Anti-cholera toxin agents

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、生体内毒素型細菌性腸管感染症に有効な抗コレラトキシン剤に関する。

背景技術 原虫、真菌、ウィルス、細菌等の種々の微生物が腸管感染症を引き起こすが、主要なものは細菌である。 この腸管感染症を引き起こす細菌は、その発症機構により、
組織侵入型、生体内毒素型（感染毒素型）、及び（生体外）毒素型の３型に大別できる。 そのうち、生体内毒素型細菌性腸管感染症は、コレラ菌（Vibrio chole
rae）や毒素原性大腸菌（Enterotoxigenic Escherichia
coli）による下痢症のように、経口的に腸管に入った生菌が腸管内で定着・増殖して毒素を産生する結果、発症する疾患であり、その代表的なものとして、コレラ、
旅行者下痢症が挙げられる（薬局， 42 ,1105（199
1））。

コレラは、コレラ菌の感染によって引き起こされる激しい水様性下痢を主体とする疾患であり、現在、アジア・アフリカを中心に世界中に蔓延している。 その経過は、極めて急性なものであり、下痢が始まった初期から極期・末期を得て死に至るまでの経過が短く、死亡率の高い疾患である。 現在、コレラに対する治療は、対症療法である輸液療法が全てであり、治療法として根本治療は開発されていない。

近年、コレラ治療法として、コレラ菌が体外に産生するコレラ毒素（コレラトキシン）の活性を阻害・抑制（抗コレラトキシン活性）し、無毒化することが注目されている。 しかし、現在まで抗コレラトキシン活性を有する薬物は発見されておらず、抗コレラトキシン活性を有する物質の開発が求められていた。

毒素原性大腸菌は、易熱性エンテロトキシン（Heat−
labile toxin）又は耐熱性エンテロトキシン（Heat−st
able toxin）のいずれか一方又は両方を産生する大腸菌である。 1971年にSackらによって見いだされたこの菌は、旅行者下痢症の主要な原因菌であり、最も重要な下痢原因菌の一つである（薬局， 42 ,1105（1991））。 上記易熱性エンテロトキシンはコレラ毒素（コレラトキシン）と分子構造、抗原性及び生物活性が酷似している（微生物， ３ ,248（1987））。 従って、抗コレラトキシン活性を有する薬物は易熱性エンテロトキシンの活性も阻害・抑制し、無毒化すると考えられている。

発明の開示 本発明者等は、上記の課題を解決すべく、種々の生薬、漢方薬について、鋭意研究を重ねた結果、大黄、桂皮及び麻黄からなる群から選ばれる少なくとも一種の生薬又はその抽出物、並びにこれらを構成処方に含む漢方薬又はその抽出物が抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は下記の発明を包含する。

（１）大黄、桂皮及び麻黄からなる群から選ばれる少なくとも一種の生薬（以下「本発明の生薬」という。）又はその抽出物を有効成分として含有する抗Vibrio chole
rae由来コレラトキシン剤。

（２）有効成分が大黄、桂皮及び麻黄からなる群から選ばれる少なくとも一種の生薬又はその抽出物を構成処方に含む漢方薬（以下「本発明の漢方薬」という。）又はその抽出物である上記（１）に記載の抗Vibrio cholera
e由来コレラトキシン剤。

（３）有効成分が大黄又はその抽出物である上記（１）
に記載の抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン剤。

（４）有効成分が桂皮又はその抽出物である上記（１）
に記載の抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン剤。

（５）有効成分が麻黄又はその抽出物である上記（１）
に記載の抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン剤。

（６）有効成分が大黄甘草湯又はその抽出物である上記（２）に記載の抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン剤。

（７）有効成分が桂枝加芍薬大黄湯又はその抽出物である上記（２）に記載の抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン剤。

（８）有効成分が麻黄附子細辛湯又はその抽出物である上記（２）に記載の抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン剤。

本発明の生薬である、大黄、桂皮及び麻黄は、従来、
鎮静、鎮痙、抗炎症等の作用を有することが知られていたが、抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン作用を有することは、全く知られていなかった。

本発明の漢方薬としては、葛根湯、葛根湯加川きゃう辛夷、乙字湯、八味地黄丸、大柴胡湯、柴胡桂枝湯、柴胡桂枝乾姜湯、柴胡加竜骨牡蛎湯、五苓散、桂枝加朮附湯、小青竜湯、桂枝茯苓丸、桂枝加竜骨牡蛎湯、麻黄湯、大黄牡丹皮湯、木防巳湯、当帰四逆加呉茱萸生姜湯、苓桂朮甘湯、桂枝湯、十全大補湯、潤腸湯、よく苡薬湯、桂皮加芍薬湯、桃核承気湯、防風通聖散、五積散、炙甘草湯、調胃承気湯、桂枝人参湯、大黄甘草湯、
治打撲一方、小建中湯、当帰湯、通導散、温経湯、牛車腎気丸、人参養栄湯、柴苓湯、胃苓湯、茵ちん五苓散、
当帰建中湯、桂枝加芍薬大黄湯、麻黄附子細辛湯、茵ちん蒿湯等が挙げられ、そのうち特に大黄甘草湯、桂枝加芍薬大黄湯及び麻黄附子細辛湯が好ましい。

