植物由来の悪性腫瘍治療薬

本発明は、植物由来の成分を含有する悪性腫瘍治療薬に関する。

植物中には数多くの生理活性物質が含まれており、植物から医薬品を抽出することは長年行なわれてきている。 植物由来の悪性腫瘍治療薬としては、イチイ科の植物からの抽出物であるタキソール；クロタキカズラ科クサミズキ、タマミズキ科カンレンボクに含まれるアルカロイドであるカンプトテシン；及びキョウチクトウ科ニチニチソウに含まれるインドールアルカロイドであるビンクリスチン、ビンブラスチン等が知られている。

一方、植物由来の成分であるネオリグナン類の中には、種々の薬効を示す化合物が知られており、細胞傷害活性を示すネオリグナンとしては、パーシールＦ（Ｐｅｒｓｅａｌ Ｆ）及びリカリンＡ（ＬｉｃａｒｉｎＡ）が知られている（非特許文献１〜２）。
Ｔｈａｉ Ｉ． Ｌ． ，Ｃｈｅｎ Ｊ． Ｈ． ，Ｄｕｈ Ｃ． Ｙ． ，Ｃｈｅｎ Ｉ． Ｓ． ''Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｎｅｏｌｉｇｎａｎｓ ａｎｄ Ｂｕｔａｎｏｌｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｍａｃｈｉｌｕｓ ｏｂｏｖａｔｉｆｏｌｉａ''Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ ２００１；６７：５５９−５６１ Ｔｈａｉ Ｉ． Ｌ． ，Ｈｓｉｅｈ Ｃ． Ｆ． ，Ｄｕｈ Ｃ． Ｙ． ，Ｃｈｅｎ Ｉ． Ｓ． ''Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｐｅｒｓｅａ ｏｂｏｖａｔｉｆｏｌｉａ''Ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １９９９；５１：３３５−３４５

本発明の目的は、植物中から新規な悪性腫瘍治療薬を探索することにある。

本発明者は、ブラジル産薬用植物であるＬｉｃａｒｉａ ｐｕｃｈｕｒｙ−ｍａｊｏｒの種子を原料として用い、各種溶媒抽出画物についてアポトーシス誘導能及び抗腫瘍活性を指標にスクリーニングしてきたところ、アセトン画分が腫瘍細胞に対する優れたアポトーシス誘導能を有し、その有効成分について検討したところ下記化合物であり、これらの化合物が優れた抗腫瘍活性を有することを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、次の式（１）又は（２）

（式中、Ｒ ^１及びＲ ^２はそれぞれメチル基を示すか、Ｒ ^１とＲ ^２が一緒になってメチレン基を形成してもよく、Ｒ ^３は水素原子又はメトキシ基を示す）
で表される化合物を含有する悪性腫瘍治療薬及びアポトーシス誘導剤を提供するものである。

また、本発明は、上記化合物の、悪性腫瘍治療薬及びアポトーシス誘導剤製造のための使用を提供するものである。
さらに本発明は、上記化合物の有効量を投与することを特徴とする悪性腫瘍の治療方法及びアポトーシス誘導方法を提供するものである。

本発明の悪性腫瘍治療薬は、優れた抗腫瘍活性を有し、その作用は癌細胞に対するアポトーシス誘導能によるものであると考えられる。 従って、新たな悪性腫瘍治療薬として有用である。

アセトン画分のフローサイトメトリーによるＪｕｒｋａｔ細胞に対するアポトーシス誘導能を示す図である。

化合物（１）のＩＭＲ−３２に対する細胞傷害活性を示す図である。

化合物（２ａ）のＩＭＲ−３２に対する細胞傷害活性を示す図である。

化合物（２ｂ）のＩＭＲ−３２に対する細胞傷害活性を示す図である。

化合物（２ｃ）のＩＭＲ−３２に対する細胞傷害活性を示す図である。

化合物（１）のＳＫ−Ｎ−ＳＨに対する細胞傷害活性を示す図である。

化合物（２ａ）のＳＫ−Ｎ−ＳＨに対する細胞傷害活性を示す図である。

化合物（２ｂ）のＳＫ−Ｎ−ＳＨに対する細胞傷害活性を示す図である。

化合物（２ｃ）のＳＫ−Ｎ−ＳＨに対する細胞傷害活性を示す図である。

化合物（１）のＮＢ−３９に対する細胞傷害活性を示す図である。

化合物（２ａ）のＮＢ−３９に対する細胞傷害活性を示す図である。

化合物（２ｂ）のＮＢ−３９に対する細胞傷害活性を示す図である。

化合物（２ｃ）のＮＢ−３９に対する細胞傷害活性を示す図である。

本発明の悪性腫瘍治療薬及びアポトーシス誘導剤（以下、悪性腫瘍治療薬等という）は、前記式（１）又は（２）で表される化合物を有効成分とするものである。 ここで、式（２）の化合物の具体例としては、次の式（２ａ）〜（２ｃ）で表される化合物が挙げられる。

