性,体重25.5±2.31g,按体重搭配分成4组,其中,空白对照组灌胃给予蒸馏水(灌胃体积0.2ml/10g,下同),阳性对照组灌胃给予麝香接骨丹水溶液(0.045g/ml,折算成生药含量),试验用药组分别灌胃给予和胃接骨饮大剂量(0.21g/ml)和小剂量(0.105g/ml),
[0183] ICR小鼠96只,雌性,体重25.5±2.31g,按体重搭配分成8组,其中,空白对照组灌胃给予蒸馏水(灌胃体积0.2ml/10g,下同),阳性对照组灌胃给予麝香接骨丹水溶液(0.045g/ml),试验用药组(A-1组)灌胃给予实施例1的和胃接骨饮大剂量(0.21g/ml),试验用药组(A-2组)灌胃给予实施例1的和胃接骨饮小剂量(0.105g/ml),试验用药组(B组、 C组、D组、E组)分别灌胃给予实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的和胃接骨饮小剂量(0.105g/ml);每日1次,连续7天;末次给药前1日起禁食,并于末次给药后20min灌胃给予5%活性炭溶液0.2ml/10g,20min后脱颈臼处死,量取炭末前沿长度及小肠全长,计算炭末推进百分率,结果见表7。
[0184] 表7各实验组对小鼠炭末肠推进的影响(X±SD)
[0185]
[0186] 注:*表示与空白对照组比较差异显著(P<0.05)。
[0187] 由表7可见,各试验用药组均具有较高的炭末肠推进百分率,与空白对照组相比具有显著差异(p<0.05);而阳性对照组小鼠的炭末肠推进百分率却比空白对照组要低,且具有显著差异(p<0.05);表明和胃接骨饮能促进小鼠肠推进功能,而麝香接骨丹却使小鼠炭末肠推进减慢,即服用麝香接骨丹后小鼠肠推进功能变弱。
[0188] 由试验用药组(D组)与A-1组、A-2组、B组、C组、E组的数据可以看出(结合检测例1的检测结果),虽然D组的和胃接骨中药与其他试验用药组具有相近的接骨功能,但D组的和胃接骨饮中由于不含有白术、佛手、木香、谷芽和麦芽,其肠推进功能减弱程度较大,但并非完全 丧失。表明佛手和鸡内金虽主要起到和胃作用,但这两个成份与其他的成份之间仍存在协同作用,佛手和鸡内金也能起到部分接骨功能,而其他成份也具有一定的和胃功能,两个方面相辅相成。
[0189] 并且,E组的炭末肠推进百分率虽比D组要高,但仍比其他试验用药组要低,表明海螵蛸对小鼠肠推进功能的促进作用较僵蚕、女贞子和黄芪的组合要弱。
[0190] 2、和胃接骨饮对大鼠酚红胃残留的影响
[0191] SD大鼠80只,雌雄兼用,体重232±60g,按体重搭配分成8组,每组10只,其中,空白对照组灌胃给予蒸馏水(灌胃体积1ml/100g,下同),阳性对照组灌胃给予麝香接骨丹水溶液(0.063g/ml),试验用药组(A-1组)灌胃给予实施例1的和胃接骨饮大剂量(0.3g/ml),试验用药组(A-2组)灌胃给予实施例1的和胃接骨饮小剂量(0.15g/ml),试验用药组(B组、C组、D组、E组)分别灌胃给予实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的和胃接骨饮小剂量(0.15g/ml);每日1次,连续21天,每周称体重1次,末次给药前1天起禁食,并于末次给药后1h以20mg%酚红糊剂灌胃(1ml/100g),20min后脱颈臼处死,取胃,两端结扎,用蒸馏水洗出内容物至刻度试管,按常规方法处理,用721可见分光光度计在560nm处测定吸光度,以初始灌胃酚红量为基数,计算胃酚红残留百分率,结果见表8。
[0192] 表8和胃接骨饮对大鼠胃酚红残留百分率的影响(X±SD)