本発明の漢方薬の処方は、「外台秘要方」、「傷寒論」、「金匱要略」等の古典に記載されており、例えば、大黄甘草湯、桂枝加芍薬大黄湯及び麻黄附子細辛湯では、若干の差異があるが生薬の配合範囲は一般に次の通りである。 また、これら本発明の漢方薬の用途としては、便秘、急性腸炎、高血圧等の種々のものが知られているが、コレラ、旅行者下痢症等の抗Vibrio cholerae
由来コレラトキシン剤として有用であることは、全く知られていなかった。

大黄甘草湯 大黄 4.0重量部 甘草 1.0〜2.0重量部 桂枝加芍薬大黄湯 芍薬 6.0重量部 桂皮 4.0重量部 大棗 4.0重量部 甘草 2.0重量部 大黄 1.0〜2.0重量部 乾生姜 1.0〜4.0重量部 麻黄附子細辛湯 麻黄 4.0重量部 細辛 3.0重量部 附子 0.5〜1.0重量部 本発明の生薬及び本発明の漢方薬の抽出物としては、
各種の水系溶剤抽出物が挙げられるが、水抽出物を用いることが好ましい。 具体的な抽出物の調製例としては、
上記の生薬又は漢方薬を10倍量の熱水で抽出し、得られた抽出液を濾過する方法が挙げられる。 この抽出物は必要に応じて乾燥させ、乾燥粉末として用いることができる。

抽出物調製の具体例を以下に示す。

具体例１ 大黄甘草湯 大黄16.0g及び甘草8.0gの混合生薬（大黄甘草湯:24.0
g）に240gの精製水を加え、100℃で１時間加熱抽出した。 得られた抽出液を濾過後、スプレードライして6.0g
の乾燥エキス粉末を得た。

具体例２ 桂枝加芍薬大黄湯 芍薬6.0g、桂皮4.0g、大棗4.0g、甘草2.0g、大黄2.0g
及び乾生姜1.0gの混合生薬（桂枝加芍薬大黄湯:19.0g）
に190gの精製水を加え、100gで１時間加熱抽出した。 得られた抽出液を濾過後、スプレードライして4.0gの乾燥エキス粉末を得た。

具体例３ 麻黄附子細辛湯 麻黄12.0g、細辛9.0g及び附子末3.0gの混合生薬（麻黄附子細辛湯:24.0g）に240gの精製水を加え、100℃で１時間加熱抽出した。 得られた抽出液を濾過後、スプレードライして4.5gの乾燥エキス粉末を得た。

具体例４ 大黄 大黄24gの240gの精製水を加え、100℃で１時間加熱抽出した。 得られた抽出液を濾過後、スプレードライして
8.6gの乾燥エキス粉末を得た。

具体例５ 桂皮 桂皮24gの240gの精製水を加え、100℃で１時間加熱抽出した。 得られた抽出液を濾過後、スプレードライして
2.6gの乾燥エキス粉末を得た。

具体例６ 麻黄 麻黄24gの240gの精製水を加え、100℃で１時間加熱抽出した。 得られた抽出液を濾過後、スプレードライして
4.8gの乾燥エキス粉末を得た。

具体例７ 大黄甘草湯 大黄1600g及び甘草800gの混合生薬（大黄甘草湯:2400
g）に24Lの精製水を加え、加熱し、100℃になってから１時間抽出した。 得られた抽出液を遠心分離機にかけ、
残渣を分離して溶液20Lを得た。

この溶液を0.3μｍのメンブランフィルター（東洋濾紙社製）により無菌清澄濾過した。 得られた濾液をダイアフィルターＧ−10T（バイオエンジニアリング社製：
分画分子量10000）を用いて限外濾過した。 この限外濾過は、内容積2.0Lの溶液の下面に直径152mmの膜をセットし、圧力3kg/cm ²で行い、容器内の液が濃縮されるにつれ精製水約2Lを添加するというように実施した。 この結果、限外濾過液20Lを得た。

次に、実施例を示して、本発明の有効成分が抗コレラトキシン活性を有することについて説明する。

実験例１ CHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞アッセイによる検討 本実験では、本発明の生薬又は漢方薬を10mg/mlになるように溶解し、37℃で30分間抽出し、この抽出液を延伸して得られる上清液を適宜濃度を調整して用いた。

CHO細胞（2.5×10 ³ cells/ml）に10ng/mlのコレラトキシン及び上記本発明の生薬又は漢方薬（抽出上清液）を
37℃で17時間作用させ、コレラトキシンによる卵円形から紡錘形への細胞の形態変化の阻害を観察し、阻害率を求めた。