これらの式（１）及び（２）の化合物は、ブラジル産薬用植物であるＬｉｃａｒｉａ ｐｕｃｈｕｒｙ−ｍａｊｏｒの種子から抽出することにより得ることができる。 Ｌｉｃａｒｉａ ｐｕｃｈｕｒｙ−ｍａｊｏｒは、現地では赤痢、下痢、失禁、胃病、腰気に煎剤として、また虫毒やリウマチの治療にハップや浴剤として用いられている（ブラジル産薬用植物事典、橋本悟郎著）。

Ｌｉｃａｒｉａ ｐｕｃｈｕｒｙ−ｍａｊｏｒの種子から、前記化合物を抽出するには、例えばまず、当該種子を粉砕してエタノール抽出し、その抽出物をｎ−ヘキサン及び９０％メタノールにより分配抽出した時、その９０％メタノール抽出画分中に前記化合物が含まれる。 さらに、当該９０％メタノール画分を、合成吸着剤に吸着させた後４０％メタノール、７０％メタノール、１００％メタノール及びアセトンで順次溶出すれば、主に１００％メタノール画分及びアセトン画分、特にアセトン画分に含まれる。 従って、本発明の悪性腫瘍治療薬等には当該Ｌｉｃａｒｉａ ｐｕｃｈｕｒｙ−ｍａｊｏｒの前記１００％メタノール画分又はアセトン抽出画分を用いてもよい。 さらに精製するには、前記１００％メタノール画分又はアセトン画分を、カラムクロマトグラフィーに付せばよい。

ここで、合成吸着剤としては、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ブロムスチレン−ジビニルベンゼン共重合体等が挙げられ、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体が好ましい。 合成吸着剤の市販品としては、ダイヤイオンＨＰ２０、ダイヤイオンＨＰ２１、セパビーズＳＰ８２５、セパビーズＳＰ８５０等が挙げられる。

後記実施例から明らかなように、式（１）及び（２）の化合物は、白血病細胞、神経芽腫細胞等に対して優れた細胞傷害活性を有する。 また、その細胞傷害活性はアポトーシス誘導活性に基づくものである。 従って、式（１）又は（２）の化合物、あるいはこれらの化合物を含有するＬｉｃａｒｉａ ｐｕｃｈｕｒｙ−ｍａｊｏｒ抽出物は、ヒトを含む哺乳動物の悪性腫瘍治療薬として有用である。
本発明の悪性腫瘍治療薬の対象となる悪性腫瘍には、白血病、リンパ腫などの血液や造血組織の腫瘍及び固形腫瘍が含まれる。 固形腫瘍としては、皮膚癌、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌などの上皮細胞癌；及び平滑筋肉腫、骨肉腫などの肉腫が挙げられる。

本発明の医薬は、式（１）又は（２）の化合物、あるいは前記抽出物に、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、被覆剤、乳化剤、懸濁化剤、溶剤、安定化剤、吸収助剤、軟膏基剤等の１以上の薬学的に許容される担体を適宜添加し、常法により経口投与用、注射投与用、直腸内投与用、外用などに適する剤形（医薬組成物）に製剤化することによって得られる。
経口投与用の製剤としては、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤等が；注射投与用の製剤としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、点滴注射用の製剤などが；直腸内投与用の製剤としては、坐薬軟カプセル等が好ましい。
本発明の医薬は上記の如き製剤として、ヒトを含む哺乳動物に投与することができる。
本発明の医薬は、式（１）又は（２）の化合物として、１日当り約１〜５００ｍｇ／ｋｇを１〜４回投与するのが好ましい。