[0193]
[0194] 注:*表示与空白对照组比较差异显著(P<0.05)。
[0195] 由表8可见,试验用药组(A-1组、A-2组、B组、C组、D组、E组)组大鼠均具有较低的胃酚红残留百分率,与空白对照组相比无显著差异,其中D组大鼠的胃酚红残留百分率比其他试验用药组要稍高;而阳性对照组小鼠的胃酚红残留百分率却明显高于空白对照组、且具有显著差异。
[0196] 上述结果表明和胃接骨饮不影响大鼠胃残留,而麝香接骨丹对大鼠胃残留却具有较大影响。
[0197] 同时,由试验用药组(D组)与A-1组、A-2组、B组、C组、E组的数据可以看出(结合检测例1的检测结果),虽然D组的和胃接骨中药与其他试验用药组具有相近的接骨功能,但D组的和胃接骨饮中由于不含有白术、佛手、木香、谷芽和麦芽,其胃酚红残留百分率相对有所升高,但仍与空白对照组无显著差异。表明这五种成份虽主要起到和胃作用,但与其他的成份之间仍存在协同作用,这五种成份也能起到部分接骨功能,而其他成份也具有一定的和胃功能,两个方面相辅相成。
[0198] 并且,E组的胃酚红残留百分率虽比D组要低,但仍比其他试验用药组要高,表明僵蚕、女贞子和黄芪的组合较海螵蛸更有利于降低胃酚红残留百分率。
[0199] 3、和胃接骨饮对正常大鼠胃粘膜的影响
[0200] SD大鼠80只,体重200±20g,雌雄兼用,按体重搭配分成8组,每组5只,以前法大鼠给药剂量灌胃给药,每日1次,连续21天,第21天并禁食,次日脱颈臼处死,取胃,两端结扎,每胃灌以1%甲醛8ml固定,1h后检视胃粘膜受损情况,结果各组大鼠胃粘膜均未发现溃疡及出血点,表明和胃接骨饮和麝香接骨丹均不会损伤大鼠正常胃粘膜。
[0201] 4、和胃接骨饮对乙醇性大鼠胃溃疡模型的影响
[0202] SD大鼠28只,体重336±60g,雌雄兼用,按体重搭配分成3组,其中,空白对照组灌胃给予蒸馏水(灌胃体积1ml/100g,下同),阳性对照组灌胃给予麝香接骨丹水溶液(0.063g/ml),试验用药组(A组、B组、C组、D组、E组)分别灌胃给予实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2的和胃接骨饮小剂量(0.15g/ml),上、下午各1次,次日上午起并禁食,第三天上午末次给药后1小时,各组大鼠灌胃给予无水乙醇每只1ml,1小时后脱颈臼处死,取胃,两端结扎,每胃灌以1%甲醛8ml固定,1小时后检视胃粘膜受损情况,记录条状溃疡长度及出血点数,以累计溃疡长度(mm)作为溃疡指数比较各组溃疡发生情况,结果见表9。
[0203] 表9和胃接骨饮对大鼠乙醇性胃溃疡发生的影响(X±SD)
[0204]
[0205] 注:*表示与空白对照组比较差异显著(P<0.05)。
[0206] 由表9可见,与空白对照组相比,各试验用药组的和胃接骨饮均能明显降低降低大鼠乙醇性胃溃疡模型的溃疡指数(P<0.05),而麝香接骨丹对大鼠乙醇性胃溃疡模型无任何修复作用。表明和胃接骨饮具有较好的健运脾胃、消肿止痛作用,接骨而不伤脾胃。
[0207] D组由于缺失了白术、佛手、木香、谷芽和麦芽,因此溃疡指数较其他试验用药组要高,但与空白对照组相比仍具有显著差异,表明其他主要起接骨作用的组分也具备一定的和胃功能。
[0208] 并且,E组的溃疡指数虽比D组要低,但仍比其他试验用药组要稍高,表明僵蚕、女贞子和黄芪的组合较海螵蛸更有利于修复大鼠乙醇性胃溃疡模型的溃疡指数。
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