実験例２ アグマチンアッセイによる検討 １μｇのコレラトキシンＡサブユニット、0.7mgのアグマチン、0.0375μCiの［ ¹⁴ C］ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及び実験例１で得た本発明の生薬又は漢方薬（抽出上清液）を混合し、30℃で３時間保温し、
形成される［ ¹⁴ C］ADP（アデノシン二リン酸）−リボシル化アデマチンを測定した。 この［ ¹⁴ C］ADP−リボシル化アグマチンの形成を指標に、本発明の有効成分によるコレラトキシンのADP−リボシル化転移酵素活性の阻害率を求めた。

実験例１及び実験例２の結果を表１に示す。 表１において、濃度は抽出上清液を得るのに用いた生薬又は漢方薬の最終濃度を示す。

Vibrio cholerae由来コレラトキシンに直接作用し、ADP

−リボシル化転移酵素活性を著明に阻害し、抗Vibrio c

holerae由来コレラトキシン活性を有することが確認された。 従って、本発明の抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン剤は、コレラ、旅行者下痢症等の生体内毒素型細菌性腸管感染症の治療薬として有用である。

なお、本発明の有効成分は、長い歴史を有し、安全性が確認されたものであるので安心して使用することができる。 例えば、マウス及びラットに対し、限界投与量である15g/kgの経口投与が死亡例が認められないことから明らかなように極めて安全性の高いものである。

次に、本発明の抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン剤の製剤化及び投与量について説明する。

本発明の抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン剤は、本発明の生薬又は漢方薬をそのまま、又は抽出物を公知の医薬用担体と組合せて製剤化することができる。
投与形態としては、特に限定がなく、必要に応じ適宜選択して使用され、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、
散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。

所期の効果を発揮するためには、患者の年令、体重、
疾患の程度により異なるが、通常成人で本発明の抗Vibr
io cholerae由来コレラトキシン剤の有効成分の重量として３〜15gを、１日数回に分けての服用が適当である。

経口剤は、例えばデンプン、乳糖、白糖、マッニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。

この種の製剤には、適宜上記賦形剤の他に、結合剤、
崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、
着色剤、香料等を使用することができる。 それぞれの具体例は以下に示すごとくである。

［結合剤］ デンプン、デキストリン、アラビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、
カルボキシメチセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース、エチルセルロース、
ポリビニルピロリドン、マグロゴール。

［崩壊剤］ デンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシルメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース。

［界面活性剤］ ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レチシン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート80。

［滑沢剤］ タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレングリコール。

［流動性促進剤］ 軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム。

また、本発明の抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン剤は、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。

一方、非経口剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、
注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。 更に必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。 また、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。 更に、必要に応じて適宜、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えてもよい。

発明を実施するための最良の形態 以下、実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制限されるものではない。

実施例１ コーンスターチ 21g 結晶セルロース 10g カルボキシメチルセルロースカルシウム 7g 軽質無水ケイ酸 1g ステアリン酸マグネシウム 1g 具体例１で得られた大黄甘草湯 160g計200g 上記の処方に従って〜を均一に混合し、打錠機にて圧縮成型して１錠200mgの錠剤を得た。

この錠剤１錠には、具体例１で得られた大黄甘草湯16
0mgが含有されており、成人１日20〜80錠を数回にわけて服用する。

実施例２ コーンスターチ 29g ステアリン酸マグネシウム 2g カルボキシメチルセルローウカルシウム 8g 軽質無水ケイ酸 1g 具体例２で得られた桂枝加芍薬大黄湯 160g計200g 上記の処方に従って〜を均一に混合し、圧縮成型機にて圧縮成型機、破砕機により粉砕し、篩別して顆粒剤を得た。

この顆粒剤1gには、具体例２で得られた桂枝加芍薬大黄湯180mgが含有されており、成人１日４〜18gを数回にわけて服用する。

実施例３ コーンスターチ 19g 軽質無水ケイ酸 1g 具体例３で得られた麻黄附子細辛湯 180g計200g 上記の処方に従って〜を均一に混合し、200mgを２号カプセルに充填した。

このカプセル剤１カプセルには、具体例３で得られた麻黄附子細辛湯180mgが含有されており、成人１日20〜8
0カプセルを数回にわけて服用する。

実施例４ 具体例７で得られた大黄甘草湯20Lにアラニン（発熱物質不含）300gを添加し、溶解した。 これを900本のバイアル瓶に分注した後、凍結乾燥し、粉末注射剤を得た。 この注射剤１バイアルには、凍結乾燥物406mgが含まれており、10mlの精製水で溶解した時、その水溶液は澄明であった。 また、この水溶液は日本薬局方の発熱性物質試験法に合格していた。

産業上の利用可能性 本発明の抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン剤は、抗Vibrio cholerae由来コレラトキシン活性を有し、コレラ、旅行者下痢症等の生体内毒素型細菌性腸管感染症の治療薬として有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平５−51301（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−172338（ＪＰ，Ａ) 特表 平６−508849（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ． Ｐｈａｒｍａ ｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ． 96，Ｎｏ． １− ２，ｐｐ． 11−19，1983 (58)調査した分野(Int.Cl. ⁷ ，ＤＢ名) A61K 35/78 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)