次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

実施例１
Ｌｉｃａｒｉａ ｐｕｃｈｕｒｙ−ｍａｊｏｒの種子を粉砕して粉砕物２．８ｋｇを得た。 粉砕物を超音波照射下にエタノール（２．５Ｌ×３）で抽出した。 ろ過して得られたエタノール抽出物を濃縮し乾燥固形分として２７６．８ｇを得た。 次に、このエタノール抽出物をｎ−ヘキサン及び９０％メタノールを用いて分配抽出し、９０％メタノール抽出画分を濃縮し乾燥固形分として９３．８ｇを得た。
９０％メタノール抽出物を、ダイヤイオンＨＰ２０を充填したカラムに吸着させた。 この吸着物を、４０％メタノール（４Ｌ）、７０％メタノール（４Ｌ）、１００％メタノール（４Ｌ）、次いでアセトン（５Ｌ）で順次溶出させた。 アセトン画分６．９５ｇについて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン−酢酸エチル）及び逆相ＨＰＬＣ（水−メタノール）により精製し、化合物（１）３１．４ｍｇ、（２ａ）１８７．８ｍｇ、（２ｂ）７１．７ｍｇ及び（２ｃ）７．５ｍｇをそれぞれ単離した。 これらの化合物の構造決定は、 ^１ Ｈ−ＮＭＲ、 ^１３ Ｃ−ＮＭＲ、ＥＩＭＳにより行なった。 なお、化合物（１）はＳＮ−０２８として、化合物（２ａ）はＳＮ−０２０として、化合物（２ｂ）はＳＮ−０１７（フェレアリンＣ）として、化合物（２ｃ）はＳＮ−０４７（フェレアリンＧ）として公知の化合物であった。

実施例２
実施例１により得られた各種溶媒による抽出画分について、骨髄性白血病細胞であるＪｕｒｋａｔ細胞に対するアポトーシス誘導能をフローサイトメトリーにより検出した。 すなわち、Ｊｕｒｋａｔ細胞５×１０ ^５ ｃｅｌｌｓ／２ｍＬウェルに、各抽出画分を３０μｇ／ｍＬ又は陽性対象としてのカンプトテシンを４×１０ ^−７ Ｍとなるように加え、３７℃、５％ＣＯ _２条件下で２４時間又は４８時間インキュベーションした。 細胞をＰＢＳで洗浄した後、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を加え、フローサイトメトリーを行なった。 この方法によれば、アポトーシスの初期段階の細胞はアネキシンＶ−ＦＩＴＣの蛍光のみが観察され、アポトーシスの後期段階の細胞はアネキシンＶとＰＩの両方の蛍光が観察される。
その結果、第一のエタノール抽出物、及びメタノール抽出画分に高濃度でアポトーシス誘導能が認められた。 また、ｎ−ヘキサン画分にはアポトーシス誘導能は認められなかった。 さらに、合成吸着剤の溶出画分のうち、７０％メタノール画分、１００％メタノール画分及びアセトン画分に強いアポトーシス誘導能が認められた。 アセトン画分（ＳＮ−００１）のアポトーシス誘導能の結果を図１に示す。
図１から明らかなように、アセトン画分（ＳＮ−００１）は、カンプトテシンに比べて、早期（２４時間）から、後期段階へのアポトーシスを誘導した。

実施例３
神経芽腫細胞培養株であるＩＭＲ−３２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、又はＮＢ−３９を用いて、化合物（１）、（２ａ）、（２ｂ）及び（２ｃ）の抗悪性腫瘍効果をＭＴＴ法により検討した。
すなわち、各細胞を９６穴プレートに１×１０ ^４ ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播き、その２４時間後に各薬物を添加した。 ３７℃、５％ＣＯ _２条件下で４８時間インキュベートした。 これにＭＴＴ溶液を加え、その３時間後に生成したブルーホルマザンをピペッティングによりほぐし、５７０ｎｍ（ｔｏｐ）、６５５ｎｍ（ｂｏｔｔｏｍ）で吸光度を測定し、対照群に対する細胞生存率を求めた。 この方法によれば、細胞が生存していた場合のみにミトコンドリアの活性によりブルーホルマザンの生成が観察される。

得られた結果を図２〜図１３に示す。 図２から図１３から明らかなように、化合物（１）（ＳＮ−０２８）、（２ａ）（ＳＮ−０２０）、（２ｂ）（ＳＮ−０１７）及び（２ｃ）（ＳＮ−０４７）は、いずれも神経芽腫細胞に対して強い細胞傷害活性を示した。